LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI TANAMAN UJI ELEKTROFORESIS (KUANTITAS & KUALITAS DNA)
Disusun oleh : Nama
: Langgeng Waskitho
Nim
: 4442150052
Kelas
:6B
Kelompok
:2
JURUSAN AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS SULTAN AGENG TIRTAYASA 2018
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah
yang telah
melimpahkan rahmat dan hidayah-nya serta memberikan kelancaran dalam menyeselaikan laporan. Dalam penyusunan laporan ini penulis mendapatkan bantuan moril maupun materil dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis me ngucapkan terimakasih kepada : 1.
Teh Fitri, Teh Maryam dan Teh Putri selaku asisten laboratorium yang senantiasa memberikan doa, ilmu, bimbingan, motivasi dan membagikan ilmu dalam penyusunan laporan ini.
2.
Sulastri Isminingsih, S.P., M.Si selaku dosen pengampu yang senantiasa memberikan doa, motivasi dan membagi ilmu dalam pembelajaran mata kuliah Bioteknologi tanaman
3.
Ibu
Andy
Apriany
Fatmawaty,
Ir.,
M.P
selaku
Ketua
Jurusan
Agroekoteknologi Penulis berharap semoga laporan ini dapat bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi di Bidang Pertanian. Semoga Allah senantiasa melimpahkan ramat dan hidayahnya kepada kita semua. Amin
Serang, April 2018
Penulis
i
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR .............................................................................................i DAFTAR ISI .......................................................................................................... ii DAFTAR TABEL ................................................................................................ iii BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 1
1.1 latar Belakang.......................................................................................... 1 1.2 Tujuan .....................................................................................................1 BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...........................................................................1
2.1 Elektroforesis DNA ................................................................................. 1 2.2 Perinsip Kerja Elektroforesis ..................................................................2 2.3 Kualitas dan Kuantitas DNA...................................................................3 2.4 Langkah Elektoroforesis Gel...................................................................4 BAB III BAHAN DAN METODE ........................................................................7
3.1 Waktu dan Tempat ..................................................................................7 3.2 Alat dan Bahan ....................................................................................... 7 3.3 Cara Kerja ...............................................................................................7 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 8
4.1 Hasil ........................................................................................................ 8 4.2 Pembahasan.............................................................................................9 BAB V PENUTUP ................................................................................................11
5.1 Simpulan ............................................................................................... 11 5.2 Saran......................................................................................................11 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 12 LAMPIRAN
ii
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Hasil Uji Elektroforesis (Kualitatif) ...........................................................7
iii
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp) (Dwidjoseputro 1998). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Dwidjoseputro 1998). Hasil DNA elektroforesis harus dibandingkan denga DNA marker. Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. DNA Marker yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi (Thompson & Fritchman, 2012) Dalam praktikum ini akan menguji kualitas dan mengetahui pita DNA padi varietas amas menggunakan metode elektroforesis menggunakan gel-doc.
1.2 Tujuan
Tujuan dari praktikum uji elektroforesis (kualitas dan kuantitas DNA) ialah : 1. Untuk mengetahui kualitas DNA. 2. Untuk mengetahui ada tidaknya pita DNA.
1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Elektroforesis DNA
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp) (Dwidjoseputro, 1998). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Dwidjoseputro, 1998). Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Klug and Cummings, 1994).
2.2 Perinsip Kerja Elektroforesis
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion)
2
akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug and Cummings, 1994). Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen, 1999).
2.3 Kualitas dan Kuantitas DNA
Analisis kuantitatif dilakukan untuk mengetahui kualitas hasil isolasi DNA meliputi konsentrasi dan tingkat kemurnian DNA genom. Analisis ini dapat dilakukan dengan menggunakan alat spektrofotometer. Analisis kualitatif DNA genom dapat dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa. Pengukuran konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer didasarkan pada prinsip radiasi sinar ultra violet yang diserap oleh nukleotida. Asam nukleat dapat menyerap cahaya dengan kuat pada panjang gelombang 260 nm . Apabila kepadatan optic (Muladno, 2002). Pada panjang gelombang A260 nm sama dengan satu, maka konsentrasi molekul DNA setara dengan 50 µg/ml untuk DNA heliks ganda dan 40 µg/ml untuk DNA untai
tunggal
Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan
kualitasnya. DNA dikatakan berkualitas jika memiliki tingkat kemurnian yang tinggi, karena telah termurnikan dari kontaminan seperti RNA, protein, dan lipid. Tingkat kemurnian DNA diukur dengan membandingkan absorbansi asam nukleat pada panjang gelombang A260 nm dan protein pada A280 nm. Kontaminasi DNA dapat dilihat dengan semakin meningkatnya nilai absorbansi protein (Muladno, 2002). Analisis kualitatif DNA genom menggunakan elektroforesis pada gel agarosa merupakan metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan, dan purifikasi fragmen DNA. Pewarna ethidium bromida digunakan sebagai alat identifikasi dan mengukur semikualitatif fragmen DNA yang terpisah di dalam gel. Ethidium bromida akan terikat di antara dua untai ganda
3
DNA sehingga pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar karena pewarna ini mengandung zat fluoresen. Ikatan DNA dengan ethidium bromida ini akan terekspos pada sinar UV tingkat medium, sekitar panjang gelombang 300 nm . Intensitas fluoresen dapat diukur dengan menggunakan DNA penanda standar sehingga kuantitas DNA dapat diperkirakan, misalnya antara 0.50-20 µg/ml (Jamsari, 2013).
2.4 Langkah Elektoroforesis Gel
a. Gel Poliakrilamida Merupakan polimer bertauatan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan.Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA,RNA,atau oligonukleotida),gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara
akrilamida
dan
zat
yang
memungkinkan
pertauatan
silang
(crosslinked),menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda.Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa),gel yang digunakan adalah agarose (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan (Medula, 2014). b.Staining(pewarnaan) Setelah proses eletroforesis selesai,dilakukan proses pewarnaan (staining) agar
molekul
sampel
yang
telah
terpisah
dapat
dilihat.
Etidium
bromida,perak,atau pewarna “biru coomassi” (coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini.jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah “diwarnai” dengan etidium bromida),gel difoto dibawah sinar uiltraviolet.Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif,autoradiogram gel tersebut dibuat. Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Medula, 2014). c.Marker(penanda)
4
Marka atau penanda yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampl degan meng-elektroforesiskan marak tersebut pada lajur di gel yang pararel dengan sampel.Pita-pita pada lajur mereka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya.Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul (Medula, 2014).
5
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum mengenai uji elektroforesis (kuantitas dan kualitas DNA) dilaksanakan pada hari kamis tanggal 12 April 2018 pukul 14.40 sampai dengan 16.10 yang bertempat di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sultan Ageng Tirtayasa.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada praktikum uji elektroforesis (kuantitas dan kualitas DNA ) adalah seperangkat alat elektroforesis (sisir elektroforesis, cetakan agar), Alumunium foil, pipet ukuran 0,5-10 dan ukurang 0,1-0,25, tips, parafilm, plastic wrap, gel doc dan timbangan analitik. Sedangkan bahan yang digunakan adalah bubuk agarose 0,2 gram, larutan TAE (Tri-Aset at-EDTA) 20 ml, gel red 1 ml, 1 ml loading dye, dan 5 ml sampel DNA.
3.3 Cara Kerja
Adapun cara kerja yang dilakukan pada praktikum mengenai uji elektroforesis adalah sebagai berikut : 1.
Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2.
Ditimbang bubuk agarose sebanyak 0.2 gram menggunakan timbangan analitik.
3.
Dilarutkan pada 20 ml larutan TAE (Tri-Asetat-EDTA)
4.
Dicampurkan/dihomogenkan menggunakan hot plate sampai berwarna bening.
5.
Didiamkan pada suhu ruang sampai suhu hangat kuku.
6.
Diteteskan 1 ml larutan gel red, kemudian diaduk dan gel dimasukan kedalam cetakan beserta dengan sisir elektroforesisnya.
7.
Ditunggu agar mengeras sampai terbentuk sumur.
8.
Setelah agar/gel mengeras, maka sisir boleh dilepas dan gel dapat digunakan.
9.
Dipasang parafilm pada alas datar.
6
10. Diambil larutan loading dye sebanyak 1 ml dan diletakan diatas parafilm sebanyak 7 titik untuk marker, aslab dan sampel DNA kel 1 sampai 5 menggunakan mikropipet ukuran 0.1 – 0.25 ml. 11. Dirhesus 5 ml bahan marker, sampel DNA aslab dan kel 1 sampai 5 dengan loading dye diatas parafilm. 12. Dimasukan sampel yang telah di rhesus pada sumur yang telah terbentuk pada agar. 13. Ditutup
elektroforesis
dengan
rangka
penutup
yang
tersambung
elekrtoforesis melalui kutub positif dan kutub negatif. 14. Dipasang kabel elektroforesis , kabe hitam pada kutub negatif dan kabel merah pada kutub positif. 15. Dinyalakan alat elektroforesis dengan menekan tombol power dibagian belakang. 16. Ditekan tombol start untuk memulai kerja dan diatur tegangan sebesar 75 Volt selama 30 menit, kemudian dijalankan elektroforesis dengan menekan tombol run pada sumber arus. 17. Setelah proses elektroforesis selesai, dimatikan sumber arus, kabel dibuka dan rangka penutup dibuka. 18. Diuji agar yang telah mengandung pita DNA menggunakan gel doc. 19. Didokumentasikan hasil dari proses pengujian menggunakan gel doc.
7
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil
Tabel 1. Hasil Uji Elektroforesis (Kualitatif) No
Gambar
Keterangan
Keterangan: Pita DNA 1: Marker (dibaca dari kiri) Pita DNA 2: Asisten Laboratorium Pita DNA 3: Varietas Kambang Pita DNA 4: Varietas Amas Pita DNA 5: Varietas Pandan Ungu Pita DNA 6: Varietas Ciherang Pita DNA 7: Varietas Mira
1. Sampel DNA padi varietas Amas telihat
memiliki
smear
paling
sedikit
1.
2. Sampel DNA padi milik asisten laboratorium smear paling
terlihat
memiliki
banyak dibandingkan
dengan sampel DNA padi lainnya 3. Sampel
DNA
padi
varietas
Kambang juga terlihat memiliki smear tapi
yang cukup tebal
4. Sampel DNA padi varietas Pandan Ungu, Ciherang, dan Mira juga memiliki smear yang tidak terlalu tebal dibandingkan dengan varietas Kambang
8
4.2 Pembahasan
Pada table hasil uji elektroforesis (kualitatif) didapatkan data gambar dalam gel-doc dimulai pada sebelah kiri dapat diketahui gambar yang paling kiri merupakan marker sebagai pita DNA 1. Marker ini merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel kemudian dibandingkan dengan pita sampel. Jika memiliki kesamaan keduanya maka akan terjadi kesamaan pita dna marker dengan pita sampel. Oleh sebab itu smear atau goresan pita pada dna marker lebih terlihat jelas dibandingkan dengan yang lainnya. Menutu Davis (1994) Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis . Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software. Pada pita dna 2 pita assisten laboratorium didapatkan sampel memiliki smear terbanyak dibandingkan dengan smear pada varietas kambang, amas, pandan ungu, varietas ciherang dan varietas mira. Hal ini dapat dipengaruhi oleh kontaminan protein dan rna sehingga jika terjadi kontaminan maka smear atau goresan pada pita dna akan semakin sedikit. Pita dna 3 varietas kembang diketahui smear pada sampel memiliki smear lebih tebal dibandingkan dengan yang lainnya. Sehingga pita dna yang terbentuk tertutupi maka terbentuklah smear. Pita dna 4 varietas amas dapat diketahi terlihat memiliki smear yang paling rendah dibandingkan dengan varietas kembang. Meskipun demikian terlihat sedikit adanya pita dna namun tidak terlalu jelas. Sehingga kemurnian pada varietas amas lebih baik dibandingkan yang lainnya. Pita dna 5 varietas pandan ungu, ciherang dan mira juga memiliki smear yang tidak terlalu tebal dibandingkan dengan varietas kambang. Dari ketujuh pita dna tersebut dapat diketahui smear terbanyak terdapat pada sampel assisten laboratorium sehingga kualitas dna yang dihasilkan kurang bagus. Sampel dna sedikit smear ada pada varietas amas sehingga varietas amas terlihat pita sedikit terbentuk dibandingkan yang lainnya. Banyaknya smear yang
9
terjadi dapat disebabkan oleh agaroses gel elektroforesis. Menurut Susanti (2003) Agarose gel elektroforesis adalah metode yang digunakan untuk memisahkan DNA berdasarkan besar molekul. Pemisahan molekul terjadi melalui pergerakan asam nukleat yang negatively charged yang menembus matriks agarose dalam tank elektroforesis. Molekul dengan berat molekul lebih rendah akan bergerak lebih cepat. Setelah pembuatan gel elektroforesis, DNA dapat segera dirunning tetapi sebelumnya perlu diberi loading buffer (Bromophenol blue) untuk memberikan berat sampel dan sebagai penanda sampai kapan elektroforesis bisa dihentikan Marker yang digunakan dalam praktikum ini menggunakan gel red. Sebab lebih aman dalam penggunannya dan tingkat kontaminasi etbr lebih ringan dibandingkan dengan menggunakan etidium bromida. Menurut Babec (2012) EtBr bersifat mutagen kuat dan dapat menyebab kanker. Gel red memiliki struktur molekuler serupa dengan EtBr dan memiliki sensitivitas yang tinggi. Akan tetapi, gel red memiliki kelebihan yaitu lebih aman dari EtBr karena bukan mutagen. Hal tersebut membuat gel red digunakan dalam praktikum elektroforesis. Dari ketujuh pengamatan tersebut dapat diketahui gel red merupakan pewarna dna yang menyelip ke sela-sela nukleotida untuk manampilkan basa nukleutida. Menurut Susanto (2012), laju migrasi DNA ditentukan oleh konformasi molekulnya, dari yang paling cepat yaitu Covalently Closed Circular (CCC), Open Circular, dan linier. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, s ehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Pita dna marker, asisten laboratorim, varietas kembang, varietas amas, pandan ungu, ciherang dan varietas mira memiliki kualitas dna kurang baik sebab pita yang dihasilkan masih belum terlalu jelas. Oleh sebab itu diperlukan metode terbaik agar terlihat pita dan yang jelas tida smear.
10
BAB V PENUTUP
5.1 Simpulan
Simpulan yang didapatkan dalam praktikum ini yaitu hanyalah varietas amas yang memiliki smear paling sedikit sehingga terbentuk 1 pita dna yang kecil namun agak samar. Untuk pita dna marker, asisten laboratorium, varietas kambang, varietas pandan ungu, varietas ciherang dan varietas mira bersifat smear sebab ketika terjadinya proses elektroforesis agarose dna tidak memisah melalui pergerakan asam nukleat ketika dilakukan sentuhan energi listrik dari kutub yang berbeda. Pita dna marker, asisten laboratorim, varietas kembang, varietas amas, pandan ungu, ciherang dan varietas mira memiliki kualitas dna kurang baik sebab pita yang dihasilkan masih belum terlalu jelas.
5.2 Saran
Akan lebih maksimal jika hasil geldoc memiliki band pita yang jelas dan dapat dijelaskan.
11
DAFTAR PUSTAKA
Babec.
2012. Guide for using gelred™ safe nucleic acid gel stain. http://www.babec.org/node/32: 3 hlm. 14. Diakses pada 19 April 2017.
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed. Appleton & Lange, Norwola. Dwidjoseputro. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan. Fairbanks, D.J. & W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. 4th ed. Wadsworth Publishing Company, London: xix + 820 hlm. Klug, W.S., Cumming, M.R. 1994. Concepts of Genetic. Prentice-Hall Inc, Englewoods Cliff. 36-44. Medula. 2014. laporan praktikum bioteknologi tanaman. http://medulaoblongata258.blogspot.co.id/2014/04/laporan-praktikum bioteknologi-tanaman.html. Diakses pada tanggal 19 April 2018. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Jamsari. 2007. Bioteknologi Pemula : Prinsip Dasar dan Aplikasi Analisis Molekuler. Pekan Baru. Unri Press. Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Jamsari. 2007. Bioteknologi Pemula : Prinsip Dasar dan Aplikasi Analisis Molekuler. Pekan Baru. Unri Press. Susanti Sri . 2003. Pengertian DNA dan Karateristiknya : Kamus Biologi . Jakarta : PT Gramedia Utama. Susanto, Agus Hery. 2012. Bahan Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Unsoed, Purwokerto Thompson, R. & B. Fritchman. 2012.Illustrated guide to home biology experiments: All lab, no lecture. California, O’Reilly Media Inc. : xv + 358 hlm.
12
LAMPIRAN
Agarose ditimbang 0.2 gram
Neraca analitik
Dinyalakan alat Elektroforesis dengan tegangan 75 volt selama 30 menit
Alumunium foil untuk menutup
stirrer
Di uji agar mengandung pita dna menggunakan gel doc. 13
Erlenmeyer
Larutan loading dte diletakkan diatas parafilm
Glass jam
Mikropipet
Hasil visualisasi Geldoc di foto.
