1. TUJUAN PRAKTIKUM
Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk mengetahui pentingnya sterilisasi dan hal-hal yang dapat mempengaruhi sterilisasi, mengetahui proses sterilisasi dengan menggunakan alat autoklaf, dan mengetahui cara penggunaan autoklaf, mengetahui berbagai macam jenis media, mengetahui perbedaan dari media padat dan cair, mengetahui cara pembuatan medium, mengetahui komposisi medium, serta mengetahui bentuk-bentuk medium.
2. TINJAUAN PUSTAKA
Media adalah suatu tempat yang berguna untuk pertumbuhan dan berkembangnya mikroba. Agar mikroba dapat tumbuh dan berkembang, media harus memenuhi syaratsyarat tertentu yaitu media harus mengandung unsur hara yang berguna untuk pertumbuhan dan perkembangan, memiliki tekanan osmotik, memiliki tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan kebutuha n mikroba, serta sebelum digunakan media harus dalam keadaan steril, yang berarti tidak ada pertumbuhan mikroba lain yang tidak diharapkan. Didalam nedia oun sudah terdapat bahan-bahan makanan yang berguna untuk pertumbuhan mikroba yang bentuknya alami dan bahan kimianya berbentuk senyawa-senyawa senyawa-senyawa organik.(Suriawiria, 2005, 74 : 172)
Pada pembuatan medium sebaiknya menggunakan air suling atau
aquadest .
Mikroorganisme memiliki kebutuhan dasar hidup diantaranya adalah air, energi, karbon, mineral, dan faktor tumbuh. Faktor tumbuh adalah komponen yang esensial tidak dapat disintesis sendiri oleh organisme. Selain itu, keasaman (pH) medium juga sangat penting bagi pertumbuhan mikroorganisme dan sebagian sebagian besar tumbuh optimal pada pH 7.
1
2
Tipe-tipe medium: 1. Medium serbaguna Paling umum digunakan pada bakteriologi, contohnya kaldu nutrien. 2. Medium selektif Mengandung zat kimia tertentu yang dapat menghambat pertumbuhan sekelompok atau lebih bakteri tanpa harus menghambat pertumbuhan organisme yang dibutuhkan. 3. Medium diferensial Mengandung zat kimia tertentu untuk membedakan berbagai berbagai macam bakteri. (Hadioetomo, 1993, 44-46:163).
Macam-macam medium berdasarkan berdasarkan konsistensinya: 1. Medium cair Berguna untuk pembiakan organisme dalam jumlah yang besar, fermentasi, dan uji-uji yang lain. Contohnya adalah Nutrient Broth Broth dan Glucose Broth. 2. Medium setengah padat Digunakan untuk menguji keberadaan motilitas serta kemampuan fermentasi. Medium ini serungkali mengandung gelatin ataupun agar-agar, namun konsentrasinya konsentrasinya lebih kecil daripada medium padat. 3. Medium padat Berguna untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan, sehingga koloninya dapat dihitung, diamati, dan diisolasi. Contoh medium padat adalah Nutrient Agar (NA), Plate Count Agar, Agar, Potato Dextrose Agar (PDA). (Hadioetomo, 1993,
46:163). Macam-macam bentuk media : 1. Media alami Tersusun dari bahan-bahan organik (alami). Yang paling banyak digunakan adalah bentuk kultur jaringan pada tumbuhan dan hewan. Contohnya adalah telur sebagai pertumbuhan virus.
3
2. Media sintetik Media sintetik tersusun oleh senyawa kimia, dipergunakan untuk membuat kultur bakteri Clostridium. Contoh: K2HPO4, KH2PO4, NaCl, CaCO3, dll. 3. Media semi sintetik Medianya tersusun dari bermacam-macam campuran bahan alami dan bahan sintetik. (Suriawiria, 2005, 76-77 : 172).
Bahan pembuat medium menjadi padat adalah agar-agar, gelatin atau gel silika. Dan yang paling sering digunakan adalah agar-agar. Bahan utama dari agar-agar adalah galaktan yang merupakan kompleks karbohidrat yang telah diekstraksi dari alga marin genus Gelidium, namun sebagian besar mikroorganisme tidak menggunakannya sebagai bahan makanan, sehingga agar-agar dapat berguna sebagai bahan pemadat. Agar akan o
larut atau mencair bila dipanaskan pada suhu 100 C dan akan tetap berbentuk cair bila o
didingunkan sampai suhu 43 C. Jika gelatin, sekali memadat harus dipanaskan kembali o
sampai kurang lebih 100 C untuk cair kembali. Namun, pada media agar tidak dianjurkan untuk mencair kembali lebih dari dua kali karena akan mengakibatkan hasilnya kurang baik. (Hadioetomo, 1993, 46:163) .
Dalam pembuatan media padat, pada proses pemanasan media cair harus diaduk secara terus-menerus dengan stirrer (pengaduk magnet) yang berfungsi untuk mencegah hangusnya atau meluapnya medium. Pada pembuatan media dengan cawan petri, medium tidak boleh bersuhu terlalu tinggi ketika dituang karena akan mengakibatkan kondensasi air yang berlebihan pada tutup cawan petri dan air akan kembali menetes pada agar yang telah memadat. Pemindahan medium dari tabung reaksi ke cawan petri harus dilakukan secara aseptis untuk mencegah tercemarnya biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu spesies tunggal. (Anonim, 2008)
Pembuatan media agar miring berfungsi untuk mendapatkan permukaan media yang lebih luas sehingga mikroorganisme yang tumbuh bisa lebih banyak dan tersebar.
4
Sedangkan pada agar tegak berfungsi untuk kebutuhan gas dari mikroorganisme. Media agar cawan bertujuan menyediakan permukaan yang luas untuk proses isolasi. Tabung durham berbentuk sama dengan tabung reaksi, tetapi lebih kecil ukurannya dan berfungsi menampung gas yang terbentuk akibat dari metabolisme bakteri yang diuji. Penempatannya harus terendam sempurna dalam media dan tidak boleh ada gelembung udara (Anonim, 2008). Malt Extract Agar (MEA) terdiri dari ekstrak dari malt (gandum) 5,0 gr/liter, pepton
dari soymeal 3,0 gr/liter, agar-agar 15,0 gr/liter. Media ini berguna untuk isolasi, enumerasi dan menumbuhkan fungi dan yeast. Contoh mikroorganismenya ialah Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces uvarum, Candida albicans , dan Aspergillus brasiliensis (Condalab.com, 2011). Nutrient Agar (NA) terdiri dari pepton dari daging
5,0 gr/liter, ekstrak daging 3,0gr/liter, agar-agar 12,0 gr/liter. Media ini digunakan untuk menumbuhkan bakteri (Omalu, 2011).
Lactose Broth (LB) termasuk kedalam medium cair. Medium ini berguna untuk
memperbanyak koliform. Komposisinya adalah ekstrak beef 0,3% yang berfungsi sebagai sumber karbohidrat dan nitrogen yang dibutuhkan bakteri, pepton 0,5% yang berfungsi sebagai sumber protein, nitrogen dan karbohidrat, serta laktosa 0,5% sebagai sumber energi, karbohidrat dan aquades yang merupakan sumber oksigen dan pelarut. (Anonim, 2010). Potato Dextrose Agar (PDA) berguna untuk
menumnuhkan dan
mengidentifikasi yeast dan kapang, juga daoat menumbuhkan fungi (omalu, 2011). Komposisinya yaitu ekstrak kentang 20% sebagai sumber karbohidrat dan glukosa 2% yang baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Media PDA yang digunakan untuk enumerasi yeast dan mold harus dalam keadaan pH yang rendah agar tidak tumbuh bakteri dengan diberi asam atau antibiotik (Condalab.com, 2011)
Pepton Glucose Yeast (PGY) merupakan media sintesis karena terbuat dari bahan kimia
murni dengan konsentrasi yang terukur dan dilarutkan dalam air murni yang berguna untuk menumbuhkan bakteri anaerob. Terbuat dari pepto, glukosa, ekstrak yeast,
5
MgSO4.7H2O, dan KH2PO4. Harus disimpan dalam suhu kamar pada posisi tegak dan terlindung dari cahaya sehingga media dapat hidup hingga 26 minggu sejak tanggal pembuatan. (Anonim, 2001). Media de Mann, Rogosa dan Sharpe (MRS) yang telah dikenalkan pada tahun 1960, media ini berguna untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus. Komposisinya adalah protein dari kasein 10 g/L, ekstrak daging 8,0 g/L, ekstrak ragi 4,0 g/L, D (+) glukosa 20 g/L, magnesium sulfat 0,2 g/L, agar-agar 14 g/L, dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L, tween 80 1,0 g/L, diamonium hidrogen sitrat 2 g/L, natrium asetat, mangan sulfat 0,04 g/L (De Man, et al., 1960).
Sterilisasi adalah suatu proses untuk memusnahkan seluruh organisme yang terdapat pada suatu benda dan juga berarti membebaskan tiap benda dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Mikroorganisme dapat dimatikan setempat oleh panas (kalor), gas (formaldehida, etilen oksida, dan lain-lain), serta oleh sinar ultra atau sinar gamma. Mikroorganise dapat juga disingkirkan dengan cara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi oleh filtrasi. (Irianto, 2006, 75:256)
Tiga cara utama yang umum digunakan dalam proses sterilisasi adalah: 1. Penggunaan panas Terbagi menjadi 2 jenis : a. Sterilisasi panas lembab (sterilisasi basah) o
Menggunakan panas dari uap air jenuh bertekanan pada suhu 121 C selama 15 menit. (Hadioetomo, 1993, 55:163). b. Sterilisasi panas kering (sterilisasi kering) Proses sterilisasi tanpa menggunakan kelembaban. Alat yang digunakan mempunyai suhu oven 160-175ºC selama 10 menit untuk dapat mematikan mikroorganise. Bahan yang biasanya disterilkan dengan cara ini adalah pecah belah, seperti pipet, tabung reaksi, cawan petri dari kaca, botol sampel. (Hadioetomo, 1993, 57:163).
6
2. Penggunaan bahan kimia Sterilisasi ini menggunakan gas atau radiasi. Bahan kimia yang digunakan yaitu etilena oksida, asam perasetat, formaldehida, dan glutaraldehida alkalin. Sterilisasi dengan radiasi dapat menggunakan sinar gama (sinar ultraviolet).
3. Penyaringan (filtrasi) Filtrasi dilakukan pada suhu kamar. Larutan atau suspensi dibebaskan dari semua organisme hidup dengan melewatkannya di saringan dengan ukuran pori (0,45 atau 0,22 m ) sehingga bakteri dan sel yang lebih besar dapat tertahan diatasnya, sedangkan filtratnya ditampung pada wadah yang steril. (Hadioetomo, 1993, 55-58:163).
Sterilisasi kering dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu: a. Pemijaran Diterapkan pada ose ujung-ujung pinset dan sudip (spatula) logam, b. Jilatan api ( flaming) Diterapkan terhadap skalpel, jarum, mulut tabung biakan, kaca objek dan kaca penutup. Benda-benda tersebut dijilatkan pada api bunsen tanpa membiarkannya memijar. Dapat juga dilakukan dengan cara mencelupkan ke dalam spiritus bakar, tetapi cara ini tidak menghasilkan suhu yang tinggi untuk sterilisasi. Biasanya diterapkan pada permukaan baskom dan mortir. c. Tanur Uap Panas ( Hot-Air oven) Sebagian besar sterilisasi kering dilakukan dengan alat ini. Digunakan pada suhu o
160-165 C selama 1 jam. Baik dilakukan untuk alat-alat kering yang terbuat dari kaca, seperti tabung reaksi, pinggan petri, labu, pipet, pinset, skalpel, gunting, kapas hapus tenggorok, alat suntik dari kaca. Masuknya panas ke dalam bahanbahan berjalan lambat, jadi harus disterilkan dalam jumlah sedikit dan dalam lapisan tipis tidak lebih dari 0,5 cm dalam pinggan petri. Kadang-kadang o
dilakukan sterilisasi pada suhu 170 C selama 2 jam. (Irianto, 2006, 86, 256)
7
Sterilisasi basah dilakukan dengan cara-cara sebagai berikut: a. Perebusan dalam air Cara tersebut hanya cukup untuk mematikan mikroorganisme yang tidak berspora. Cara ini tidak menjamin sterilitas, tetapi dianggap cukup memuaskan untuk tujuan sterilitas mutlak tidak esensial dan cara lain pun tidak mungkin dilakukan. b. Uap mengalir Cara ini bebas digunakan dalam tempat yang tidak tertutup rapat yang dapat menahan uap tanpa tekanan. Air mendidih dan uap bebas tidak pernah mencapai o
o
suhu lebih dari 100 C (212 F). Keuntungan dengan cara ini adalah tidak membutuhkan alat yang khusus, tetapi kerugiannya yaitu memakan waktu lama dan dalam beberapa cairan seperti air, sporanya tidak segera tergerminasi dan mungkin saja terbawa spora anaerob yang tidak tumbuh kontak dengan oksigen atmosfer. c. Uap dalam tekanan Cara ini dilakukan dengan autoklaf. Di dalam autoklaf, uapnya dalam keadaan jenuh dan meningkatnya tekanan menyebabkan suhu menjadi lebih tinggi, yaitu o
di bawah tekanan 15 lb (2 atm). Suhunya dapat meningkat sampai 121 C. Bila uapnya bercampur dengan udara sama banyak, pada tekanan yang sama, maka o
suhunya hanya tercapai 110 C. Karena itu udara dalam autoklaf harus dikeluarkan sampai habis untuk memperoleh suhu yang diinginkan. Pada suhu tersebut semua mikroorganisme vegetatif maupun spora dapat mati dalam waktu yang tidak lama, yaitu sekitar 15-20 menit. (Irianto, 2006, 86-87, 256)
Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan autoklaf: 1. Sterilisasi bergantung pada uap, karena itu udara harus dikosongkan dari ruang sterilisator. 2. Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkena uap. 3. Bahan yang berpori atau yang berbentuk cair harus permeable terhadap uap
8
o
4. Suhu yang terukur oleh termometer harus mencapai 121 C selama 15 menit. (Hadioetomo, 1993, 56:163).
Ketika melakukan sterilisasi, cawan petri lazimnya ditempatkan dalam kaleng atau dibungkus kertas, tabung uji dan botol disumbat dengan kapas untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme dalam atmosfir. (Volk & Wheeler, 1993, 39:396). Sterilisasi panas-lembab lebih efektif dan efisien dalam mematikan mikroorganisme karena membutuhkan suhu tidak setinggi metode panas-kering. Volk, W.A. & M.F. Wheeler. (1993)
3.
MATERI DAN METODE
3.1. Materi 3.1.1. Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah rak dan tabung reaksi, tabung durham, cawan petri steril, timbangan analitik, bunsen, korek api, otoklaf, kapas , hot plate, pengaduk magnet ( stirrer ), gelas piala, sendok (plastik untuk MgSO 4.7H2O dan KH2PO4, logam untuk bahan lain), plastik bening, karet gelang, serbet, masker, tatakan untuk membuat agar miring, label, kertas buram, beaker glass, gelas ukur, sarung tangan, dan lap.
3.1.2. Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah Nutrient Agar (NA), Potato Dextrose Agar (PDA), Multi Extract Agar (MEA), Lactose broth (LB), glukosa, pepton, extract yeast , MgSO4.7H2O, Kalium dihidrogen fosfat (KH 2PO4), alkohol, aquades.
3.2. Metode 3.2.1. Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
Sebanyak 4 gram NA ditimbang menggunakan neraca analitik. Kemudian dimasukkan ke dalam gelas piala ( beaker glass) berisi 200 ml aquades dan diaduk rata. Dimasukkan pengaduk magnet ( stirrer ). Lalu larutan dipanaskan menggunakan hot plate dan pemanasan dihentikan setelah seluruh agar larut (ketika larutan sudah menjadi semakin berwarna bening). Larutan lalu dimasukkan ke dalam 5 tabung reaksi masing-masing 5 ml untuk membuat agar miring, kemudian dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi masing-masing 10 ml untuk membuat agar tegak, dan dimasukkan juga ke dalam 13 tabung reaksi masing-masing 10 ml untuk agar cawan. Semua tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang. Cawan petri disiapkan, dibalik, dibungkus
9
10
menggunakan kertas buram dan dimasukkan dalam plastik. Lalu semua tabung reaksi o
dan cawan petri disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121 C (15 lb) selama 15 menit. 5 tabung reaksi yang masing-masing berisi 5 ml media diletakkan pada tatakan untuk membuat agar miring sampai memadat. Kemudian 13 tabung reaksi yang berisi masing-masing 10 ml agar dipindahkan ke dalam cawan petri secara aseptis dan dibiarkan memadat. Dan 3 tabung yang berisi masing-masing 10 ml diletakkan pada rak tabung reaksi untuk membuat agar tegak. Segala proses dilakukan secara aseptis. Agar dibiarkan hingga memadat. 1 hari setelah itu, warna dan wujud diamati.
3.2.2. Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)
1,36 gram PDA ditimbang dan dimasukkan ke dalam gelas piala yang berisi 35 ml aquades. Lalu medium tadi dipanaskan dengan menggunakan hot plate dan diaduk dengan pengaduk magnet ( stirrer ). Setelah semua medium telah larut (ketika larutan sudah menjadi semakin berwarna bening), pemanasan dihentikan, lalu media PDA dimasukkan ke dalam 5 tabung reaksi, masing-masing 5 ml. Selanjutnya mulut tabung ditutup dengan menggunakan kapas agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang. Tabung-tabung reaksi dimasukkan ke o
dalam autoklaf untuk disterilisasi pada suhu 121 C (15 lb) selama 15 menit. 5 tabung reaksi yang masing-masing berisi 5 ml media diletakkan dalam posisi miring hingga memadat. 1 hari setelah itu warna dan wujud agar diamati lalu digambar dan diberi keterangan wujud dan warnanya.
3.2.3. Pembuatan Media Malt Extract Agar (MEA)
1,2 gram MEA ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam gelas piala yang berisi 25 ml aquades. Lalu campuran diaduk rata dan pengaduk magnet ( stirrer ) dimasukkan. Larutan dipanaskan menggunakan hot plate dan pemanasan dihentikan setelah seluruh agar larut (ketika larutan sudah menjadi semakin berwarna bening). Kemudian larutan dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi masing-masing 5 ml. Tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan 0
diikat menggunakan karet gelang. Disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121 C (15 lb) selama 15 menit. Lalu ketiga tabung reaksi yang masing-masing berisi 5 ml
11
media diletakkan pada tatakan untuk membuat agar miring sampai memadat. 1 hari setelah itu, warna dan wujud agar diamati.
3.2.4. Pembuatan Media Pepton Glucose Yeast (PGY)
0,06 gram glukosa, 0,03 gram pepton, 0,03 gram ekstrak yeast, 0,012 gram MgSO4.7H2O, 0,03 gram KH2PO4 ditimbang menggunakan timbangan analitik. Bahan-bahan tersebut dimasukkan ke dalam gelas piala yang berisi 15 ml aquades. Campuran diaduk rata lalu larutan dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi yang masingmasing 5 ml. Tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang. 0
Disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121 C (15 lb) selama 15 menit. Lalu ketiga tabung reaksi yang masing-masing berisi 5 ml media diletakkan pada rak tabung reaksi untuk membuat agar tegak sampai memadat. 1 hari setelah itu, warna dan wujud agar diamati.
3.2.5. Pembuatan Lactose Broth (LB)
7,15 gram LB ditimbang, dimasukkan ke dalam beaker glass berisi 550 ml aquades dan diaduk sampai terbentuk larutan yang homogen. Larutan dimasukkan ke dalam 54 tabung reaksi masing-masing 10 ml untuk membuat agar tegak. Tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang. Disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 0
121 C (15 lb) selama 15 menit kemudian pada tabung reaksi tersebut dimasukkan tabung durham. Lalu 54 tabung reaksi yang masing-masing berisi 10 ml media diletakkan pada rak tabung reaksi untuk membuat agar tegak sampai memadat. 1 hari setelah itu, warna dan wujud agar diamati.
3.2.6. Pembuatan Media Man Rogosa Sharpe (MRS)
2,73 gram MRS ditimbang, dimasukkan ke dalam beaker glass berisi 40 ml aquades. Lalu campuran diaduk rata dan pengaduk magnet ( stirrer ) dimasukkan. Larutan dipanaskan menggunakan hot plate dan pemanasan dihentikan setelah seluruh agar larut (ketika larutan sudah menjadi semakin berwarna bening). Kemudian larutan
12
dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi masing-masing 10 ml. Tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang. Disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 0
121 C (15 lb) selama 15 menit. Lalu ketiga tabung reaksi yang masing-masing berisi 10 ml media diletakkan pada rak tabung reaksi untuk membuat agar tegak sampai memadat. 1 hari setelah itu, warna dan wujud agar diamati
4. HASIL PENGAMATAN
Hasil pengamatan praktikum pembuatan media dan sterilisasi dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Pembuatan Media dan Sterilisasi Kelompok
Jenis Media
D1
PDA
Gambar
Keterangan Warna: kuning bening Wujud: padat
D2
MEA
Warna: orange kekuningan Wujud: padat
D3
LB
Warna: kuning bening Wujud: cair
D4
MRS
Warna: kuning kecoklatan Wujud: padat
D5
NA
Warna: kuning emas Wujud: cair
13
14
Warna: kuning emas Wujud: padat
Warna: kunng bening Wujud: padat
D6
PGY
Warna: bening kekuningan Wujud: cair
Pada kelompok D1 membuat media Potato Dextrose Agar (PDA) berwarna kuning bening dan padat bentuknya dengan tabung yang dimiringkan. Kelompok D2 membuat media MEA yang berwarna orange kekuningan dengan tabung yang juga dimiringkan. Kelompok D3 membuat media LB dengan warna kuning bening dan wujudnya cair dengan tabung reaksi yang ditegakkan dan berisi tabung durham. Kelompok D4 membuat media MRS dengan warna kuning kecoklatan dan wujudnya padat, tabung reaksinya tegak. Kelompok D5 membuat media NA, pada tabung yang miring berwarna kuning emas dan wujudnya cair. Sedangkan pada tabung yang tegak berwarna kuning being dan wujudnya padat. Pada cawan warnanya kuning emas dan padat. Kelompok D6 membuat media PGY yang berwarna bening kekuningan dan wujudnya cair dengan tabung reaksi yang tegak.
5. PEMBAHASAN
Pada praktikum yang telah dilakukan adalah proses sterilisasi menggunakan autoklaf dan pembuatan media. Terdapat enam macam media yang telah kami lakukan yaitu Potato Dextrose Agar (PDA), Malt Extract Agar (MEA), Lactose Broth (LB), de Man Ragosa & Shape (MRS), Nutrient Agar (NA), dan Peptone Glucose Yeast (PGY).
Menurut Suriawiria (2005) media merupakan suatu tempat yang berguna untuk pertumbuhan dan berkembangnya mikroba dan sebelum digunakan media tersebut harus dalam keadaan steril agar tidak ada mikroorganisme lain yang tidak diharapkan tumbuh. Sebelum pembuatan media, kami melakukan sterilisasi pada alat-alat yang akan digunakan seperti cawan petri, dan alat-alat gelas lainnya serta media dengan menggunakan autoklaf yang dapat mematikan mikroorganisme dengan panas (kalor).
Berdasarkan teori Hadioetomo (1993), autoklaf termasuk sterilisasi panas lembab (sterilisasi basah) dengan menggunakan panas dari uap air jenuh yang bertekanan pada o
o
suhu 121 C selama 15 menit. Agar suhunya dapat meningkat sampai 121 C, udara autoklaf kami keluarkan sampai habis dan supaya tekanannya tidak dibawah 15 lb (2 atm) sehingga semua mikroorganisme vegetatif maupun spora dapat mati dalam waktu sekitar 15 menit. Hal tersebut sesuai dengan teori dari Irianto (2006).
Pada pembuatan media ketika proses pemanasan kami aduk terus menerus dengan menggunakan pengaduk magnet ( stirrer ) yang menurut Anonim (2008) bertujuan mencegah hangusnya atau meluapnya medium yang kami panaskan. Dan saat pembuatan media padat di cawan petri, medium yang akan kami tuangkan kami diamkan sebentar agar medium tersebut suhunya tidak terlalu tinggi karena menurut Anonim (2008) hal tersebut harus dilakukan agar tidak terjadi kondensasi air pada tutup cawan petri sehingga dapat terhindarkan dari menetesnya air di permukaan agar yang memadat.
15
16
Dalam pembuatan media juga kami melakukannya dalam kondisi yang aseptis dengan cara menyemprot tangan dan sekeliling udara serta meja dengan alkohol. Pemindahan dari tabung reaksi ke cawan petri dan tabung reaksi lain pun berada di dekat bunsen yang menurut Anonim (2008) untuk mencegah tercemarnya biakan murni. Jarum ose juga kami sterilkan dengan sterilisasi kering berupa pemijaran yaitu dengan memanaskan jarum ose di atas bunsen sampai memijar kemerahan yang sesuai dengan pendapat Irianto (2006).
Ketika melakukan sterilisasi pada media sebelum dimasukkan ke dalam autoklaf, kami membungkus cawan petri dengan kertas dan tabung uji disumbat dengan kapas dan dibungkus rapat dengan plastik. Menurut Volk & Wheeler (1993) hal tersebut harus dilakukan untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme dalam atmosfir dan sterilisasi panas-lembab seperti autoklaf lebih efektif dan efisien dalam mematikan mikroorganisme karena tidak membutuhkan suhu setinggi metode panas-kering.
5.1. Pembuatan Media Nutrient Agar (NA)
Menurut Omalu (2011) komposisi dari NA adalah pepton dari daging 5,0 gram/liter, ekstrak daging 3,0 gram/liter, agar-agar 12,0 gram/liter. Media ini digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Langkah untuk membuat media NA adalah dimulai dengan menimbang NA bubuk sebanyak 4 gram lalu dimasukkan ke dalam aquades 200 ml dan diaduk rata. Kemudian dimasukkan stirrer guna mencegah hangusnya dan meluapnya larutan kemudian dipanaskan di atas hot plate hingga larutan berwarna jernih. Lalu larutan tersebut dimasukkan ke dalam 5 tabung reaksi berisi masing-masing 5 ml, 3 tabung reaksi masing-masing 10 ml, dan 13 tabung reaksi dengan masing-masing 10 ml. Tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme lain yang tidak diharapkan sesuai dengan teori Volk
17
& Wheeler (1993). Seluruh tabung reaksi tersebut dimasukkan ke dalam autoklaf untuk o
disterilisasikan selama 15 menit pada suhu 121 C. Setelah proses sterilisasi, 5 tabung yang berisi 5 ml larutan dibuat agar miring dan setelah dingin berwarna kuning emas dan berbentuk cair, sedangkan 3 tabung yang berisi 10 ml larutan dibuat agar tegak setelah dingin berwarna kuning bening dan wujudnya padat. Menurut Anonim (2008) pembuatan agar miring bertujuan untuk mendapatkan media yang lebih luas sehingga mikroorganisme yang diharapkan tumbuh dapat lebih banyak dan menyebar, sedangkan pada agar tegak bertujuan dalam kebutuhan gas dari mikroorganisme. Kemudian 13 tabung reaksi yang berisi 10 ml, dipindahkan ke dalam cawan petri secara aseptis untuk mencegah kontaminasi dari mikroorganisme lain yang tidak diinginkan dan hal tersebut sesuai dengan teori Anonim (2008). Setelah dingin warna dari media adalah kuning emas dan wujudnya padat. Sesuai dengan pendapat Hadioetomo (1993), pembuatan media menggunakan NA termasuk dalam medium padat yang berguna untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan, sehingga koloninya dapat dihitung, diamati, dan diisolasi.
5.2. Pembuatan Media Potato Dextrose Agar (PDA)
Komposisi dari PDA adalah ekstrak kentang 20 % sebagai sumber karbohidrat dan glukosa 2 % yang baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk petumbuhan bakteri. Media PDA yang digunakan untuk enumerasi yeast dan mold harus dalam keadaan PH yang rendah agar tidak tumbuh bakteri dengan pemberian asam atau antibiotik (Condalab.com, 2011). Cara pembuatan media ini adalah menimbang PDA bubuk yang berwarna kuning sebanyak 1,36 gram lalu dimasukkan ke dalam aquades 35 ml dan diaduk rata. Kemudian dimasukkan stirrer guna mencegah hangusnya dan meluapnya larutan kemudian dipanaskan di atas hot plate hingga larutan berwarna jernih. Lalu larutan tersebut dimasukkan ke dalam 5 tabung reaksi berisi masing-masing 5 ml. Tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme lain yang tidak diharapkan sesuai dengan teori Volk & Wheeler (1993). Seluruh tabung reaksi tersebut dimasukkan ke
18
o
dalam autoklaf untuk disterilisasikan selama 15 menit pada suhu 121 C. Kemudian setelah selesai sterilisasi, tabung reaksi tersebut diletakkan miring di atas tat akan karena akan dibuat agar miring yang bertujuan supaya permukaan agar lebih luas sehingga mikroorganisme yang diharapkan tumbuh dapat lebih banyak dan menyebar (Anonim, 2008). Setelah dingin warna dari media PDA adalah kuning bening dan wujudnya padat. Menurut Omalu (2011), Potato Dextrose Agar berguna untuk menumbuhkan dan mengidentifikasi yeast dan kapang, juga dapat menumbuhkan fungi.
5.3. Pembuatan Media Malt Extract Agar (MEA)
Komposisi dari MEA adalah ekstrak dari malt (gandum) 5,0 gram/liter, pepton dari soymeal 3,0 gram/liter, agar-agar 15,0 gram/liter (Condalab.com, 2011). Langkah
pembuatannya adalah menimbang MEA yang berwarna kuning oranye karena berasal dari ganggang merah sebanyak 1,2 gram lalu dimasukkan ke dalam aquades 25 ml dan diaduk rata. Kemudian dimasukkan stirrer guna mencegah hangusnya dan meluapnya larutan kemudian dipanaskan di atas hot plate hingga larutan berwarna jernih. Lalu larutan tersebut dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi berisi masing-masing 5 ml. Tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme lain yang tidak diharapkan sesuai dengan teori Volk & Wheeler (1993). Seluruh tabung reaksi tersebut dimasukkan ke dalam autoklaf untuk o
disterilisasikan selama 15 menit pada suhu 121 C. Kemudian setelah selesai sterilisasi, tabung reaksi tersebut diletakkan miring di atas tatakan karena akan dibuat agar miring yang bertujuan supaya permukaan agar lebih luas sehingga mikroorganisme yang diharapkan tumbuh dapat lebih banyak dan menyebar (Anonim, 2008). Setelah dingin warna dari media adalah orange kekuningan dan wujudnya padat. Media ini berguna untuk isolasi, enumerasi dan menumbuhkan fungi dan yeast. Contoh dari mikroorganismenya adalah
Saccharomyces
cerevisiae,
Saccharomyces
Candida albicans, dan Aspergillus brasiliensis (Condalab.com, 2011)
uvarum,
19
5.4. Pembuatan Media Pepton Glucose Yeast (PGY)
Komposisi dari PGY adalah 0,03 gram pepton; 0,06 gram glukosa; 0,03 gram ekstrak yeast; 0,012 gram MgSO 4.7H2O dan 0,03 gram KH 2PO4. Cara pembuatannya adalah bahan-bahan
tersebut
ditimbang
menggunakan
timbangan
analitik.
Kemudian
dimasukkan ke dalam gelas piala yang berisi 15 ml aquades. Campuran diaduk rata lalu larutan dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi yang masing-masing 5 ml. Tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme lain yang tidak diharapkan sesuai dengan teori Volk & Wheeler 0
(1993). Disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121 C (15 lb) selama 15 menit. Setelah itu tabung reaksi tersebut ditegakkan di rak tabung reaksi. Setelah dingin warna PGY adalah bening kekuningan dan wujudnya cair. Menurut Anonim (2001), PGY harus disimpan dalam suhu kamar pada posisi tegak dan terlindung dari cahaya sehingga media dapat hidup hingga 26 minggu sejak tanggal pembuatan. Dan Pepton Glucose Yeast (PGY) merupakan media sintesis karena terbuat dari bahan kimia murni
dengan konsentrasi yang terukur dan dilarutkan dalam air murni yang berguna untuk menumbuhkan bakteri anaerob.
5.5. Pembuatan Lactose Broth (LB)
Menurut Anonim (2010) komposisi dari LB adalah ekstrak beef 0,3% yang berfungsi sebagai sumber karbohidrat dan nitrogen yang dibutuhkan bakteri, pepton 0,5% yang berfungsi sebagai sumber protein, nitrogen dan karbohidrat, serta laktosa 0,5% sebagai sumber energi, karbohidrat dan aquades yang merupakan sumber oksigen dan pelarut. Langkah-langkah pembuatannya adalah dengan menimbang LB sebanyak 7,15 gram dan dilarutkan ke dalam 550 ml aquades. Lau dimasukkan ke 54 tabung reaksi yang berisi masing-masing 10 ml. Lalu ditutup dengan kapas dan dibungkus menggunakan plastik lalu diikat dengan karet untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme lain
20
yang tidak diharapkan sesuai dengan teori Volk & Wheeler (1993). Kemudian disterilisasi di autoklaf pada suhu 121°C, tekanan 15 lb, selama 15 menit. Selesai sterilisasi, dimasukkan tabung durham ke dalam tabung reaksi yang berfungsi menampung gas yang terbentuk dari metabolisme bakteri yang diuji. Tabung durham harus terendam sempurna tidak boleh ada gelembung udara didalamnya (Anonim, 2008). Setelah dingin, warna dari LB kuning bening dan wujudnya cair. Menurut Anonim (2010), Lactose Broth (LB) termasuk kedalam medium cair. Medium ini berguna untuk memperbanyak koliform. Dan didukung dengan teori Hadioetomo (1993) yaitu medium cair berguna untuk pembiakan organisme dalam jumlah yang besar, fermentasi, dan uji-uji yang lain.
5.6. Pembuatan Media de Man Rogosa Sharpe (MRS)
Pada pembuatan MRS, komposisinya adalah protein dari kasein 10 g/L, ekstrak daging 8,0 g/L, ekstrak ragi 4,0 g/L, D (+) glukosa 20 g/L, magnesium sulfat 0,2 g/L, agar-agar 14 g/L, dipotassium hidrogen phosphate 2 g/L, tween 80 1,0 g/L, diamonium hidrogen sitrat 2 g/L, natrium asetat, mangan sulfat 0,04 g/L (De Man, et al., 1960). Langkah pembuatannya adalah dengan menimbang 2,73 gram MRS lalu dilarutkan ke dalam aquades 40 ml. Kemudian dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi yang masing-masing 10 ml. Tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat menggunakan karet gelang untuk mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme lain yang tidak diharapkan sesuai dengan teori Volk 0
& Wheeler (1993). Disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121 C (15 lb) selama 15 menit. Setelah itu tabung reaksi tersebut ditegakkan di rak tabung reaksi. Setelah itu tabung reaksi tersebut ditegakkan di rak tabung reaksi. Saat dingin, warna dari MRS adalah kuning kecoklatan dan wujudnya padat. Media de Mann, Rogosa dan Sharpe (MRS) yang telah dikenalkan pada tahun 1960, media ini berguna untuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus.
6. KESIMPULAN
Sterilisasi adalah suatu proses untuk memusnahkan semua mikroorganisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda.
Media adalah suatu tempat yang berguna untuk pertumbuhan dan berkembangnya mikroba.
Tipe-tipe medium adalah medium serbaguna, medium selektif dan medium diferensial.
Mecam medium berdasarkan konsistensinya adalah medium cair, medium setengah padat, dan medium padat.
Media MEA berguna untuk isolasi, enumerasi dan menumbuhkan fungi dan yeast.
Media LB berguna untuk menumbuhkan bakteri untuk pembiakan organisme dalam jumlah yang besar, fermentasi, dan uji-uji yang lain.
Media PDA berguna untuk menumbuhkan dan mengidentifikasi yeast dan kapang.
Media PGY berguna untuk menumbuhkan bakteri anaerob.
Media MRS berguna ntuk memperkaya, menumbuhkan, dan mengisolasi jenis Lactobacillus.
Media NA berguna untuk menumbuhkan bakteri.
Pembuatan media agar miring berfungsi untuk mendapatkan permukaan media yang lebih luas sehingga mikroorganisme yang tumbuh bisa lebih banyak dan tersebar.
Pembuatan media agar tegak berfungsi untuk kebutuhan gas dari mikroorganisme.
Media agar cawan bertujuan menyediakan permukaan yang luas untuk proses isolasi.
Tabung durham berfungsi menampung gas yang terbentuk akibat dari metabolisme bakteri yang diuji.
21
22
Stirrer (pengaduk magnet) berfungsi untuk mencegah hangusnya atau
meluapnya medium
Autoklaf termasuk sterilisasi panas lembab.
Autoklaf menggunakan panas dari uap air jenuh bertekanan 15 lb, pada suhu o
121 C selama 15 menit.
Mulut tabung reaksi yang berisi media harus disumpal dengan kapas dan dibungkus dengan plastik agar terhindar dari kontaminasi.
Semarang, 20 Mei 2011 Praktikan,
Adelia Arie Pradita 10.70.0145
Asisten Dosen : - Christina Vania U. - Maria Rosalia - Pricillia Gunawan
7. DAFTAR PUSTAKA
Anonim. (2010). Sterilisasi Media Kultur. http://fpk.unair.ac.id/webo/kuliahpdf/sterilisasi-2010%20%5BCompatibility%20Mode%5D.pdf. Universitas Airlangga. Surabaya. Diakses tanggal 15 Mei 2011.
Anonim. (2001). Peptone Yeast Glucose Broth. http://www.dalynn.com/docs/AN1045.pdf. Research Dalynn Biologycal. Diakses 15 Mei 2011.
Anonim. (2008). Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar. http://www.freewebs.com/mikrodas/PETUNJUK%20PRAKTIKUM.pdf. Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi. Universitas Jenderal Soedirman. Purwokerto. Diakses tanggal 15 Mei 2011.
Condalab.com. (2011). www.condalab.com/pdf/1022.pdf . Malt Extract Agar. Research Laboratorios Conda, S.A. Diakses 15 Mei 2011.
Condalab.com. (2011). www.condalab.com/pdf/1022.pdf . Potato Dextrose Agar (European Pharmacopoeia). Research Laboratorios Conda, S.A . Diakses 15 Mei 2011.
De man, J.C, Ragosa, M. & Sharpe, M.E. (1960). A Medium for The Cultivation of Lactobacilli. http://132.248.9.1:8991/hevila/pdfariel/A%20medium%20for%20the%20cultivation%20of%20Lactobacilli.pdf. Jurnal J. appl. Bact. 23 (1), 130-135. Diakses 15 Mei 2011.
Hadioetomo, R. S. (1993). Mikrobiologi Dasar dalam Pr aktek. Gramedia. Jakarta.
Irianto, K. (2006). Mikrobiologi : Menguak Dunia Mikroorganisme Jilid I. CV. Yrama Widya. Bandung.
23
24
Omalu, C. J., V. A. Ayanwale, A. B. Ajalaruru, A. Z. Mohammed, J. D. Bala & V. Chukwuemeka. (2011). Isolation Of Fungi And Bacteria From Housefly (Musca Domestica L.) Larvae .http://www.ispub.com/journal/the_internet_journal_of_microbiology/volume_9_numbe r_1_19/article_printable/isolation-of-fungi-and-bacteria-from-housefly-muscadomestica-l-larvae.html. The Internet Journal of Microbiology 2010 : Volume 9 Number 1. Diakses 15 Mei 2011.
Suriawiria, Unus. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Papas Sinar Sinanti.
Volk, W. A. & M. F. Wheeler. (1993). Mikrobiologi Dasar. Erlangga. Jakarta.
8. LAMPIRAN 8.1. LAPORAN SEMENTARA
