Universidad César Vallejo Facultad de Ingeniería Escuela de Ingeniería Agroindustrial EFECTO DE LOS SUSTRATOS TALCO INDUSTRIAL, HARINA DE PAPA (Solanum tuberosum) Y ALMIDÓN DE MAÍZ (Zea mays) EN LA VIABILIDAD DE ESPORAS DE Paecilomyces lilacinus
TESIS PARA OBTENER EL TITULO PROFESIONAL DE: INGENIERO AGROINDUSTRIAL Autor: Miñano Yucra, Kristy Normy Asesor Dr. Lezama Asencio, Pedro
Trujillo, Perú 2013
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EFECTO DE LOS SUSTRATOS TALCO INDUSTRIAL, HARINA DE PAPA (Solanum tuberosum) Y ALMIDÓN DE MAÍZ (Zea mays) EN LA VIABILIDAD DE ESPORAS DE Paecilomyces lilacinus .
Kristy Normy Miñano Yucra Autora
Presentada a la Escuela de Ingeniería Agroindustrial de la Universidad César Vallejo para su aprobación.
Dr. José Gonzalez Cabeza Presidente
Ing. Gabriela Barraza Jauregui
Dr. Pedro Lezama Asencio
Secretario
Vocal
TRUJILLO – PERÚ 2013
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DEDICATORIA Se lo dedico con todo cariño a…
A Dios por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado salud para lograr mis objetivos, además de su infinita bondad y amor.
A mi madre Mónica por haberme apoyado en todo momento, por sus consejos, sus valores, por la motivación constante que me ha permitido ser una persona de bien, pero más que nada, por su amor.
A mis maestrospor su gran apoyo y motivación para la culminación de nuestros estudios profesionales y para la elaboración de esta tesis.
A mis amigos por apoyarnos mutuamente en nuestra formación profesional y que hasta ahora, seguimos siendo amigos, en especial a Barbara Zapata, por haberme ayudado en la realización de este trabajo.
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AGRADECIMIENTO
Al finalizar un trabajo arduo como el desarrollo de tesis se reconoce la importante participación de personas e instituciones que han facilitado las cosas para que este trabajo llegue a un feliz término. Es por ello, que es para mí un verdadero placer utilizar este espacio para ser consecuente con ellas, expresándoles misagradecimientos. A mi madre, Mónica Yucra Ccasa por el apoyo incondicional que me brindó a lo largo de la carrera. A mis tías Sonia Yucra Ccasa y Clara Yucra Ccasa
que a pesar de la
distancia, siempre estuvieron pendientes de mi desarrollo académico, deseándome lo mejor y brindándome todo su apoyo y amor. A la empresa SOLAGRO S.A.C. por haberme brindado su apoyo en la utilización de los laboratorios durante el desarrollo de este trabajo. Al personal dentro de la empresa, en especial a la Ing. Diana Moreno, Sra Janet Alayo Iko, por brindarme su apoyo y motivación para seguir adelante en la realización del desarrollo de tesis. También me gustaría agradecer a mi
profesor asesor
Dr. Pedro Lezama
Asencio, por sus consejos, su enseñanza y más que todo por su amistad. Y a todas aquellas personas que de una u otra forma, colaboraron o participaron en la realización de esta investigación, hago extensivo mi más sincero agradecimiento.
LA AUTORA
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PRESENTACIÓN
Señores Miembros del Jurado:
En cumplimiento con las disposiciones vigentes del reglamento de Grados y Títulos de la Facultad de Ingeniería de la Universidad Cesar Vallejo de Trujillo, someto a su consideración y elevado criterio el presente informe de Tesis intitulado: EFECTO DE LOS SUSTRATOS TALCO INDUSTRIAL, HARINA DE PAPA (Solanum tuberosum) Y ALMIDÓN DE MAÍZ (Zea mays) EN LA VIABILIDAD DE ESPORAS DE Paecilomyces lilacinus.
Es propicia esta oportunidad para manifestar nuestro sincero reconocimiento a nuestra alma Mater y toda su plana docente, que con su capacidad y buena voluntad contribuyeron a nuestra formación profesional.
Trujillo, Diciembre del 2012
MIÑANO YUCRA, KRISTY NORMY
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ÍNDICE GENERAL DEDICATORIA………………………………………………………………………… iii AGRADECIMIENTO…………………………………………………………………..
iv
PRESENTACIÓN……………………………………………………………………….
v
RESUMEN………………………………………………………………………………. viii ABSTRACT……………………………………………………………………………… ix 1. INTRODUCCION ………..…………………………………………………………
1
PROBLEMA DE INVESTIGACION ……….…………………………
2
1.1.
1.2.
1.1.1. Realidad Problemática ……………………………………………...
2
1.1.2. Formulación del Problema.………………………………………….
2
1.1.3. Justificación ………………………………………………………......
3
1.1.4. Antecedentes ……………………………………………………........
4
1.1.5. Objetivos…………………………………………………………….....
6
1.1.5.1.
General…………………………………………………… 6
1.1.5.2.
Específicos………………………………………………
6
MARCO REFERENCIAL ……………………………………………… 6 1.2.1. Marco Teórico………………………………………………………....
6
1.2.1.1.
Hongos Entomopatogenos…………………………....
6
1.2.1.2.
Paecilomyces lilacinus………………………………...
7
1.2.1.2.1. Ubicación Taxonómica…………………………………
7
1.2.1.2.2. Características………………………………………….
7
1.2.1.2.3. Acción frente a Nematodos……………………………
8
1.2.1.2.4. Bioplaguicidas a base de P.lilacinus…………………
9
1.2.1.3.
Sustrato………………………………………………….
9
1.2.1.3.1. Elaboración de sustratos o formulados……………… 10 1.2.1.4.
Esporas………………………………………………….. 12
1.2.1.4.1. Viabilidad de las Esporas……………………………… 12 1.2.1.4.2. Germinación de esporas………………………………. 12 1.2.1.4.3. Factores que afectan la germinación de esporas….. 13 1.2.2. Marco Conceptual……………………………………………………
13
2. MARCO METODOLOGICO………………………………………………………. 16 2.1.
HIPOTESIS……………………………………………………………… 16
6
2.2.
VARIABLES……………………………………………………………. 16 2.2.1. Definición Conceptual……………………………………………….. 16
2.3.
METODOLOGIA………………………………………………………… 17
2.4.
DISEÑO EXPERIMENTAL……………………………………………. 18
3. RESULTADOS……………………………………………………………………. 20 4. DISCUSIONES…………………………………………………………………….. 26 5. CONCLUSIONES………………………………………………………………….. 28 6. SUGERENCIAS…………………………………………………………………… 29 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………….. 30 8. ANEXOS……………………………………………………………………………. 34
INDICE DE CUADROS Cuadro 1. Operacionalización de variables………………………………………… 16 Cuadro 2. Recuento de conidias de P. lilacinus en tres sustratos diferentes por tres meses…………………………………………………………………………. 20 Cuadro 3. ANVA para recuento de conidias……………………………………….. 21 Cuadro 4. ANVA para viabilidad de esporas de P. lilacinus……………………..
23
Cuadro 5. TUKEY aplicado en recuento de conidias…………………………….
23
Cuadro 6. TUKEY de viabilidad de P.lilacinus……………………………………… 25
INDICE DE FIGURAS Figura 1. Esquema experimental para determinar el efecto de los sustratos talco industrial, fécula de papa (Solanum tuberosum) y almidón de maíz (Zea mays) en la viabilidad de esporas de Paecilomyces lilacinus……………………………. 19 Figura 2. Cambio en el recuento de conidias de P. lilacinus en cada uno de los sustratos después de 3 meses de análisis…………………………………
22
Figura 3. Cambio en la viabilidad de P. lilacinus en cada uno de los sustratos después de 3 meses de análisis…………………………………………………….. 24
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RESUMEN
Debido a los ya comprobados efectos adversos derivados del uso indiscriminado de plaguicidas los investigadores se han abocado a la búsqueda de alternativas no químicas para el manejo de plagas agrícolas, siendo el control biológico una de las alternativas más promisorias. El objetivo principal de la presente investigación fue encontrar el sustrato más adecuado y económico que permita mantener la viabilidad de la espora del hongo entomopatógeno y antagonista
Paecilomyces lilacinus por mayor
tiempo en almacenamiento, además de asegurar su efectividad en el campo de cultivo. Se utilizó tres tipos de sustratos (talco industrial, harina de fécula de papa y almidón de maíz), a los cuales se inoculó 2g de espora pura del hongo P. lilacinus, además de un testigo (sustrato en fresco más esporas de dicho hongo). Estas muestras se mantuvieron en almacenamiento por un espacio de 3 meses bajo condiciones de refrigeración entre 2-4ºC, Se encontró diferencias significativas (p < 0.05) en el recuento de conidias entre el primer y último mes de análisis de viabilidad del hongo Paecilomyces lilacinus almacenado en sustrato fresco, harina de papa (Solanum tuberosum), almidón de maíz (Zea mays) y talco industrial. La harina de papa (Solanum tuberosum)fue el sustrato que presentó mayor recuento de conidias con 1.6x1010 cond./mL, en comparación con los sustratos almidón de maíz (Zea mays) con un recuento de 1.57x1010 cond./mL y talco industrial con 1.24x1010 cond./mL. El porcentaje de viabilidad fue mayor en el sustrato harina depapa (Solanum tuberosum) con 98.67%, en comparación con los sustratos almidon de maíz (Zea mays)con 97.67% y talco industrial con 97.33%. Se identificó que la harina de papa(Solanum tuberosum) fue el sustrato más adecuado para el el almacenamiento de la espora del hongo Paecilomyces lilacinus
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ABSTRACT
Currently against the plenty use of pesticides around the world, we have the challenge
of
improve
the
Biological
Control,
such
as
the
use
of
entomopathogenic fungus Paecilomyces lilacinus. For that, in order to find an optimal and cheapest substrate for spores survive in storage and better effectuality in land soil, this research was made, using like substrates talcum powder, potatoes flour and maize starch. All were inoculated with two grams of pure spores of P. lilacinus, keeping in refrigeration between 2 - 4ºC. We found significant differences (p <0.05) in the count of conidia between the first and last month's analysis of the fungus P. lilacinus feasibility stored in fresh substrate, flour potato (Solanum tuberosum), maize starch (Zea mays) and talc industrial.Potato flour (Solanum tuberosum) was the substrate showed higher counts of conidia with 1.6x1010 cond. / mL, compared with corn starch substrates (Zea mays) with a count of 1.57x1010 cond. / mL and industrial talc with 1.24x1010 cond. / mL.The viability percentage was higher in the substrate flour potato (Solanum tuberosum) with 98.67%, compared with the substrates Cornstarch (Zea mays) with 97.67% and 97.33% industrial talc.It was identified that the flour potato (Solanum tuberosum) was the most suitable substrate for storing the fungus Paecilomyces lilacinus spore.
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I.
INTRODUCCIÓN
Debido a los ya comprobados
efectos adversos derivados del uso
indiscriminado de plaguicidas los investigadores se han abocado a la búsqueda de alternativas no químicas para el manejo de plagas agrícolas. Una de las alternativas más promisorias es el control biológico que incluye el control microbiano a través del uso productos elaborados en base a hongos, bacterias y virus, conocidas en conjunto como bioplaguicidas. De estos, los hongos constituyen uno de los grupos de mayor importancia debido a la facilidad que ofrecen en cuanto a su aislamiento, producción masiva y formulación. El uso de estos microorganismos
presenta
un
interés múltiple; porque permite reducir el riesgo de sus residuos en los alimentos, cuando se consumen en fresco, como en el caso de numerosos productos hortícolas. Por otro, aumenta la seguridad laboral del agricultor y contribuye a preservar el medio ambiente, respondan a una
mediante programas que
agricultura de manejo sostenible, que responda a la
creciente preocupación de nuestra sociedad (Riva, 2007).
10
1.1.
PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
1.1.1. Realidad problemática
Actualmente, la producción de hongos entomopatógenos para el control biológico de nematodos radiculares en las plantas es una de las soluciones más buscadas, por lo cual se considera importante emplear sustratos viables ideales para la comercialización de dichos hongos, entre ellos de manera
semi industrial las esporas de Paecilomyces
lilacinus, debido a su efectividad como controladora en nematodos de los géneros Meloidogyne, Pratylenchus y Radophulus y en algunos insectos como mosca blanca y chinches; actuando también como un buen colonizador de raíz y competidor de rizósfera (Mont, 2002). En la actualidad existen en el Perú empresas comercializadoras de Paecilomyces lilacinus como producto fresco, por ejemplo Productos Biológicos para la Agricultura E.I.R.L. (PBA.E.I.R.L) en Lima-Perú, que ayuda al control de nematodos en los cultivos. En México empresas como NATURALMENTE PURESA que comercializa este hongo entomopatógeno de manera industrializada, es decir formulado, que les permite prolongar el tiempo de vida útil del producto y la venta de esporas como producto seco, generando menor costo al productor y facilidad de obtención al agricultor. Es por esto que en el presente proyecto de investigación se trabajará con tres tipos de sustrato: Talco industrial, harina de papa y harina de maíz para analizar la viabilidad de esporas de Paecilomyces lilacinus producida por la empresa SOLAGRO. SAC ubicado en la ciudad de Trujillo departamento de La Libertad.
1.1.2. Formulación del problema
¿Cuál será el efecto de los sustratos talco industrial, harina de papa (Solanum tuberosum) y almidón de maíz (Zea mays) en la viabilidad de esporas de Paecilomyces lilacinus?
11
1.1.3. Justificación
La mayor parte de los insectos que atacan a las plantas cultivadas tienen enemigos naturales que los parasitan y matan, produciendo así una reducción considerable en su población. Así, entre los principales hongos
entomopatógenos
tenemos
a:Beauveria,
Metarhizium
y
Paecilomyces, cuyo uso es un método importante de control. Sin embargo, el de mayor uso es la especiePaecilomyces lilacinus, por tener un gran rango de hospedantes
y utilizado para controlar diversos
géneros de fitonematodos comoMeloidogyne,PratylenchusyRadophulus en distintos cultivos (Cañedo y Ames, 2004). En el Perú se han trabajado en programas para el control de nematodos, observando que atacan tanto a estados móviles de estos nematodos y a las hembras sedentarias, pero es especialmente agresivo contra los huevos. Parasita las hembras de los nematodos patógenos, deforma su estilete, destruye sus ovarios y disminuye la eclosión de los huevos (Cañedo y Ames, 2004). A pesar de su importancia, no se tiene un sustrato ideal para su comercialización como producto formulado, es decir un producto basados casi en su totalidad a unidades infectivas del hongo (Riva, 2007). Frente a esta situación se viene comercializando producto fresco – refiriéndose como tal al crecimiento de hongos (incluyendo unidades efectivas) sobre granos de cereal que representa el 99% del peso total, los cuales son elaborados de manera semi artesanal ocasionando una demora de atención de pedidos urgentes como mínimo de 20 días. Por esta razón se investigará la viabilidad de esporas de Paecilomyces lilacinus en sustratos económicos y de fácil obtención para disminuir los inconvenientes presentados hasta ahora como: minimizar costos de producción y trasporte de la empresa comercializadora, reducir el espacios en almacén de producto terminado e incrementar el apoyo al desarrollo del manejo orgánico de plagas colaborando con la conservacióndel medio ambiente.
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1.1.4. Antecedentes
A partir del aislamiento del hongo Paecilomyces lilacinus solubilizador de fosfatos obtenido de cultivos de arroz en el Municipio de Valledupar, Badillo y Sandó (2010) masiva
con
miras
al
evaluaron la posibilidad de su propagación diseño
de
un
producto
biofertilizante,
determinándosesu velocidad de crecimiento en medio mínimo de sales Czapeck-dox sólido suplementado con melaza y lactosuero, utilizando 7 concentraciones de cada sustrato (2,5%; 5%; 10%; 20%; 30%; 40% y 50%), de la cual se seleccionaron las 3 concentraciones en las cuales el hongo presentó mayor crecimiento. Para el medio con melaza se determinó que eran a las concentraciones de 2,5%; 5% y 10%; con lactosuero 10%, 20% y 30%, evaluándose en cada uno su cinética de crecimiento. Se encontró que a una concentración de melaza del 10% se obtiene el mejor desarrollo de micelio y conidios por mL, y en el medio con lactosuero al 20% se obtuvieron mejores resultados.
Vargas (2011) estudió la viabilidad de las esporas puras almacenadas en refrigeración a 4-6°C a través del tiempo, los resultados indicaron que a los 5 meses aun conservan una viabilidad superior al 91,85%. Un segundo estudio se realizó en formulaciones líquidas de Paecilomyces lilacinus producidas por Novagri S.A.C., evaluándose la viabilidad en dos tratamientos: En refrigeración a 5 °C (A), y en lugar fresco y seco a una temperatura de 21-26°C (B). Los resultados mostraron que en A el formulado puede almacenarse refrigerado hasta 6 meses sin mostrar un valor de viabilidad menor al 91,2% en el sexto mes; mientras que bajo el tratamiento B, luego de 4meses, la viabilidad disminuyó hasta un 90,0%. Figueroa et al, (2007) emplearon 6 sustratos naturales (cebada, arroz, avena, fríjol, trigo y soya) para la propagación masivadel hongo entomopatógeno Paecilomyces. fumosoroseusutilizandodos cepas: una nativa y una importada, bajo condiciones de laboratorio,determinando la taza de esporulación de ambas cepas en cada uno de los medios. Con la evaluacoión se determinó que la concentración con cebada mostró la mayor productividad con
para la cepa importada y 13
para la cepa nativa, seguido en rendimiento por avena y el arroz como medios. Estadísticamente se encontraron diferencia con respecto a la esporulación entre los diferentes sustratos. Carr, et al (2003) evaluaron la reproducción de las cepas Pz-5 y LBPf-4 dePaecilomyces fumosoroseus usando diferentes sustratos (cabecilla de arroz, cáscara de arroz), tanto por vía líquida como sólida, realizando sus controles de calidad. Los resultados mostraron la posibilidad de utilizar la cabecilla de arroz como soporte sólido para la propagación de este microorganismo, donde se alcanzan concentraciones de 8-9 x 108 con/g, mientras que la combinación de levadura torula al 1% y melaza al 2% resultó superior y significativamente diferente a los otros medios ensayados, alcanzando un valor de 108 esporas/mL.
Cortez (2001) realizó el estudio de la relación entre producción de conidias del hongo Lecanicillium lecanii en diferentes sustratos (medios nutritivos y soporte) y su patogenicidad. Como medios se evaluaron: sorgo, grano de arroz, grano de arroz quebrado (granillo) polvo de arroz (pulido), y como soportes: bagazo de caña, cascarilla de arroz y "olote" de maíz. La combinación de medios y soportes proporcionó doce tratamientos más un testigo constituido solo por arroz, encontrándose diferencias significativas entre tratamientos (p< 0.05). Los sustratos con mayor producción de conidios fueron bagazo de caña y arroz (839.7 ± 1.2 x 106cond/g) y sorgo y olote (825.8 ± 1.7 x 106cond/g). Aunque el pulido fue el medio menos eficiente, la producción conidial en todas sus combinaciones fue superior a la del arroz, aunque mostró la menor producción conidial (265.4 ±1 x 106 g–1). La patogenicidad de L. lecanii sobre Toxoptera aurantii y Aphis gossypii también se vio afectada por el medio y el soporte en que se produjo. La aireación proporcionada por el soporte marcó la diferencia entre los tratamientos y el testigo. Los resultados señalan que el medio de cultivo es importante en la producción masiva de L. lecanii e indican que la patogenicidad del hongo también fue afectada por el mismo.Los resultados sugieren que la mayor o menor patogenicidad de los conidios obtenidos con los diferentes 14
sustratos posiblemente se deba a la calidad nutritiva de losmedios, pero también puede obedecer a la influencia de los soportes.
1.1.5. Objetivos 1.1.5.1. General
Analizar el efecto de los sustratos talco industrial, harina de papa (Solanum tuberosum) y almidón de maíz (Zea mays) en la viabilidad de esporas de Paecilomyces lilacinus.
1.1.5.2. Especifico
Determinar el número de esporas presentes en los sustratos de talco industrial, harina de papa (Solanum tuberosum) y harina de fécula de maíz (Zea mays). Evaluar la viabilidad de esporas dePaecilomyces lilacinus en los diferentes sustratos. Identificar el sustrato más adecuado.
1.2. MARCO REFERENCIAL 1.2.1. Marco teórico. 1.2.1.1. Hongos Entomopatógenos
Los hongos Entomopatógenos son un grupo de microorganismos ampliamente estudiados en todo el mundo, existiendo más de 700 especies pertenecientes a 100 géneros. Ellos tienen la particularidad de parasitar a diferentes tipos de artrópodos (insectos y ácaros) y de encontrarse en los habitats más variados ya sea acuáticos o terrestres y dentro de estos en cultivos anuales, semiperennes y perennes. Finalmente, su característica de penetrar al hospedante vía tegumento no es muy común entre el resto de los entomopatógenos (Lecuona, 1996). Estos hongos se encuentran en la naturaleza, en rastrojos de cultivos, estiércol del suelo, las plantas, etc. Logran un buen desarrollo en lugares frescos, húmedos y con poco sol, constituyendo el grupo de mayor importancia en el control biológico de insectos plagas. Prácticamente, 15
todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por dichos hongos. Se conocen aproximadamente 100 géneros y 700 especies de hongos entomopatógenos. Entre los más importantes
están:
Entomophthora, Fusarium,
Metarhizium,
Zoophthora,
Hirsutella,
Erynia,
Hymenostilbe,
Beauveria,
Aschersonia,
Eryniopsis,
Akanthomyces,
Paecelomyces
y
Verticillium
(Monzón, 2001).
1.2.1.2. Paecilomyces lilacinus
1.2.1.2.1.
Ubicación taxonómica Barnett (1999) expresa:
Clase: Deuteromicetos. Orden: Moniliales (Hyphomycetes). Familia: Moniliaceae. Género: Paecilomyces. Especie: P. lilacinus.
1.2.1.2.2.
Características
En la naturaleza P. lilacinus es encontrado como habitante del suelo, con habilidad de sobrevivir en materia orgánica
y siempre se
encuentra presente en el campo principalmente en zonas húmedas. P. lilacinus es también patógeno de insectos, aunque su mayor relevancia es contra fitonematodos, ya que causa una alta tasa de mortalidad reduciendo sus poblaciones
en los cultivos (Elósegui,
2006) El hongo P. lilacinus (Thom) Samson ha sido reportado como un agente potencial de control biológico de nematodos de nudo de raíz y otros nematodos parásitos de las plantas (Khan y Williams, 1998). P. lilacinusestá también relacionada con Penicillium, compartiendo su hábitat en el suelo (Chica, 2006). Las etapas sedentarias de la raíz, nudo y nematodo del quiste son más vulnerables a P. lilacinus. El hongo es capaz de colonizar las estructuras reproductivas del nematodo causando así la destrucción de las hembras, los quistes y huevos (Cardona y Leguizamon, 1997).
16
Las colonias de P. lilacinus en Agar Extracto de Malta (MEA) o Agar Papa Dextrosa (PDA) son de tonalidades violáceas; al reverso incoloro o vináceo. Los conidioforos erectos, mayormente solitarios del micelio horizontal, raramente sinematoso, amarillo a púrpura, paredes rugosas con fiálides agrupadas densamente. Los conidios fusiformes a elipsoidales, paredes lisas a suavemente. Puede producir conidióforos mononematosos o sinemas en insectos. Es un hongo típico de suelo. Tiene alguna actividad antagonista contra bacterias y hongos. Producen el antibiótico peptídico leucinostatina, efectivo contra un amplio rango de hongos y bacterias Gram positivas y también el lilacinin (Elósegui, 2006). 1.2.1.2.3.
Acción frente a nematodos
Los productos en base a P. lilacinus actúan contra los fitonematodos como productos de contacto. Este hongo produce estructuras llamadas conidias responsables del efecto sobre los nematodos. Estas conidias al hacer contacto con el cuerpo de estos organismos, se fijan en la pared externa, luego germinan y producen unas estructuras especializadas, a través de las cuales penetran en el cuerpo del nematodo. En el interior el hongo toma sus nutrientes y se reproduce masivamente invadiendo totalmente el cuerpo, que finalmente causa su muerte. En condiciones favorables de humedad, después de la invasión, las estructuras del hongo salen del cuerpo del nematodo y sobre este se producen nuevas conidias que pueden afectar a otros nematodos (Monzón y col., 2009). Los productos a base de paecilomyces no matan a los nematodos inmediatamente, ya que se requiere de cierto tiempo desde el momento de la adhesión de la conidias hasta el momento que ocurre la colonización del hongo en el nematodo. Sin embargo, a partir del momento
que
comportamiento
el
hongo
de los
penetra
al
cuerpo,
nematodos (movimiento,
se
afecta
el
reproducción,
alimentación), por lo que a partir de ese momento la plaga deja de causar daño al cultivo, hasta que finalmente muere (Monzón et al, 2009).
17
1.2.1.2.4.
Bioplaguicidas a base de Paecilomyces lilacinus
Por la eficiencia en el control de plagas y vectores, puede producirse bioinsecticidas a partirde diferentes géneros y especies de hongos entomopatógenos cuyo ingrediente activo es el propio hongo (Lozano y col. 2000). El uso de bioplaguicidas a base de P. lilacinus para el control de nematodos debe ser considerado como parte de programas de manejo integrado de plagas y no como única medida de control. Por lo tanto, para un control efectivo de nematodos, el uso de Paecilomyces debe combinarse con medidas preventivas, tales como: -
Selección adecuada del lugar de siembra
-
Uso de plantas (vivero) libres de nematodos
-
Evitar el uso de plantas de vivero procedentes de áreas infestadas con nematodos
-
Uso de material de siembra tolerante a nematodos (injertos)
-
Evitar el uso de suelo contaminado (en vivero)
-
Regulación del nivel de sombra en la plantación
-
Identificación de especies de nematodos presentes y monitoreo de la población (Monzón y col., 2009).
Se debe considerar que los productos a base del hongo P. lilacinus son una medida de supresión directa, cuya efectividad depende del contacto con la plaga, de modo que si el hongo no llega hasta el nematodo no hay control. En ese sentido, se debe garantizar que la aplicación del hongo llegue a cubrir el área o zona donde se localizan los nematodos, lo cual se logra utilizando un volumen adecuado de agua para su aplicación. P. lilacinus puede ser utilizado para el control de nematodos ya sea en plantas de vivero o en plantaciones establecidas (Monzón et al, 2009) 1.2.1.3.
Sustrato El término sustrato, que se aplica en agricultura, se refiere a todo material, natural o sintético, mineral u orgánico, de forma pura o mezclado, cuya función principal es servir como medio de crecimiento y desarrollo a las plantas, permitiendo su anclaje y soporte a través 18
del sistema radical, favoreciendo el suministro de agua, nutrientes y oxígeno. El cultivo de plantas en sustrato difiere marcadamente del cultivo de plantas en suelo. Así, cuando se usan contenedores, el volumen del medio de cultivo, del cual la planta debe absorber el agua, oxígeno y elementos nutritivos, es limitado y significativamente menor que el volumen disponible para las plantas que crecen en campo abierto. En la actualidad existen una gran cantidad de materiales que pueden ser utilizados para la elaboración de sustratos, y su elección dependerá de la especie a propagar, época, sistema de propagación, precio, disponibilidad y características propias del sustrato (Hartmann y Kester, 2002). 1.2.1.3.1.
Elaboración de sustratos o formulaciones
Monzón (2001) señala que la formulación del hongo es el proceso mediante el cual el ingrediente activo, es decir las conidias del hongo, se mezclan con materiales inertes, tales como vehículos, solventes, emulsificantes y otros aditivos. Estos materiales inertes ayudan a que el hongo trabaje mejor. Todo esto se hace con el fin de lograr una buena homogeneidad y distribución de las partículas del hongo, para poder ser manipuladas y aplicadas adecuadamente. Para ser formulado, la viabilidad del hongo no debe ser menor de 95% y el contenido de humedad debe estar entre 4 y 6 %.A temperatura ambiente las conidias mantienen su viabilidad por más tiempo cuando el hongo ha sido formulado que cuando se almacena el polvo sin formular. Tipos de formulaciones: a . Seco o polvo mojable: en la cual se utiliza un vehículo, el cual puede ser de origen mineral o vegetal, que ayuda a absorber la humedad de las conidias y mantiene la viabilidad por un tiempo considerable. Por ejemplo arcilla (caolinita), tierra de diatomeas, talco industrial, etc. (Monzón, 2001). a.1.Almidón de Maíz Se usa como alimento, excipiente en la preparación de productos farmacéuticos y otras industrias. El Instituto 19
de Ciencia Animal (ICA) empleó fécula de maíz como sustrato en un crudo enzimático con actividad fitasa a partir de fermentaciones microbianas, mostrando una efectividad en el crecimiento de las cepas estudiadas (Albelo et al, 2008). a.2.Fecula de Papa Es un polímero de reserva, compuesto por unidades repetitivas de glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa 1-4 y alfa 1-6. Se utilizó harina de fécula de papa en Bogotá con la finalidad de Inmovilizar Bacillus licheniformis y Saccharomyces cerevisiae para la producción
de
etanol,
demostrando
que
estos
microorganismos con harina de fécula de papa presentaron una mayor retención de células (26x10 6 y 10x107 UFC/g) y permite la difusión de los productos (Sossa et al., 2008) b. Liquido o emulsificable que utiliza un líquido solvente y un emulsificante. El líquido utilizado tiene la función de mantener suspendidas las conidias en el medio para lograr una mezcla homogénea que garantice una buena aplicación. Además este líquido debe evitar la absorción de agua por las conidias y mantener su viabilidad. Ambas formulaciones son de fácil manejo y su uso depende de la disponibilidad. Por ejemplo: derivados de nonil fenol y otros coadyuvantes. Los materiales utilizados en la formulación deben presentar algunas características tales como: -
No deben tener actividad biológica (efecto sobre animales o plantas)
-
Debe ser inocuo al ambiente.
-
Debe presentar características físicas adecuadas para mezclarse con las conidias.
-
Debe facilitar la aplicación del producto.
-
No debe afectar la actividad del hongo y
-
Debe ser económicamente rentable (Monzón, 2001).
20
1.2.1.4.
Espora Son estructuras del hongo que se encargan de realizar el efecto sobre los nematodos. Estas esporas al hacer contacto con el cuerpo de los nematodos, se fijan en la pared externa del cuerpo del nematodo, luego germinan y producen unas estructuras especializadas, a través de las cuales penetran en el cuerpo del nematodo (Carrillo, 2003). Las esporas suelen ser pequeñas y secas y las corrientes de aire las dispersan. Cada espora al germinar da lugar a una hifa y un micelio (Starr y Taggart,2005). Los conidióforos del género Paecilomyces son: ramificados, agrupados o irregulares. Las conidias se encuentran agrupadas en forma de cadena. P. lilacinus presenta un rápido crecimiento de sus hifas. El Conidióforo presenta grupos de ramificaciones laterales, cada una de las cuales presenta de 2 a 4 divisiones ovaladas antes de las conidias. Estas últimas, tienen una longitud de 2.5-3.0 µm y de 2.0-2.2 µm de ancho; presentan coloración lila (López, 1995).
1.2.1.4.1.
Viabilidad de las Esporas
La viabilidad de los conidias se mantiene mayor tiempo en la formulación líquida que en la sólida. Sin embargo, cuando en la formulación líquida se utilizan aceites minerales o derivados de petróleo, esta no es aceptada en producción orgánica debido al tipo de aceite que contiene. Las conidias pierden su viabilidad a partir de los 10 - 15 días cuando se mantienen a temperatura ambiente, en cambio la viabilidad se mantiene por más de 60 días en las mismas condiciones, cuando las conidias son formuladas (Monzón, 2001). 1.2.1.4.2.
Germinación de esporas
La germinación de esporas de la gran mayoría de hongos requiere al menos de alta humedad relativa, casi siempre por encima del 90% (Lecuona, 1996).
21
1.2.1.4.3.
Factores que afectan la germinación de esporas: Efecto de la temperatura Los requerimientos de temperatura para germinar varían con las especies de hongos que se trate ya que los Deuteromicetos germinan a temperaturas de 25°C. De modo general, la temperatura óptima para los diferentes hongos entomopatógenos varía de 10 a 30 °C; y paraP. lilacinus oscila entre 20-25°C (Mata, 2008). Efecto de la Luz. Todos los insecticidas microbianos son inactivados por exposición a rayos solares. El efecto directo puede causar la reducción de la estabilidad de los microorganismos y un tiempo limitado para su actividad. Las conidias de los hongos entomopatógenos expuestas a dosis sub letales de radiación UV experimentan cambios genéticos y/o fisiológicos que puede afectar el índice de germinación y crecimiento (Mata, 2008). Requerimiento de humedad. Aunque las esporas pueden sobrevivir por largos períodos en un medio extremadamente seco, una humedad relativa de cerca del 90% es necesaria para su germinación y rápido crecimiento (Nava, 2006).
1.2.2 Marco Conceptual Viabilidad: Corresponde al tiempo en que las esporas son capaces de germinar de manera exitosa permitiendo su estableciendo y colonización de los sustratos (Perez y Reyes, 1993). Sustrato: Se entiende por formulación o sustrato del Hongos Entomopatógeno (HEP) al proceso mediante el cual el ingrediente activo -ya sea conidias o micelio- se mezcla con ciertos materiales inertes, tales como vehículos, solventes, emulsificantes o gelificantes, y otros aditivos que pueden ser nutrientes o estimulantes (Urtubia y France, 2007). 22
Control biológico: El control biológico de manera general se refiere al uso de organismos vivos para restringir el desarrollo y la proliferación de un organismo indeseable (Mont, 2002), aunque también se puede definir como la acción de los parásitos predadores y patógenos para mantener la densidad de otro organismo en valor más bajo que el que se podría presentar en su ausencia (Lecuona, 1996). Hongos entomopatógenos: Estos hongos se encuentran en la naturaleza, en rastrojos de cultivos, en el suelo, las plantas, etc. Logran un buen desarrollo en lugares
frescos,
húmedos
y
con
poco
sol.
Los
hongos
entomopatógenos constituyen el grupo de mayor importancia en el control biológico de insectos plagas. Prácticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por estos hongos (Monzón, 2001). Conidio Unidad reproductiva asexuada de un hongo (Urtubia y France, 2007). Harina de papa: Está compuesta de gránulos con forma elipsoidal de 20-100 micras. El granulo se hincha y aumenta ligeramente de tamaño en presencia de agua fría, cuando las suspensiones del almidón se calientan a temperatura de 50-55ºC, los puentes de hidrogeno intermoleculares de las zonas amorfas se rompen y continua la absorción de agua en un fenómeno conocido como gelatinización. A medida que se aumenta la temperatura aumenta el agua absorbida (FABPSA, 2004). Almidón de maíz: Es el polisacárido obtenido a través de la molienda húmeda de los granos de diversas variedades del maíz(Zea mays, L), Familia Poaceae antiguamente Gramineae (NMX-F-382-1986). 23
Talco Industrial: Es un material fibroso, suave y de textura grasa, presentado en forma de polvo muy fino de color blanco. Se emplea como carga en la industria
de
la
cerámica,
pinturas,
jabones,
masilla,
lubricantes, aislamientos eléctricos (INSUMEX, 2011).
24
hules,
II.
MARCO METODOLÓGICO 2.1.
HIPÓTESIS
Con el sustrato harina de papa (Solanum tuberosum) se obtendrá una viabilidad mayor de la espora del hongo Paecilomyces lilacinus
con
respecto a los sustratos almidón de maíz (Zea mays) y talco industrial. 2.2.
VARIABLES
2.2.1. Definición conceptual Variable independiente: Sustratos de Talco industrial, Harina de papa (Solanum tuberosum) y Almidón de maíz (Zea mays). Variable dependiente: Viabilidad de esporas del hongo Paecilomyces lilacinus. 2.2.2. Definición operacional Cuadro 1. Operacionalización de variables VARIABLE
DEFINICIÓN CONCEPTUAL Material fibroso, suave y de textura grasa
Talco industrial
Se emplea comocarga en pinturas, jabones, sustratos,etc
DEFINICIÓN OPERACIONAL
El talco industrial que se empleara como sustrato para la espora del hongo Paecilomyces lilacinus
INDICADORES
Numero de conidias y porcentaje de germinación
ESCALA DE MEDICIÓN
- Porcentaje - Conidias/ml
Harina de papa (Solanum tuberosum)
Producto obtenido de la molienda de tubérculos apropiados para ser utilizados en el consumo humano
La harina de que se empleara como sustrato para la espora del hongo Paecilomyces lilacinus
Numero de conidias y porcentaje de germinación
- Porcentaje
Almidón de maíz (Zea mays)
Polisacárido que se obtiene de moler las diferentes variedades del maíz. Suele formar parte de los carbohidratos que se ingieren de manera habitual a través de los alimentos.
El almidón de maíz que se empleara como sustrato para la espora del hongo Paecilomyces lilacinus
Numero de conidias y porcentaje de germinación
- Porcentaje
Tiempo en que
Esporas germinadas de
Viabilidad
25
- Conidias/ml
- Conidias/ml
Porcentaje
permanecen viables, esto es, que son capaces de llevar a cabo una germinación exitosa
Paecilomyces lilacinus inoculadas en cada uno de los sustratos
2.3. METODOLOGÍA Para recuento de conidias Se realizó el recuento deacuerdo a lo establecido por el Servicio Nacional de Sanidad Agraria (SENASA). -
Se recepcionó la espora pura de hongo P. lilacinus.
-
Se inoculó 2 g de espora pura por sustrato: talco industrial, harina de papa (Solanum tuberosum) y almidón de maíz (Zea mays).
-
De cada sustrato inoculado se extrajo 1 g de muestra diluyéndolo con 10 ml de agua destilada estéril (ADE) + Tween 80 al 0.1%, con la finalidad de obtener una solución madre.
-
Se procedió a agitar la solución madre utilizando un vortex durante 5 minutos, con la finalidad de suspender la mayor cantidad de esporas posibles.
-
Se procedió a tomar 1 mL de esta solución madre el cual es depositado en un tubo de ensayo que contiene 9 mL de ADE+Tween 80 al 0.1%, lo que constituye la solución 10 -1 y así sucesivamente hasta obtener la dilución 10-4.
-
De la dilución 10-4 se tomó 0,01 mL con una pipeta esteril y se depositó con cuidado en la cámara de Neubauer, después de esperar 5 minutos, se procedió a su lectura en el microscopio (ver Anexo 1-6)
Porcentaje de germinación A partir de la última dilución obtenida para el recuento de esporas, se evaluó el porcentaje de germinación, para lo cual, con una pipeta estéril se procedió a tomar aproximadamente 1 mL el cual es depositado alrededor de una placa petri que contiene Agar Sabouraud Sacarosado (SDA).
26
Las placas se incubaron a temperatura ambiente y expuesta a luz constante durante 18-24 horas. Una vez transcurrido este tiempo se llevó al microscopio. La observación se hizo con el objetivo 40X y se contó un mínimo de 100 esporas (entre germinadas y no germinadas). Con los datos obtenidos se calculó el porcentaje de germinación (viabilidad), para lo cual se utilizó la siguiente ecuación:
Dónde: %G
= Porcentaje de germinación
Ng
= Número de esporas germinadas
Nng
= Número de esporas no germinadas
Análisis de Pureza Después de haber sido analizadas
las muestras incubadas en las
placas Petri, se dejaron germinar durante 3 días mas, para determinar si las muestras leídas anteriormente se encontraban contaminadas por agentes externos. (ver Anexo 7-12)
2.4. DISEÑO EXPERIMENTAL Se analizó la viabilidad de las esporas del hongo Paecilomyces lilacinus en tres sustratos: talco industrial, harina de papa (Solanum tuberosum) y almidón de maíz (Zea mays), mensualmente durante 3 meses. Se trabajó un Diseño Completamente Randomizado (DCR), con 3 tratamientos y 3 repeticiones cada uno, haciendo un total de 9 unidades experimentales, que se analizaron durante tres meses. Se utilizó un grupo control (producto fresco) como base para analizar la viabilidad de la espora. La variable dependiente (VD) es la viabilidad de esporas de hongo P. lilacinus y la variable independiente (VI) los sustratos de estudio: talco industrial, harina de papa (Solanum tuberosum) y almidón de maíz (Zea mays) como se observa en la figura 1. Para el procesamiento de los datos se aplicó el análisis estadístico ANVA y Tukey, utilizando el programa Statistica7. 27
Espora pura del hongo Paecilomyces lilacinus
TRATAMIENTO 1 SUSTRATO FRESCO
Repetición 1
Repetición 2
Repetición 3
TRATAMIENTO 3 Harina de papa (Solanumtuberosum) + espora pura
TRATAMIENTO 2 Talco industrial + espora pura
Repetición 1
Repetición 2
Repetición 3
Repetición 1
Repetición 2
Repetición 3
TRATAMIENTO 4 Almidón de maíz (Zea mays) + espora pura
Repetición 1
Repetición 2
Repetición 3
Figura 1. Esquema experimental para determinar el efecto de los sustratos talco industrial, harina de papa (Solanum tuberosum) y almidón de maíz (Zea mays) en la viabilidad de esporas de Paecilomyces lilacinus.
28
III.
RESULTADOS
Para evaluar los cambios en el contenido de conidias y la viabilidad de la espora de P. lilacinus, se realizó un estudio mensual de dicha espora inoculado en los diferentes sustratos, cuyos datos se pueden evidenciar en el Cuadro 2. Cuadro 2.Recuento de conidias de P.lilacinus en tres sustratos diferentes por 3meses Conteo de REPETICIONES
conidias
CAMBIO Viabilidad
Nº conidias/ml 98%
6.75 x10
9
98%
7.75 x10
9
98%
3.50 x10
10
99%
3.50 x10
10
99%
3.00 x10
10
99%
3.25 x10
10
98%
2.75 x10
10
99%
3.00 x10
10
98%
3.25 x10
10
99%
2.70 x10
10
99%
2.75 x10
10
99%
1.05 x10
9
98%
0%
1.25 x10
9
97%
1%
1.25 x10
9
98%
0%
1.75 x10
10
98%
1%
2.05 x10
10
99%
0%
1.63 x10
10
98%
1%
1.70 x10
10
99%
-1%
1.65 x10
10
99%
0%
1.59 x10
10
99%
-1%
1.60 x10
10
99%
0%
1.57 x10
10
99%
0%
1.57 x10
10
98%
1%
0.85 x10
9
97%
1%
0.75 x10
9
96%
2%
0.10 x10
9
96%
2%
2.40 x10
10
99%
0%
2.10 x10
10
98%
1%
R3
1.65 x10
10
98%
1%
R1
2.05 x10
10
97%
1%
4.75x10
R2 R3
Harina de 1°
papa+ espora
A
R1 R2 R3
FECH Almidón de maíz + espora
R1 R2 R3
Talco Industrial + espora pura Sustrato Fresco
R1 R2 R3 R1 R2 R3
Harina de 2°
papa+ espora
A
R1 R2 R3
FECH Almidón de maíz + espora
R1 R2 R3
Talco Industrial + espora pura Sustrato Fresco FECH A
R1 R2 R3 R1 R2 R3
3° Harina de papa+ espora Almidón de
VIABILIDAD
9
R1 Sustrato Fresco
EN
R1 R2
29
maíz + espora
R2 R3 R1
Talco Industrial +
R2
espora pura
R3
2.00 x10
10
97%
2%
1.25 x10
10
98%
0%
1.30 x10
10
97%
2%
1.26 x10
10
98%
1%
1.30 x10
10
97%
2%
0.60 x10
9
96%
2%
0.65 x10
9
96%
2%
0.75 x10
9
96%
2%
1.60 x10
10
99%
0%
1.53 x10
10
98%
1%
1.65 x10
10
99%
0%
1.57 x10
10
97%
1%
1.53 x10
10
98%
1%
1.60 x10
10
98%
0%
1.25 x10
10
97%
2%
1.23 x10
10
97%
2%
1.23 x10
10
98%
1%
R1
Sustrato
R2
Fresco
R3 R1
Harina de
R2
papa+ espora
4°
R3
FECH A
R1
Almidón de
R2
maíz + espora
R3 R1
Talco Industrial +
R2
espora pura
R3
Para determinar la variación del recuento de conidias fue necesario realizar un análisis ANVA, cuyos resultados se muestran en el Cuadro 3.
Cuadro 3. ANVA para recuento de conidias ANVA-RECUENTO DE CONIDIAS FV
GL
SC
CM
3
2,573440E+20
8,578132E+19
Error
8
5,517833E+19
6,897292E+18
Total
11
3,125223E+20
TIPO DE SUSTRATO
Dónde: FV: Fuente de Varianza GL: Grados de Libertad SC: Suma de Cuadrados CM: Cuadrados Medios F y p: Intervalos de confianza
30
F 12,4370
p 0,002216
En la Figura 2 se muestra el cambio en el recuento de conidias de P. lilacinus en cada uno de los sustratos, después de 3 meses de estudio.
SF
HP
AM
TI
Figura 2. Cambio en el recuento de conidias de P. lilacinus en cada uno de los sutratos después de 3 meses de análisis
Donde: SF: Sustrato fresco HP: Harina de papa AM: Almidón de maíz TI: Talco industrial
31
Para determinar la variación de la viabilidad, fue necesario realizar un análisis ANVA, cuyos resultados se muestran en el Cuadro 4.
Cuadro 4. ANVA para viabilidad de esporas de P. lilacinus ANVA-VIABILIDAD FV
GL
SC
CM
F
p
3
0,000567
0,000189
7,55556
0,010135
Error
8
0,000200
0,000025
Total
11
0,000767
TIPO DE SUSTRATO
Dónde: FV: Fuente de Varianza GL: Grados de Libertad SC: Suma de Cuadrados CM: Cuadrados Medios F y p: Intervalos de confianza
Se realizó una prueba Tukey para verificar si existe diferencia significativa entre el tipo de sustrato empleado para la conservación de la espora de P. lilacinus.
Cuadro 5. Prueba TUKEY aplicado en recuento de conidias TUKEY-RECUENTO DE CONIDIAS TIPO DE
{1}
SUSTRATO
575E7
{2} 1740E7
{3} 1433E7
{4} 1663E7
1
GC
0,002904
2
CHE
0,002904
3
ME
0,016717
0,516864
4
TIEP
0,004353
0,983287
0,016717
0,004353
0,516864
0,983287 0,714638
0,714638
En el Cuadro 5. se observa quesi existe diferencias significativas (p<0.05) entre el conteo de conidias del hongo P. lilacinus, según el tipo de sustrato con respecto al grupo control. 32
En la Figura 3 se muestra el cambio en la viabilidad de P. lilacinus en cada uno de los sustratos después de 3 meses de análisis
SF
AM
HP
TI
Figura 3. Cambio en la viabilidad de P. lilacinus en cada uno de los sustratos después de 3 meses de análisis.
Donde: SF: Sustrato fresco HP: Harina de papa AM: Almidon de maíz TI: Talco industrial
33
Se realizó una prueba Tukey para determinar si existe diferencia significativa de viabilidad en los diferentes sustrato empleado para la conservación de la espora de P. lilacinus.
Cuadro 6. TUKEY de viabilidad de P.lilacinus. TUKEY-VIABILIDAD TIPO DE
{1} .0200
SUSTRAT
0
{2} .00333
{3} .00667
{4} .01667
O 1
GC
0,015039
2
CHE
0,015039
3
ME
0,045828
0,845277
4
TIEP
0,845277
0,045828
0,045828
0,845277
0,845277
0,045828 0,144294
0,144294
En el Cuadro 6se muestra si existe diferencias significativas (p<0.05) entre los sustratos empleados para mantener la viabilidad de la espora de P. lilacinus en espacio de tiempo de 3 meses.
34
IV.
DISCUSIÓN
Los resultados de este estudio mostraron que el talco industrial, la harina de papa(Solanum tuberosum) y el almidón de maíz(Zea mays)
como
sustrato mantuvieron mayor cantidad de conidias durante 3 mesescon un conteo entre 3-1 x 1010cond/mL, respecto al sustrato fresco, cuyo resultados se encuentran entre 6 - 0.6 x109 cond/mL. El conteo de conidias de harina de papa(Solanum tuberosum) en la última fecha de estudio fue de 1.6x1010cond./mL (Figura 1), probablemente debido a su alto contenido de carbohidratos y otros compuestos especialmente microelementos y vitaminas, necesarios para mantener la conservación de las esporas de Paecilomyces lilacinus (Figueroa (2007).
En la Figura 2,la disminución en la cantidad de esporas de P. lilacinus en sustrato fresco es muy notoria respecto a los otros sustratos, contándose al tercer mes solamente 0.57x1010 cond./mL.. En harina de papa (Solanum tuberosum) elnúmero de conidias se mantiene con respecto al tiempo lo cual indica una
menor variabilidad, por lo tanto es el sustrato más
adecuado mantener a las esporas de P. lilacinus para su uso como controladores biológicos formulados.
SENASA (2009) indica que si el producto tiene una concentración de conidias/ml mayor o igual a 109, está apto para ser utilizado en campo. Contrastando con resultados expuesto por Carr (2003), quien reprodujo Paecilomyces fumosoroseus en diferentes sustratos obteniendo recuento de conidias promedio entre 8-9x108 cond/g, empleando como sustrato la cabecilla de arroz, probablemente porque los soportes sólidos usados son para producción semi artesanal y lo que se busca es el crecimiento de la espora en dichos sustratos.
En el Cuadro 4 en referencia al cambio en el recuento de conidias realizada mensualmente por un total de 3 meses, se observa que no existen diferencias significativas entre la harina de papa(Solanum tuberosum), almidón de maíz (Zea mays) y talco industrial, siendo el 35
método de selección para la aplicación de estos como sustratosun tema económico, en relación a la cantidad de conidias conservadas. Sin embargo,Vargas (2011) resalta que se debe analizar la viabilidad de dichas esporas para garantizar su efectividad.
Con respecto a la viabilidad,y para asegurar su buena acción como controlador biológico, se trabajó paralelo a los conteos de conidias, determinándose que el sustrato que tuvo menorvariación menorfue la harina de papa (Solanum tuberosum), manteniendo su viabilidad en un 98.67% después de 3 meses de almacenamiento (Figura 3), respecto a los dos sustratostalco industrial y almidón de maíz, y al testigo comosustrato fresco. Este resultado es 6.77% más que los resultados obtenidos por Vargas (2011) que analizó la viabilidad de espora pura de P. lilacinusalmacenadas por 5 meses obteniendo como resultado una viabilidad promedio de 91.9%, diferencia debido a que la espora de dicho hongo en esta investigación cuenta con sustratos que le brindan un habitad adecuada para un mayor tiempo de vida a través del tiempo de estudio. Este porcentaje de viabilidad de la espora es aceptable para su utilización en campos de cultivo. SENASA (2009) manifiesta que si el porcentaje de viabilidad es igual o superior al 90%, se considera que la viabilidad del producto es satisfactoria.
Existe una diferencia mínima estadísticamente evidenciable entre la harina de papa (Solanum tuberosum) y el almidón de maíz (Zea mays), en la cantidad de esporas viables de dichos sustratos. López (1995) expresa que esto se debe a que dichos sustratos son rico en elementos minerales y orgánicos, incluyendo vitaminas, produciendo mejor supervivencia de la espora de P. lilacinus,para obtener un buen desarrollo y una buena esporulación.
36
CONCLUSIONES
Se encontró diferencias significativas (p < 0.05)en el recuento de conidias entre
el
primer
y
último
mes
de
análisis
de
viabilidad
del
hongoPaecilomyces lilacinusalmacenado en sustrato fresco, harina de papa(Solanum tuberosum), almidón de maíz (Zea mays) y talco industrial. La harina de papa (Solanum tuberosum)fue el sustrato que presentó mayor recuento de conidias con 1.6x1010 cond./mL, en comparación con los sustratos almidón de maíz (Zea mays)conun recuento de 1.57x1010 cond./mL y talco industrial con1.24x1010 cond./mL. El porcentaje de viabilidad fue mayor en el sustrato harina depapa (Solanum tuberosum) con 98.67%, en comparación con los sustratos almidon de maíz (Zea mays)con 97.67% y talco industrial con 97.33%. Se identificó que la harina de papa(Solanum tuberosum) fue el sustrato más adecuado para el el almacenamiento de la espora del hongo Paecilomyces lilacinus
37
V.
SUGERENCIAS
Para una mejor evaluación del porcentaje de viabilidad de la espora de Paecilomyces lilacinus, se recomienda que el tiempo de análisis sea más prolongado, sugiriéndose hasta los 6 meses.
De preferencia el almacenamiento de las muestras utilizadas en este tipo de investigaciones, debe de ser aislada de microorganismos contaminantes y expuestos a temperaturas constantes de refrigeración.
38
VI.
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42
VII.
ANEXOS
Anexo 1. Diagrama de recuento de conidias 1 gr
Solución madre
1gr espora pura+sustrato + ADE+Tween 80 al 0.1%
1gr espora pura + 10 gr sustrato
1 mL
Dilución -2 10
Dilución -3 10
Dilución -1 10 1 mL
9 mLADE+Tween 80 al 0.1% Recuento en Camara de Neubauer
Formula: N° conidias/mL= X . 5 . 104 . ID Donde: 5= N° cuadraditos contados en el cuadrante central X= promedio de conidias contadas ID= inversa de la dilución empleada
Fuente: Elaboración propia
43
ANEXO 2. Pesado de la mezcla de la espora pura de P. lilacinus más sustrato
ANEXO 3. Diluciones hasta llegar a la dilución 10-4
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Anexo 4. Recuento en Camara de Neubauer
ANEXO 5. Rotulado de placas petric que se utilizaron para siembra en cultivo agar Sabouraud Sacarosado (SDA).
45
ANEXO 6. Siembra de la dilución 10-3, del sustrato más espora pura, en placa con agar Sabouraud Sacarosado (SDA).
Anexo 7. Análisis de pureza del Talco Industrial más espora pura de P. lilacinus, después de 3 días de siembra en placa agar Sabouraud Sacarosado (SDA).
46
Anexo 8. Análisis de pureza del harina de fécula de papa(Solanum tuberosu) más espora pura de P. lilacinus, después de 3 dias de siembra en placa agar Sabouraud Sacarosado (SDA).
Anexo 9. Análisis de pureza del Almidón de maiz (Zea mays) más espora pura de P. lilacinus, después de 3 dias de siembra en placa agar Sabouraud Sacarosado (SDA).
47
Anexo 10. Análisis de pureza del Talco Industrial más espora pura de P. lilacinus, después de 3 dias de siembra en placa agar Sabouraud Sacarosado (SDA) en la 4º Fecha.
Anexo 11. Análisis de pureza del Harina de fécula de papa (Solanum tuberosu) más espora pura de P. lilacinus, después de 3 dias de siembra en placa agar Sabouraud Sacarosado (SDA) en la 4º Fecha.
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Anexo 12. Análisis de pureza del Almidón de maíz (Zea mays) más espora pura de P. lilacinus, después de 3 dias de siembra en placa agar Sabouraud Sacarosado (SDA) en la 4º Fecha.
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