evaluación de viabilidad celular

Biotecnología Médica Ancco Mamani Midwar

Ingeniería Biotecnológica Universidad Católica de Santa María

EVALUACION DE LA VIABILIDAD CELULAR: METODO DE EXCLUSION DEL AZUL DE TRYPAN Midwar R. Ancco Mamani Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Bioquímicas y Biotecnológicas, Programa Profesional de Ingeniería Biotecnológica, Universidad Católica de Santa María, Urb. San José s/n, Yanahuara, Arequipa, Perú. e-mail: [email protected]

Resumen En la práctica se utilizó azul de tripán que es un colorante azoico que se utiliza en tinciones histológicas para ensayos de viabilidad que permiten diferenciar células vivas de células muertas. Las células vivas o tejidos con la membrana celular intacta no se colorean debido a que la membrana celular es selectiva respecto a qué compuestos pueden atravesarla. En las células viables, con membrana intacta, no se incorpora el azul de tripano; por el contrario, sí atraviesa la membrana de las células muertas. Por lo tanto, las células muertas se muestran de un distintivo color azul bajo el microscopio empleando una cámara de Neubauer para contarlas. Debido a que las células vivas excluyen al colorante y no se tiñen. Palabras clave: azul de tripan, viabilidad celular, membrana, cámara de Neubauer.

Abstract In practice trypan blue azo dye which is used in histological staining for viability assays that distinguish live cells from dead cells are used. Live cells or tissues with intact cell membranes are not colored because the cell membrane is selective as to which compounds can penetrate. Viable cells have an intact membrane, trypan blue is incorporated; on the contrary, does cross the membrane of dead cells. Hence, dead cells are shown in a distinctive blue color under a microscope using a Neubauer counting chamber. Since living cells exclude the dye and not dyed. Keywords: trypan blue, cell viability, membrane Neubauer chamber .



INTRODUCCION

El azul trypan es un colorante azoico que se utiliza en tinciones histológicas para ensayos de viabilidad que permiten diferenciar células vivas de células muertas.

Las células vivas o tejidos con la membrana celular intacta no se colorean debido a que la membrana celular es selectiva respecto a qué compuestos pueden atravesarla. En las células viables, con membrana intacta, no se incorpora el azul de tripano; por el contrario, sí atraviesa la membrana de las células muertas. Por lo tanto, las células muertas se muestran de un distintivo color azul bajo el microscopio (típicamente, empleando una cámara de Newbauer para contarlas).3 Debido a que las células vivas excluyen al colorante y no se tiñen, este método también se llama método de tinción por exclusión. El azul de trypan se usa comúnmente en microscopía (para el recuento de células) y en ratones de laboratorio para la evaluación de la viabilidad de tejidos. El método no puede distinguir entre células necróticas y células muertas por apoptosis. 1.1. Colorantes

Un colorante es un cuerpo coloreado que puede comunicar su color a otro cuerpo. Según su origen pueden ser:  Naturales  Sintéticos o Artificiales Según sus propiedades químicas:  Ácidos  Básicos  Neutros  Indiferentes 1.2. Ventajas de colorantes 

Facilita la identificación de células, bacterias o en general de objetos microscópicos.





Los colorantes tiñen de forma parcial, total o gradual las diferentes estructuras que integran los objetos y principalmente los productos que se desean observar.

1.3. Desventajas de colorantes 

Después de su empleo difícilmente se puede utilizar sobre las preparaciones teñidas otro colorante, en consecuencia, después de emplear las tinciones se ha modificado las propiedades fisicoquímicas del contenido de la preparación ya que el empleo de colorantes está basado en características físicas y químicas.

1.4. Tipos de coloraciones:  

II.

OBJETIVOS Evaluar la viabilidad de una suspensión celular. Determinar el número de células viables en una suspensión celular.

 

III.

Directas: se producen por inmersión en el baño colorante. Indirectas: en este tipo de coloración, el colorante no puede actuar directamente, el objeto que ha de colorearse debe ser tratado de antemano por otra sustancia que lo prepare para admitir el colorante, esta se llama mordiente.

MATERIALES Y REACTIVOS -

PBS Azul de Trypan (0.2%) Suspensión Celular Micropipetas 0 - 20l – 200 - 100l Microscopio



- Cámara de Newbauer (hemocitometro) IV.

PROCEDIMIENTO 1. Se centrifugo una alícuota de una suspensión celular de la cual se desea determinar la viabilidad durante 2 minutos a 4000 rpm y luego se descarto el sobrenadante. 2. Se resuspendió el pellet en 1ml de PBS o medio de cultivo libre de suero. 3. Se mezclo 1 parte de la suspensión celular (diluida en PBS) con una parte del azul de trypan (0.4%). Se incubo la mezcla por 3 minutos a temperatura ambiente. 4. Se aplico una gota de la mezcla células – azul trypan en una cámara de Newbauer. Se coloco el hemocitometro en la platina del microscopio y se enfoco las células con el objetivo de 40x. 5. Se contaron las células viables (no teñidas) y las células no viables (teñidas).

V.

RESULTADOS 1. Haga los cálculos para determinar el número de células por ml - Se contabilizaron 836560 cel/ml 2. Determinar el porcentaje de viabilidad celular

  () 

        

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- Se obtuvo un 92.78% de células viables VI.

CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el fundamento del Método de Exclusión del Azul de Trypan? - El azul de trypan es un colorante utilizado para el recuento de células íntegras por exclusión de dicho colorante. Este método está basado en que las células vivas (viables) no captan el azul de trypan mientras que las células muertas (no viables) si lo hacen. Se cuentan como muertas las células teñidas de azul y como vivas las refringentes. 2. ¿Por qué se debe evitar utilizar un medio de cultivo con suero, en la evaluación de la viabilidad celular por el método de azul de trypan? - Esto se debe a que el azul de trypan tiene alta afinidad por las proteínas.

3. ¿Cuáles serian las ventajas y desventajas del método de exclusión del azul de trypan?



- Ventajas  Permite obtener información del daño inducido a células aisladas.  No es necesario trabajar con células en proliferación.  Fácil aplicación (en cualquier tipo celular).  Puede aplicarse en estudios tanto in vitro con in vivo.  Alta sensibilidad (detecta muy bajos niveles de daño al ADN)  Se requieren bajas cantidades de células (<200000).  Relativamente poco tiempo para la obtención de resultados. - Desventajas  Después de su empleo difícilmente se puede utilizar sobre las preparaciones teñidas otro colorante.  Después de emplear las tinciones se ha modificado las propiedades fisicoquímicas del contenido de la preparación ya que el empleo de colorantes está basado en características físicas y químicas. 4. ¿Qué otros colorantes se puede usar en la determinación de la viabilidad celular? - Existen cinco métodos principales para determinar la viabilidad celular. Tres se basan en la exclusión de pigmentos por las células vivas y se pueden evaluar con el microscopio óptico. Los pigmentos utilizados son el azul de trypan, la eosina y la nigrosina (las células muertas aparecen teñidas de azul, rojo o negro; respectivamente). Los otros dos métodos se basan en el acetato de fluoresceína y el naranja de acridina/bromuro de etidio y se valoran con un microscopio de fluorescencia o por citofluorometria de flujo. Solo las células vivas hidrolizan el acetato de fluoresceína produciendo una fluorescencia verde. La acridina tiñe las células vivas de verde mientras que el bromuro de etidio solo impregna las células muertas que aparecen rojas a la fluorescencia. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

http://www.ataonline.org.ar/stop/pdf/7c_fsimoniello.pdf http://www2.uah.es/tejedor_bio/bioquimica_ambiental/guion-citotoxicidad.pdf http://worldwidescience.org/topicpages/multi/ES/t/trypan+blue.html http://docencia.izt.uam.mx/sgpe/files/users/uami/lebo/6Cultivocelular_ColorantesFluorescentesEnsayos.pdf - http://books.google.com.pe/books?id=p2BmCezyycsC&pg=PA32&lpg=PA32&dq=met odo+de+exclusion+del+azul+de+tripan&source=bl&ots=QHXlfoekFC&sig=DS0xl_btL9 7HZ3MPUZSkL7GByJw&hl=es&sa=X&ei=o3GUZWYA4354AO2r4GgCA&ved=0CFQQ6AEwBQ#v=onepage&q=metodo%20de%2 0exclusion%20del%20azul%20de%20tripan&f=false - http://www.slideshare.net/medicinac/tcnicas-de-tincin -

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