METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ (HPLC) HPLC este cea mai extinsă metodă cromatografică utilizată pentru analiza analiţilor compuşi biologic activi, fiecare clasă a acestora fiind testată separat. Spre deosebire de tehnica LC-MS, nu oferă o certitudine 100% cu privire la identificarea analiţilor. Principiul cromatografiei lichide Spre deosebire de cromatografia de gaze în care faza mobilă joacă doar rolul de “cărăuş” în transportul componenţilor prin coloană, în cazul cromatografiei de lichide, faza mobilă participă alături de faza staţionară la procesul de separare prin interacţiuni selective mult mai complexe (Gocan, 2002). Cromatografia lichidă se subclasifică după tipul suportului, în cromatografie cu fază normală (NP-HPLC) şi inversă (RP-HPLC). Sistemele NP-HPLC utilizează o fază staţionară polară (silicagel, alumină, celuloză, Ca(OH)2, MgCO3 ), o fază mobilă nepolară (eter de petrol, hexan puri sau în amestec cu acetonă 1-15%), separarea având la bază adsorbţia diferită a componentelor amestecului pe faza staţionară. Se adresează probelor preponderent nepolare, ordinea de eluţie (caracterizată de timpul de retenţie, tR, al probei pe coloană, exprimat în minute) a componentelor amestecului fiind : tR componente nepolare < tR componente polare În sistemele RP-HPLC, faza staţionară devine nepolară prin legare chimică de octadecilsilan (C18) sau octasilan (C8), ca fază mobilă se folosesc amestecuri de solvenţi polari (acetonitril, metanol, acetat de etil, apă), iar procesul de separare are la bază repartiţia componentelor amestecului între faza staţionară şi eluent. Este indicat în cazul probelor preponderent polare, ordinea de eluţie fiind: tR componente polare < tR componente nepolare (Socaciu, 1997). În prezent, peste 60% din totalul separărilor se realizează prin cromatografia cu fază inversă. Popularitatea acestei tehnici rezidă în faptul că prezintă o universalitate în separarea unor compuşi nepolari, polari şi ionici, incluzând un larg domeniu de mase moleculare şi faptul că optimizarea separărilor se realizează relativ uşor (Gocan, 2002).
După mecanismul de separare, cromatografia poate fi: de absorbţie, de repartiţie lichid-lichid, de schimb ionic, de excluziune sterică (gel-cromatografia) sau de afinitate (interacţiuni hidrofobe, separări chirale). Principalele tipuri de tehnici cromatografice, în funcţie de mecanism, fază staţionară şi mobilă sunt redate în tabelul 1. Tabel 1 Principalele tipuri de tehnici cromatografice Mecanism 1. Adsorbţie* (CA)
de lichide
Cromatografia gazoasă
Faza mobilă
S1, NP-HPLC
Solvenţi preponderent
Si-C8,Si-C18,RP-
nepolari Solvenţi preponderent
3.Schimb ionic (CSI)
HPLC Schimbători de ioni2
polari Soluţii acizi-baze
4. Excluziune sterică *** 5.Afinitate** şi
Geluri3(CES) Geluri şi
Soluţii tampon4 Soluţii tampon4
Interacţiuni hidrofobe 1. Adsorbţie
Hidroxilapatită Oţel sau răşini (GSC) Ar, He, N2 + H2
2. Repartiţie
Uleiuri(GLC)
**
Cromatografia
Faza staţionară
2.Repartiţie LL (CR) ***
Ar, He, N2 + H2
* Efectuată pe hârtie (CH), strat subţire (CSS), coloană deschisă (CC) şi coloană închisă (HPLC) ** Efectuată pe strat subţire (CSS) sau pe coloană deschisă (CC) şi închisă de oţel (HPLC) *** Efectuată pe coloană deschisă sau închisă de sticlă la presiuni joase (LPLC- Low pressure liquid chromatography) 1
Vezi faze staţionare
2
răşini schimbătoare de ioni de tip Amberlit, Doriex
3
geluri de tip Sephadex (G50, G100, G200), Sephacryl, cu pori controlaţi
Sursa: Socaciu, 1997 Părţile componente ale unui cromatograf de lichide de înaltă performanţă sunt: pompele ataşate la un rezervor de unde preiau eluentul (faza mobilă), un injector manual sau un autosampler, cuptorul termostatat în interiorul căruia se află coloana cromatografică de separare, degazorul, controller-ul, detectorul şi instrumentul de înregistrare a semnalului furnizat de detector (fig.1).
Fig. 1. Schema generală a unui HPLC
Coloana cromatografică este componenta cea mai importantă a cromatografului, deoarece aici este sediul procesului de separare. Eluentul, împreună cu substanţa lichidă de analizat este pompat în coloana ce conţine faza staţionară. Are loc migrarea, cu viteze diferite, a componenţilor amestecului de separat de-a lungul coloanei. La ieşirea din coloană, detectorul preia continuu fluxul de solvent conţinând componentele separate şi transformă semnalul chimic în semnal electric, înregistrat sub forma unei cromatograme (fig. 2). Aria corespunzătoare unui semnal cromatografic este proporţională cu concentraţia substanţei pe care acesta o determină şi această arie se poate măsura cu un integrator, sau cu un computer. Maximele înregistrate deasupra liniei de bază în cromatogramă poartă numele de picuri şi au forma distribuţiei normale Gauss (Socaciu, 1997).
Absorbanta/Absorbance (mAU)
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0 10
15
20
25
30
Timp de retentie/Retention time (min)
Fig. 2. Cromatograma unui amestec de compuşi analizaţi prin tehnica HPLC
În cazul unor amestecuri complexe, atât ca număr de componenţi, cât mai ales ca proprietăţi diferite ale acestora, separarea în condiţii izocratice, care implică o singură fază mobilă, este imposibilă. În aceste situaţii se apelează la eluţia cu gradient, în care se modifică faza mobilă în timp, după un anumit program. Acest lucru se realizează prin amestecarea a doi, trei sau chiar patru solvenţi, pentru a obţine un gradient de un anumit profil (Gocan, 2002). Tehnici de extracţie
Tehnica HPLC presupune o etapă de prelucrare a probei în care se realizează extracţia şi curăţarea matricei, urmată de analiza propriu-zisă, în care analitii vor fi separaţi şi cuantificaţi. Pentru extracţia analiţilor de interes din matrice se folosesc tehnicile LLE (extracţie lichid-lichid), SPE (extracţie în fază solidă) sau SFE (extracţie cu fluide supercritice).
Primele două sunt cel mai frecvent folosite. Întrucât SFE necesită echipament specializat, nu şi-a găsit aplicaţii foarte largi. O importanţă deosebită prezintă alegerea solventului utilizat în extracţia analitului. În acest sens, se va ţine seama de proprietăţile termodinamice ale solventului şi solvatului: polaritate, interacţiuni dipol-dipol, calităţi donoare sau acceptoare de H+, precum şi de observaţiile analistului din practica experimentală. Alternanţa pH-ului are un efect dramatic asupra solubilităţii compuşilor ionizabili. Se ştie că compuşii ionizaţi sunt mult mai solubili in solvenţi polari (în special soluţii apoase) decât compuşii neionizaţi (Fedeniuk şi Shand, 1998). Metodologia LLE constă în amestecarea a două faze nemiscibile (de obicei una organică şi una apoasă), în urma căreia analitul de interes este separat de ceilalţi componenţi ai matricei din prima fază şi extras în cea de-a doua fază lichidă. Procedeul se repetă de regulă de 2-3 ori, pentru a asigura o extracţie completă. Comparativ cu LLE, extracţia în fază solidă SPE are unele avantaje: este mai rapidă, mai reproductibilă, se obţin extracte mai curate şi necesită cantităţi de solvenţi mai reduse. Utilizarea cartuşelor SPE implică patru paşi: condiţionarea umpluturii cartuşului; aplicarea probei prin care analiţii de interes vor fi reţinuţi selectiv pe cartuş, în timp ce restul compuşilor vor fi îndepărtaţi; spălarea cartuşului cu solvenţi care să îndepărteze compuşii nedoriţi adsorbiţi la încărcarea probei; eluarea compuşilor reţinuţi pe cartuş, utilizând un solvent care va distruge interacţiunile analit-pat adsorbant. Există patru mecanisme generale de extracţie întâlnite în tehnica SPE: - nepolar - grupările funcţionale utilizate sunt C18, C8, C2, fenil, ciclohexil şi copolimerul stiren-divinilbenzen - polar - grupările funcţionale utilizate sunt: cianopropil, diol şi aminopropil - schimbător de ioni - coloanele schimbătoare de ioni se împart în coloane schimbătoare de anioni şi cationi. Grupările schimbătoare de cationi pot fi puternic schimbătoare (derivaţii acidului sulfonic) sau slab schimbătoare (derivaţii acidului carboxilic). Grupările schimbătoare de anioni pot fi deasemenea puternic schimbătoare (aminele cuaternare) sau slab schimbătoare (aminele primare, secundare şi terţiare).
-covalent - interacţiunile de tip covalent depind de structura chimică a analitului. Un exemplu ar fi utilizarea derivaţilor boratului pentru extracţia compuşilor cu două grupări vecine hidroxil. Cartuşele SPE cu o singură grupare funcţională prezintă dezavantajul că nu pot fi folosite pentru analiza multireziduală, structura chimică a analiţilor fiind diferită. Utilizarea mai multor cartuşe SPE cu structuri ale umpluturii diferite a fost aplicată cu succes în pregătirea probei, dar timpul de analiză a fost mult mai mare. De aceea, s-a încercat folosirea unor cartuşe SPE cu amestec de faze, care combinau grupările nepolare cu cele schimbătoare de ioni (Oka şi col., 1987). Acestea, prezentau avantajul utilizării unui singur cartuş pentru mai mulţi analiţi cu proprietăţi chimice diferite. Dar, datorită faptului că extracţiile nu erau reproductibile, particulele umpluturii nefiind distribuite omogen, s-a revenit la cartuşele SPE cu o singură fază. S-a încercat deasemenea crearea unui tip de cartuş SPE care utiliza carbonul grafitic poros (PGC). În acest caz, particulele PGC se caracterizau printr-o distribuţie omogenă, dar capacitatea lor de adsorbţie era mai redusă. Deşi erau multifuncţionale, având capacitatea de a reţine atât analiţi polari cât şi nepolari, principala problemă era aceea că adsorbţia compuşilor era foarte puternică, în unele cazuri ireversibilă. Principiul extracţiei SPE se bazează pe teoria cromatografiei. Alegerea variantei de extracţie a analiţilor se va face ţinând cont de natura şi particularităţile matricei.
Detectori utilizaţi în cromatografía lichidă
Pentru cromatografia de lichide au fost create două tipuri de detectori care sunt astăzi folosiţi în mod curent:
Detectorii bazaţi pe proprietatea componentului sunt sensibili la unele
proprietăţi chimice ori fizice. Din această categorie fac parte detectorii spectrofotometrici de absorbţie UV-Vis, de fluorescenţă, electrochimici şi spectrometrul de masă. Se pot atinge sensibilităţi remarcabile, selectivitate bună şi permit eluţia cu gradient.
Detectorii bazaţi pe proprietatea de volum funcţionează prin măsurarea unor
proprietăţi fizice ale componentului în efluent în comparaţie cu eluentul. Astfel de detectori se bazează pe măsurarea indicelui de refracţie, a constantei dielectrice şi a conductivităţii. Sunt foarte sensibili la variaţii de temperatură şi nu sunt recomandaţi pentru eluţia cu gradient (Gocan, 2002). Există posibilitatea creşterii selectivităţii şi sensibilităţii detecţiei prin tehnicile de derivatizare pre- şi post-coloană. Detectorii sunt selectivi, ei nu răspund la toate moleculele existente într-un amestec, ci numai la anumite molecule sau clase de compuşi. În cromatografia lichidă nu există un detector universal şi de înaltă sensibilitate, aşa cum este de exemplu detectorul de ionizare cu flacără (FID) din cadrul cromatografiei gazoase, în schimb detectorii din cromatografia lichidă acoperă un număr mult mai mare de substanţe. Caracteristicile detectorului cromatografic ideal: • răspuns independent de compoziţia fazei mobile, debit, temperatură • sensibilitate mare • selectivitate • răspuns rapid • zgomot de fond scăzut • non-destructiv pentru probă • domeniu dinamic liniar mare
• stabilitate într-un timp îndelungat de operare Detectorii ce au la bază absorbţia în ultraviolet (UV)-vizibil (Vis) sunt cei mai populari detectori utilizaţi în cromatografia de lichide şi sunt practic insensibili la variaţii de debit şi temperatură. Pentru a se utiliza un asemenea detector, este necesar ca componentele de analizat să manifeste absorbanţe suficient de mari în domeniul spectral la care funcţionează detectorul, iar eluentul să fie transparent în domeniul spectral respectiv (Gocan, 2002). Exista mai multe tipuri de detectori UV-Vis şi-anume: • detectori cu o singură lungime de undă, care folosesc ca sursă de lumină UV o lampă de mercur la presiune joasă, având o energie înaltă de emisie la 254nm. Prezintă un zgomot de fond redus, dar componentul trebuie să aibă o absorbanţă acceptabilă la această lungime de undă. •
spectrometre cu lungime de undă variabilă, care au sursă spectrală continuă de înaltă energie stabilă reprezentată de lampa cu deuteriu (190-400nm). Pentru domeniul vizibil (350-800nm) s-a introdus lampa de tungsten. Prezintă avantajele: poate fi aleasă lungimea de undă optimă (adică corespunzătoare absorbanţei maxime), poate fi aleasă absorbanţa cea mai bună în raport cu eluentul sau cu compuşii care interferă, putând fi selectată continuu, din întreg domeniul UV. Acest tip de detector poate fi utilizat şi ca un spectrofotometru pentru înregistrarea spectrului unui anumit component ce urmează a fi identificat prin compararea acestui spectru cu cel din biblioteca de date.
• detectori cu serie de fotodiode, care prezintă facilitatea că întreg domeniul spectral este înregistrat continuu, la intervale de timp de microsecunde, iar datele stocate pot fi folosite în diferite moduri şi la date ulterioare, fără a fi necesară repetarea separării. Există situaţii în care amestecul de separat este complicat şi timpul de retenţie nu este suficient pentru a caracteriza fiecare component. Unele substanţe organice au timpi de retenţie identici, fapt ce conduce la erori de interpretare datorită suprapunerii semnalelor. Astfel, este universal recunoscut că cea mai bună metodă de identificare şi caracterizare a fiecărui component separat prin cromatografie constă în înregistrarea spectrului său de masă. Spectrometrul de masă (MS) este detectorul care permite identificarea prin compararea electronică a spectrului oricărei specii moleculare cu spectrele etalon din biblioteca de spectre.
Spectrometrul de masă se bazează pe principiul că ionii de diferite greutăţi (indiferent de modul lor de formare) după accelerarea într-un câmp electric, supuşi acţiunii unui câmp magnetic perpendicular pe direcţia lor de deplasare, vor fi deviaţi mai mult sau mai puţin în funcţie de masa şi sarcina lor (Oprean, 1974). În figura 3 este redată schema de principiu a unui spectrometru de masă.
Fig. 3. Schema de principiu a unui spectrometru de masă
Spectrometrele de masă sunt alcătuite din trei componente de bază: -
sursa de ioni sau camera de ionizare
-
analizatorul de ioni
-
detectorul sau colectorul de ioni, la care se adaugă sistemul de introducere a probei şi înregistratorul. Sursa de ioni constituie partea cea mai importantă a unui spectrometru de masă,
fiind locul unde se petrece transformarea moleculelor neutre în ioni pozitivi (alături de alte particule negative sau neutre). Analizatorul de ioni separă ionii proveniţi din camera de ionizare în funcţie de raportul dintre masa şi sarcina acestora (m/z). Ionii cu aceeaşi valoare m/z formează în colector un curent slab care este trimis spre amplificator şi apoi înregistrat (Oprean, 1974).
METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE CUPLATE CU SPECTROMETRIE DE MASĂ (LC-MS)
LC-MS este o tehnică cu multe aplicaţii datorită sensitivităţii şi specificităţii sale foarte ridicate, având utilizări atât calitative cât şi cantitative: identificarea compuşilor
necunoscuţi,
determinarea
compoziţiei
izotopice
moleculare,
determinarea structurii în funcţie de fragmentare şi cuantificarea compuşilor din diferite probe (http://en.wikipedia.org/wiki/Shimadzu_Scientific). Pe parcursul anilor, sistemele LC-MS au suferit transformări semnificative, pornind de la analize simple ca un înlocuitor al tradiţionalului UV şi ajungând la analize calitative şi cantitative foarte exacte. Aceste sisteme şi-au găsit largi aplicaţii în analiza alimentară, farmaceutică, a mediului şi în criminalistică. Prin cuplarea cromatografului de lichide cu spectrometrul de masă s-a obţinut un instrument de analiză performant capabil să separe, să identifice şi să cuantifice componenţii din cele mai complexe probe. Pentru utilizarea spectrometrului de masă ca detector în cromatografia de lichide, problema principală este realizarea unei interfeţe eficiente care să soluţioneze două incompatibilităţi majore: - faza mobilă este un lichid, adesea conţinând proporţii semnificative de apă, care este pompat prin coloană cu un debit de ordinul ml/min, în timp ce spectrometrul de masa operează sub un vid de 10-6 torr. Astfel, este imposibilă trecerea directă a eluentului din coloana HPLC în sursa spectrometrului şi rolul interfeţei este de a îndepărta faza mobilă. Interfaţa asigură trecerea analiţilor din soluţie în stare de vapori. - majoritatea analiţilor separaţi prin HPLC sunt nevolatili şi/sau nestabili termic şi prin urmare nu pot fi supuşi ionizării electronice sau chimice. A fost necesară dezvoltarea unor metode alternative de ionizare (Ardrey, 2003). Principalele interfeţe utilizate în cuplarea unui LC cu un MS sunt: cu introducerea directă a efluentului curgere continuă cu bombardament atomic rapid
cu bandă transportoare cu pulverizare la temperatură (thermospray) cu electropulverizare (electrospray) cu pulverizarea efluentului într-un curent de gaz la cald combinată cu o ionizare chimică la presiunea atmosferică (APCI) sau cu fotoionizare la presiunea atmosferică (APPI) (Gocan, 2002). Principiul cromatografiei lichide cuplate cu spectrometrie de masă
După extracţie şi purificare, proba de analizat este preluată din dispozitivul de introducere a probei de către faza mobilă şi introdusă în coloana cromatografică ce conţine faza staţionară. Aici are loc separarea componenţilor care, datorită distribuţiei diferenţiate între cele două faze, vor migra cu viteze diferite de-a lungul coloanei. Pe măsură ce componenţii amestecului sunt eluaţi din coloană, ei sunt trecuţi în spectrometrul de masă. Alegerea fazei mobile are o mare importanţă în obţinerea unor bune separări. Tampoanele sunt folosite în cromatografia lichidă pentru a controla gradul de ionizare al analitului şi implicit simetria semnalului şi reproductibilitatea retenţiei. Cele mai des utilizate sunt cele anorganice, nevolatile cum ar fi fosfatul de potasiu sau sodiu. Unul dintre rolurile interfeţei LC-MS este acela de a îndepărta faza mobilă, lucru ce duce la depunerea nedorită a moleculelor de tampon în interfaţă şi sursa ionică a spectrometrului. Consecinţa este reducerea performanţei detectorului. Drept urmare, sunt de preferat metodele care implică utilizarea tampoanelor volatile, cum ar fi acetatul de amoniu. Compoziţia şi parametrii fazei mobile (punct de fierbere, tensiune superficială, conductivitate) pot afecta funcţionarea diferitelor interfeţe. De mare importanţă este degazeificarea fazei mobile pentru a preveni formarea de bule în cadrul interfeţei LC-MS. Solvenţii trebuie să fie de puritate înaltă, pentru a nu da naştere la un fond spectral semnificativ ce ar putea îngreuna interpretarea datelor (Ardrey, 2003).
Spectrometria de masă este o metodă ce permite obţinerea ionilor, separarea acestora în funcţie de raportul dintre masă şi sarcină (m/z) precum şi înregistrarea lor. În spectrometria de masă pot fi studiate numai particule gazoase. Fasciculul molecular gazos este trimis în camera de ionizare, unde va fi bombardat de un flux de electroni a căror energie e cuprinsă între 10-100 eV. În urma ciocnirii moleculelor cu electronii, se formează specii moleculare cu energie mărită. Moleculele pot ceda surplusul de energie fie prin schimbarea configuraţiei lor electronice, fie prin radiaţie. În cazul când schimbarea configuraţiei electronice are lor prin emisie de electroni, se formează ioni moleculari pozitivi (M+), în timp ce schimbarea configuraţiei prin câştig de electroni duce la formarea de ioni moleculari negativi (M-). M - e- → M+ M +e- → MProcesul de formare al ionilor moleculari pozitivi este de aproximativ 104 ori mai probabil. Dacă energia fluxului de electroni depăşeşte cu mult energia necesară ionizării (potenţialul de ionizare), molecula se fragmentează în ioni pozitivi, negativi, radicali şi molecule neutre simple. Pentru a împiedica ciocnirile între particulele pozitive pe de o parte, sau între acestea şi moleculele neionizate pe de altă parte, întreaga incintă a camerei de ionizare, a sistemului de separare şi a colectorului e menţinută sub un vid de 10-6 torr. Radicalii şi moleculele neutre formate sub impactul electronic sunt evacuaţi de către pompele de vid, iar ionii pozitivi sunt acceleraţi de-a lungul tubului analizorului de ioni aflat în câmp magnetic. Ionii descriu o traiectorie circulară a cărei rază e proporţională cu masa lor. Prin varierea continuă fie a câmpului magnetic, fie a potenţialului accelerator, se realizează treptat condiţiile ca ionii de toate mărimile m/z să focalizeze şi să ajungă la detector. După detectareamplificare, curentul de ioni este înregistrat de către înregistrator, care furnizează astfel spectrul de masă (Oprean, 1974).
Spectrele de masă sunt spectre de linii, adică semnalul generat de ion apare sub forma unei linii numite şi pic. În figura 4 sunt ilustrate tipurile de linii din spectrul de masă al unui compus organic.
Fig. 4. Tipuri de linii în spectrul de masă al unui compus organic
Dacă o moleculă conţine doar atomi formaţi dintr-un singur izotop de abundenţă naturală de 100%, linia de la valoarea m/z cea mai mare corespunde ionului molecular. Majoritatea atomilor au mai mulţi izotopi, ceea ce determină apariţia de linii la valori mai mari decât cea corespunzătoare ionului molecular. Aceste linii se numesc linii izotopice sau picuri izotopice. Cel mai înalt pic din spectrul de masă se numeşte pic de bază (linie de bază) şi corespunde ionilor cu viaţă lungă, care ajung la detector în cea mai mare cantitate. Acesta poate fi identic cu picul molecular sau poate fi un pic generat prin fragmentarea ionului molecular. Intensitatea procentuală relativă se consideră de 100% pentru picul de bază, iar intensităţile relative a celorlalte picuri se determină în raport cu picul de bază. Cunoaşterea intensităţii procentuale relative permite cunoaşterea abundenţei procentuale relative pentru fiecare specie de ioni din spectrul de masă.
Pe lângă linia ionului molecular şi a liniilor izotopice, spectrul de masă mai conţine şi alte linii datorate ionilor (cationi sau radicali cationici) de fragmentare. Fragmentarea ionului molecular în spectrul de masă se face după anumite reguli specifice fiecărei clase de compuşi. Spectrometrul de masă poate fi utilizat în două moduri: modul “scan” (scanare completă), în care se monitorizează toţi ionii dintr-un anumit interval al fragmentelor de masă. Tehnica are sensibilitate redusă şi se foloseşte la determinarea compuşilor necunoscuţi a unei probe. Deasemenea, când se realizează dezvoltarea unei metode în laborator, este indicat să se efectueze mai întâi analiza în modul “scan”
pentru a determina timpii de
retenţie şi amprentele spectrale ale analiţilor de interes. modul “sim” (monitorizarea ionului selectat), în care se introduc în metodă numai fragmentele de masă ale compuşilor urmăriţi şi numai acele fragmente sunt detectate de MS. Avantajele modului “sim” sunt: limita de detecţie e mai joasă, interferenţele matriceale sunt mai mici şi poate confirma identificarea unui compus dacă raţia ionilor obţinută este comparabilă cu cea dată de standardele de referinţă. Cromatograful de lichide poate fi deasemenea cuplat cu două sau multiple stadii de analiză de masă (LC-MS/MS respectiv LC-(MS)n ). Acest mod de operare poate fi foarte folositor la identificarea unor substanţe necunoscute şi anume în cazul în care s-a utilizat o ionizare blândă, se vor produce predominant ionii [M+H] +
. Acest spectru este sărac în informaţii, din acest motiv fiind nevoie de o a doua
etapă de analiză MS (Gocan, 2002). Tehnici de ionizare
Producerea ionilor în spectrometrul de masă se poate realiza în mai multe moduri (Gocan, 2002): Ionizare electronică (electron ionization, EI) Ionizare chimică (chemical ionization, CI)
Pulverizare electronică (electrospray ionization, ESI) Pulverizare termică (thermospray, TSP) Ionizare chimică la presiune atmosferică (atmospheric-pressure chemical ionization, APCI) Ionizare prin bombardament cu atomi rapizi (fast atom bombardment, FAB) Ionizare prin desorbţie asistată laser din matrice (matrix assisted laser desorption ionization, MALDI). Ionizarea electronică şi chimică poate fi aplicată numai probelor în fază gazoasă. De aceea, aceste tehnici de ionizare sunt utilizate cu precădere în cromatografia de gaze. Cromatografia de lichide este folosită la analiza unor compuşi polari şi nevolatili şi prin urmare necesită alte moduri de ionizare. Ionizarea electrospray constă în trecerea la presiunea atmosferică şi debit foarte mic a unei soluţii a compusului de analizat printr-o capilară expusă unui câmp electric foarte puternic (3-6 kV). Soluţia este transformată în picături foarte fine (spray), înalt încărcate electric şi odată cu evaporarea solventului, încărcarea electrică este transferată moleculei de analizat. Tehnica se aplică moleculelor foarte polare, polimerilor şi proteinelor. Ionizarea ESI este o metodă blândă de producere a ionilor, fără a afecta integritatea probelor. În urma ionizării, sunt produşi ioni moleculari cvasistabili care nu sunt fragmentaţi în timpul analizei. Aceşti ioni moleculari sunt formaţi prin ataşamentul unor ioni mic moleculari la macromoleculele
studiate
ori
prin
sustragerea
unui
ion
(http://www.icmpp.ro/intranet/Prezentari/HPLC_MSD.doc). În cazul interfeţei care utilizează pulverizarea termică, tot eluentul este introdus prin intermediul acesteia în masa spectrometrului. Prin pulverizarea termică, ionizarea probei poate fi obţinută fără a se recurge la folosirea unui filament. Ionizarea thermospray se produce când un component într-o soluţie salină este vaporizat, producând un jet supersonic de vapori încărcaţi. Pe măsură ce solventul se evaporă şi raza picăturii se micşorează, suprafaţa câmpului pe o picătură creşte până are loc evaporarea finală a unui ion. Spectrele de masă obţinute prin ionizare TSP sunt simple, producând aducţi protonaţi (M+1)+ prin procedeul cu ion pozitiv şi (M-1)- prin procedeul cu ion negativ. Temperatura joacă un rol
important şi de aceea trebuie riguros controlată şi menţinută la parametri optimi de funcţionare a interfeţei (Gocan, 2002). Ionizarea APCI este o tehnică în care fluxul de eluent provenit din coloana cromatografică este dispersat în picături mici datorită temperaturii şi a unui gaz nebulizator. Mecanismul de formare al ionilor implică un transfer de sarcină speciilor între un ion reactiv şi o moleculă ţintă, pentru a produce un ion ţintă care poate fi transmis către analizorul de masă. Spectrele obţinute prin APCI sunt similare cu cele obţinute prin pulverizarea electronică prin metoda ioni pozitivi când rezultă ionii [M+H]+, în timp ce prin metoda ioni negativi sunt produşi ionii [M-H] -. Spre deosebire de pulverizarea electronică, APCI nu produce ioni cu sarcini multiple şi nu este potrivită pentru analiza compuşilor cu mase moleculare mari cum ar fi proteinele. Totuşi, datorită energiei termice mari utilizată la generarea de ioni, APCI poate ioniza compuşi relativ nepolari, cu un domeniu al maselor moleculare de la 100 la 2000 dalton (Gocan, 2002). În tehnica de ionizare FAB, proba dizolvată într-o matrice lichidă (glicerina) este bombardată cu un fascicul de atomi (Xe) de energie foarte înaltă. Ionizarea are loc la impactul atomilor cu matricea din care sunt expulzaţi ionii compusului de analizat. Matricea se adaugă la eluentul HPLC, de preferinţă post-coloană, pentru a nu influenţa procesul de separare. Pentru a nu se diminua performanţa tehnicii FAB, conţinutul matricei din faza mobilă nu trebuie să depăşească procentul de 5%, fapt ce ar conduce la creşterea fundalului spectral (Ardrey, 2003). Ionizarea MALDI se realizează prin impactul fotonilor de energie ridicată asupra probei plasate într-o matrice organică solidă. Se aplică moleculelor polare, nestabile termic, cu mase de până la 500000 dalton (Ardrey, 2003).
METODA CROMATOGRAFIEI GAZOASE CUPLATE CU SPECTROMETRIE DE MASĂ (GC-MS)
Dacă gaz cromatografia era la început aplicată doar analizelor compuşilor volatili, studiile ulterioare au revoluţionat chimia separărilor. În prezent, GC poate fi utilizată atât pentru probe gazoase, cât şi pentru soluţii lichide şi solide volatile. Dacă proba analizată este nevolatilă, se pot folosi tehnicile de derivatizare sau piroliză GC (Grob şi Barry, 2004). Tehnica cromatografiei gazoase cuplată cu spectrometria de masă se bazează pe natura şi distribuţia fragmentelor moleculare rezultate prin bombardarea componenţilor probei cu electroni de o anumită energie. Spectrometria de masă este cea mai performantă şi sigură tehnică de identificare a compuşilor, întrucât face posibilă compararea numerelor de masă obţinute cu numerele de masă a unor compuşi cunoscuţi, din librăria de spectre. Datorită acestui fapt, toate metodele bazate pe cromatografie fără utilizarea MS, trebuie confirmate prin spectrometrie de masă, prevede Decizia Comisiei Europene 2002/657/CE (Gentili şi col., 2005). Principiul cromatografiei gazoase Ca principiu de funcţionare, cromatografia gazoasă realizează separarea substanţelor volatile pe baza adsorbţiei sau repartiţiei lor într-o fază staţionară (solidă sau lichidă) şi o fază mobilă gazoasă ( un gaz sau un amestec de gaze). În funcţie de natura fazei staţionare, gaz cromatografia se poate diviza în cromatografie gaz-solid (GSC) şi cromatografie gaz-lichid (LGC). În primul caz, faza staţionară introdusă în coloana cromatografică este adsorbant sau suport polar activ, iar în al doilea caz suportul este legat chimic de o peliculă de lichid nepolar cu tensiune de vapori mică, nevolatil la temperatura de lucru. Faza mobilă este constituită din gaze inerte (H 2 , N 2 , He, Ar, CO 2 ) care nu sunt reţinute de faza staţionară. Faza mobilă se deplasează de-a lungul coloanei prin porii fazei staţionare. Dacă la capătul superior al coloanei se introduce amestecul de separat în stare de vapori, fiecare component al amestecului va fi transportat diferenţiat de gaz, menţinându-se un echilibru între cantitatea reţinută în faza staţionară şi cantitatea din faza mobilă. Dintr-un amestec de substanţe, fiecare component va fi separat la
timpi de retenţie (t R ) diferiţi. Efluentul care părăseşte coloana este analizat de un detector care permite trasarea cromatogramei: variaţia concentraţiei fiecărui component eliminat din coloană în funcţie de timpul de retenţie pe coloană sau variaţia concentraţiei în funcţie de volumul efluentului. Separarea se poate face în sistem izoterm şi izobar (temperatura, debitul fazei mobile şi presiunea în coloană sunt constante) sau în sistem de gradient (variază unul sau doi dintre parametri, de obicei temperatura coloanei sau debitul gazului purtător). Separarea compuşilor este realizată atât de stratul activ al coloanei, cât şi de programarea temperaturii (separarea compuşilor condensaţi în capul coloanei pe baza punctelor de fierbere). Între factorii care pot influenţa capacitatea separării se numără: numărul de talere teoretice din stratul cromatografic, factorul de separare şi volumul de retenţie a componentelor (Socaciu, 2000). Un cromatograf de gaze conţine următoarele componente principale: butelia cu gazul transportor, injectorul, coloana de separare situată într-un cuptor termostatat, detectorul şi înregistratorul. În figura 5 este redată schema de principiu a unui gaz cromatograf.
Fig. 5. Schema de principiu a unui gaz cromatograf
Coloanele cromatografice sunt foarte diverse, cu lungimi, diametre, compoziţii diferite, în funcţie de natura componenţilor de separat. Se disting două tipuri de coloane: coloane cu umplutură ce conţin suporturi solide şi care pot fi
analitice sau preparative în funcţie de lungime şi coloane capilare construite dintrun tub de oţel moale sau Cu, Al, sticlă, în care pereţii interiori pot fi folosiţi ca atare, ca fază staţionară sau pot fi tapetaţi cu o fază staţionară. Coloanele capilare sunt net superioare celor cu umplutură, larga lor utilizare datorându-se eficienţei ridicate de separare a acestora. Numărul de talere teoretice este proporţional cu lungimea coloanei, deci pentru separări optime se folosesc coloane lungi. Diametrul interior al coloanelor este de 2-500mm pentru coloanele clasice şi <1mm pentru coloanele capilare. Diametrul interior influenţează viteza optimă a gazului transportor, capacitatea de lucru a coloanei şi cantitatea maximă de material separat. Cu cât diametrul coloanei este mai mic, separarea este mai performantă. Umplutura coloanelor clasice depinde de tipul cromatografiei, astfel în GSC se folosesc faze staţionare active: cărbune activ, silicagel, alumină, site moleculare, zeoliţi, sticlă poroasă, silicat de Mg. Întrucât energiile de absorbţie sunt mai mari decât energiile de disociere, analiza se realizează la temperaturi mai mari decât în GLC. Faza staţionară în GLC este constituită dintr-un suport inactiv, poros (suprafaţa specifică de 1-10 m 2 /g) impregnat 5-20% cu un lichid. Faza staţionară astfel constituită este repartizată uniform ca peliculă subţire pe pereţii coloanei, pentru a opune rezistenţă cât mai mică amestecului de separat. Suporturile poroase folosite sunt: Chromosorb W sau P, celita, pământul de diatomee, produsele Brique C 22 , iar suporturile mai puţin poroase sunt: bile de sticlă, pudra de teflon, grafit, polietilenă microporoasă. Înălţimea unui taler teoretic este proporţională cu diametrul particulelor. Este important ca particulele să aibă dimensiuni apropiate. Pentru a elimina proprietăţile absorbante ale suportului se pot face tratamente chimice cu dimetildiclorsilan sau acoperirea suportului cu polivinilpirolidonă (PVP), cu teflon sau argintare. În alegerea fazei staţionare trebuie să se ţină seama de tipul substanţelor de separat (polaritate, legături de hidrogen, etc.), de interacţiunile chimice posibile cu faza staţionară sau faza mobilă, de capacitatea de adsorbţie pe suport. S-a făcut o scală de selectivitate a lichidelor staţionare care începe cu squalenul (nepolar) şi se încheie cu β, β’- dioxipropionitril (cel mai polar). Suportul impregnat cu lichid este încălzit într-un curent de gaz inert la o temperatură apropiată de cea de separare.
Umplerea coloanei se face sub vid, iar condiţionarea ei constă în încălzire sub curent de gaz purtător la temperatură înaltă pentru a îndepărta impurităţile volatile. Coloanele capilare pot fi constituite din tuburi goale în care faza staţionară nu este fixată pe suport, fiind repartizată uniform pe pereţii interiori ai coloanei. Practic se realizează o peliculă foarte subţire prin evaporarea fazei staţionare lichide. Diametrul interior este de 0.25-0.5mm, iar lungimea de 20-50m, realizânduse aproximativ 10000 talere teoretice. Proba nu se introduce direct în coloană, ci printr-o cameră de injectare a cărei formă şi volum influenţează mult separarea. Această cameră are o temperatură mai mare decât coloana, permiţând evaporarea probei. Volumul probei trebuie să fie cât mai mic. Când coloanele sunt supraîncărcate, se reduce numărul de talere teoretice, creşte înălţimea unui taler şi picurile devin asimetrice şi cu lăţime mare. Injectarea probei poate fi făcută cu sau fără splitare. În cel de-al doilea caz, toată cantitatea injectată intră în coloana cromatografică. Pentru compuşii mai volatili decât solventul este obligatoriu să se lucreze cu splitare: o parte din extractul de injectat va intra în coloană, o parte va fi direcţionată în exteriorul cromatografului. În calculul concentraţiilor componenţilor determinaţi se va ţine seama de raportul de splitare, care are practic semnificaţia unei diluţii. Analiza unei probe implică etapele de pregătire a probei, de separare a componenţilor şi de evaluare calitativă şi cantitativă a componenţilor separaţi. Analiza calitativă presupune identificarea fiecărui pic din cromatogramă. Analiza cantitativă se face prin integrarea picurilor şi calculul ariilor acestora, exprimate ca procent din totalul picurilor. Acest procent este proporţional cu ponderea fiecărei componente în amestec. Pentru a exprima în valori absolute cantitatea fiecărei componente din amestec, trebuie determinată concentraţia totală a substanţelor în amestec şi apoi pe baza procentelor deduse din cromatograme se calculează concentraţia fiecărei componente (Socaciu, 2000).
Detectori utilizaţi în cromatografía gazoasă Detectorul
pune în evidenţă componentele separate pe coloana
cromatografică, sub forma unor semnale electrice care pot fi înregistrate. Detectorul trebuie să deosebească o proprietate oarecare a componentului de analizat faţă de gazul purtător. Există detectori universali, sensibili la un număr mare de componenţi şi specifici, sensibili numai la anumiţi componenţi (la anumite grupări funcţionale sau legături chimice). Caracteristicile detectorului: • sensibilitate cât mai mare pentru a putea detecta chiar şi urmele de componenţi şi pentru a nu fi necesară încărcarea coloanei cu cantităţi mult prea mari de probă • viteză de răspuns cât mai mare • liniaritate: sensibilitatea detectorului să rămână constantă într-un domeniu larg de concentraţii • limită de sensibilitate ( concentraţia minimă de substanţă în eluent pentru care se obţine un pic) cât mai joasă • stabilitate: linia de fond şi reproductibilitatea să fie cât mai puţin afectate de condiţiile de lucru (temperatură, debit, presiune, etc) (Liteanu şi col., 1981). Cele mai importante tipuri de detectori sunt: 1. Detectorul de conductibilitate termică (DCT) a fost primul care a apărut, făcând parte din categoria detectorilor universali. Se mai numeşte şi catarometru, este nedestructiv, putând fi utilizat şi în cromatografia preparativă. Principiul de funcţionare se bazează pe diferenţa de conductibilitate termică dintre component şi eluent. 2. Detectorul cu flacără de ionizare (FID) este tipul de detector cel mai mult folosit în GC. Principiul de funcţionare constă în măsurarea conductibilităţii electrice a unei flăcări de hidrogen în prezenţa unui compus organic. La ieşirea din coloană, eluentul este amestecat cu un curent de hidrogen şi este aprins la capătul unei duze din oţel inoxidabil. Creând un câmp electric între duză şi un electrod colector aşezat deasupra flăcării, se stabileşte un curent slab (10-14 A) între cei doi electrozi prin flacără. Apariţia în flacără a unui compus organic măreşte intensitatea
curentului datorită ionizării acestuia în funcţie de natura şi concentraţia componentului respectiv. Acest curent va fi amplificat şi apoi înregistrat. Detectorul FID are o sensibilitate înaltă, stabilitate pe termen lung, răspuns al semnalului rapid, simplitate în operare şi întreţinere. 3. Detectorul cu captură de electroni (ECD) prezintă o mare sensibilitate pentru compuşii capabili de captură de electroni, cum ar fi compuşii conţinând halogeni. Mulţi compuşi de interes biologic prezintă proprietatea de a capta electroni sau posilitatea de a fi derivatizaţi cu compuşi care au această proprietate. Sursa de ionizare constă din tritiu sau Ni63 radiocactiv. Azotul se utilizează ca gaz purtător şi produce prin iradiere electroni şi ioni pozitivi: N2 →N2 + +eDatorită mobilităţii ridicate a electronilor liberi, nu are loc recombinarea lor cu ionii pozitivi. Prin aplicarea unui câmp electric între electrozii camerei de ionizare, ionii formaţi prin iradiere vor fi colectaţi. Prezenţa unor molecule cu afinitate ridicată pentru captarea electronilor liberi favorizează formarea ionilor negativi: [component] + e- →[component]Ionii negativi se recombină cu ionii pozitivi mult mai uşor decât electronii liberi: N2 + + [component]- →[moleculă neutră] Detectorul ECD are avantajul selectivităţii şi sensibilităţii foarte ridicate. 4. Detectorul cu fotoionizare (DFI) are la bază ionizarea fotonică a moleculelor probei şi măsurarea curentului format cu ajutorul electrodului colector cuplat cu un electrometru. 5. Spectrometrul de masă (MS): în urma ionizării în vid a moleculelor substanţei de analizat, are loc fragmentarea acestora cu formarea unui grup de ioni caracteristici, cu mase diferite. Procesele se desfăşoară în sursa de ionizare a spectrometrului. Ionii formaţi sunt separaţi în funcţie de masa lor în analizorul de masă şi apoi sunt detectaţi şi înregistraţi. Reprezentarea abundenţei lor (concentraţiei relative) în funcţie de masă constituie spectrul de masă. Ionizarea moleculelor poate avea loc în două modalităţi: prin impact electronic (EI) şi ionizare chimică (CI).
Ionizarea prin impact electronic În camera de ionizare se realizează un vid înaintat, de 10-8 torr. Electronii proveniţi de la un filament încălzit sunt focalizaţi în timp ce străbat camera şi colectaţi de un electrod având un potenţial de 70V. Acesta îi conferă fiecărui electron o energie de 70eV. Dacă în camera de ionizare se introduce o substanţă într-o cantitate suficientă ca presiunea să crească la 10-5torr, ciocnirile dintre electroni şi moleculele compusului respectiv determină fragmentarea acestora. Întrucât electronii la 70eV au energie suficientă pentru a rupe orice legatură din moleculă, prin fragmentare se vor forma toţi ionii posibili. Din cauza presiunii scăzute din camera de ionizare, numai o moleculă din aproximativ 10 6 va realiza ciocnirea şi ionizarea. Fragmentele de molecule neutre şi de ioni formaţi nu se vor ciocni între ei, ci numai cu pereţii camerei, fiind posibilă aşadar îndepărtarea lor din camera de ionizare şi colectarea ionilor de mase diferite în detector. Ionizarea EI duce la fragmentarea moleculei şi la obţinerea unui amestec complex de ioni a căror masă si abundenţă relativă se poate utiliza pentru identificarea calitativă a compuşilor respectivi. Spectrul de masă obţinut în asemenea condiţii va fi reproductibil şi caracteristic pentru compusul respectiv. Primul ion care se formează în urma impactului este aşa-numitul ion molecular, care are mare importanţă în identificarea substanţei deoarece are aceeaşi masă cu masa moleculară a compusului respectiv. Din păcate însă, stabilitatea ionului molecular este aşa de redusă (el se va fragmenta mai departe) încât, abundenţa sa relativă va fi foarte mică şi identificarea de cele mai multe ori imposibilă. În consecinţă, a devenit necesară utilizarea unei tehnici de ionizare mai blânde, prin care să se obţină informaţii despre masa moleculară. Această tehnică este ionizarea chimică, introdusă în anul 1966. Spectrele de masă cu ionizare chimică sunt produse prin reacţii ionmoleculare între moleculele neutre ale componentului (10-5 torr) şi o presiune ridicată (0.2-2 torr) a plasmei de ioni a gazului reactiv (de obicei metan sau izobutan). Gazul reactiv poate să înlocuiască gazul purtător în GC-MS şi poate fi introdus direct în sursă, cu puţine efecte asupra rezoluţiei cromatografice. Întrucât concentraţia gazului reactiv este cu câteva ordine de mărime peste concentraţia
probei, fasciculul de electroni ionizează gazul reactiv cu puţine molecule ale probei ionizate direct. Deoarece sursa este operată la presiune înaltă comparativ cu sursa EI, reacţiile ion-molecule sunt favorizate, realizându-se ionizarea probei. Aceste reacţii au loc cu energie mică în comparaţie cu impactul direct cu electroni, abundenţa ionului molecular faţă de alte fragmente rezultate va fi mare şi mecanismul de fragmentare va fi mult mai simplu. Majoritatea tehnicilor de ionizare chimică lucrează cu ioni pozitivi, dar s-au dezvoltat şi cele cu ioni negativi bazate pe captura unor electroni cu energie mai mică. Comparativ cu ionizarea prin EI, ionizarea chimică prezintă dezavantajul că oferă rezultate mai puţin reproductibile şi nu este posibilă alcătuirea unei librării de spectre care să fie folosită în scopuri de identificare. Separarea ionilor formaţi are loc în analizorul de masă, tipurile cele mai uzuale fiind cele magnetice şi cu cuadrupol descrise în capitolul 3.3.3. Spectrele de masă pot fi înregistrate sub formă de picuri cu maxime (forma originală a spectrului), dar în practică se utilizează reprezentarea fiecărui pic sub forma unei linii. Celei mai înalte linii din spectru i se atribuie arbitrar valoarea 100, iar restul sunt exprimate ca procente faţă de aceasta, obţinându-se concentraţia diverselor fragmente ionice ca valori de abundenţă relativă (Gocan, 1998; Ciucanu, 1990; http://www.scritube.com/stiinta/chimie/Cromatografia-de-gaze41182.php).
