Percobaan V dan VI
Uji Aktivitas Anti Mikroba Pada Media Cair Dan Media Padat I. Tujuan Mengetahui aktivitas anti mikroba pada media padat dan media cair.
II. Dasar Teori Pengukuran aktivitas secara mikrobiologi dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain : 1) Metode Dilusi Ada dua macam metode dilusi yaitu metode dilusi cair (Metode Macro Broth Dillution) dan metode dilusi padat (Metode agar dilusi). Pada dilusi cair, masingmasing konsentrasi obat ditambah suspensi bakteri, sedangkan dalam dilusi padat tiap konsentrasi dicampur dengan media agar lalu ditanam bakteri, diinkubasi selama 24 jam. Kegunaan dari metode dilusi ini adalah untuk mencari KHM (Kadar Hambat Minimum) yaitu kadar obat terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Kadar terkecil yang menunjukkan hambatan terhadap pertumbuhan bakteri ditandai oleh kejernihan media merupakan KHM. Data sifat kimia fisika dan data aktivitas antibakteri (KHM) dianalisis secara statistik dengan uji regresi liner dan non linier . 2) Metode Difusi a) Cara Kirby Bauer Beberapa koloni kuman dari pertumbuhan 24 jam pada agar diambil, disuspensikan ke dalam 0,5 ml BHI cair, diinkubasikan 4–8 jam pada 37°C. Suspensi ditambah aquadest steril hingga kekeruhan tertentu sesuai dengan standar konsentrasi bakteri 108 CFU per ml. Kapas lidi dicelupkan dalam suspensi bakteri lalu ditekantekan pada permukaan media agar selanjutnya diletakkan kertas samir (disk) yang mengandung antibiotik di atasnya, diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. b) Cara Sumuran Seperti cara Kirby Bauer, setelah dioleskan bakteri pada media agar dibuat sumuran dengan garis tengah tertentu dan ke dalam sumuran diberi larutan antibakteri dan diinkubasikan pada suhu 37°C selama 18-24 jam. c) Poor Plate Diambil suspensi bakteri satu ose dimasukkan ke dalam 4 ml agar base 1,5% yang mempunyai temperatur 50oC setelah suspensi homogen dituang pada media Mueller hinton ditunggu sebentar sampai agar tersebut membeku, diletakkan disk diatas
media, diinkubasi 15 – 20 jam dengan temperatur 37 oC, interprestasikan hasilnya sesuai standar antibiotika untuk masing-masing bakteri (Anonim, 1994). Pembacaan hasil dapat dilakukan dengan cara mengukur : (1) Zona radikal yaitu suatu daerah di sekitar disk dimana sama sekali tidak ada pertumbuhan bakteri. (2) Zona irradikal yaitu suatu daerah di sekitar disk yang pertumbuhan bakterinya dihambat tetapi tidak dimatikan (Anonim, 1993).
II. Alat dan bahan Tabel keperluan alat dan bahan untuk setiap kelompok percobaan Percobaan : Alat dan Bahan 5. Uji aktivitas Tabung Reaksi Steril kosong anti mikroba Tabung reaksi berisi akuades steril 6 ml Tabung reaksi berisi media BHI steril 1 ml Tabung reaksi berisi BHI DS steril 5 ml Tabung reaksi berisi CYG steril 5 ml Tabung reaksi (erlenmeyer) berisi larutan sampel Tabung reaksi berisi 1 ml suspensi Candida albicans
Jumlah 8 1 1 1 1 1 1
Blue tip Yellow tip Mikropipet Lampu Bunsen
5 5 1 1
III. Cara Kerja 1. Pembuatan stok bakteri : Satu ose bakteri dari stok disuspensikan ke dalam 2 ml media BHI Inkubasi pada suhu 37ºC, selama 3-5 jam (krn waktu terbatas, dilakukan 1 jam saja) Diambil ± 200 µl, diencerkan dengan NaCl 0,9% steril , hingga kekeruhan sama dg standar Mc Farland (108 CFU/ml) Suspensi bakteri 108 CFU/ml diencerkan menjadi 106 CFU/ml dengan BHI DS Suspensi bakter
2. Pemeriksaan aktivitas antibakteri (metode dilusi cair) a. Persiapan tabung uji : Disiapkan 8 tabung reaksi steril (4 untuk kontrol dan 4 lagi untuk cuplikan) : 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8)
Tabung I diisi 0,5 ml filtrat 50% v/v dan 0,5 ml suspensi bakteri Tabung II diisi 0,5 ml filtrat 25% v/v dan 0,5 ml suspensi bakteri Tabung III diisi 0,5 ml filtrat 12,5% v/v dan 0,5 ml suspensi bakteri Tabung IV diisi 0,5 ml filtrat 6,25% v/v dan 0,5 ml suspensi bakteri Tabung V diisi 0,5 ml BHI dan 0,5 ml suspensi bakteri (kontrol bakteri) Tabung VI diisi 0,5 ml BHI dan 0,5 ml aquadest steril (kontrol pelarut) Tabung VII diisi 0,5 ml filtrat 50 % v/v dan 0,5 ml BHI (kontrol sampel) Tabung VIII diisi 1 ml media BHI (kontrol media) b. Semua tabung uji diinkubasi pada temperatur 37ºC selama 18-24 jam
lalu dilihat adanya kekeruhan dengan cara membandingkan dengan kontrol untuk menetapkan KHM. c. Kemudian percobaan dilanjutkan dengan menggoreskan sampel dari masing-masing tabung pada media Agar. Media yang digunakan adalah media Agar Darah (Staphylococcus aureus) dan Mc Conkey (Escherichia coli). Konsentrasi filtrat terkecil yang tidak terjadi pertumbuhan pada media dinyatakan sebagai KBM. 0,5 ml suspensi bakteri dimasukkan dalam tabung yang telah berisi 0,5 ml sampel dalam berbagai konsentrasi
Diinkubasi pada suhu 37° C selama 24 jam
KHM dibaca dengan melihat kejernihan larutan dibandingkan dengan tabung kontrol
Tiap tabung digores di media agar (Media agar darah untuk Staphylococcus aureus dan Media Mc Conkey untuk Escherichia coli)
Diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam
KBM dibaca dengan melihat tumbuh tidaknya bakteri dalam media agar dan dibandingkan kontrol
Gambar Skema Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Dilusi Cair Catatan : untuk Jamur Candida albicans digunakan media cair CYG (sebagai pengganti BHI) dan media padat SDA (Sabouroud Dextrose Agar)
