UD 7.2: OTROS MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS DE ANÁLISIS. Espectroscopia de luminiscenica molecular 1. Introducción 2. Espectrometría de fluorescencia molecular a. Fundamento b. Relación entre intensidad de fluorescencia y concentración concentración c. Factores que afectan a las mediciones mediciones fluorimétricas fluorimétricas d. Instrumentación e. Aplicaciones clínicas 3. Espectrometría de quimioluminiscencia molecular a. Fundamento b. Factores que afectan a las mediciones de quimioluminiscencia quimioluminiscencia c. Instrumentación d. Aplicaciones clínicas 1.
Introducción
La luminiscencia es un fenómeno de emisión de luz debido a un proceso de relajación de un estado excitado a un estado de menor energía (generalmente el estado fundamental) La espectrometría de luminiscencia molecular (ELM) se basa en la medida de la luz emitida por moléculas. Para que las moléculas pasen a un estado excitado será necesario aportarles energía y dependiendo de la fuente de energía que utilicemos para la excitación distinguimos dos tipos de fenómenos luminiscentes: •
Fotoluminiscencia.- Cuando la fuente de energía de excitación es una radiación luminosa (luz). Son fenómenos de este tipo: La fluorescencia o La fosforescencia o La diferencia entre fluorescencia y fosforescencia es que la primera cesa rápidamente, la luz tiene una vida muy corta (es menor de 10 -5 segundos), es instantánea, mientras que la fosforescencia se mantiene durante un tiempo mayor tras haber cesado la radiación, este tiempo es mayor de 10 -4 segundos o generalmente 10 segundos o incluso puede durar horas. o
Quimiloluminiscencia.- La energía de excitación es aportada por una reacción química. Cuando la quimioluminiscencia tiene lugar en seres vivos se denomina bioluminiscencia.
2. Espectrometría de fluorescencia molecular 2.1. Fundamento
La fluorescencia y fosforescencia son dos formas de luminiscencia que tienen lugar cuando una molécula (o átomo) absorbe energía luminosa de una determinada longitud de onda y cuando vuelve a su estado fundamental reemite esa energía en forma de luz. La radiación de fluorescencia puede ser de la misma longitud de onda que la radiación de excitación, en este caso se denomina fluorescencia resonante o puede ser que la longitud de onda sea mayor que la radiación de excitación y en este caso se llama fluorescencia no resonante. Esta última es la que se produce con mayor frecuencia en
moléculas. A este desplazamiento de la longitud de onda de emisión respecto a la de absorción se denomina desplazamiento de Stokes. La energía absorbida por las moléculas además de ser emitida como energía radiante, energía luminosa, puede ser liberada en forma de calor. La competencia entre otras formas de desexcitación y la emisión de energía radiante es la que va a determinar que una molécula sea fluorescente o no. Experimentalmente se ha observado que no todos los fotones absorbidos son emitidos como fluorescencia. Con el fin de relacionar la intensidad de la radiación emitida con la intensidad de la radiación absorbida, se ha definido una constante, ϕ, que se denomina rendimiento cuántico o eficacia cuántica y relaciona el número de moléculas que emiten fluorescencia con el número de moléculas excitadas o lo que es lo mismo, la intensidad de radiación emitida en relación con el número de fotones absorbidos. ϕ =
I F I Ab
El rendimiento cuántico puede tomar valores entre 0 y 1. Aquellas moléculas que presentan una alta fluorescencia tienen una eficacia cuántica próxima a 1, mientras que aquellos que no tienen una fluorescencia apreciable se aproximan a 0. Para que una molécula sea fluorescente debe poseer grupos funcionales capaces de absorber radiación luminosa y además esos grupos deberán ser capaces de emitir luz cuando se produce la desexcitación. A estos grupos funcionales se les denomina fluorocromos o fluoróforos (en general se denomina así a las moléculas que poseen fluorescencia) Los grupos funcionales que proporcionan una mayor intensidad fluorescente son los aromáticos, pero si existen sustituciones en los anillos aromáticos la fluorescencia puede desaparecer. También, moléculas que no son fluorescentes, a través de determinadas reacciones químicas pueden volverse intensamente fluorescentes. La fluorescencia también va a depender de la longitud de onda de la radiación de excitación, en general son mucho más eficaces las radiaciones U.V. con longitudes de onda de excitación superiores a 250 nm.
2.2. Relación de la concentración con la intensidad de la fluorescencia Con intención de poder determinar concentraciones desconocidas, habrá que encontrar una relación entre la intensidad de la radiación fluorescente emitida por una determinada sustancia y la concentración de ésta. La intensidad de la emisión fluorescente es proporcional a la intensidad de la radiación absorbida. IF = ϕ (Io – It) Donde Io es la intensidad de la luz incidente (excitadora) e I t la intensidad de la luz transmitida. Siendo Ø un factor de proporcionalidad que suele llamarse rendimiento cuántico . Por otra parte, tengamos en cuenta la ley de Lambert-Beer, ya vista, es decir A=ε × b × c ;
LogT = ε × b × c
−
−
Log
I t I o
I t
= ε ×
I o
= 10
I t
=
I F
=Φ
I F
=
b c
−ε × ×
I 0 × 10
Φ
b × c ; donde la fracción de luz transmitida es:
− ε ×b×c
; sustituyendo en la primera ecuación considerada, obtenemos:
( I − ( I 0
o × 10
I 0 (1 − 10
×
b c
− ε × ×
b c
− ε × ×
))
)
I F = Φ × I 0 × 2,3 × ε × b × c Si consideramos que Io se mantiene constante a lo largo de toda la prueba y agrupamos esta última junto con las constantes Φ, ε y b, podremos concluir diciendo que: I F
=
K × c
Esto sólo se cumple cuando las muestras son soluciones muy diluidas en las que la intensidad absorbida es inferior a un 2 % de la intensidad inicial de la radiación.
2.3. Factores que afectan a las mediciones fluorométricas - Estructura de la molécula .- Empíricamente se encuentra que la fluorescencia está particularmente favorecida en moléculas que poseen estructuras rígidas. Generalmente son compuestos heterocíclicos o hidrocarbonos poliarómaticos. - Concentración.- Cuando hay una concentración alta se producen dos fenómenos: Autoabsorción.- Se produce cuando las longitudes de onda de o emisión y excitación están muy próximas. Cuanto mayor concentración, mayor será la autoabsorción. Autoamortiguación.- Es debido a que con una mayor concentración o es más probable que la desexcitación no sea radiante porque al haber
-
-
muchas más moléculas hay muchas más colisiones y se va a incrementar el calor (se desexcitan más por calor y no por la radiación fluorescente). Temperatura .- En general a mayor temperatura menor intensidad de fluorescencia. pH.- Pequeñas variaciones del pH pueden modificar de manera importante la intensidad de la fluorescencia. Disolvente.- Al disminuir la viscosidad del disolvente va a disminuir la intensidad de fluorescencia porque disminuye el Ф. Además la presencia de ciertos iones como cloro, bromo, yodo en el disolvente van modificar de manera apreciable la intensidad de fluorescencia. También la presencia de moléculas que absorben en las longitudes de onda de excitación modificará la intensidad de fluorescencia. Dispersión de la radiación.- la radiación dispersada va a producir un ruido de fondo. Fotodescomposición.- Se refiere a la descomposición de la muestra por la luz que incide sobre ella.
2.4.
Instrumentación Los
instrumentos se denominan fluorímetros o espectrofluorímetros. Se diferencian en que el fluorímetro emplea filtros y el espectrofluorímetro monocromadores. Los componentes de estos instrumentos, son los siguientes: •
Fuente de energía radiante .- Deben de proporcionar una intensidad grande. Los más utilizados son: Las lámparas de arco de mercurio de baja presión. o Las lámparas de arco de Xenón de alta presión. o Y en algunos casos láseres o
•
•
•
Sistemas de selectores de longitud de onda .- Situados uno antes de la muestra y otro después. Pueden ser filtros de interferencia o absorción en los fluorímetros o monocromadores de red en los espectrofluorímetros. El selector de emisión y el detector se encuentra formando un ángulo con el haz inicial (de excitación), para evitar que la luz procedente de la fuente llegue al detector. Generalmente este ángulo es de 90 º. Será necesario seleccionar la longitud de onda de máxima absorción con el selector primario y la longitud de onda de máxima fluorescencia con el secundario. Compartimiento para la muestra .- Pueden ser cubetas rectangulares o cilíndricas, pueden ser de vidrio, cuarzo o sílice fundido (vidrio → visible, cuarzo y sílice → UV). Detector.- Los más utilizados son tubos fotomultiplicadores. También se pueden utilizar detectores de diodos en serie.
Hay fluorímetros y espectrofluorímetros de haz simple y de doble haz. En los de doble haz, el haz de radiación pasa alternativamente por la muestra y por la cubeta de referencia. Las medidas de fluorescencia están sometidas a múltiples variables y es muy difícil que en el mismo instrumento nos de la misma medida de una solución de una concentración determinada de un día para otro. Hay que calibrarlos con mucha frecuencia y se realiza la calibración con una disolución de un fluoróforo estable de concentración conocida para las longitudes de onda de emisión o excitación que se utilicen. Con este tipo de patrón ajustamos el aparato a un valor de sensibilidad determinado y las medidas de la intensidad se harán con relación a este patrón.
2.5. Aplicaciones clínicas Métodos fluorimétricos: Las ventajas que tienen son que es mucho más sensible y las desventajas son que es menos preciso y menos exacto. En general se utiliza para determinar sustancias que se encuentran en concentraciones mínimas en líquidos biológicos (enzimas, hormonas, fármacos, vitaminas, etc). Casi todas estas determinaciones se realizan por fluoroinmunoanálisis. Métodos fosforimétricos: Se emplean en la determinación de ácidos nucleicos, aminoácidos, enzimas, etc. Se emplea menos que la fluorimetría. Ambas técnicas se utilizan como detectores de los componentes luminiscentes del eluido de una columna cromatográfica de HPLC o de electroforesis capilar.
3. Espectroscopia de quimioluminiscencia molecular 3.1.
Fundamento
Se produce cuando por medio de una reacción química se genera un producto intermedio o final excitado que al volver al estado fundamental emite luz. La reacción más sencilla sería:
A + B → C * + D
C * → C + h × U
Generalmente las reacciones que se producen son mucho más complejas. C+E → F*+G
A+B → C+D F* → F+ h x υ
La intensidad de la radiación emitida (que se mide en fotones por segundo, depende de la velocidad de la reacción y de la eficacia cuántica o del rendimiento cuántico que se refiere al número de fotones emitidos por molécula que reacciona. Generalmente los valores de rendimiento cuántico de las sustancias quimioluminiscentes que se utilizan en análisis están entre 0,01-0,2. I cl
= Фcl ×
d c
d c
d t
d t
→
Velocidad de reacción
Фcl → Re n dim iento cuántico
En las reacciones quimioluminescentes generalmente la luz emitida aumenta rápidamente tras la mezcla de los reactivos, llegando a un máximo, para después comenzar a disminuir.
Las medidas generalmente se efectúan en la parte descendente de la curva. Las medidas se pueden efectuar de dos formas: • Medir la intensidad total en un período de tiempo determinado. • Medición instantánea tras haber transcurrido un tiempo tras la incubación. Los componentes quimioluminiscentes más utilizados son: Luminol y sus derivados • Ester de Acridinio • Esteres de oxalato • Lucigenina • También se pueden utilizar algunos marcadores bioluminiscentes (NAD+/NADH; FMN/FMNH2, etc.).
3.2. Factores que afectan a la quimioluminiscencia 1. Luz ambiental.- Debe estar cerrado herméticamente para evitar que entre la luz. 2. Que existan en la muestra otras sustancias que absorban o que emitan luz. 3. La temperatura, el pH del medio y también que exista en la muestra otros componentes que reaccionan directamente en la reacción de quimioluminiscencia. 4. Concentración elevada de sales y tampones, sobre todo en el caso de las enzimas de los marcadores bioluminiscentes porque se puede inhibir la reacción enzimática.
3.3 Instrumentación Consta de: • • •
Una cubeta de reacción adecuada. Detector.- Tubos fotomultiplicadores. Sistema de lectura.
A estos aparatos se les suele llamar luminómetros. En las medidas de quimioluminiscencia es muy importante el tiempo de mezcla de los reactivos que debe de ser instantáneo, para obtener resultados repetibles.
3.4. Aplicaciones clínicas En bioquímica clínica tienen utilidad para la determinación de hormonas, drogas terapéuticas y de abuso, marcadores tumorales, etc. Parte de estos análisis se realizan por una combinación de quimioluminiscencia y técnicas inmunológicas.
