Sumario La construcción de un ser vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Natalia López Moratalla
Genes inteligentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
Tim Beardsley
La fecundación en los mamíferos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
16
Paul M. Wassarman
Una herencia distinta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
24
Robin Holliday
Impronta parental de los genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 Carmen Sapienza
Espermatogénesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
Cristóbal Mezquita Pla
Las histonas, proteínas reguladoras de genes . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Michael Grunstein
El gen de la histona H 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 Jovita Mezquita Pla
Carbohidratos en el reconocimiento reconocimiento celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 Nathan Sharon y Halina Lis
Glicoesfingolípidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
80
Sen-itiroh Hakomori
Genes con homeobox y el plan corporal de los vertebrados . . . . . 92 Eddy M. De Robertis, Guillermo Oliver y Chistopher V. V. E. Wright
Base molecular del desarrollo desarrollo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
100
Walter J. Gehring
Arquitectos moleculares del diseño corporal . . . . . . . . . . . . . . . . 112 William McGinnis y Michael Kuziora
Sustitución dirigida de genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 Mario R. Capecchi
Notas Impronta paterna e impronta materna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 El equilibrio de la dosis informativa del cromosoma X . . . . . . . . . . . . . . . 41 Antonio García-Bellido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 La vitamina A y su cohorte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 ¿Niño o niña? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 Cosecha de homeobox . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 Linajes celulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128
La construcción de un ser vivo Natalia López Moratalla
T
odos los seres vivos, entre los que cada uno de nosotros se cuenta, están formados por células. Hay una enorme variedad de ellas, que tienen formas y tamaños tan distintos entre sí como lo puedan ser las apariencias de un microbio y de un elefante. Y también hay una enorme variedad de seres vivos, desde los que no consisten más que en una sola célula hasta los formados por millones y millones de ellas. En marcado contraste con el mundo inerte de su entorno (el agua, el aire o el suelo, que podemos explicar con fórmulas químicas relativamente sencillas), las estructuras de los seres vivos son intrincadas asociaciones de moléculas comple jas, generalmente organizadas en una jerarquía de niveles diferenciados. Cada componente y cada parte del organismo tiene su función propia, al tiempo que mantiene una fina armonía con el con junto, lo que hace que éste, el individuo, viva. En cualquier ser vivo el conjunto individual es más que la mera suma de las partes. Pero empecemos por hacernos una idea general. Hasta el más modesto de los seres vivos es capaz de tomar de su entorno los materiales disponibles y emplearlos en la obtención de la energía que necesita para alimentarse, moverse, reproducirse, etc. Son estos mismos materiales los que se transforman en las estructuras con las que construye y modela su propio organismo. Pero la interacción de los seres vivos con el ambiente no se limita a esta captación de materiales y de energía, sino que, por un lado, también lo transforman y, por otro, se adaptan con frecuencia a lo que les ofrece, autorregulando sus capacidades. Con todo, el atributo más llamativo y característico de los seres vivos es su capacidad de producir una réplica fiel de sí mismos, es decir, de utilizar una energía y unos materiales disponibles para construir otra entidad de la misma complejidad y características. ¿Cómo es esto siquiera imaginable? Construir evoca de inmediato la idea de edificar, fabricar, hacer de nuevo algo siguiendo un diseño o un proyecto. La construcción de un ser vivo se parece, en cierto sentido, a la tarea de armonizar las notas musicales para que surja el complejo entramado de una sinfonía. Con 2
frecuencia se compara el mensaje genético, el diseño para que se construya un ser vivo contenido en los genes, con una partitura musical. La música escrita sería el equivalente del mensaje genético que define una especie —bacteria, nogal, camello—. Y así como una misma partitura puede interpretarse miles de veces con sutiles cambios de matiz expresivo, cada especie puede concretarse en miles o millones de individuos, que son iguales y a la vez diversos. Mientras que una partitura se escribe y se interpreta mediante notas musicales, el mensaje genético se escribe, se expresa y se traduce en clave de compuestos químicos capaces de combinarse. Pero, más allá de cualquier analogía, un ser vivo no es un artefacto, ni una poesía, ni una canción. Tiene una vida suya y propia, con un inicio, un desarrollo temporal en el que se completa, crece, se adapta a diversas circunstancias del ambiente, se reproduce y alcanza su final. Desde la más remota antigüedad los hombres se han preguntado acerca de ese “vivir” de los seres vivos: ¿cómo surgen?, ¿por qué hasta el más insignificante de los organismos es capaz de engendrar otro igual a él, mientras que el más maravilloso de los diamantes jamas podrá hacer una réplica suya?, ¿cómo consiguen una semilla o un huevo fecundado llegar a ser planta o animal?, ¿por qué todo lo que tiene vida muere inexorablemente en un período de tiempo siempre relativamente breve? Sólo en la segunda mitad del siglo XIX comenzó la ciencia biológica a comprender algo de la lógica de los seres vivos. Desde la especulación basada en la observación contemplativa de lo viviente se fue abriendo paso un conjunto de ciencias activas y rigurosas, con bases firmes en que asentar nuevos descubrimientos, capaces de dar razón de esa lógica de la vida al explicar los procesos vitales en términos de unas moléculas cuya estructura les permite organizarse en otras estructuras superiores: complejos moleculares, células, tejidos, órganos y organismos. Sabemos actualmente que la clave del proceso se encierra en las estructuras tan peculiares que son los cromosomas, celosamente custodiados de ordinario en el núcleo de la célula. Contienen éstos la
información genética encriptada en forma de secuencias específicas de los cuatro nucleótidos del ADN. Un material muy particular, que no sólo sirve como receptáculo de información, sino que, merced a la complementariedad de su estructura, permite que el proceso molecular de realización de copias tenga la elasticidad suficiente para que, al tiempo que se conserva lo fundamental del mensaje previo, se puedan “inventar” nuevos mensajes. Es así como los seres vivos surgen por generación de progenitores y evolucionan. Los materiales de construcción y la energía
Los materiales de que están construidos los seres vivos son en su mayoría compuestos orgánicos de carbono, en estado reducido o hidrogenado y acompañados de nitrógeno. Se combinan de formas muy variadas y a veces extraordinariamente complejas. Se calcula que una bacteria como Escherichia coli , uno de las seres vivos unicelulares más sencillos, tiene unos cinco mil tipos diferentes de estas moléculas. Es, sin embargo, muy simple, si se la compara con un organismo superior. Se calcula que el cuerpo humano tiene unas cien mil proteínas diferentes, frente a las tres mil de esta bacteria. Y si tenemos en cuenta que existen alrededor de un millón y medio de especies, el conjunto podría ascender a unos cuantos billones de moléculas diferentes, lo que supone un gran contraste con el reducido número de moléculas constituyentes de la materia inanimada. Desde otro punto de vista, sin embargo, la organización molecular básica de una célula es relativamente simple, puesto que los grandes bloques constructivos, o sillares, de la gran mayoría de las biomoléculas mencionadas pertenecen a un reducido número de tipos. Estas moléculas sencillas, y comunes a todos los seres vivos, se combinan de formas distintas para formar orgánulos, fibras o membranas. Dos de ellas, los ácidos nucleicos –el ADN y el ARN– y las proteínas necesariamente presentes en todo organismo dan identidad a cada una de las especies. Cada individuo de una especie posee un conjunto, distintivo de la especie, de ambas biomoléculas. Las células actúan como fábricas dotaTEMAS 3
das de una maquinaria de gran precisión de este tipo, que se denomina conjugación. de las numerosísimas combinaciones de genes posibles. que produce las moléculas requeridas. Su El resultado inicial es una única célula. funcionamiento depende en buena medida En rigor sólo es reproducción sexuada Un organismo pluricelular está forde que algunas de sus proteínas sean la que transmite la vida por fusión de las mado, sin embargo y como hemos dicho, enzimas, es decir, catalizadores de gran células germinales, o gametos, proceden- por muy distintos tipos de células. ¿Cómo especificidad y eficacia, que aceleran la tes de dos individuos de diferente sexo. se llega a ellas desde esa célula única? La velocidad de síntesis, con rendimientos Cada gameto porta únicamente la mitad respuesta está en su multiplicación repede reacción del 100 por cien y que no de los cromosomas normales, de modo tida, acompañada de una diferenciación generan subproductos. Para realizar su que, al fundirse los gametos en la fecun- sucesiva, determinadas ambas de forma trabajo no necesitan elevadas temperatu- dación, cada individuo recibe en esa pri- detallada por el genoma. La diferenciación celular es un proceso ras ni presiones. El funcionamiento tan mera célula una dotación cromosómica especial de estos procesos de fabricación completa, formada por una combinación ordenado y preciso por el cual unos genes de los componentes celulares se apoya en de los conjuntos de cromosomas, o geno- concretos se activan y permiten su la estructura de las propias biomoléculas, mas, paterno y materno. Esta mezcla le expresión, mientras que otros permanecen que son capaces de reconocerse entre sí e confiere su individualidad, basada en una inactivos. La diversa actividad interna interactuar de forma extraorresultante hará que la célula adquiera un tipo determidinariamente selectiva y especifica. nado, tenga un fenotipo concreto: fabricará un tipo u otro La energía necesaria para la síntesis de biomoléculas, de materiales, tendrá un para el transporte de materiatamaño y forma determinales por el interior celular, dos, y no otros, y desempepara la locomoción, etc., es ñará un tipo u otro de función. toda energía química, que En muchos casos la diferenproviene del ATP (adenosina ciación viene a ser como un acontecimiento final: una trifosfato), la moneda energética universal. El ATP hace célula embrionaria recorre muchos pasos hasta llegar a posible el aporte de energía al hidrolizar o transferir un ser un hepatocito y construir el hígado, pero una vez que fosfato terminal, convirtiénCélula dose en ADP (adenosina entró en esa vía tiene ya nerviosa Célula de adquirido el compromiso de difosfato). Este ADP puede túbulo renal participar de nuevo en reacser ese tipo celular y no otro. La diferenciación no es una ciones que aporten energía química y le permitan recucapacidad exclusiva de los perar un grupo fosfato. Las organismos superiores, anicélulas captan energía del males o plantas, constituidos entorno y la aprovechan para por millones de células de la síntesis de ATP. Esto muy diversos tipos. Los misucede tanto si obtienen la croorganismos unicelulares también se diferencian, es energía de la luz solar (céluLeucocito las fotosintéticas), como si decir sufren cambios notables de estructuración, modificánaprovechan la que proviene de moléculas, como la gludose en respuesta a las variaciones del entorno. Por cosa, cuyas reacciones de degradación tienen gran ejemplo, si no hay nutrientes Bacterias adecuados, un hongo puede potencial energético, que consumen en su metabodesarrollar una espora: una célula inactiva capaz de lismo; esto es lo que hacen las células llamadas heterosobrevivir en ambientes Eritrocitos tróficas. Las células cuentan adversos durante largo tiem po con dos tipos de orgánulos y germinar después cuando para realizar esta función: los reaparezcan las condiciones cloroplastos, que absorben la propicias, generando una luz solar, y las mitocondrias, célula vegetativa. Y de igual forma una bacteria expresa que mediante reacciones de oxidación obtienen la eneruna batería de genes que codifican las proteínas necesarias gía contenida en las moléculas “energéticamente ricas”. para sintetizar un determinado compuesto, un aminoácido Un notable modo por ejemplo, si no lo tiene en de construir el entorno; por el contrario, si lo tiene, reprimirá la expreMás del 95 por ciento de Célula acinar sión de esos genes. las especies vivas tienen una pancreática Célula de músculo estriado El mecanismo de la exprereproducción sexuada. sión y de la represión selec1. DIVERSOS TIPOS DE CELULAS, representativos de sus granIncluso las bacterias poseen des diferencias morfológicas. tiva de un gen, o de un conuna forma de reproducción CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
3
la célula que las recibe, que puede estar ya predeterminada para seguir un destino concreto. El diseño de construcción de un vegetal configura un programa bastante más simple que el requerido para el desarrollo de un animal. La diferencia fundamental s e r estriba en la notable capaciValina Isoleucina Leucina Metionina Fenilalanina a l o dad que tienen las plantas p o para responder a los cam N bios del entorno exterior con modificaciones de su crecimiento e incluso de su construcción. Así, según sea la intensidad o la duración de luz que recibe, la planta a responderá acortando o alar g r a gando los entrenudos de su c n tallo. Y también, dependienGlicina Alanina Prolina Triptófano Tirosina i s , do de ciertas condiciones s e r a ambientales, la zona cono l o P cida como meristemo apical puede continuar formando nuevas ho jas y tallos o, por el contrario, modificar su programa de desarrollo y dar flores. A pesar de ser mucho más complejo, el desarrollo aniSerina Treonina Cisteína Asparagina Glutamina mal ha sido mucho más estudiado y se conoce mejor que el vegetal. En el caso de a a v v i i t los animales el programa es t i s a o g mucho más rígido y no res e p n a a ponde a los cambios en el g r g r a a ambiente externo, del que c c n n está incluso físicamente ais o o c c , lado. No obstante, el princi s , s e r e r a pio de funcionamiento es el l a l o o mismo. Las plantas tienen P P hormonas vegetales, que Acido aspártico Acido glutámico Arginina Lisina Histidina son mensajes o señales quí2. FORMULAS QUIMICAS de los aminoácidos de que disponen los genes para realizar su tarea. Con ellos se construyen las proteínas. Y las proteínas son los materiales básicos utilizados para micas que informan a las la construcción de todas las células, junto con otros pocos tipos de moléculas diferentes (azú- células de cómo han de cares, lípidos, etc.). construirse y adaptarse a las condiciones ambientales, dirigiendo la expresión o junto de genes, es siempre el mismo: una o, si ya existían en esa célula, sufren una bien el silenciamiento de genes concretos. Las plantas tienen moléculas que señal del entorno se traduce en otra señal modificación y se tornan activas. cambian de forma con la luz y sólo intracelular que lleva instrucciones hasta Variedad de tipos cuando adquieren la conformación adesu ADN para regular la expresión de los genes. La señal originaria puede ser tanto La diferenciación celular se va produ- cuada se unen al ADN. La luz transmite el contacto con las células circundantes ciendo a lo largo del proceso de desarrollo así instrucciones a las plantas: hasta qué (así sucede, por ejemplo, en el embrión) como la ejecución de un programa, con altura deben crecer, cuándo deben florecomo la presencia o ausencia de molécu- etapas sucesivas de expresión de genes, cer, dar fruto, envejecer y morir. Las plantas y algunos animales menos las que la célula reconoce a través de ordenadas en el tiempo y dependientes receptores específicos. Por su parte las del sitio que cada célula ocupa en el con- complejos que los mamíferos, como la señales intracelulares son moléculas, junto del organismo en desarrollo. El estrella de mar o la rana, mantienen en denominadas segundos mensajeros, que ambiente en que se encuentra una célula fases muy avanzadas de su desarrollo, e se sintetizan o degradan en respuesta a la vegetal o animal determinará su destino incluso en su estado adulto, células totiseñal procedente del exterior. Y los regu- al inducirle cambios de sus características potentes, es decir, con capacidad de ladores de los genes son proteínas que se y fijar sus funciones. Ahora bien, las convertirse en cualquier otra. Esta es la sintetizan en ese momento como conse- señales enviadas por el entorno se inter- razón de que el núcleo de una de estas cuencia de la señal del segundo mensajero pretan de forma diferente según cuál sea células, o una parte del organismo, pueda 4
TEMAS 3
regenerar la estructura completa de otro individuo. En este sentido se habla de que el programa de desarrollo es reversible. Las células de los mamíferos, en cambio, alcanzan durante el desarrollo embrionario una etapa en la que quedan irreversiblemente determinadas para seguir por un camino prefijado y llegar a ser parte de un tejido o de un órgano concretos. El programa no es reversible, debido a que en su ADN se van introduciendo modificaciones, que cierran definitivamente otras posibilidades en el camino de la diferenciación. Y estas modificaciones se instauran en fases muy tempranas de su desarrollo embrionario, por lo que sus células dejan muy pronto de ser totipotentes.
algo que está también genéticamente determinado para cada una de ellas. Patrones de tamaño y forma
Todo organismo, animal o vegetal, tiene un patrón estructural: un sitio fijo para la cabeza y otro para los pulmones, o para las alas, las raíces o las hojas. Las células que constituyen un riñón no sólo son diferentes de las que forman un dedo, sino que el riñón que originan también está situado en una posición fija. Hay una información genética posicional según la cual se establece en el embrión desde muy pronto una polaridad cabezacola y otra dorsoventral. Las células guardan memoria del sitio que ocuparon en ese momento en forma de moléculas de proteína, codificadas por los genes que Los hitos del camino portan la información morfológica, que El desarrollo de un embrión a partir de les dan un etiquetado concreto. Estas una única célula puede dividirse en varias proteínas indicarán qué genes deben etapas. La fecundación conlleva la fusión expresarse y cuáles no en cada célula de un espermatozoide y un oocito. concreta. Grupos de células situadas en Inmediatamente después comienzan las la cercanía de la cabeza se diferenciarán, divisiones celulares y miles de células por ejemplo, para dar los pulmones, mienpoco diferenciadas aún se organizan en el tras que otras células más alejadas acabaestado de blástula. Un acontecimiento rán, gracias a sus instrucciones, convirimportante en el desarrollo de un embrión tiéndose en los riñones. Los mismos animal es la gastrulación, una fase en que mecanismos moleculares sitúan la mano movimientos organizados de capas más alejada que el antebrazo en la extrecelulares generan tres estratos de células midad o, en la construcción de una flor, que son progenitoras de todos los demás disponen ordenadamente los sépalos, te jidos y órganos, incluidas las células pétalos, estambres o carpelos desde la germinales. Cada línea de células va periferia al centro. siguiendo una vía que conducirá a su Esa información de posición permite especialización. Las divisiones celulares que tipos similares de células se configuhacen también que el embrión crezca. ren de modo diferente. La misma batería Después del nacimiento el organismo de proteínas mensajeras informa simultáseguirá creciendo y seguirá manteniendo y neamente a los genes sobre el número de regenerando sus células. La mayoría de las divisiones celulares que deben inducir, estructuras de un recién nacido simple- con lo que se fija el tamaño que debe mente crecen de tamaño, sin que ocurran alcanzar cada órgano. Por ejemplo, la cambios cualitativos, excepto en lo que se formación correcta de las extremidades refiere al establecimiento de las conexio nes requiere un desarrollo diferencial de neuronales en el sistema nervioso de los músculos, nervios, huesos y piel en canvertebrados. Con la excepción del cerebro, tidades y en ordenaciones distintas según los distintos órganos y tejidos animales se que esa extremidad vaya a ser un brazo o regeneran a mayor o menor velocidad, una pierna. Para que la construcción de la evitándose así que las alteraciones de sus forma sea correcta, el crecimiento de las componentes comprometa la vida. células está controlado por regiones deliEse recambio celular es posible gracias mitadas a su vez en compartimentos. Los a la existencia de las llamadas células tamaños de estos compartimentos celulamadre. Estas células se dividen en el orga- res y sus fronteras forman parte del diseño nismo de una forma perfectamente regu- contenido en el mensaje genético y están lada; algunas de ellas conocidas como controlados por genes específicos. unipotentes se diferencian hacia un solo No todo está decidido tipo celular, como es el caso de las células de antemano de la piel. Otras son pluripotentes y dan lugar a varios tipos de células diferenciaLa expresión metafórica que se emplea das, como es el caso de las células de la para referirse al proceso de diferenciación sangre. y crecimiento hasta el estado adulto como La última etapa del programa consiste un “programa de desarrollo” induce a en poner en marcha las instrucciones que equiparar el proceso de construcción de indican el término de la vida del organismo. un ser vivo con un rígido programa de Los individuos pertenecen a una especie ordenador, cuyas instrucciones predetery sólo pueden vivir un tiempo máximo, minasen por completo el resultado final. CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
La realidad biológica es bien diferente. El proceso está recibiendo continuamente nuevos datos que le permiten no sólo ramificarse hacia otros tipos alternativos de instrucciones, sino también cambiarlas. Es decir, los organismos tienen “historia”, guardan memoria de situaciones por las que han pasado previamente y su proceso vital sólo en parte está determinado por los genes. Para predecir cómo será el fenotipo de un individuo en el futuro no basta saber cuáles son las peculiaridades propias del mensaje genético heredado, ni es suficiente descubrir el entorno que le afectará en el futuro inmediato, sino que han de conocerse ambos factores. La nutrición, la altitud a la que viva, etc., se alían con la dotación genética para determinar, por ejemplo, la talla. Y hay, por último, una tercera variable que contribuye a las características morfológicas del organismo: los acontecimientos aleatorios que ocurren durante su desarrollo. Es frecuente que haya asimetría en dos estructuras paralelas de un organismo, o peculiaridades en la distribución del pelo, coloración de la piel, etc. Es el llamado “ruido del desarrollo”: pequeñas variaciones al azar en la concentración y localización de mensajeros en el interior de células en crecimiento y diferenciación que aportarán su contribución al fenotipo. Por ello, aunque los genes sean los determinantes reales de la arquitectura y construcción de un organismo, no debe pensarse en modelos del tipo de fabricación con molde. Al considerar un ser vivo hay que pensar más bien en términos de construcción artesanal donde el artífice conoce el diseño y, por detallado que éste sea, no le saldrán nunca dos obras exactamente iguales; aunque intentara la máxima uniformidad, a medida que avanza su tarea, los materiales ejercen su propia influencia en el resultado final por su calidad, textura, etc. Por último, si nos referimos a la construcción de los organismos más comple jos, hay que tener en cuenta que algunos órganos esenciales, como el cerebro, tienen un proceso de desarrollo que no se completa hasta pasados bastantes años de vida. Y, si hablamos de un organismo humano, sobrepuesto a la dotación genética, al ambiente y al ruido del desarrollo, la conciencia del yo actúa además como cauce de relaciones personales, de asunción de tareas, etc. Se hace así posible que ciertos rasgos corporales, gestos, o hasta el modo de moverse, reflejen una biografía no escrita en los genes.
NATALIA LOPEZ MORATALLA es catedrático de bioquímica y biología molecular de la Universidad de Navarra.
5
d
c
b
a
6
TEMAS 3
Genes inteligentes Tim Beardsley ¿Por qué genes muy parecidos producen células tan distintas? La respuesta estriba en saber qué genes se activan y en qué momento, en conocer los mensajes químicos que controlan la diferenciación
D
esde hace medio siglo los biólogos saben que, a medida que las células se van diferenciando, unos genes se activan y otros se inactivan, lo que posibilita que un simple óvulo fecundado se transforme en una flor, una mosca de la fruta o un ser humano. Durante el desarrollo de un organismo las células se mue ven, migra n, sig uie ndo compl ejas estrategias, cambian su forma y terminan por asociarse para constituir tejidos especializados. Un ser humano, por ejemplo, tiene más de 250 tipos distintos de células y cada una debe estar y funcionar en el lugar adecuado. (Las células hepáticas no servirían en el cerebro.) Todas, sin embargo, portan los mismos genes en su ADN. Cómo se consigue armonizar la acti vidad de los genes de un organismo para que las células se formen y funcionen en el sitio correcto, y en el momento preciso, ha constituido un misterio que ahora empieza a esclarecerse. Cientos de experimentos demuestran que el control de la expresión de la mayoría de los genes de un organismo se realiza casi siempre mediante la regulación de la transcripción, un proceso cuyo fin es copiar la información genética que contiene el ADN en ARN, que son las moléculas utilizadas para fabricar los millares de proteínas que determinan que una célula difiera notablemente de otra. La principal enseñanza de la biología molecular del último cuarto de siglo es la del control de la expresión génica mediante la regulación de la transcripción.
La profundización en el conocimiento puede ayudarnos a encontrar vías de cómo se controla la transcripción en para combatir las enfermedades que los organismos pluricelulares ha sido se originan cuando los procesos no se obra de muchos investigadores. Eric llevan a cabo adecuadamente. H. Davidson ha acuñado la expresión Enfermedades que no se limitan a las “genes inteligentes” para designar los patologías hereditarias, sino que que responden a las combinaciones de incluyen también el cáncer y los sínseñales enviadas de un gen a otro en dromes de autoinmunidad. Cuando se las redes de control. Estudia ahora el conozcan mejor los sistemas de control “cerebro del gen inteligente”, es decir, que regulan los genes, se podrá diseel complejo transcripcional, un compli- ñar drogas que activen o inactiven cado agregado de proteínas. Para que genes específicos: un auténtico salto se inicie el proceso de la transcripción, cuántico que revolucionará la medilas proteínas, que actúan como señales cina. químicas, han de unirse al ADN en un sitio cercano al gen que debe trans Anteproyectos genéticos cribirse. La idea de que las señales químicas Este tipo de complejo viene a ser una “computadora desgarbada”, donde se podían condicionar la actividad de los combinan señales y se toma la decisión genes se remonta a los primeros días de si se activa o no un gen. En el caso de la embriología. Cuando en el labode que la combinación de mensajes ratorio se cortaba un trozo de tejido de químicos —que pueden recibirse desde un embrión de rana y se trasplantaba fuera de la célula— sea la adecuada, a otro sitio, el tejido trasplantado orise activará la enzima que realice la ginaba a veces una estructura propia de su ubicación de partida: una rana, transcripción y se producirá ARN. Se suele trabajar con mosca de la por ejemplo, con una extremidad fuera fruta, gusanos microscópicos e incluso de su región. Pero si la manipulación con bloques sueltos de proteínas. Pero del embrión acontecía en una fase prehay razones poderosas para pensar coz del desarrollo, entonces el animal que los resultados serán generaliza- se recuperaba de la “extirpación” y bles a todos los organismos, incluido llegaba a término con normalidad. Hasta 1960 no se contó con una el ser humano. En efecto, en todos los organismos pluricelulares parecen explicación coherente del fenómeno; funcionar los mismos procesos bási- se la debemos a los experimentos reacos. El “gen inteligente” podría consti- lizados por François Jacob y Jacques tuir una de las características univer- Monod con la bacteria intestinal sales de las que dependen los procesos Escherichia coli. Se sabía que, en presencia del azúcar lactosa, E. coli prode desarrollo embrionario. Aparte de su interés teórico estricto, ducía rápidamente enzimas capaces conocer los mecanismos por los que los de metabolizarla. Los investigadores genes controlan y son controlados franceses propusieron la existencia de una proteína que, en presencia de lactosa, activaba algunos genes que esta1. ACTIVACION de los genes decisivos para la diferenciación celular mediante la forma- ban inactivos. ción de un complejo de proteínas que se unen a sitios específicos del ADN. El proceso “El genoma contiene no sólo una comienza cuando el ADN se desprende de las histonas ( a), que mantienen arrollado el serie de anteproyectos”, escribieron ADN mientras no se utiliza. Los factores de transcripción (estructuras pares) se unen Jacob y Monod, “sino todo un proentonces al ADN (b). Forman un complejo transcripcional (c) que activa a las proteínas grama coordinado de síntesis de proasociadas con la enzima encargada de transcribir el gen en una cadena de ARN (d).
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
7
teínas y medios para controlar su ejecución.” Su propuesta incluía también un punto clave: la proteína que controlaba el proceso era capaz de reconocer y unirse a una secuencia específica de bases, próxima a los genes sometidos a control. De esta forma, aseguraban, la proteína impedía la transcripción. La hipótesis de Jacob y Monod se mostró acertada. Desde entonces se han descubierto sistemas de control génico en E. coli , variantes en su mayoría del esquema inicial. En muchos de ellos participan genes que producen enzimas que metabolizan un nutriente o sintetizan algún otro compuesto que se encuentra en bajas concentraciones. En todos los casos, proteínas con capacidad de unirse al ADN se adhieren a sitios específicos del ADN bacteriano para reprimir o promover la transcripción de un gen que no suele quedar lejos. La eficacia con que las proteínas enlazadas al ADN promueven o reprimen la transcripción depende de las concentraciones de dichas proteínas, que a su vez puede depender de multitud de factores. Aunque algunos mecanismos de control de la transcripción bacteriana son exquisitamente sensibles, su funcionamiento recuerda más el de un conmutador que el de una computadora. Reto muy distinto es el que plantea el control de los genes de un organismo pluricelular, de mecanismos más complejos. Las bacterias podrían utilizar la mayoría de sus genes durante su corta vida, activándolos o reprimiéndolos rápidamente, en respuesta a las condiciones cambiantes del medio. Por contra, una célula diferenciada de un organismo pluricelular utiliza sólo una pequeña proporción de sus genes. Si bien los cambios de actividad génica deben ser más escasos, porque los
organismos pluricelulares se afanan por mantener un medio interno constante, no parece tarea fácil decidir qué genes han de activarse. Las células de un organismo complejo necesitan “saber” dónde están instaladas para decidir qué genes expresar. Y deberían, además, estar capacitadas para responder ante situaciones de emergencia, como una agresión o la súbita presencia de una hormona. Por ser tan distintos los requerimientos de las bacterias en relación con las exigencias de los eucariotas, nadie se imaginaba que recurrieran a idénticos mecanismos fundamentales para controlar sus genes. Pero ocurre que las proteínas que se unen al ADN son las que se dan en eucariotas. Desde los mismos comienzos de la investigación sobre el control transcripcional en eucariotas empezaron a aparecer fenómenos novedosos. Así, en 1982, Steven L. McKnight y Robert Kingsbury levantaron uno de los primeros mapas en los que se señalaban las regiones de ADN que afectaban a la transcripción de un gen en una célula eucariota. Utilizaron un gen de un virus herpes que se expresaba en ovocitos de la rana Xenopus laevis . Provocaron mutaciones en las proximidades del gen, con la intención de averiguar qué regiones eran fundamentales para la transcripción normal del gen y, por tanto, intocables. Hallaron varias. Una estaba junto al “promotor”, sitio muy próximo al lugar por donde la enzima encargada de la transcripción aborda su tarea. A tenor de lo conocido en bacterias, era éste un resultado esperado. Los otros dos sitios de interés quedaban lejos, en términos moleculares, uno a 50 y el otro a 100 pares de bases. Resultaba extraño que a tanta distancia una proteína incidiera en la transcripción. Cabía, empero, sospe-
2. GENES ESPECIFICOS DE TEJIDOS se activan cuando los factores de transcripción se unen a una combinación adecua-
8
char que se tratara de sitios de engarce de proteínas. Sospecha que no tardó en confirmarse, cuando Robert T. N. Tjian aisló una proteína que estimulaba experimentalmente la transcripción de un gen en una célula eucariota; lo hacía mediante el enlace en otra secuencia de las bases del ADN. Tjian encontró que su proteína se unía a cinco sitios distintos en las proximidades de un gen vírico. Luego se vería que todos los genes eucariotas son muy parecidos en ese sentido. A diferencia de las proteínas que se unen al ADN de las bacterias, las de eucariotas suelen controlar la transcripción desde sitios de engarce muy alejados. Pronto se identificaron factores transcripcionales que se unían a puntos situados hasta a 40.000 pares de bases del gen diana, sin perder por ello la capacidad de estimular, o reprimir, la transcripción. También, a diferencia de las proteínas bacterianas que se unen al ADN, no importa tanto la posición exacta de los factores transcripcionales eucariotas. Pueden estar a cualquier lado del promotor o incluso curso abajo del gen.
¿Cuántos reguladores? Barbara R. Hough-Evans y otros que trabajan con Davidson se han ocupado del gen que produce la proteína actina en Strongylocentrot us purpuratus (erizo de mar). Hasta 20 regiones próximas al gen son reconocidas por proteínas reguladoras. Davidson y sus colaboradores han demostrado que cinco de ellas, por lo menos, deben estar con proteínas reguladoras para que el gen de la actina se transcriba. Han encontrado también otras dos regiones a las que deben unirse proteínas reguladoras para impedir la transcripción de dicho gen. Según Davidson, cinco es el número
da de sitios para constituir un complejo único. Cada factor transmite una información específica.
TEMAS 3
3. EMBRIONES TEÑIDOS de Drosophila revelan cómo se activan selectivamente los genes en ciertas regiones durante el desarrollo. La proteína producida por hunchback se tiñe de verde; de rojo, la de giant (arriba, a la izquierda). Zen es verde y dorsal, roja (centro, a la izquierda). El color verde revela actividad de twist (abajo, a la izquierda). La proteína hunmedio de sitios reguladores en un gen de un organismo pluricelular. Parece como si la mayoría de los gene s de los organismos pluricelulares tuviesen que montar una computadora proteica antes de proceder a la transcripción. Tjian sostiene que el promotor eucariota debe poseer muchos sitios de control, en tanto que el conmutador genético bacteriano más complejo que se conoce —analizado por Mark Ptashne y que controla la proliferación de un virus bacteriano— presenta sólo tres de esos sitios, justo donde se inicia la transcripción. Los factores de transcripción eucariotas son además menos cuidadosos que los bacterianos a la hora de unirse al ADN. Lo que, en un principio, desconcertó a los investigadores: en el núcleo eucariota había más genes dentro de un volumen mayor y, no
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
chback es roja y Krüppel , verde ( arriba, a la derecha). La proteína even-skipped es verde y hairy, roja (centro, a la derecha). (El amarillo débese al solapamiento.) Un embrión de más edad muestra la proteína de engrailed (bandas de color marrón) y de S59 ( puntos púrpura ), que preceden al desarrollo del músculo (abajo, a la derecha).
obstante, las proteínas se mostraban para la regulación normal de la transmenos específicas. Dicho de otro modo, cripción. Se necesita la compañía del en los eucariotas los factores de trans- complejo formado por los factores de cripción podían mancomunar sus transcripción, situado junto al gen. Sólo esfuerzos para compensar la falta de cuando coinciden todos los componenespecificidad de unión. Pero la única tes —proteínas obligatorias, enzima y manera de que varias proteínas entra- la combinación justa de factores transsen en comunicación mutua cuando se cripcionales específicos— se realizará hallaban dispersas a lo largo del fila- la transcripción controlada del gen mento de ADN era agrupándose en un inteligente. complejo. La idea no era descabellada, Se han encontrado ya varios cientos ya que el ADN que actuaba como espa- de factores transcripcionales distinciador, al ser flexible, podía plegarse. tos. Unas dos terceras partes de los Tjian ha realizado electromicrografías mismos se pueden clasificar en grupos, en las que se aprecian esos bucles en según su estructura molecular: hélicepreparaciones de complejos transcrip- vuelta-hélice, dedos de cinc, cremallecionales. Ha visto, además, que para ras de leucina, hélice-bucle-hélice. El que el sistema funcione es preciso que resto corresponde a proteínas solitaconcurran siempre cinco proteínas, rias, algunas de las cuales son especípor lo menos. ficas de un tipo particular de tejido. Sin embargo, estas proteínas obliPtashne y Kevin Struhl diseñaron gatorias no son suficientes por sí solas ingeniosos experimentos en los que
9
producían factores de transcripción híbridos. Y aunque las generalizaciones son peligrosas, demostróse con los ensayos que los factores de transcripción tienen al menos dos regiones: la que reconoce secuencias específicas de ADN y se une a ellas y la que se considera responsable del efecto activador. Abre muchos interrogantes la forma de funcionar del complejo transcripcional, entendido como “cerebro” del gen inteligente. Se exige, tal parece, cierto “quorum” de factores transcrip-
E
cionales; pero no hay modo de plasmar en imágenes la interacción mutua de hasta 20 proteínas. Se admite que los factores transcripcionales se presten mutuo auxilio para unirse al ADN. Tjian afirma haber aislado un tipo de proteína (la llamada coactivador) que reúne a los factores transcripcionales e specíficos de secuencia con la enzima que realiza la transcripción y las proteínas asociadas. No todos se lo acaban de creer. Ptashne, por ejemplo, piensa
Mezcla de señales Aunque los detalles estén por aclarar, no cabe duda de que el complejo transcripcional determina cuándo hay que transcribir un gen. Y ello podría explicar las observaciones de los embriólogos, según las cuales habría
Las infinitas enseñanzas de Drosophila
sa mosca vulgar de la fruta ha sido la favorita de los genetistas durante más de 60 años. Su contribución actual a la biología del desarrollo no desdice de sus aportaciones a la teoría de la herencia. En los últimos años se ha ido componiendo un cuadro bastante completo de las interacciones génicas que acontecen en las primeras fases del desarrollo embrionario de Drosophila. El adulto está dividido en 17 segmentos, algunos con apéndices (alas o patas). Aunque las células que conforman el embrión son muy parecidas, si se trasplantan a un sitio diferente producen las estructuras características del lugar de partida. Dato que atestigua que, desde muy pronto, las células están programadas para crear estructuras de un segmento concreto. Durante las primeras fases del desarrollo se manifiestan una serie de genes a través de bandas de proteínas que se tornan visibles con tinciones especiales. Las bandas dividen al embrión en segmentos. El proceso comienza cuando las células nutricias maternas secretan en el huevo ARN del gen bicoid . El ARN permanece confinado en un extremo del huevo; traducido allí en proteína, ésta se va propagando por el huevo. Al mismo tiempo, ARN de otro gen materno, de nombre nanos, difunde en la dirección contraria. La proteína bicoid estimula, mediante una adecuada combinación de activaciones y represiones, la transcripción de los genes gap. Son éstos los primeros genes propiamente del embrión que desempeñan un papel en la configuración del patrón de desarrollo. Se forman cuatro bandas anchas, dos de proteínas hunchback , separadas por otras de proteínas de los genes Krüppel y knirps. Christiane NüssleinVolhard y Wolfgang Driever han puesto de relieve el papel
10
que la propuesta de Tjian se funda en una concepción errónea del funcionamiento de los factores de transcripción.
de la proteína bicoid ; si se la altera, cambia la expresión de los genes gap. Los genes gap ceden el paso a siete bandas solapantes, producto de la expresión de even-skipped , hairy y runt . Posteriormente siete bandas de proteína fushi tarazu alternan con siete de even-skipped . Todavía más tarde aparecen 14 bandas más estrechas de proteína engrailed . Cada banda parece representar una combinación de genes activos. Se cree que otros genes, la mayoría todavía desconocidos, responden a estas combinaciones produciendo las estructuras especializadas de cada segmento. Mientras acontece todo ello, una jerarquía distinta crea en el embrión un eje dorsoventral, proceso fundamental para que se produzcan diferentes tipos de tejidos. En el proceso interviene un gradiente de producto del gen dorsal, capaz de obrar como bicoid . Luego los genes denominados twist y snail se expresan en regiones específicas del eje dorsoventral. Algunos de los genes implicados en el desarrollo parecen contrarrestar el efecto de otros. Otros operan en concierto. Muchos se autorregulan: una vez activos, ellos mismos se siguen autoactivando, hasta que ocurre algo que los inactiva. Y otros, como even-skipped , cumplen misiones diferentes en momentos distintos. Los biólogos que trabajan con otros organismos singularizan el caso de Drosophila porque sus paredes celulares se forman bastante tarde, dando tiempo a las proteínas para crear gradientes de concentración. Sin negarlo, Nüsslein-Volhard replica que las células pueden también crear los equivalentes a los gradientes, si hay entre ellas diferencias cuantitativas en las señales que reciben. Está convencida de que los animales más complejos poseen también gradientes.
TEMAS 3
señales extracelulares e intracelulares que intervendrían en la activación o inactivación de un gen. Si una célula posee la combinación adecuada de factores de transcripción para un gen particular, el complejo se formará y comenzará la transcripción del gen inteligente. Diferentes tipos de señales podrían procesarse así: información sobre linajes, interacciones con otras células, estado del ciclo de división celular, etc. Los genes inteligentes ofrecen también una salida a un difícil problema, que ha traído de cabeza a los teóricos. Si cada gen de un organismo debe tener su propia proteína controladora, ¿cómo regular la síntesis de tantas proteínas? Ahora bien, si se admite la interacción mutua entre varias proteínas reguladoras, bastarían unas pocas para controlar muchos genes. Muchos factores transcripcionales están formados por dos subunidades. Este rasgo dimérico aumenta el número de genes que pueden controlar. Como las dos subunidades no tienen por qué ser idénticas, con un grupo limitado de subunidades se crean muchos dímeros distintos; bastan cuatro subunidades, A, B, C y D, para formar diez dímeros: AA, AB, AC, AD, BB, BC, BD, CC, CD y DD. No es posible decir cuántos genes diferentes podrían controlar los diez dímeros, sin saber exactamente cómo funcionan los complejos transcripcionales, pero podrían ser cientos, sobre todo si el sistema tolera algunos errores. Y hay indicios de que sí puede. Muchas células parecen producir cantidades pequeñas de algunas proteínas sin función conocida. Quizá son el resultado de imprecisiones que no afectan al sistema de control de la transcripción. Aunque en los estudios primeros sobre factores de transcripción eucariotas se utilizaron genes simples, los complejos transcripcionales desempeñan un papel fundamental en sistemas más complicados, como podemos ver en el trabajo con levaduras de Ira Herskowitz y Alexander D. Johnson. El organismo unicelular posee, sin embargo, estructura cromosómica eucariota y existen distintos tipos celulares. De esos tipos, uno es asexuado. Se multiplica por gemación, dividiéndose simplemente en dos, para producir descendientes idénticos. Los dos tipos celulares restantes son formas sexuadas, que se producen en condiciones desfavorables, y que pueden cruzarse entre sí. Herskowitz y Johnson han desentrañado los controles genéticos
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
4. ESTRUCTURAS ANORMALES derivadas de mutaciones sufridas por los genes del desarrollo. Arriba a la izquierda se ofrece un ojo normal de Drosophila. A la derecha, otro con mutaciones en el gen sevenless; a los grupos de fotorreceptores les falta una de las siete células. El trasplante en Drosophila de un gen con una secuencia homeótica de ratón produce pata (centro derecha) donde una mosca normal presenta antena (izquierda). Abajo a la izquierda, una cría normal de ratón; a la derecha, una deforme, con mutaciones en un gen homeótico.
que dan razón de esa disparidad triple. El principal locus de control es un factor de transcripción que regula los genes que se expresan de manera diferente en los tres tipos. El esquema de control es complejo y elegante, a un tiempo. El factor transcripcional fundamental está constituido por un dímero, cuyas subunidades pueden ser idénticas o distintas. Un dímero integrado por dos subunidades distintas hace que la célula sea asexual, porque reprime
todos los genes necesarios para que se formen los tipos sexuales. Si el dímero consta de subunidades idénticas, se activan los genes utilizados en los tipos sexuales. Las levaduras utilizan feromonas para coordinar sus actividades reproductoras; estos mensajeros químicos, muy parecidos a las hormonas, inter vien en en la tran scripció n. Un a pequeña proteína secretada por una célula de un “tipo sexual” se une a receptores especiales presentes en
11
5. MODELOS que ilustran la unión de los factores de transcripción al ADN. A la izquierda, una proteína homeótica (en amari-
llo) se une al ADN ( azul y lila). A la derecha, la que lo hace es del tipo dedos de cinc (naranja, amarillo y lila).
otra célula del tipo sexual contrario. existencia se explica por las mutacio- O’Farrel y Claude Desplan aportaron La unión desencadena una cascada de nes que provocan la duplicación de un pruebas de que las proteínas homeóreacciones químicas que termina con gen; si una copia duplicada no e s per- ticas se unían, en efecto, al ADN. En la activación de otro factor transcrip- jud icial, pue de evo lucion ar con el 1988 O’Farrel dio el último paso al cional especializado. Provoca, pues, la tiempo y adquirir una nueva función. demostrar que las proteínas produciconvergencia de los genes que inter- Y si el nuevo gen vale la pena, podrían das por fushi tarazu (en japonés, “falto vien en en el cruzamiento . En con- perpetuarlo las nuevas especies. de segmentos”), un gen homeótico de junto, al menos 13 genes participan No tardaron en descubrirse secuen- Drosophila, y por otro gen homeótico, en el control del tipo celular en leva- cias homeóticas, o similares, por todas no sólo se unían al ADN, sino que duras, y casi todos ellos son factores partes. Drosophila tenía varias copias, activaban y reprimían la transcriptranscripcionales. todas ellas en genes relacionados con ción de genes próximos. Las pruebas el desarrollo. Pero no acababa ahí el ulteriores apuntaban en la misma interés del asunto. La ordenación dirección. En definitiva, los genes La secuencia homeótica física de los genes homeóticos a lo homeóticos producían factores de Al iniciarse los años ochenta nadie largo del cromosoma se correspondía transcripción que controlan genes en dudaba de la importancia de los fac- bastante bien con el orden de sus organismos pluricelulares. tores transcripcionales eucariotas. dominios de actividad a lo largo del Una cosa es mostrar un fenómeno Pero era difícil hallar ejemplos que cuerpo. en el tubo de ensayo y otra, muy disdestacaran su interés en los procesos Muy pronto también, McGinnis y tinta, demostrarlo en la naturaleza. de desarrollo. Los biólogos no sabían otros encontraron secuencias pareci- McGinnis y su colega Michael A. qué secuencias genéticas buscar, das a las homeóticas en otros organis- Kuziora pusieron sobre el tapete el hasta que, en 1983, el laboratorio de mos: escarabajos, gusanos, ranas, interés de un dominio homeótico, Walter J. Gehring y, por separado, gallinas, ratones y hasta en el hombre. recurriendo a un animal vivo. SustiMatthew P. Scott, realizaron un des- En todos ellos se conservaba la orde- tuyeron la secuencia homeótica de un cubrimiento crucial. nación génica en el cromosoma, así gen de Drosophila por una secuencia Estudiaban un grupo de genes de la como la propia secuencia homeótica. homeótica, ligeramente distinta, de mosca de la fruta, Drosophila , cuya Y no sólo en invertebrados y vertebra- otro gen, para que el gen q uimérico se mutación provocaba que, en los seg- dos: se ha descubierto recientemente expresara en el insecto. Y nació una mentos de los adultos, se desarrolla- una variante (algo alterada) en el de- larva cuyos segmentos de la cabeza sen estructuras erróneas. El gen sarrollo de las plantas. parecían segmentos torácicos. El La tenaz conservación de la secuen- dominio homeótico introducido reco Antennapedia, por ejemplo, determinaba la formación de patas allí donde cia homeótica, durante miles de millo- nocía una región específica del ADN y correspondía que hubiese antenas. nes de años, abonaba la idea de atri- se unía a ella. Scott, en Colorado, y Ernst Hafen, buirle una función principal. Lo que Michael Levine y William J. McGinnis, se ratificó en 1984, cuando Allen Jerarquía de genes en Basilea, descubrieron que varios de Laughon advirtió que la región proteíEl refinamiento de las técnicas para estos genes, denominados genes nica determinada por la secuencia homeóticos, contenían una secuencia homeótica guardaba cierto parecido identificar productos génicos ha percaracterística de bases, que desde con las secuencias de las proteínas mitido descubrir cierta jerarquía, entonces es conocida como la secuen- bacterianas que se unen al ADN y con sorprendente, compleja y enmarañada, cia homeótica (“homeobox”). las proteínas implicadas en el tipo de genes implicados en la ejecución del La secuencia homeótica es un punto sexual de las levaduras. Las similitu- plan corporal de Drosophila. Muchos de referencia fundamental, ya que es des llevaron a Laughon y Scott a pro- son genes homeóticos. En las primeras algo concreto que los genéticos mo- poner que la secuencia homeótica horas del desarrollo, tras la fecundaleculares pueden buscar. Una vez determinaba un fragmento de pro- ción, el embrión elipsoidal se subdiidentificada una secuencia en el seno teína, que llamaron dominio homeó- vide progresivamente en diferentes de un gen, se hallan las secuencias tico, capaz de unirse al ADN. direcciones. Las proteínas producidas similares en los cromosomas, cuya No mucho después Patrick H. por esos genes forman gradientes de
12
TEMAS 3
concentraciones que activan o inacti van a otr os gen es, seg ún Mar tin Hülskamp y Diethard Tautz. Los genes inteligentes hablan mucho unos con otros durante el desarrollo. El proceso se repite a escalas sucesivamente decrecientes, hasta configurar bandas de expresión proteínica. Cada banda posee una combinación peculiar de genes activos y es probable que éstos determinen qué genes deben activarse en cada segmento de la mosca adulta. Uno de los genes homeóticos de esta jerarquía se llama even-skipped, denominación que alude al hecho de que algunos mutantes carecen de segmentos pares. La proteína even-skipped aparece primero en siete bandas, muy poco definidas, que subdividen al embrión. Posteriormente las bandas se van haciendomás precisas.Mutaciones en el gen even-skipped condicionan la actividad de otro gen, situado más abajo en la jerarquía, el en grailed. El gen even-skipped es afectado, a su vez, por genes situados curso arriba en la misma jerarquía: hunchback, Krüppel, giant y bicoid. El equipo harvardiano de Tom Maniatis, junto con Levine, han encontrado que el gen even-skipped posee varias regiones a las que se unen proteínas reguladoras, que controlan la expresión del gen. Una de esas regiones, que controla la aparición temprana de cierta banda evenskipped, tiene sitios que reconocen las proteínas bicoid, hunchback, Krüppel y giant. Una serie distinta de proteínas, que se unen a otros sitios, con trolan la expresión tardía de even-ski pped. Y esto es sólo el principio; casi con toda seguridad cada una de las siete bandas posee su propia batería de proteínas reguladoras. El número de genes de vertebrados con contrapartida equivalente en Drosop hila parece aumentar cada semana. El producto del gen dorsal de Drosophila, por ejemplo, es similar a un factor de transcripción de mamíferos, designado NF-kB, que participa en una “respuesta de emergencia”. Darnell y su grupo han descubierto un factor de transcripción específico de hígado, muy afín al producto de un conocido gen homeótico de Drosophila, fork-head, que se expresa en las células precursoras del aparato digestivo de la mosca. Estas células dan lugar al equivalente al hígado en Drosophila, el cuerpo graso. En los últimos años se han realizado ingeniosos experimentos para comprobar si la similitud de secuencias reflejaba un paralelismo de funciones.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
6. GENES HOMEOTICOS con secuencias similares aparecen en el mismo orden en los cromosomas de especies diversas. La ordenación a lo largo del cromosoma es la misma que la de las regiones de actividad en el cuerpo. Por ejemplo, el Abd-B de Drosophila y el Hox 2.5 de ratón son activos en el extremo posterior del embrión.
7. ACTIVACION del gen even-skipped de Drosophila. Requiere el concurso de varios factores transcripcionales, producidos por otros genes. Las regiones E7 y E2 ( aumentadas abajo), que controlan las bandas 7 y 2 de even-skipped durante el desarrollo temprano, contienen muchos sitios donde se unen proteínas hunchback, bicoid, giant y Krüppel. Una actividad posterior ( L) es controlada por hairy, runt y la propia even-skipped.
13
8. FACTORES transcripcionales ( grandes borrones ) pegados en los extremos de una cadena de ADN, en la fotomicrografía
de la izquierda. Bajo ciertas condiciones, se unen y forman un complejo, lo que origina un bucle de ADN (derecha).
Se han trasplantado genes del de- car respecto de las enfermedades algo que ver en el desarrollo del sissarrollo (o parte de ellos) de una espe- humanas relacionadas con el de- tema nervioso de los mamíferos. cie a otra. McGinnis introdujo en sarrollo. Se anda a oscuras en lo con- Promovieron la formación de embrio Drosophila un gen de ratón equiva- cerniente a los genes de mamíferos nes de ratón con dos genes Wnt-1 lente a Antennapedia y promovió deli- que gobiernan las primeras fases del defectuosos; aparecieron sin una parte beradamente la sobreexpresión del desarrollo. Ignorancia que reina tam- importante del cerebro. Ocurre, sin mismo. Las moscas nacieron con bién sobre la mayoría de los genes embargo, que Wnt-1 no determina defectos “casi idénticos” a los produci- situados en el extremo opuesto de la ningún factor de transcripción; de dos por la sobreexpresión de su propio jerarquía de control: los que gobier- acuerdo con todos los indicios, lo que Anten nap edi a: patas donde debía nan la identidad de los tejidos especí- hace es especificar una sustancia difuhaber antenas. Introdujo también en ficos. sible que afecta a la transcripción en Drosophila un gen homeótico humano Con una excepción reseñable. Me células vecinas. similar a otro encontrado en el insecto. refiero al gen de mamíferos MyoD , Se conocen bastante bien ciertas Cuando el gen humano se sobreex- investigado por Harold Weintraub y señales extracelulares que provocan presa deliberadamente en Drosophila sus colegas. MyoD es un potente factor la respuesta de los genes inteligenproduce deformaciones en la cabeza, de transcripción que puede, sin nin- tes. Las hormonas esteroides y la del tipo de las provocadas por la sobre- guna ayuda, convertir células en vitamina D, por ejemplo, viajan desde expresión del gen equivalente de la músculo. (Maniatis y su grupo halla- el exterior de la célula hasta su mosca. ron un gen de Drosophila, nautilus , núcleo, donde se unen a los receptoEn 1991 Osamu Chisaka y Mario R. con una secuencia similar a MyoD , res para formar factores de transcripCapecchi obtuvieron pruebas directas que también se expresa en células ción activos. De otras muchas molédel papel de los genes homeóticos en destinadas a ser músculo.) culas vitales, que actúan como mamíferos. Manipularon un gen El descubrimiento de que muchos señales, sabemos muy poco. Me homeótico de ratón y nacieron embrio- de los genes fundamentales para el refiero a los “factores de crecimiento” nes de ratón que sólo portaban la ver- desarrollo sean factores de transcrip- y las moléculas de adhesión. Estas sión alterada del gen. Los ratoncitos, ción refleja la misión destacada que moléculas señalizadoras prefieren que sobrevivieron sólo unas horas, cumple al control transcripcional. unirse a los receptores de la superfiaparecieron con terribles malforma- Pero hay otros genes, importantes cie celular, desde donde enviarían su ciones en el corazón y la garganta y desde el punto de vista del desarrollo, mensaje al núcleo. carecían de algunas glándulas. Las que afectan también a la transcripGerald M. Rubin investiga la red de malformaciones recordaban las que ción indirectamente. interacciones entre determinaciones caracterizan al síndrome de DiGeorge, An drew P. Mc Ma ho n y Al la n específicas de linajes celulares y señauna enfermedad humana rara. Bradley se preguntaron si un gen de les difusibles que rige el destino de las Pero no se crea que será tarea fácil ratón, designado Wnt-1, similar a otro células fotorreceptoras de los ojos de deducir lo que todo esto pueda impli- gen de Droso phila , wingless , tenía Drosophila . Las células forman gru-
9. RENACUAJO NORMAL de rana africana, a la izquierda. Si al embrión se le inyecta ARN de activina humana, se forma un eje
14
adicional (derecha). El ARN determina una sobreproducción de activina, que afecta a los genes del desarrollo.
TEMAS 3
pos de ocho miembros, pero en los mutantes afectados en un gen denominado sevenless falta el séptimo miembro del grupo. El gen sevenless determina un receptor de la séptima célula, cuya función consiste en recibir una señal de las células vecinas, gracias a la cual aquélla adquiere su identidad. Si el gen está alterado, la señal no se recibe. H. Robert Horvitz defendía que las moléculas implicadas en la comunicación celular en los animales sencillos operaban, asimismo, en los organismos superiores, tesis a la que acabó de dar fundamento demostrando que el gen let-60 es uno de los varios conmutado res que gobiernan el desarrollo de las seis células precursoras de la vulva en el gusano microscópico Caenorhabditis ele gans .
Claves del cáncer Let-60, que como el gen sevenless de Drosophila determina un componente de una ruta de señales, se parece a un oncogén humano, esto es, un gen que puede causar cáncer. La verdad es que no constituye ninguna sorpresa que muchos oncogenes sean formas mutadas de genes que intervienen en el desarrollo y determinen factores de transcripción u otras moléculas implicadas en las señales ligadas al desarrollo que afectan a la expresión génica. El gen Wnt-1 de ratón de McMahon y Bradley, por ejemplo, tiene una forma oncogénica; lo mismo que dos importantes factores de transcripción de la “respuesta precoz”, fos y jun, que se activan cuando las células de mamíferos responden a factores de crecimiento. Las correspondencias entre genes que controlan la transcripción y sustancias ligadas al cáncer afloran con una regularidad casi monótona. Douglas A. Melton ha demostrado que el factor de crecimiento activina activa genes homeóticos durante el desarrollo de la rana Xe no pu s . Durante el desarrollo del animal, las células saben dónde están gracias a la formación de gradientes de acti vin a; eso se infier e de su ens ayo : cuando Melton manipuló los niveles de activina en embriones se alteraron los ejes corporales. El ácido retinoico desempeña en aves y mamíferos un papel semejante al de la activina en Xenopus. No hace mucho que se hallaron pruebas de la producción de cierta forma de leucemia por parte de un receptor del ácido retinoico mutado.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
Histonas En el ámbito de la regulación génica los factores de transcripción han quitado protagonismo a las histonas, proteínas presentes en grandes cantidades en el núcleo eucariótico y que concentraron la atención a principios de los años ochenta. Mientras no se transcribe, el ADN permanece arrollado en torno a las histonas, formando los nucleosomas. El ADN empaquetado en nucleosomas es la cromatina. A pesar de la reticencia de algunos, las histonas comienzan a encontrar acomodo en el nuevo marco explicativo general. Ptashne, por ejemplo, reconoce que los nucleosomas imponen una barrera inespecífica a la transcripción, aunque cree improbable que ello obligue a introducir cambios profundos en los modelos sobre control génico basados en los complejos transcripcionales. James T. Kadonaga estudia la lucha de histonas y factores de transcripción por acceder al ADN. El sí prevé un cambio drástico en los puntos de vista tradicionales sobre activación génica. Robert E. Kingston y sus colegas han demostrado que algunos factores de transcripción compiten mejor que otros. Las histonas podrían ser un componente esencial de los genes inteligentes. Tjian plantea un problema que los modelos basados exclusivamente en los complejos de transcripción no suelen explicar: ¿qué le impide a un factor de transcripción activar todos los genes que están a su alrededor? Con el resurgir del interés por las histonas comenzamos a ensamblar las piezas del sistema. Mas, aun cuando se desentrañe en los próximos años el control de la transcripción y se conozca perfectamente el cerebro de los genes inteligentes, no debemos olvidar que la transcripción no es el único modo de regular genes. Procesos que vienen más tarde, como los que introducen nucleótidos en secuencias ya transcritas de ARN (“RNA editing”), añaden un nuevo nivel de complejidad, que mantendrá viva nuestra atención.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA NUCLEOSOMES: REGULATORS
OF
TRANS-
. Michael Grunstein en Trends in Genetics, vol. 6, n.o 12, págs. 395-400, diciembre de 1990. CRIPTION
P ATTERN F ORMATION
DURING
A NIMAL
. Douglas A. Melton en Science, vol. 252, págs. 234-241, 12 abril de 1991. DEVELOPMENT
15
La fecundación en los mamíferos Paul M. Wassarman Los fenómenos que preceden y siguen a la fusión del espermatozoide con el óvulo tienen que ocurrir en una secuencia precisa. En el curso de este proceso interviene, de forma destacada, una molécula singular
H
an transcurrido más de cien de las interacciones espermatozoideaños desde que Hermann Fol, óvulo con bastante detalle. un perspicaz zoólogo suizo, Esas investigaciones han aclarado lograra, mediante su microscopio, ver no sólo los sucesos fundamentales de cómo un espermatozoide penetraba en la fecundación en los mamíferos, sino un óvulo y lo fecundaba, para formar también los mecanismos moleculares la primera célula de un nuevo embrión. subyacentes. Mis colegas y yo hemos De entonces acá, muchas de las etapas identificado y caracterizado la moléque constituyen el proceso de la fecun- cula específica que, en la capa externa dación —la serie de sucesos que tienen del óvulo de ratona, funciona como lugar, en un orden estrictamente obli- receptora del espermatozoide. Tamgado, desde el contacto inicial del bién hemos descubierto que esta moléespermatozoide y el óvulo hasta la cula receptora desempeña otros papefusión de ambos—, así como los que les críticos en el decurso de la acontecen inmediatamente después fecundación y en los fenómenos que de ella, han sido objeto de atención inmediatamente le siguen. Los estupreferente por parte de los biólogos. dios sobre esta molécula receptora, Al igual que Fol, que obse rvó la otras moléculas implicadas en el profecundación de un óvulo de una estre- ceso de fecundación del ratón y molélla de mar, los primeros investigadores culas análogas en otros mamíferos, centraron sus estudios en los in ver- pueden facilitar en el futuro estudios tebrados marinos. La razón principal bioquímicos sobre la reproducción de esto estribaba en que los óvulos de humana. Dichos estudios podrían lletales organismos (en contraste con los var a nuevos métodos, tanto para evióvulos de los mamíferos) son fecunda- tar la concepción (contracepción), como dos fuera de la hembra (en el agua del para el tratamiento de la esterilidad mar) bajo condiciones que pueden en los seres humanos. recrearse con facilidad en el laborato Auncuandonoshayamosconcentrado rio [véase “El proceso de la fecunda- en el trabajo con ratones (dado que no ción” por David Epel; IN VESTIGACIÓN Y hay óvulos humanos disponibles en CIENCIA , enero de 1978]. Desde finales cantidades que se requieren para de la década de los 50 se han preparado estudios moleculares), su modelo de y perfeccionado sistemas de cultivo fecundación es completamente similar con los que se logra, in vitro, la fecun- al de la especie humana y al de otros dación y las primeras fases de de- mamíferos. El proceso fundamental sarrollo de los óvulos de mamíferos, y comienza cuando muchos espermatocon los que se hace posible el estudio zoides quedan, al principio laxamente adheridos y más tarde tenazmente pegados a receptores, sobre la superficie de la gruesa corteza (córtex) o capa PAUL M. WASSARMAN es director externa ovular, llamada zona pelúcida del departamento de biología celular y ( zona pellucida). Cada espermatozoide, del desarrollo en el Instituto Roche de que tiene en su superficie un gran Biología Molecular en Nutley, N. J. Obtuvo su doctorado en bioquímica por la número de proteínas óvulo-adherentes, Universidad de Brandeis en 1968 y trase pega a muchos receptores espermábajó en diversas instituciones antes de ticos sobre el óvulo. Más exactamente, incorporarse a la facultad de medicina cada punto de engarce de cada proteína de Harvard, en donde inició sus invesóvulo-adherente encaja con su punto de tigaciones sobre el desarrollo de los maengarce complementario sito en el míferos. Wassarman dejó Harvard en 1985 para acceder a su destino actual. receptor espermático, del mismo modo que cada llave ajusta en su cerradura.
16
Generalmente la unión de un espermatozoide con un óvulo presenta la así llamada especificidad específica que, en nuestro contexto, significa que los receptores espermáticos que posee el óvulo reconocen sólo a espermatozoides de la misma especie y rechazan a todos los demás. Esa capacidad de los gametos, o células sexuales, masculinas y femeninas, dentro de la misma especie, para su reconocimien to mutuo, es característica del proceso de fecundación de todos los organismos, vegetales y animales, extendida por doquier. Y hay buenas razones para ello. Los estudios experimentales han puesto de manifiesto que, con unas pocas excepciones notables (tales como los embriones de mulos y burdéganos, que se originan por cruzamiento de las especies caballo-asno), los embriones producidos por fecundación interespecífica no se pueden desarrollar normalmente.
L
a unión del espermatozoide a la zona pelúcida va seguida de lo que se llama reacción acrosómica del espermatozoide adherido. El acrosoma es un orgánulo rico en enzimas digestivas, que está situado en la región anterior de la cabeza del espermatozoide, exactamente bajo la membrana plasmática que envuelve esa cabeza. Durante la reacción los dos tercios, más o menos, que están frente a dicha membrana plasmática, se unen con la capa externa de la membrana del acrosoma. En esta fusión se forman microvesículas, que constan de la membrana plasmática del espermatozoide y de la membrana acrosómica externa. Estas vesículas híbridas terminan siendo expulsadas, con lo que la zona pelúcida queda expuesta a la capa interna de la membrana del acrosoma y a las enzimas de éste. Estimulado por las enzimas, que digieren la zona pelúcida, el espermatozoide acrosómico-reactivo perfora, entonces, la cubierta externa ovular.
TEMAS 3
Uno de los espermatozoides, entre la multitud de los que avanzan, alcanza el espacio perivitelino, estrecha región entre la zona pelúcida y la membrana plasmática del óvulo, se fusiona con esa membrana y fecunda al óvulo: el material genético del parental masculino se mezcla con el del parental femenino, para iniciar el desarrollo del embrión resultante. La fusión desencadena también una serie de reacciones que, en pocos segundos, alteran la membrana plasmática, y, al cabo de pocos minutos, alteran asimismo la zona pelúcida, en lo que se llama zona de reacción. Con ello, tanto la membrana plasmática como la cubierta ovular externa se vuelven refractarias para otros espermatozoides. Estos cambios son cruciales para evitar una situación que lleva a la muerte, denominada polispermia: la
fusión de más de un espermatozoide con un único óvulo.
C
uriosamente, la zona pelúcida se ha considerado, a veces, por los investigadores como un estorbo, a modo de barrera para los espermatozoides, y, por tanto, como un impedimento para la fecundación; a me nudo, en los experimentos con óvulos de mamíferos, éstos han sido despojados de ella. Ahora ha quedado aclarado que tal envuelta funciona como un sistema de seguridad de gran finura, que puede diferenciar los espermatozoides que llegan, para seleccionar únicamente a los compatibles con la fecundación y el desarrollo, prepara al espermatozoide para la fusión con el óvulo y, posteriormente, protege al embrión resultante contra la polispermia o fecundación múltiple.
1. EN LA ZONA PELLUClDA, o cubierta externa del óvulo, pueden adherirse y penetrar muchos espermatozoides, pero sólo uno llegará, en su caso, a unirse con la fina membrana plasmática que rodea al óvulo propiamente dicho (esfera interna), lo fecundará y originará el nuevo embrión. Con estudios recientes
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
Cuando nosotros empezamos a estudiar la fecundación en los mamíferos algunas de las más importantes preguntas sin respuesta eran las siguientes: ¿cuál es la naturaleza del supuesto receptor espermático en la zona pelúcida? ¿Qué es lo que inicia la reacción acrosómica, con la que continúa la adhesión del espermatozoide al óvulo? ¿Qué cambios bioquímicos ocurren, después de la fecundación, para que la zona pelúcida se haga refractaria a los espermatozoides restantes? Ha resultado que una glucoproteína única —un polipéptido, o cadena de aminoácidos, que lleva unidos grupos de azúcares— constituye parte de la respuesta a las tres cuestiones. Pasamos a estudiar la zona pelúcida de manera indirecta. En el curso de una investigación sobre el desarrollo del ratón, intentamos la iden-
en el ratón acometidos en mi laboratorio y en otros, se han empezado a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes en la serie de sucesos constitutivos de la fecundación en los mamíferos. Ovulo y espermatozoide de ratón se han ampliado unos 1000 diámetros en esta microfotografía del autor del artículo.
17
tificación de genes —represores o efectores— que actuaran sólo durante el crecimiento de los oocitos, las células madre de los óvulos. Entre los genes que gobiernan la producción de las proteínas de la zona pelúcida era de esperar que encontráramos los más prometedores candidatos al respecto, pero necesitábamos aislar dichas proteínas antes de poder identificar los genes correspondientes. Jeffrey D. Bleil y yo descubrimos que la zona pelúcida en el ratón cons-
taba de tres glucoproteínas diferentes. Las denominadas ZP1, ZP2 y ZP3. Sabíamos poco de su estructura química, pero sí logramos diferenciarlas mediante electroforesis sobre gelatina, una técnica estándar que separa moléculas en razón de su peso molecular. Dado que las ZP1, ZP2 y ZP3, que, respectivamente, pesan en unidades dalton 200.000, 120.000 y 83.000, son sintetizadas y segregadas por los oocitos en crecimiento, se reúnen para formar una cubierta
2. EL PROCESO DE FECUNDACION comprende varias etapas. Una vez que el espermatozoide o célula espermática se une a la zona pelluci da tiene lugar la llamada reacción acrosómica. La membrana externa del acrosoma (en verde oscuro), orgánulo rico en enzimas, y situado en la parte anterior de la cabeza del espermatozoide, se fusiona en muchos puntos con la membrana plasmática que rodea dicha cabeza. Después, ambas membranas adosadas (en verde claro ) forman vesículas que, finalmente, son expulsadas y liberan enzimas acrosómicas (en rojo); las enzimas abren una vía de penetración en la zona pellucid a, lo cual permite el avance
18
porosa, que crece hasta un espesor de unas siete micras (milésimas de milímetro). (La cubierta del óvulo humano es casi el doble de gruesa y la de otros óvulos de mamíferos puede alcanzar un espesor cuatro o cinco veces mayor.) En cierto modo quedamos sorprendidos de esa composición tan simple de la zona pelúcida del óvulo de ratona. Al fin y al cabo casi todas las células de mamífero quedan envueltas por una matriz extracelular, que es mar-
del espermatozoide. Por fin, el espermatozoide se une a la membrana plasmática del óvulo, y se fusiona con ella, para fecundarlo. El proceso culmina con las reacciones producidas entre corteza y zona pell ucida. Primeramente, gránulos corticales del citoplasma ovular, ricos en enzimas, sueltan su contenido (en amarillo) dentro de la zona pellucid a, comenzando por el punto de fusión y progresando a derecha e izquierda. Después, en la zona reaccionante, las enzimas modifican la zona pell ucid a, hasta transformarla en una barrera impenetrable a los espermatozoides, como defensa contra la polispermia.
TEMAS 3
3. MOLECULA ZP3, un componente principal de los filamentos (izquierda) que se asocian para formar la zona pellucida. ZP3 es una glucoproteína: un polipéptido al que se unen grupos glucídicos. Se combina con otra glucoproteína, ZP2, para formar los sillares de los filamentos, que aquí están dibujados, en el centro, de manera esquemática; una tercera glucoproteína, ZP1, une los filamentos. La molécula ZP3, que se muestra a la derecha, es la receptora que fija los espermatozoides;
cadamente más compleja y lleva muchas proteínas diferentes. Pero nuestros hallazgos resultaron confirmados, posteriormente, por nuevos datos de que las zonas pelúcidas ( zonae pellucidae) en todos los mamíferos estudiados, incluida la especie humana, constan también de unas pocas glucoproteínas. La citada simplicidad nos indicó otra dirección de estudio. Verosímilmente una de las tres glucoproteínas de la zona pelúcida, en la ratona, actuaba como receptor espermático y podríamos identificarla. Sin embargo, primero había que demostrar que, en efecto, la zona pelúcida contenía receptores espermáticos. Pasamos a lo que se llama prueba de competitividad. A partir de óvulos sin fecundar, aislamos zonas pelúcidas y disolvimos el material en una solución ligeramente acidificada, de tal modo que todas las glucoproteínas de cada cubierta, no sólo las de la capa externa del óvulo, pudieran reaccionar libremente con los espermatozoi-
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
también induce la reacción acrosómica. Los elementos de unión efectivos son un conjunto de las cadenas de azúcar, como salientes radiantes del eje esquelético polipeptídico de la ZP3; son oligosacáridos con uniones de oxígeno, unidos a los aminoácidos serina y treonina, con un peso molecular en torno a los 3900 dalton. Parece ser que las mismas cadenas de azúcar son las que colaboran con el polipéptido en la ZP 3, para inducir la reacción acrosómica.
des. Luego neutralizamos la disolución de zonas pelúcidas y añadimos espermatozoides de ratón en una placa de prueba, removimos bien el esperma y lo incubamos con los óvulos no fecundados, bajo condiciones conocidas, que permitieran, in vitro, tanto la fecundación como el desarrollo.
S
upusimos que si la disolución de zonas pelúcidas contenía receptores espermáticos, éstos y las proteínas óvulo-adherentes del espermatozoide podrían reaccionar entre sí y unirse para formar complejos moleculares. La formación de estos complejos impediría, entonces, la acción de las proteínas óvulo-adherentes sobre las zonas pelúcidas de los óvulos no fecundados, en la última etapa de la prueba, y, por tanto, los espermatozoides tratados no llegarían a adherirse a los óvulos, ni a fecundarlos. En otras palabras, los receptores libres disueltos podrían competir con éxito con los receptores espermáticos de los óvulos. Por otra parte, si la disolución no contenía
receptores, los espermatozoides no quedarían afectados por el tratamiento con la solución de zonas pelúcidas, y podrían unirse y fecundar a los óvulos normalmente. Descubrimos que los espermatozoides tratados no podían adherirse a los óvulos, o fecundarlos; se demostró así que la zona pelúcida de los óvulos de ratona contenía receptores espermáticos. Por otra parte, los preparados de zonas pelúcidas solubilizadas, obtenidas no de óvulos sin fecundar, sino de embriones todavía unicelulares, no impedían la adherencia de los espermatozoides ni la fecundación, prueba de que la cubierta de esos embriones carecía de receptores espermáticos competentes. Este último hallazgo está en concordancia con el hecho de que los espermatozoides no pueden unirse a un óvulo fecundado (embrión unicelular), ni perforar su cubierta. Lo que también sugiere, al menos parcialmente, que la razón por la cual la zona pelúcida se hace refractaria a los espermatozoi-
19
4. LA PRUEBA DE COMPETITIVIDAD contribuyó a demostrar que la ZP3 de la zona pellucida era el receptor espermático en la ratona. Cuando en una placa de laboratorio se exponen espermatozoides a óvulos no fecundados (arriba), las proteínas óvulo-adherentes del espermatozoide se unen a los receptores espermáticos de los óvulos y sobreviene la fecundación. En la prueba de competitividad (abajo), los espermatozoides son incubados, en primer lugar, con supuestos receptores espermáticos. Si existen receptores, los espermatozoides se unen a ellos; como ahora las proteínas óvulo-adherentes están bloqueadas, los espermatozoides ya no pueden unirse a los óvulos y fecundarlos. Si no hay receptores, los espermatozoides no quedan afectados y fecundan a los óvulos. En la prueba de competitividad la ZP3, aislada a partir de óvulos no fecundados, impide que los espermatozoides interactúen con óvulos de ratona. (Dibujos de Neil O. Hardy.)
des después de la fecundación es que la inhibición de la adherencia resultaésta provoca una modificación de los ron tan eficaces la ZP3 ovular purifireceptores espermáticos del óvulo cada como los preparados mismos de —modificación que destruye su capa- zona pelúcida, señal de que la ZP 3 cidad de unión con las proteínas óvulo- había sido la responsable de la inhibiadherentes del espermatozoide. ción en las pruebas originales de comComprobado que la zona pelúcida petitividad. La ZP 3 mostraba ser la contenía receptores espermáticos, receptora espermática. intentamos saber cuál de las tres glucoproteínas servía como receptora y uando comparamos, mediante elecqué cambios en su molécula la incapatroforesis sobre gelatina, la ZP3 citaban para el reconocimiento de procedente de óvulos no fecundados espermatozoides. Dimos muy pronto con la procedente de embriones, obsercon la respuesta a la primera cuestión. vamos que las dos moléculas —una Purificamos las glucoproteínas ZP 1, receptora activa, la otra inacti va— ZP2 y ZP3, tanto de óvulos sin fecundar eran indistinguibles. Estaba claro como de embriones unicelulares, e hici- que, para que se produjera la inacmos con cada una de ellas la correspon- tivación del receptor, después de la diente prueba de competitividad. Esto fecundación, debía darse algún cambio puso de manifiesto que la unión de los químico muy sutil de ese receptor. espermatozoides con los óvulos sólo Teníamos que conocer mejor la comquedaba inhibida cuando los esperma- posición, para llegar a comprender tozoides eran tratados mediante la ZP3 cómo acontecía la inactivación. purificada, procedente de zonas pelúEsto llevaría algún tiempo. Miencidas. No ejercían ningún efecto ni las tras tanto, continuamos con otras pesglucoproteínas ZP1 y ZP2, ya de óvulos, quisas. Entre éstas se incluía una ya de embriones, ni tampoco la ZP3 prueba adicional de que la ZP3 era la procedente de embriones. Aún más, en receptora espermática. También
C
20
esperábamos determinar si la ZP 3 intervenía en la reacción acrosómica. En un estudio para evaluar el papel de la ZP3 como molécula receptora, contábamos con ciertos descubrimientos realizados en nuestro propio laboratorio, en Harvard, así como con los de Bayard T. Storey y sus colaboradores en la Universidad de Pennsyl vania: sólo pueden adherirse a la cubierta externa del óvulo los espermatozoides con un acrosoma intacto, y sólo los espermatozoides acrosómico-reactivos pueden llevar a cabo el paso siguiente, la perforación de la cubierta. Estos descubrimientos nos permitieron suponer que si la ZP3 era un receptor espermático sólo reconocería espermatozoides de acrosoma intacto, y no los de acrosoma sujeto a reacción, cuando se mezclara con espermatozoides en una placa de laboratorio. Por otra parte, sólo reconocería la cabeza del espermatozoide cuando tuviera lugar su adhesión sobre la zona pelúcida; no reconocería ni la pieza intermedia ni la cola. Se evaluó, mediante autorradiografía, la capacidad de la ZP3 para distinguir entre espermatozoides con acrosoma intacto y losacrosómico-reactivos, y entre diferentes regiones espermáticas. Marcamos ZP3 purificada con un isótopo radiactivo; después, registramos, sobre película, la emisión de radiactividad de las moléculas. Las autorradiografías resultantes indicaban que la ZP3 marcada ofrecía el comportamiento esperado, y se unía sólo a espermatozoides con acrosoma intacto, y únicamente a las cabezas. Estos experimentos nos permitieron también hacer la estimación de que cada acrosoma intacto podía unirse a unas 10.000 a 50.000 moléculas de ZP3. Dada la extraordinaria movilidad de los espermatozoides de mamíferos, habrá que suponer que se necesitan decenas de miles de receptores en la zona pelúcida intacta, para unir cada célula espermática a su superficie. Bleil y yo también colaboramos para dilucidar el mecanismo mediante el cual se inducía la reacción acrosómica. Era muy posible que una glucoproteína de la zona pelúcida que no fuera la ZP3, esto es, las ZP1 o ZP2, indujera la reacción, después de producida la unión inicial del espermatozoide a la ZP3. Por tanto, combinamos espermatozoides de acrosoma intacto con cada una de las glucoproteínas de la zona pelúcida, obtenidas de óvulos de ratona, y observamos los efectos sobre el espermatozoide. Sólo la ZP 3 purificada, procedente de zonas pelúcidas ovulares, era capaz, in vitro, de
TEMAS 3
inducir la reacción acrosómica, lo que idénticas, unidas por puentes disul- de los dos aminoácidos, serina o treoponía de manifiesto que esa ZP3 era el furo. Esta arquitectura filamentosa nina. Los oligosacáridos se presentan inductor natural. No inducían la reac- sitúa en la superficie de la zona pelú- en muchas variedades, y en cada ción ni las ZP1 y ZP2, ya de óvulos o de cida a decenas de millones de molécu- molécula de ZP3 no se dan las mismas embriones, ni la ZP 3 procedente de las ZP3, más que suficientes para la secuencias de cadenas de azúcares. embriones. Al parecer, la ZP3 pierde su unión tenacísima de un ejército de capacidad para inducir la reacción células espermáticas. oco después de que Harvey M. Floracrosómica después de la fecundación, La investigación de las interaccioman llegara a mi laboratorio nos precisamente cuando pierde su capa- nes moleculares que permiten a la ZP3 pusimos a trabajar para determinar cidad para adherirse a espermatozoi- unirse al espermatozoide, e iniciar la si eran las cadenas de polipéptidos o des. Todavía no se ha aclarado, en sus reacción acrosómica, comenzó con el las de polisacáridos, o ambas, las respormenores, de qué manera la unión análisis previo de la acción química de ponsables de la actividad espermáde espermatozoides con la ZP3 induce la molécula. Estos estudios fueron lle- tico-receptora de la ZP3. En muchos la reacción acrosómica. Algunas prue- vados a cabo por Greve y otros dos de ejemplos de interacciones receptoras, bas avalan la posibilidad de que la mis doctorandos, Richard J. Roller y la estructura tridimensional del recepunión haga más permeable, a los iones George S. Salzmann. En este trabajo tor, que es a menudo una proteína, calcio, la membrana plasmática del no podíamos distinguir, de modo inme- resulta decisiva para su capacidad de espermatozoide y la posibilidad de que diato, qué características eran unión con una proteína complementadicho cambio facilite la fusión de las importantes para la función receptora ria. No conocíamos la conformación de membranas plasmática y acrosómica. y cuáles no lo eran, pero nos dio una la ZP3, pero sabíamos cómo alterarla, base firme para posteriores estudios. y al hacer esto podría determinarse si Averiguamos que la cadena polipep- lo importante, en su capacidad de l descubrimiento de la doble función de la ZP3 —unión espermá- tídica de la ZP3 constaba de unos 400 interacción con la proteína óvulotica e inducción de la reacción acrosó- aminoácidos. Como ramas salientes adherente sobre el espermatozoide de mica— nos sorprendió gratamente. El de esa cadena polipeptídica hay ratón, era la forma de la ZP3. caso es completamente distinto en los muchas cadenas de oligosacáridos, Nos encontramos con que el exponer erizos de mar y otros invertebrados cadenas cortas de azúcares sencillos. la ZP3 a agentes que desplegaban su marinos, en los que estas funciones se Tres o cuatro son oligosacáridos N-li- esqueleto polipeptídico (estructura plereparten entre dos moléculas diferen- gados, lo que significa que están uni- gada-no plegada) no ejercía influencia tes. En esos organismos, los óvulos dos a un átomo de nitrógeno, sobre el sobre la unión espermática, lo que presentan dos cubiertas exteriores: aminoácido asparraguina. Un número implicaba que la conformación de la una gruesa, gelatinosa, por fuera, y indeterminado, aunque bastante alto, ZP 3 no era un factor importante al otra, mucho más fina, por dentro, la eran oligosacáridos O-ligados, enlaza- respecto. Para confirmar esto, cortaenvuelta vitelina. Una molécula glu- dos a un átomo de oxígeno sobre uno mos moléculas de ZP 3 en pequeños cídica en la capa gelatinosa induce la reacción acrosómica, mientras que una glucoproteína, en la envuelta vitelina, es la responsable de la unión con especificidad específica. El saber que la ZP3 puede actuar en la unión espermática y en la inducción de la reacción acrosómica no sirve para explicar cómo lo hace. Esto nos llevó a otro estudio más amplio, si bien mis colegas y yo deseábamos ahondar más en la distribución de la ZP3 por la zona pelúcida. Pretendíamos, en particular, determinar si la superficie de la cubierta exhibía suficientes moléculas de ZP3 como para hacer posible las decenas de millares de interacciones que suponíamos eran necesarias para fijar a cada espermatozoide en su lugar. Jeffrey M. Greve y yo establecimos que la zona pelúcida constaba de largos filamentos interconectados, dotado cada uno de un grosor de unos 7 nanómetros (millonésimas de milímetro). Posteriormente determinamos que el sillar fundamental de los filamentos era una unidad compuesta de una molécula ZP 2 y otra ZP3, y que dicha unidad se repetía, a menudo 5. ESPERMATOZOIDE estrechamente adherido a una bola de vidrio, cubierta con ZP 3 de óvulo de ratona. Este hallazgo, unido al de que ni la ZP1 ni la ZP2, ni otras cientos de veces, en cada filamento. glucoproteínas, provocan esa unión, proporciona la prueba más importante de que Los filamentos de la zona pelúcida se la ZP3 es la receptora espermática en los ratones. La microfotografía, con microshallan conectados entre sí por ZP1, que copio de barrido, fue tomada por David M. Phillips, con material preparado por consta de dos cadenas polipeptídicas Mónica H. Vázquez.
P
E
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
21
6. EL EFECTO DE LA REACCION DE ZONA resulta espectacularmente claro en esta microfotografía en campo oscuro, tomada por el autor. Los espermatozoides se adosan a óvulos no fecundados (en masas apelotonadas), pero no a un embrión en fase bicelular. Es muy verosímil que la ZP3 esté implicada en la reacción de zona. Las enzimas corticales liberadas en la zona pellucida alteran las moléculas de ZP3 de manera que si antes actuaban como receptoras ahora rechazan a los espermatozoides.
glucopéptidos mediante pronasa, enzima totalmente indiferente ante la elección de los puntos de cortadura. Después volvimos a nuestras pruebas de competitividad, y mezclamos espermatozoides con toda la colección de glucopéptidos, para exponer ese esperma así tratado a óvulos no fecundados. Por lo que respecta a impedir la unión de espermatozoides y óvulos, los glucopéptidos pequeños mostraban la eficacia de la ZP3 intacta, cuyo resultado elimina, virtualmente, la posibilidad de que se requiera una conformación específica para la actividad espermático-receptora de la ZP3. El hecho de que la conformación de la ZP3 no revista importancia para la adherencia indica que la cadena polipeptídica, probablemente, no proporciona el sitio de unión. Para confirmar esto, tratamos la ZP3 con ácido trifluorometansulfónico, reactivo que elimina de las cadenas polipeptídicas tanto los oligosacáridos N-ligados como los O-ligados; entonces, mediante la prueba de competitividad, ensayamos, sobre la cadena desnuda, la acti vidad es permático-re ceptora. Ta l como se esperaba, la exposición de espermatozoides a la proteína sola no tenía efecto sobre la unión de los espermatozoides a los óvulos: los polipéptidos no poseen, de suyo, actividad espermático-receptora detectable. En pruebas similares separamos los oligosacáridos N-ligados de la ZP 3, mediante endoglucosidasa F, enzima que deja intactas las cadenas de glúcidos O-ligados. Esta forma modifi-
22
cada de la ZP3 conserva la actividad espermático-receptora. El hallazgo implicaba, muy firmemente, que los oligosacáridos O-ligados constituían la parte principal de la ZP3 del ratón en la adhesión espermática sobre zonas pelúcidas. Cuando, por otra parte, separamos los oligosacáridos O-ligados con un álcali débil, la molécula alterada no mostró actividad espermático-receptora. Y aún más, la exposición de espermatozoides ante pequeñas concentraciones de azúcares O-ligados —separados de la ZP3— impedía la unión de los espermatozoides a los óvulos y la fecundación. En conjunto, estos resultados demostraron que los oligosacáridos O-ligados eran los elementos espermático-adhesivos de la molécula ZP3.
S
in embargo, no todos los oligosacáridos O-ligados manifestaban actividad espermático-receptora. Tanto en estudios en los que se separaban, con respecto a su tamaño, cadenas de azúcares, y se mezclaban con esperma, como en aquellos en los que se mezclaba el esperma con la dotación total de las cadenas de azúcares O-ligados, obtenidas a partir de la ZP3, y en los que se suponía que estarían los oligosacáridos espermático-adherentes, se puso de manifiesto, para todos los casos, que no llegaban al 10 por ciento de los oligosacáridos O-ligados de la ZP 3 los que podían trabarse con los espermatozoides. Los que lo hacían eran los de peso molecular de unos 3900 dalton.
El descubrimiento de que, en el reconocimiento del espermatozoide y el óvulo, están implicados azúcares O-ligados se suma a una masa creciente de datos que destacan la importancia de los azúcares para el reconocimiento entre gametos, así como en otros tipos de reacciones intercelulares, no sólo en los vertebrados sino también en los invertebrados y en los vegetales. En ese sentido, los azúcares son imprescindibles para la unión con especificidad-específica de espermatozoides y óvulos de invertebrados marinos, así como para la inducción de la reacción acrosómica. También hay pruebas de que los azúcares intervienen de manera decisiva en las interacciones gaméticas del invertebrado marino Ciona intestinalis (una ascidia) y el alga parda Fucus serratus. Una vez sabido que la unión de la ZP 3 a la cabeza del espermatozoide inducía la reacción acrosómica, pasamos a examinar el papel de la cadena polipeptídica de la ZP3 y sus oligosacáridos en ese proceso. Florman y yo comenzamos con la degradación enzimática de la ZP3 en sus glucopéptidos, entre los rangos de pesos moleculares de unos 1500 a 70.000 dalton, e, in vitro, añadimos al esperma glucopéptidos de varios tamaños. Los glucopéptidos que eran mayores de unos 40.000 dalton inducían la reacción acrosómica; no así los menores (si bien en nuestros primeros experimentos los glucopéptidos pequeños lograron adherirse a espermatozoides de ratón). Además, los oligosacáridos O-ligados, obtenidos de una ZP3 ovular purificada, fracasaban también en la descarga de la reacción acrosómica. Estas y otras observaciones permiten suponer que, si bien sólo se necesitan oligosacáridos O-ligados de la ZP 3 para la unión óvulo-espermática, se requieren porciones relativamente largas de la molécula polipeptídica para inducir la reacción acrosómica. No ha sido aclarado, todavía, si es la cadena polipeptídica misma la que interactúa directamente con los espermatozoides adheridos; pudiera ser, por contra, que sirviera de mero soporte esquelético que permitiera, a un determinado número de oligosacáridos O-ligados, adecuadamente espaciados sobre la molécula Z P 3, interactuar con el espermatozoide. Tras haber averiguado algo sobre la unión de las moléculas de ZP3 a los espermatozoides y la producción de la reacción acrosómica por parte de aquéllas, volvimos a la cuestión de la pérdida, por la ZP3, de esas capacidades una vez fecundados los óvulos. ¿A
TEMAS 3
qué obedecía? No se conoce la razón de actúe, específicamente, sobre dichos los cambios que tienen lugar en la zona oligosacáridos y los convierta en irrepelúcida después de la fecundación, conocibles para los espermatozoides. pero sí se sabe que son una consecuen- En apoyo de esta idea, mis colegas y cia de la llamada reacción cortical; yo hemos encontrado que la eliminaocurre ésta inmediatamente después ción o modificación de ciertos azúcares de la fusión del óvulo con el esperma- del extremo de los oligosacáridos tozoide y precede, también inmedia- O-ligados de 3900 dalton —algo que tamente, a la reacción de zona. En la probablemente podrían hacer las enziratona, la reacción cortical comprende mas gránulo-corticales— destruye su la fusión de la membrana plasmática actividad receptora. del óvulo con la membrana que rodea a cada uno de los, aproximadamente, un cuando en estos últimos tiem4000 orgánulos ricos en enzimas, que pos se hayan encontrado respuesse llaman gránulos corticales y se tas a muchas de las cuestiones relatiextienden bajo la membrana plasmá- vas a las bases mole culares de la tica. La reacción provoca la expulsión fecundación en los mamíferos, otras de las enzimas granulares en el espa- mantendrán ocupados a los biólogos en cio perivitelino, desde el cual se filtran el futuro. Tendrán que ponerse a punto hacia la zona pelúcida. métodos con los que abordar las cues¿Acaso dichas enzimas alteran las tiones pendientes de resolución. Así, el glucoproteínas componentes de la gen codificador de la ZP3 ha sido clozona pelúcida? Ciertas pruebas, a par- nado por Ross A. Kinloch y por Jurrien tir de estudios con gametos del criceto Dean y sus colaboradores. La disponio hámster, permiten suponer que la bilidad de tales clones incrementa la molécula de mayor interés para noso- posibilidad de que las secuencias de tros, la ZP3, es alterada, sin duda, por ADN y los factores celulares que regulas enzimas gránulo-corticales. Ryuzo lan la producción de los receptores Yanagimachi y sus colaboradores, de espermáticos durante la ovogénesis la Universidad de Hawai en Manoa, puedan ser identificados prontamente. vieron que los espermatozoides de cri- Se ha determinado ya la secuencia ceto no podían unirse a la zona pelú- entera de aminoácidos de la cadena cida de óvulos expuestos a la acción de polipeptídica de la ZP3, en mi laboratolas enzimas gránulo-corticales. Es rio y en el de Dean. Esta información muy verosímil que lo mismo ocurra en podría facilitar la identificación de las el ratón: que la ZP3 quede inactivada regiones específicas de la ZP3 implicacomo receptor espermático por una das en la actividad espermático-reenzima gránulo-cortical. Visto el papel ceptora, en la inducción de la reacción primario de los oligosacáridos O-li- acrosómica y en el ensambla je de los gados de la ZP3 en la adhesión con los filamentos de la zona pelúcida. espermatozoides, existe la posibilidad Con otros investigadores estamos de que una enzima gránulo-cortical intentando aislar las enzimas gránulo-
A
INVESTIGACION Y CIENCIA DIRECTOR GENERAL Francisco Gracia Guillén EDICIONES José María Valderas, director ADMINISTRACIÓN Pilar Bronchal, directora PRODUCCIÓN M. a Cruz Iglesias Capón
Bernat Peso Infante Carmen Lebrón Pérez SECRETARÍA Purificación Mayoral Martínez EDITA Prensa Científica, S. A. Muntaner, 339 pral. 1. a 08021 Barcelona (España) Teléfono (93) 414 33 44 - Telefax (93) 414 54 13 SCIENTIFIC AMERICAN EDITOR John Rennie BOARD OF EDITORS Michelle
Press, Managing Editor ; Marguerite Holloway, News Editor ; Ricki L. Rusting, Associate Editors ; Timothy M. Beardsley; W. Wayt Gibbs; John Horgan, Senior Writer ; Kristin Leutwyler; Madhusre Mukerjee; Sasha Nemecek; Corey S. Powell; David A. Schneider; Gary Stix; Paul Wallich; Philip M. Yam; Glenn Zorpette. PRODUCTION Richard Sasso CHAIRMAN AND CHIEF EXECUTIVE OFFICER John J. Hanley CO-CHAIRMAN Dr. Pierre Gerckens
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
corticales, que al parecer catalizan la reacción de zona; pretendemos hacer lo propio con la proteína óvulo-adherente del espermatozoide, que reconoce los oligosacáridos O-ligados de la ZP3, así como determinar la secuencia glucídica de los oligosacáridos O-ligados de 3900 dalton en la ZP3, que son reconocidos por el espermatozoide; esperamos, por último, ampliar nuestros estudios a la fecundación humana, para analizarla con mucho mayor detalle molecular, lo mismo que hemos analizado la fecundación del ratón. Los estudios moleculares de la fecundación humana podrían conducirnos a nuevos métodos de contracepción por interferencia de los receptores de unión espermáticos con las proteínas óvulo-adherentes. Esto podría, también, conducirnos a nuevos tratamientos de ciertas formas de esterilidad causadas por anomalías moleculares del espermatozoide o del óvulo.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA MECHANISMS
AND
CONTROL
OF
ANIMAL
. Dirigido por John F. Hartmann. Academic Press, 1983. FERTILIZATION
O-LINKED OLIGOSACCHARIDES
OF
MOUSE
ZP3 ACCOUNT FOR ITS SPERM RECEPTOR ACTIVITY . Harvey M. Florman y Paul M. Wassarman en Cell, vol. 41, número 1, págs. 313-324; mayo de 1985. EARLY EVENTS IN MAMMALIAN FERTILIZATION . Paul M. Wassarman en Annu al Review of Cell Biology, vol. 3, págs. 109142; 1987. EGG
THE BIOLOGY AND CHEMISTRY OF FERTILI-
DISTRIBUCION para España: MIDESA
Carretera de Irún, km. 13,350 (Variante de Fuencarral) 28049 Madrid Tel. (91) 662 10 00 para los restantes países:
Prensa Científica, S. A. Muntaner, 339 pral. 1.a – 08021 Barcelona Teléfono (93) 414 33 44
. Paul M. Wassarman en Science, vol. 235, n.o 4788, págs. 553-560; 30 de enero de 1987. ZATION
PUBLICIDAD
GM Publicidad Francisca Martínez Soriano Menorca, 8, bajo, centro, izquierda. 28009 Madrid Tel. (91) 409 70 45 – Fax (91) 409 70 46 Cataluña y Baleares: Miguel Munill Muntaner, 339 pral. 1.a 08021 Barcelona Tel. (93) 321 21 14 Fax (93) 414 54 13
Copyright © 1996 Prensa Científica S. A. Muntaner, 339 pral. 1.a 08021 Barcelona (España) Reservados todos los derechos. Prohibida la reproducción en todo o en parte por ningún medio mecánico, fotográfico o electrónico, así como cualquier clase de copia, reproducción, registro o transmisión para uso público o privado, sin la previa autorización escrita del editor del libro. ISSN: 1135-5662 Dep. Legal: B-32.350-1995 Filmación y fotocromos reproducidos por Scan V2, S.A., Avda. Carrilet, 237 – 08907 l'Hospitalet (Barcelona) Imprime ROTOCAYFO, S.A. Ctra. de Caldes, km 3-Santa Perpètua de Mogoda (Barcelona) Printed in Spain - Impreso en España
23
Una herencia distinta Robin Holliday La metilación del ADN podría constituir uno de los principales mecanismos “epigenéticos”. Su función sería la transmisión de los patrones de actividad génica de una generación celular a otra durante las fases de desarrollo
E
l nacimiento de un individuo plenamente formado, con tejidos y órganos funcionalmente distintos, a partir de un espermatozoide y un óvulo es un acontecimiento que no sólo despierta la admiración de los padres, sino que abre también uno de los mayores interrogantes de la biología. En parte, la solución de dicho enigma reside en los genes del nuevo embrión, heredados de los padres a través del ADN cromosómico presente en el óvulo y el espermatozoide. La activación o desactivación de los genes (de manera permanente o transitoria) según una secuencia predeterminada modifica la mezcla proteínica de las células recién formadas y, como resultado de ello, la actividad de las mismas. Aunque las primeras células embrionarias tengan ya todo el potencial que les va a permitir formar un organismo complejo, no están todavía especializadas. Es más tarde cuando las células se determinan (quedan comprometidas a seguir cierto camino en el desarrollo); posteriormente, se diferencian y se convierten en las unidades especializadas de los organismos adultos. Las células diferenciadas sintetizan las denominadas
ROBIN HOLLIDAY trabaja en el laboratorio de biología molecular CSIRO con sede en la ciudad australiana de Sydney. Tras doctorarse, en 1959, por la Universidad de Cambridge fue contratado por el Instituto John Innes de Hertford, donde desarrolló la teoría de recombinación genética que lleva su nombre. En el Instituto Nacional de Investigaciones Médicas de Londres, su destino siguiente y cuya jefatura de la división de genética alcanzó en 1970, trabajó sobre recombinación, reparación del ADN y envejecimiento celular. Desde el año 1988 se encuentra en CSIRO, concentrado en el estudio del fenómeno de la metilación del ADN.
24
proteínas de lujo, las que confieren identidad a los distintos tejidos. La existencia de un programa de desarrollo no explica por sí sola por qué las células embrionarias tempranas divergen más tarde. Algunos procesos deben actuar sobre el ADN para dirigir la ejecución del programa: seleccionar los genes que deben acti varse o desactivarse en cada célula y en cada momento. Si no fuese así, todas las células somáticas (no germinales) del cuerpo, dotadas de los mismos cromosomas, se desarrollarían de idéntica manera. Debe haber algo que controle también la transmisión de los patrones de activación-desactivación de una generación celular a la siguiente. Esta transmisión es decisiva para que las células hijas mantengan o continúen desarrollando el programa de especialización. Los procesos que controlan la ejecución del programa de desarrollo se denominan epigenéticos. Se sabe muy poco acerca de las complejas reglas epigenéticas que regulan la alteración y herencia de las actividades génicas en las células del embrión, o en las más especializadas células somáticas del organismo adulto. Ello contrasta con el amplio conocimiento que poseemos de la genética clásica, esto es, de la mera transmisión de genes de padres a hijos. No obstante, el joven campo de la epigenética empieza ahora a cosechar algunos progresos. La mayoría de los investigadores interesados en los estudios sobre el control de la actividad génica durante el desarrollo convendrían en que tiene que basarse en interacciones específicas entre ADN y proteínas. (Después de todo, la unión de proteínas específicas a determinados segmentos de ADN de las regiones reguladoras de los genes parece controlar, de forma general, la expresión génica: la transcripción de un gen en ARN mensajero, mediada por la
enzima polimerasa de ARN, y posterior traducción del mensajero en la correspondiente proteína.) Más allá de esto, las discrepancias son notables.
S
egún un punto de vista, que defiende un tipo de herencia proteínica, las características heredables de una célula vienen determinadas por la formación de unos complejos de ADN y proteínas asociadas. Los defensores de esta hipótesis creen que dichas proteínas intervienen en la opción de los genes que deben acti varse e inactivarse dura nte el desarrollo y, además, que tales comple jos ADN-proteínas se mantienen en sucesivas generaciones celulares, esto es, que esas proteínas específicas permanecen íntimamente unidas a ciertas regiones de ADN durante la replicación de los cromosomas y la división celular. No se explica, sin embargo, cómo se puede lograr una compenetración tan duradera. Otra posibilidad muy distinta es que las propias secuencias genéticas se alterasen de una forma específica y que tales alteraciones persistieran en virtud del mecanismo normal que asegura la fidelidad de la replicación del ADN. Se sabe, por ejemplo, que ciertos segmentos de los genes que determinan anticuerpos se reorganizan en el curso de la diferenciación, con lo que se asegura que diferentes células del sistema inmunológico produzcan distintos anticuerpos. Las reorganizaciones son, no obstante, irre versibles; se ha observado, por contra, que los cambios epigenéticos en el ADN de ciertas células somáticas especializadas pueden revertirse o reprogramarse. Por tanto, es poco probable que las reorganizaciones de ADN constituyan un mecanismo fundamental en la dirección del desarrollo. Hace algún tiempo que propusimos una tercera hipótesis, afín, aunque
TEMAS 3
distinta, de la que propone la herencia proteínica. En nuestra opinión, la modificación química del ADN podría constituir un importante proceso epigenético en los organismos superiores. En particular, la adición de un grupo metilo (CH3) a las citosinas, una de
las cuatro bases nitrogenadas que distinguen a los nucleótidos que conforman el ADN, intervendría en la dirección de los cambios genéticos que se producen en las células durante su desarrollo. (Las restantes bases son guanina, adenina y timina.) La meti-
1. CELULAS ESPECIALIZADAS producidas al tratar un cultivo de fibroblastos (células del tejid o conectivo) de ratón con azacitidina, agente que elimina grupos metilo del ADN. La desmetilación va asociada a menudo con la activación de genes silenciados. Normalmente, los fibroblastos no cambian su destino, pero en este caso algunos de los fibroblastos se han transformado en células musculares (arriba ), que se unen para constituir largas fibras (bandas) que se contraen. Otras
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
lación de la citosina parece intervenir en cómo se produce la herencia de los patrones de actividad génica entre las células, como mínimo. Para nosotros, son los grupos metilo unidos al ADN, y no determinadas proteínas, los que se transmiten intactos de una genera-
células se diferencian en adipocitos, células que almacenan grasas (abajo, teñidas de rojo). Estos hallazgos apoyan la idea según la cual las alteraciones del estado de met ilación del ADN influyen en la vía de desarrollo que van a seguir las células. Las fotomicrografías fueron suministradas por Shirley M. Taylor, Lesley A. Michalowsky y Peter A. Jones, de la facultad de medicina de la Universidad del Sur de California, con cuyo permiso las publicamos aquí.
25
en el ADN eucariota son dobletes de citosina-guanina, esto es, una citosina seguida en la misma cadena por una guanina. Las bases de las cadenas emparejadas son complementarias, no idénticas; como la citosina de una cadena empareja con guanina en la cadena complementaria, la presencia de un doblete de citosina-guanina en una cadena empareja siempre con una unidad de guanina-citosina en la otra cadena. Esta configuración aporta un sustrato (la citosina) para la metilación casi exactamente en el mismo sitio de ambas cadenas.
ENZIMA +
S -ADENOSILMETIONINA
CITOSINA
5-METILCITOSINA
2 . CITOSINA, una de las cuatro bases del ADN ( izquierda). Se metila por una enzima que sustituye el átomo de hidrógeno del carbono número cinco por un grupo metilo (CH3) de la S-adenosilmetionina, para formar 5-metilcitosina (derecha). La modificación de la citosina se produce después de la replicación del ADN. ción celular a otra. Es su presencia o ausencia lo que sirve de señal para las proteínas reguladoras, que actúan sobre el ADN de las células hijas exactamente igual que lo hacían con el de las células progenitoras.
misma especificidad de secuencia que las correspondientes restrictasas. El descubrimiento de que la 5-metilcitosina podía afectar seriamente la interacción entre proteínas y ADN, junto con el hecho conocido de que constituye un componente habintes de contar con prueba alguna tual del ADN de vertebrados, plantas a favor o en contra, fueron varios y muchos otros organismos superiolos mecanismos propuestos para res, nos sugirió a mi alumno John E. explicar el papel de la metilación en Pugh y a mí que la presencia de el control del desarrollo. Presen- 5-metilcitosina podría condicionar la taremos luego las pruebas que se han actividad génica de los eucariotas, obtenido recientemente y que hablan conclusión a la que también llegó indeen favor de la hipótesis; empecemos, pendientemente Arthur D. Riggs, lo sin embargo, por relatar la historia que le permitiría actuar como una que nos permitirá entender mejor los señal que facilitase la activación o la razonamientos que apoyaban dichas inhibición de los genes. Como luego se verá con más detalle, contamos ya con propuestas. El interés por la metilación de las abundantes pruebas que demuestran citosinas del ADN, entendida como que la metilación de las regiones regumecanismo epigenético de los euca- ladoras de los genes (o regiones cercariotas, surgió mientras se investiga- nas) suele hallarse, en efecto, asociada ban las interacciones entre enzimas y con la inactivación génica, por la pro ADN en bacterias, organismo s que bable razón de que la formación de la carecen de organización corporal com- 5-metilcitosina bloquea la unión de los pleja. A principios de los años setenta activadores transcripcionales o estiya se había observado que las enzimas mula la unión de inhibidores. Tanto nosotros como Riggs propuside restricción, o restrictasas, reconocían de forma específica secuencias mos además que la señal de metilación breves de bases del ADN y lo cortaban podían retenerla los cromosomas eucapor esos sitios. Estas enzimas estaban riotas durante la replicación, antes de capacitadas para distinguir entre las la división mitótica de las células. secuencias con algún tipo de modifica- Todas las células somáticas son diploición y las no modificadas, pues sólo des; poseen un juego de cromosomas cortaban estas últimas. Una de las materno y otro paterno. Antes de que modificaciones más comunes que la célula se divida, los cromosomas se parecían influir en la actividad res- duplican: las dos cadenas de ADN de trictasa era la metilación de la ade- cada cromosoma se separan y se sinnina y del que suele denominarse car- tetizan nuevas cadenas complementabono 5 de la citosina, con la formació n rias. Así cada célula hija recibe un de la 5-metilcitosina. Las reacciones juego cromosómico completo. El mecanismo que postulábamos se de metilación ocurrían inmediatabasaba, en parte, en el conocimiento mente después de la replicación del ADN , por enzim as que tenía n la de que los sitios que suelen metilarse
A
26
A
venturamos que una enzima, la metilasa de mantenimiento, actuaría sólo en los fragmentos de ADN “hemimetilados”, entendiendo por tales aquellos en que una sola de las dos cadenas tuviese metilado el doblete de citosina-guanina. Al duplicarse el ADN completamente metilado, se originaría ADN hemimetilado, de cuya metilación inmediata se ocuparía la enzima de mantenimiento. Por el contrario, la descendencia del ADN sin metilar estaría también sin metilar y así permanecería, ya que la metilasa de mantenimiento no podría actuar sobre él. En consecuencia, se conservaría una señal de metilación previa durante la división celular; ocurriría lo propio con la ausencia de metilación y no habría regiones permanentemente hemimetiladas. Con estas reglas, se recompondría en las células hijas el patrón de metilación (y no metilación) del ADN de una célula progenitora y, por tanto, su dotación de actividades génico-específicas. Este guión esquemático del mantenimiento de los patrones de metilación del ADN a través de muchas generaciones de células no explica cómo se activan o desactivan los genes durante el desarrollo; es decir, no explica cómo se cambia el patrón de uniones proteínicas para que ciertas células adquieran una especialización mayor que sus progenitoras. No existe un modelo que justifique por sí solo todos los cambios de estado de actividad génica. Lo que no ha sido óbice para que Pugh y yo sugiriésemos algunas vías por las que la metilación o desmetilación de los cromosomas podrían participar en ese tipo de cambios. Nuestra primera premisa establecía que sólo una minoría de los dobletes de citosina-guanina del ADN participarían en los mecanismos de cambios de actividad génica; el ADN contiene demasiados dobletes metilados como para que todos cumplan una
TEMAS 3
misión reguladora. Suponíamos tam- mente de los mismos mecanismos que tan pronto como la región se metile, la bién que los dobletes importantes operan en las células madre. propia metilación desencadene una para dichos procesos deberían alojarse alojar se Mi grupo y el de Riggs han abordado rápida reacción que imposibilite impo sibilite la en secuencias de bases más largas, la participación de la metilación del modificación del otro cromosoma. De reconocibles por proteínas reguladoras ADN en los cambios que, en una fase ese modo, uno de los cromosomas queespecíficas para determinados genes; precoz del desarrollo, determinan la dará metilado en el centro de inactipor sí solos, los ubicuos dobletes no inactivación de uno de los dos cromo- vación vació n y el otro no. Este patrón se conferirían esa especificidad. somas X en todas las células somá- mantendría fielmente en futuras diviSentadas estas bases, parecía razo- ticas de las hembras. (El proceso es siones celulares mediante las reglas nable sugerir que los cambios de activi- aleatorio: en algunas células se inac- de la herencia descritas antes. dad génica se producirían cuando una tiva el cromosoma X materno; en enzima distinta de la metilasa de otras, el paterno.) na explicación más detallada de mantenimiento reconociese una Hay una región de cambio especíla inactivación de un cromosoma cromosoma secuencia específica de bases en una fica, que recibe el nombre de centro de X requiere requ iere tamb ién un meca nismo nism o de las cadenas de ADN de un inactivación, en cada cromosoma X. que dé cuenta de la progresiva inacticromosoma cromosoma y colocase un grupo metilo Esta región interviene en la determi- vación de todo un cromosoma en una en un doblete de citosina-guanina de nación de la activación o inactivación etapa temprana del desarrollo. Ello esa secuencia. Esta acción obligaría a del cromosoma. En el marco de nues- puede llevarse a cabo si la región de la enzima de mantenimiento a meti- tra hipótesis, esta región podría reco- cambio no metilada del cromosoma lar, inmediatamente, la cadena com- nocerla una enzima específica que destinado a quedarse inactivo permiplementaria. De esta manera, las futu- metila las dos cadenas del centro de tiese la unión de una segunda metirasgeneracionesdelmismo cromosoma inactivación en el cromosoma X que lasa que, desde ese sitio, recorriese estarían metiladas en el mismo sitio, a va a permanecer activo, pero no modi- todo el ADN metilando secuencias de pesar de que los grupos metilo no estu- fica el cromosoma homólogo. Esta bases específicas. vieran unidos al gen en un principio. modificación diferencial podría ocurrir Aunque hemos hablado de los mecasi se cumplen simultáneamente dos nismos de cambio y heredabilidad n otros casos, una enzima especí- condiciones: que la enzima posea una como si no estuviesen controlados más fica de secuencia podría eliminar actividad baja o encuentre dificulta- que por factores internos de cada un grupo metilo de un sitio concreto, des en metilar la región diana y que, célula, se sabe que hay agrupaciones antes de que aconteciese la división celular. En ausencia de la señal de metilación, la enzima de manteniREGION ESTRUCTURAL DE LA PROTEINA REGION REGULADORA miento no metilaría el sitio opuesto de la cadena complementaria recién sina tetizada, con lo que el gen originalmente metilado dejaría de estarlo. Un caso distinto sería el de una proteína específica de secuencia que bloquease la metilación de mantenimiento, ADN PROTEINA POLIMERASA uniéndose al punto del segmento de ACTIVADORA DE ARN ADN recién replicado donde la metime tiY ESPECIFICA DE SECUENCIA lasa de mantenimiento colocaría normalmente un grupo metilo. Al replicarse ahora el ADN hemimetilado, la cadena que careciese de grupo metilo originaría otra cadena sin metilar, quedando así eliminada la señal de ARN MENSAJERO metilación del cromosoma afectado. Este singular mecanismo de cambio podría muy bien estar implicado en la segregación de actividades génicas, proceso por el que una célula se divide PROTEINA b BLOQUEADA originando una célula hija igual a ella y otra que se ve forzada a seguir cierta 5-METILCITOSINA ruta diferente [véase la figura 5 ]. La segregación segregación se puede producir en células progenitoras (o madre, “stem cells”) ya determinadas de organismos en desarrollo o de adultos; sirvan de ejemplo las células de la médula ósea que producen diversos tipos de glóbu- 3. COMIENZA LA TRANSCRIPCION de un gen ( a) cuando una proteína (o proteínas) los rojos y leucocitos. Estos fenómenos reconoce una secuencia específica de bases de la región reguladora de dicho gen y de segregación ocurren también en se une al ADN. Esta unión es la señal para que una enzima, la polimerasa de ARN, etapas bastante tempranas del de- transcriba la región de ADN que determina la prot eína en una molécula de ARN mensajero. (Posteriormente, el ARN mensajero se traduce en la proteína corressarrollo y, en nuestra opinión, podrían pondiente.) La metilación del ADN ( b), indicada en rojo, puede inactivar un gen, si obedecer obedecer también a cambios de meti- impide la unión de la proteína activadora esencial. En opción alternativa, la metilación, aunque no se trate necesaria- lación puede facilitar la unión de una proteína inhibidora.
U
E
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
27
celulares de un embrión que sufren poseen a menudo un efecto modulacambios coordinados en respuesta a dor, lo que parece volver a indicar que señales extracelulares (inductores (inductores y la señal de metilación es el regulador morfógenos) emitidas por otras célu- más específico de la función génica. las. Las señales se reciben en la membrana celular y se transmiten transmi ten al ales estudios no establecen por sí núcleo, núcleo, donde dejan sentir su influenmismos una relación de causa a cia sobre la transcripción de genes efecto entre metilación y actividad específicos. La metilación podría po dría génica, pero otros experimentos son mediar en este proceso; esto es: la más concluyentes. Por ejemplo, cuando cuando señal recibida en la membrana celular se preparan genes metilados y sin podría alterar el estado de metilación metilar mediante la técnica del ADN de las secuencias reguladoras de genes recombinante, y se introducen en culparticulares en un grupo de células cé lulas tivos de células de mamíferos, sólo se diana. Una vez realizado el cambio de expresan los genes sin metilar. [Estos metilación, se heredaría por las experimentos de transferencia (“transsiguientes generaciones celulares. fection”) aportan también pruebas Como ya se señaló más arriba, la sobre la heredabilidad de los patrones metilación del ADN podría no ser la de metilación del ADN, ya que el ADN única forma de inducir en él cambios foráneo retiene su estado de metilación metilación heredables. Con todo, a medida que muchas generaciones después de su pasa el tiempo, nuestra idea funda- introducción en las células cultivamental, es decir, que la metilación es das.] un componente de la regulación Diversos trabajos de transferencia génica, va ganando apoyo experimen- han demostrado posteriormente que, tal. Son muchos los estudios que han cuando se introduce un gen metilado correlacionado la activación génica en una célula que suele expresar dicho con la ausencia de metilación del ADN gen, el gen insertado se desmetila y en sitios específicos, normalmente en activa de inmediato. Esto se observa la región reguladora del gen o en su para el gen de la actina de los mioblas vecindad. Resulta sorprendente que tos, precursores de células muscudicha correlación no constituya un lares; la actina es necesaria para la efecto débil o relativo, sino una aso- contracción muscular. Resulta cierto ciación del tipo todo o nada: la presen- también en el caso del gen de la insucia de los grupos metilo no parece lina en células de origen pancreático estar asociada con un simple descenso y en un gen de anticuerpo en los linde la expresión génica, sino, casi siem- focitos, células del sistema inmunolópre, con la total inactivación. Por con- gico. Ahora bien, si se introducen las tra, las alteraciones en la secuencia de versiones metiladas de los genes en bases de las regiones promotoras, células sin especializar, permanecen donde se inicia la transcripción,
T
metiladas e inactivas. Estudios similares han demostrado que la expresión, inducida por hormona, del gen de la vitelogenina (un componente de la yema del huevo en anfibios y aves) está asociada con la desmetilación específica de la región reguladora del gen y que el gen de la cristalina (una proteína del cristalino) se desmetila en las células del cristalino antes de su activación. En todos esos ejemplos, la desmetilación parece darse fuera de los períodos períodos de replicación de ADN, lo que indica de manera tajante que el proceso no es un mero subproducto de la replicación, sino que está gobernado directamente por proteínas que sólo funcionan en tipos celulares específicos. La presencia de dicho proceso activo, específico de tejido, sugiere que la desmetilación no es una reacción casual, sino que encierra un propósito definido: la activación génica selectiva. Se han obtenido nuevas pruebas de la influencia de la metilación sobre sobre la actividad génica con un enfoque experimental totalmente diferente: la eliminación química de grupos metilo del ADN. Las células se exponen a una droga, la azacitidina, que se incorpora A LA CELULA HIJA
DOBLETE DE CG
METILASA DE MANTENIMIENTO
5-METILCITOSINA
4. TRANSMISION del patrón de metilación de ADN de una célula a su hija. Del proceso se ocupa una enzima, la metilasa de mantenimiento (círculos). El resultado puede ser la transmisión de un patrón idéntico de unión de proteínas y, por tanto, de actividad e inactividad in actividad génica. Cuando Cuand o las cadenas de ADN se separan para la replicación, cada una de ellas retiene sus grupos metilo originales; la metilasa rápidamente coloca nuevos grupos metilo en el sitio opuesto de la cadena recién sintetizada (naranja). La enzima actúa sobre dobletes de las bases citosina citosin a (C) y guanina (G). Las otras bases son adenina ( A) y timina (T ). ).
28
A LA CELULA HIJA
TEMAS 3
b
a
REPLICACION
REPLICACION
ENZIMA ESPECIFICA DE SECUENCIA ELIMINA CH3
CROMOSOMA ALTERADO
METILASA DE MANTENIMIENTO MANTENIMIENTO AÑADE CH3
CROMOSOMA IDENTICO
ENZIMA ESPECIFICA DE SECUENCIA METILA SITIO
CROMOSOMA IDENTICO
METILASA DE MANTENIMIENTO AÑADE CH3
CROMOSOMA ALTERADO
5. CAMBIO GENETICO que permite a una célula precursora dar origen a dos células hijas, una igual a ella y otra con un patrón distinto de actividad génica. El cambio puede realizarse de varias maneras. Por ejemplo, una enzima puede eliminar un grupo metilo de una secuencia específica de bases de un gen recién
replicado; ello determinará que el gen se herede en su forma n o metilada (a). La unión específica de una proteína puede impedir también la metilación de la nueva cadena (no se muestra). Cabe asimismo que una enzima específica añada un grupo metilo a un gen sin metilar (b), que ahora se heredaría de esta forma.
al ADN e inhibe la actividad de la muestran que puede existir un estre- de la facultad de medicina de la metilasa de mantenimiento. En vir- cho control epigenético de la activi- Universidad de California en Los tud de lo cual muchos puntos original- dad génica y que dicho control es Angeles. Angeles. Observaron la transformamente metilados quedan desmetila- heredable. ción de fibroblastos no totalmente dos a los pocos ciclos de replicación Aunque el proceso de inactivación y diferenciados, que pueden considecelular. En muchos sistemas experi- reactivación de genes en células culti- rarse células del tejido conectivo, en mentales se ha demostrado que el fár- vadas de mamíferos ha suministrado otros tipos celulares diferenciados, maco reactiva la expresión de genes pruebas valiosas sobre la existencia tras el tratamiento con azacitidina. que se hallaban antes silenciados, lo de una relación entre metilación del Algunas células se convierten en mioque indica claramente que la pérdida ADN y expresión génica, no demues- blastos (precursores de las células del grupo metilo es su causa. Así se tra por sí solo que las alteraciones de musculares) y luego en células muscumetilan genomas retrovíricos inacti- los patrones de metilación desem- lares adultas, que se contraen en las vos que se han incorporado incorpo rado en cro- peñen un papel fundamental en los placas de cultivo. Otras células de la mosomas celulares pero pierden sus cambios de actividad génica durante población de fibroblastos se diferengrupos metilo y simultáneamente se el desarrollo. Pero contamos con prue- cian en adipocitos, células que almareactivan en cuanto los exponemos a bas sugestivas sugest ivas de que los cromoso mas mas cenan grasas. Se ha demostrado que azacitidina. X activos e inactivos de las células de la diferenciación de las células musculas hembras (que, como señalamos, se lares iba asociada con la pérdida de or citar otro ejemplo, muchas líneas lí neas diferencian durante el desarrollo) metilación en un determinado gen celulares de mamíferos se mues- poseen patrones de metilación distin- regulador, lo que indicaría que el tran incapaces de sintetizar una tos, tal como postulaba el modelo pro- estado de metilación de los genes enzima activa activa porque presentan una puesto por nosotros. En concreto, se influye en las vías de desarrollo de las mutación clásica, esto es, una altera- ha encontrado que ciertas secuencias células. Si las células somáticas se determición en la secuencia de ADN del gen. de ADN de las regiones reguladoras Otras líneas líneas celulares que son defi- de los genes “cotidianos”, o próximas a nan, diferencian y son capaces de oricientes en esa enzima tienen intactos ellas, se hallan metiladas en el cromo- ginar sólo ciertos tipos celulares los genes para dicha enzima, pero se soma X inactivo y sin metilar en su durante el desarrollo, ¿qué es lo que homólogo activo. Los genes cotidianos, permite a las células germinales perencuentran silenciados, por la presu- homólogo responsables del mantenimiento “dia- manecer totipotentes, de tal manera mible causa de su metilación. Cuando responsables las células células se tratan con azacitidina, rio” de las células, suelen darse acti- que, cuando un espermatozoide fecunda un óvulo, el embrión resulse reactivan reactivan del 10 al 30 por ciento de vos en todas éstas. Los genes del cro- fecunda los genes inicialmente silenciados, un mosoma X inactivo pueden también tante pueda originar cualquier tipo vados por la azacitidina. efecto que viene a suponer multipli- ser reacti vados celular en el nuevo individuo? Más directo aún es el trabajo de Las células germinales no parecen car por un millón la tasa de reversión Tay lor, seguir el curso unidireccional de las espontánea. Estos experimentos de- Peter A. Jones y Shirley M. Taylor,
P
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
29
SEÑAL EXTRACELULAR
MEMBRANA CELULAR
NUEVA SEÑAL PRODUCIDA O RECIBIDA
RECEPTOR
RECEPTOR PRODUCIDO
SEÑAL INTERNA
DIVISION CELULAR
NUCLEO
NUEVO ESTADO DE METILACION
6. CIERTAS SEÑALES EXTERNAS provocan cambios heredables en las actividades de grupos completos de células durante el desarrollo, modificando quizás el patrón de metilación del ácido desoxirribonucleico. En la transmisión de la señal (izquierda) media una proteína difusible (verde), que se une a un receptor de la superficie celular (rojo) (o bien una proteína que se une a la superficie de otro tipo de célula). El
complejo señal-receptor puede provocar un cambio en el estado de metilación del ácido desoxirribonucleico celular, como la eliminación de los grupos metilo de un gen, y producir así un nuevo receptor o un factor difusible que puede influir sobre otras células. El cambio resultaría hereditario y se mantendría, por consiguiente, en las generaciones posteriores (derecha).
células somáticas. Cualquier cambio espermatozoides y de óvulos están un gen del cromosoma X inactivo es epigenético que ocurra en las células metilados de forma distinta. bastante baja, pero cobra una celerigerminales, como la inactivación de Con independencia del modo en dad progresiva con la edad del animal. un cromosoma X, revierte o se altera que se controle el desarrollo embrio- Por otro lado, un gen necesario para durante o inmediatamente antes de la nario de los organismos superiores, la formación de pigmentos se silencia meiosis, proceso de división celular el resultado final es un organismo cuando se inserta en un cromosoma X que origina óvulos y espermatozoides. completo, cuyo cuerpo permanece inactivo; el resultado es un animal Además, los cromosomas de óvulos y estable durante bastante tiempo. Con albino. El gen se activa progresivaespermatozoidesrecibenuna impronta todo, el cuerpo acaba envejeciendo; mente a medida que el receptor envedistinta, esto es, una marca diferen- los tejidos se vuelven torpes. Una jece, con el consiguiente incremento cial, según procedan de la madre o del causa que probablemente contribuya de la pigmentación del pelaje. padre. Así, aunque los cromosomas de a ello es la gradual disfunción de los un espermatozoide procedan, por mecanismos de mantenimiento celuruebas experimentales con céluejemplo, de la madre del padre, segui- lar: los encargados de reparar el las humanas apoyan este cuadro rán llevando la impronta masculina. ADN, de reemplazar las células que de la pérdida de metilación. Leonard Se ha comprobado que esta marca se pierden y de regular la transcrip- Hayflick descubrió que la vida media diferencial es crucial para el desarrollo ción de los genes. de las células humanas en cultivo normal de los ratones (y, por extrapoSi la heredabilidad de los patrones dependía del número de veces que se lación, de otros mamíferos), de lo que de metilación importa para el funcio- dividían y no del tiempo cronológico. se infiere que su función es silenciar namiento a largo plazo de los tejidos, Se observó que el número de sitios y activar series distintas de genes en entonces la pérdida gradual de grupos metilados del ADN de dichas células los cromosomas maternos y paternos, metilo contribuiría al envejecimiento. disminuía al aumentar el número de y que tales diferencias se complemen- Se pueden producir fallos ocasionales divisiones celulares y terminaban por tan entre sí para dirigir el desarrollo en la metilación de mantenimiento perder su capacidad de proliferar. La normal. durante la mitosis o en el reemplazo posibilidad de que esta incapacidad de los grupos metilo tras la reparación multiplicativa, acompasada con la or tanto, si se quiere que el desa- del ADN de células que no se estén edad, sea, al menos en parte, una conrrollo se inicie y lleve a cabo dividiendo. La pérdida de metilación secuencia de la pérdida de metilación correctamente, al ADN normal de podría provocar así un estado de acti- nos la sugieren los experimentos acoóvulos y espermatozoides debe super- vación no deseable en genes silencia- metidos con células cultivadas y trataponerse un “código epigenético”. Tra- dos y, por consiguiente, un desarreglo das con azacitidina. Un único tratabajos recientes indican, lo que quizá de la función celular y la muerte de las miento de células jóvenes, suficiente no debiera sorprender, que esta repro- células. para reducir significativamente el Este planteamiento ayudaría a nivel global de metilación del ADN, gramación del genoma durante la meiosis podría conllevar cambios en explicar dos descubrimientos recien- apenas incide, al principio, en el funlos patrones de metilación: en los rato- tes hechos sobre ratones. En los jóve- cionamiento o tasa de crecimiento de nes, los cromosomas que proceden de nes, la frecuencia de reactivación de las células. Pero diríase que las células
P
P
30
TEMAS 3
“recuerdan” la exposición al fármaco, carcinógenos conocidos. Ahora bien, la Tomados, pues, en su conjunto, los pues se extinguen bastante antes que azacitidina no suele producir mutacio- datos aducidos convierten la metilalos controles no tratados. nes genéticas. Y dado que el compuesto ción del ADN en un importante factor Los trabajos sobre el envejecimiento, envejecimiento, químico afecta a la metilación del epigenético del desarrollo de los orgaaunque no aportan pruebas inconcu- ADN, parece razonable sospechar que nismos superiores. Datos que sugieren, sas, revelan la fragilidad de los con- las alteraciones que produce en los asimismo, que los fallos producidos en troles epigenéticos sobre la expresión patrones de metilación contribuyan al los procesos normales de metilación génica: gé nica: no son absolutos y pueden desarrollo del cáncer. intervienen en el envejecimiento celudeteriorarse. de teriorarse. Cabe pensar, en ese orden, que las epimutaciones (aberraciones en la actividad génica) podrían OVULO ESPERMATOZOIDE causar la “desdiferenciación” celular a FECUNDACION y contribuir así a la carcinogénesis. CROMOSOMAS Entre las razones que se aducen IMPRONTA IMPRONTA para sugerir la presunta intervención MATERNA PATERNA de las epimutaciones en los procesos cancerosos está la comprobación de que, de células no metastásicas, se originan células metastásicas con mayor frecuencia de lo que cabría CELULAS esperar si dicho cambio no se desenDEL NUEVO cadenara más que por mutaciones INDIVIDUO genéticas normales. Por otro lado, las tasas de mutación parecen ser similares en el ratón y en el hombre; sin embargo, las células humanas se muestran más remisas a transfor- b marse en cancerosas, ya sea espontáDESARROLLO TEMPRANO neamente o tras la exposición a mutágenos. Según este descubrimiento, las CELULAS GERMINALES CELULAS SOMATICAS diferencias en las tasas de transformación podrían deberse a la existenEN EL MACHO EN LA HEMBRA cia de controles epigenéticos más potentes en los humanos.
H
asta ahora, no se ha demostrado la implicación directa de los cambios de metilación del ADN en la carcinogénesis. Hay, sin embargo, pruebas indirectas. Así, la azacitidina es un carcinógeno muy vigoroso, que produce un abanico mayor de tumores en animales experimentales que otros
7. LA lMPRONTA característica que identifica el origen paterno (azul) o materno (rojo) de los cromosomas de un individuo (a) puede persistir en las células somáticas durante muchas generaciones celulares ( b). La impronta, que parece determinar un patrón diferencial de activación e inactivación en los cromosomas de origen paterno o materno, se altera, sin embargo, en las células germinales durante la meiosis. (Las células germinales se segregan en una etapa temprana del desarrollo y después, tras la meiosis, producen óvulos y espermatozoides.) Se elimina la impronta original (c) y se sustituye por la que corresponde al sexo del individuo en cuestión (d). Así, a los cromosomas del esperma se les confiere una impronta masculina (incluso a los cromosomas que provengan de la madre), y a los del óvulo una impronta femenina. Los experimentos sugieren que la metilación reversible es el mecanismo que insta la marca diferencial de los cromosomas.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
c ELIMINACION DE LA IMPRONTA
MEIOSIS
d NUEVA IMPRON TA
31
lar y en la transformación de las célu- ción nos dirán si los controles epigelas normales en cancerosas. néticos sobre el desarrollo de El interés potencial de la metilación diferentes especies se fundan en los de las citosinas en los procesos celu- mismos mecanismos moleculares o en lares viene subrayado por su presen- otros diferentes. cia en organismos muy dispares, aunque quizá no se trate de un fenómeno ualesquiera que sean los factores universal. Ni en el nematodo decisivos que gobiernen el deCaenorhabditis , ni en la mosca de la sarrollo de Caenorhabditis y Drosofruta Drosophila, que pasan por com- phila phila, no se puede negar que la metiplejos procesos de desarrollo, se ha lación del ADN se nos ofrece como un encontrado 5-metilcitosina en su factor epigenético importante en ADN. Observación en que se apoyan muchos eucariotas, aunque no explialgunos investigadores para negar que todos los procesos del desarrollo. que la metilación de la citosina desem- Los controles sobre el comportamiento peñe un papel importante en la ejecu- y características celulares ejercen sus ción del programa de desarrollo de los efectos en varios niveles: interacciones eucariotas superiores. entre ADN y proteínas, transducción Este último punto de vista es cohe- de señales desde la membrana celular rente. Pero caben otras explicaciones. hasta los cromosomas y comunicación Quizá Caenorhabditis y Drosophila sí intercelular. Necesitamos una teoría dependan de la 5-metilcitosina para amplia y unificadora del desarrollo, regular la expresión de sus genes, si queremos que la epigenética dé aunque la cuantía de la misma en su cuenta del comportamiento de los ADN no sea detectable con las técni- genes durante estos procesos con la cas actuales. El tiempo y la investiga- claridad con que la genética mende-
C
liana describe la transmisión de los genes de generación en generación. Se precisa un marco de ese tipo donde se puedan formular predicciones contrastables y donde se pueda desarrollar ese continuo juego de teorías y experimentos que es esencial para el avance de la ciencia.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA GENOMIC IMPRINTING: MEMORIES OF MOTHER AND FATHER . Marilyn Monk en Nature, vol. 328, n.o 6127, págs. 203-204; 16 de julio de 1987. THE INHERITANCE OF EPIGENETIC DEFECTS. Robin Holliday en Science, vol. 238, págs. 163-170; 9 de octubre de 1987. TRANSGENES AS M OLECULAR P ROBES FOR GENOMIC I MPRINTING. M. Azim Surani, Wolf Reik y Nicholas D. Allen en Trends in Genetics, vol. 4, n.o 3, págs. 59-62; marzo, 1988. DNA METHYLATION AND GENE ACTIVITY. Howard Cedar en Cell, vol. 53, n.o 1, págs. 3-4; 8 de abril de 1988.
Impronta paterna e impronta materna Esteban Santiago
L
os gametos, las células que aportan padre y madre para la generación del cigoto, son siempre haploides; quiere esto decir que estas células sólo son portadoras de una mitad de la dotación genética característica caracterí stica de las células somáticas, que son diploides. Con la fecundación se completa mediante la aportación de ambos progenitores el patrimonio hereditario propio de un individuo de esa especie. La dotación genética de los seres humanos está contenida en 46 cromosomas, 44 de ellos denominados autosomas, formando 22 pares con información equivalente en cada miembro del par; y el par 23, que corresponde a los cromosomas sexuales, dos cromosomas X determinantes de la versión femenina, o un X y un Y, Y, si de la versión ver sión masculina se trata. Los Lo s 22 autosomas autosoma s procedentes del padre, y los 22 procedentes de la madre no intervienen en la determinación sexual. Sin embargo, dentro de cada nuevo par que se constituye en el cigoto, el cromosoma que viene del padre mantiene sus diferencias en relación con el que procede de la madre, y esas diferencias determinan también que cada uno contribuya, con sus peculiaridades, al desarrollo del embrión. La naturaleza de esa impronta se ha ido conociendo con cierto detalle en estos últimos años. Sobre el mensaje genético escrito en clave de cuatro letras —las ba ses púricas adenina ( A) y guanina (G) y las pirimidínicas citosina (C) y timina (T)— cada cromosoma tiene la posibilidad de modificar algunas de las citosinas mediante un pequeño cambio químico, la introducción de un grupo metilo en su molécula. El patrón de metilación, el número y la posición que ocupan esas citosinas metiladas (C*), 32
es característico de cada cromosoma y diferente para cada uno de ellos, según proceda del padre o de la madre. Esas C* introducen cambios en el flujo de instrucciones al cerrar, generalmente, marcos de lectura del mensaje, impidiendo la expresión de genes situados en el cromosoma después de esas zonas marcadas. El patrón de metilación de los distintos cromosomas contribuye a que cada célula del organismo adquiera la identidad biológica como célula de hígado, de riñón, o de pulmón. La distribución estratégica de estas citosinas etiquetadas condicionará que se expliciten o no instrucciones específicas para la síntesis de los componentes propios de cada tipo celular. El fenómeno de la impronta parental tiene un claro significado biológico. Define la identidad biológica del cigoto originado por la fusión de los dos gametos, como embrión unicelular, diferente de cualquier célula híbrida originada por fusión de los núcleos de otras dos células cualesquiera; y netamente diferente también de la célula producida por fusión entre sí de dos óvulos, o de dos espermatozoides. Más aún, un cigoto, resultado de una fecundación, que contuviera después de manipularlo experimentalmente los dos cromosomas de un par procedentes de un mismo óvulo o de un mismo espermatozoide, sería incapaz de desarrollarse y originar un individuo de esa especie. La impronta masculina y la impronta femenina de la dotación genética que consigo llevan los 22 autosomas de los gametos, óvulo y espermatozoide, reafirman la vinculación heterosexual originaria. originaria . Existe en los mamíferos una barrera biológica infranqueable, que echa por tierra la posibilidad TEMAS 3
de que nazca un hijo de un padre sin una madre, o de una madre sin un padre. Su naturaleza está dispuesta de tal modo que “uno” o “una” tiene que venir necesariamente necesariamente de “uno y una”. La madre biológica podría no ser la madre uterina (esto sería un tipo particular de adopción), como los padres adoptivos no son el padre o la madre biológicos. La identidad natural biológica no admite opciones. Cada ser humano es uno o es una biológicamente por la presencia presencia del par de cromosomas XY o XX con la añadidura de la impron impronta ta paterna y materna reflej ada en los 22 autosomas que aportará con su gameto a sus descendientes. De una forma natural, inamovible y no elegible, se es uno o una biológicamente, más allá de cualquier tendencia u opción personal de orientación sexual. Sólo cuando la biología falla, y se produce produce alguna de las enfermedades enferme dades ocasionadas por defectos en el par de cromosomas 23, que hacen que la diferenciación sexual sexual iniciada en el embrión no llegue a término, o que muy excepcionalmente el ser humano resulte hermafrodita, con gónadas masculinas y femeninas, puede ser necesaria necesaria la dura decisión de optar por vivir como uno, o como una.
ZONA PELUCIDA
CIGOTO OVULO MADURO
OVOGENESIS
AUMENTO DE METILACION ESBOZOS DE GONADAS INDIFERENCIADAS
Una tarea más del embrión: fabricar su propia impronta
Las marcas parentales que el cigoto tiene en sus cromosomas representan la suma de la peculiar impronta cromosómica masculina y femenina. Las marcas aportadas por la herencia paterna son más abundantes, es decir, el número de citosinas metiladas en los cromosomas del espermatozoide es mayor que el de la aportación genética materna. Y, a su vez, ese grado de metilación es más alto que en cualquier otra célula somática del organismo. Este hecho tiene su significado biológico: los gametos son las células de la transmisión de la vida. No existen para que viva el individuo que los produce, sino para perpetuar la especie. Las instrucciones de explicitación inmediata que los gametos contienen en sus genes mientras no se produce la fecundación se dirigen fundamentalmente a asegurar la conservación del único cromosoma de cada par que contienen, para que éste pueda pasar la dotación genética a un nuevo ser. Cada gameto usa las instrucciones adecuadas durante su propia formación y maduración. El espermatozoide se hace célula pequeña, con capacidad de movimiento muy rápido; a medida que madura deja de usar la información de sus genes, empaqueta los cromosomas y metila las citosinas según el patrón masculino, quedando así dispuestos a ser mitad del patrimonio de un individuo nuevo si alcanzara a fecundar a un óvulo. De forma paralela las células que se diferencian hasta convertirse en óvulo usan la información genética para llegar a ser una célula de gran tamaño, protegerse con una cubierta, la zona pelúcida, que orienta la penetración del espermatozoide, y almacenar alimento s de forma que, si llega a ser fecundado, el cigoto no necesite “buscarse la vida” hasta pasados unos días. A medida que avanza su maduración irá metilando las citosinas según el patrón femenino, cerrando la información genética y manteniéndose paralizada la expresión de los genes. Una de las tareas que tiene por delante el embrión en su desarrollo es la de ir eliminando la impronta cromosómica heredada. Al comienzo, se van eliminando metilos de las citosinas de los cromosomas paternos a mayor velocidad que de las citosinas de los maternos. Las células que se organizarán en tejidos extraembrionarios, como la placenta, recibirán recibirá n las instrucciones desde la copia paterna. Las células que van a dar los esbozos de los diferentes órganos y tejidos del organismo usarán con una determinada preferencia los genes relacionados relac ionados con una u otra herencia. herenci a. Al tiempo que progresivamente se borra la impronta parental, se moldea el cuadro de instrucciones contenidas en los genes por el mismo mecanismo de metilación y desmetilación de citosinas: surgirán instrucciones nuevas que hasta un momento determinado permaCONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
ESPERMATOGENESIS
N O I A C D I A L I D T R E E P M E D
DESAPARICION DE LA METILACION ADULTO FETO
TEJIDOS EXTRAEMBRIONARIOS AUMENTO DE METILACION
EMBRION ANIDADO
EL CIGOTO CONTIENE DOS TIPOS DE ADN, uno que posee el patrón de metilación de citosinas característico característico del espermatozoide espermatozoide ( azul ), constituyendo la herencia paterna, y otro propio del óvulo azul ), rojo), la herencia materna. La impronta parental se va perdiendo ( rojo parcialmente parcialmente en el embrión precoz. Después de la implantación del embrión en el útero las células que constituirán los diferentes órganos y tejidos establecen progresivamente progresivamente patrones de metilación específicos y distintos ( amarillo amarillo y verde) para los cromosomas heredados del padre y para los heredados de la madre.
necían ocultas, y determinadas células célula s verán dirigido su desarrollo hasta verse integradas en tejidos y órganos con funciones y morfología propias. Todas las líneas celulares seguirán este proceso, proceso, con la sola excepción de las que darán lugar a los gametos. Hacia la semana sexta del desarrollo embrionario aparece el esbozo gonadal. Las células del tejido germinativo primordial, primordial, de origen ectodérmico, de las que se formarán más adelante los gametos, emigran hacia una matriz procedente del tejido mesenquimático. Las gónadas indiferenciadas, indistinguibles sexualmente, están constituidas en esa etapa por células procedentes del saco vitelino y por las germinales de origen ectodérmico. En ese momento ya se han formado también los conductos de Wolf y de Müller, de origen mesonéfri mesonéfrico, co, asociados a las gónadas en desarrollo. A partir de este con junto de estructuras, bajo la dirección de los genes del cromosoma Y (embrión masculino) o del X (embrión femenino), se formarán respectivamente testículos y ovarios embrionarios. Para ese momento las células germinales primordiales habrán hecho ya tabla rasa de la impronta paterna y materna en cada uno de los distintos pares de cromosomas. Serán, por tanto, iguales en ambos tipos de embriones. Sólo más tarde, cuando las células germinales sufran gametogénesis, se irá estableciendo el patrón de metilación de citosinas correspondiente a su sexo, masculino durante la espermato espermatogénesis génesis y femenino durante la ovogénesis, sin guardar memoria de la impronta heredada del padre o de la madre. Así, cada uno de los progenitores podrá transmitir a su descendencia la impronta que le corresponda como padre o como madre. 33
Impronta parental de los genes Carmen Sapienza Aunque el padre y la madre transmitan genes idénticos a los hijos, sus efectos pueden ser quizá distintos. La impronta diferencial de los genes en función del sexo podría condicionar el desarrollo normal y provocar enfermedades
E
n sus primeros experimentos con guisantes, realizados a mediados del siglo XIX , Gregor Mendel hizo una observación que, andando el tiempo, se convertiría en axioma para los genetistas. Observó que, al cruzar líneas puras de guisantes lisos con líneas puras de guisantes rugosos, todas las plantas de la descendencia híbrida producían guisantes lisos. El resultado era independiente de la planta lisa empleada en el cruzamiento: se tratara del ma cho o de la hembra. Mendel había descubierto el principio de equivalencia en los cruzamientos recíprocos, esto es, el gen se comportará siempre de la misma manera, sin importar que venga de la madre o del padre. El alcance de la observación de Mendel en la historia y práctica de la genética no puede minusvalorarse. Se ha comprobado su validez para muchos rasgos genéticos, no sólo del guisante, sino también de la mosca de la fruta, ratones, el hombre y muchos otros organismos. Recientemente, sin embargo, genetistas y embriólogos han descrito algunos rasgos que no obedecen esas reglas. Antes bien, se trata de características gobernadas por la impronta genómica, proceso éste que marca o graba diferencialmente a los genes de manera transitoria y reversible, según se transmitan a través de la hembra o del macho. Los descendientes que reciben los genes marcados de la madre difieren de quienes los reciben del padre. Dicho en otras palabras,
CARMEN SAPIENZA abrió camino en la investigación de la influencia de la impronta genética en el desarrollo de ciertas enfermedades genéticas y cánceres. Dirige el laboratorio de genética del desarrollo del Instituto Oncológico Ludwig en Montreal.
34
importa saber de qué progenitor se recibe determinado gen. Científicos de varios laboratorios repartidos por todo el mundo investigan la naturaleza molecular de la impronta genómica, el mecanismo que la establece y el número y tipos de genes que reciben dicha huella. Aunque no son aún grandes los logros, sí hemos descubierto algunos aspectos fascinantes, que nos están permitiendo ampliar el conocimiento sobre ciertos cánceres, enfermedades genéticas y otros males. Las investigaciones sobre la impronta genómica pueden incluso poner de manifiesto algunas influencias, hasta ahora insospechadas, sobre la herencia de los caracteres que se explicaban antaño en el marco de la genética mendeliana clásica. Excepciones a la regla de la reciprocidad en los cruzamientos se conocen desde hace mucho tiempo, pero generalmente se incluyen en una de las categorías siguientes. Dentro de la primera se encuentran los caracteres ligados a genes de los cromosomas sexuales, X e Y. Las hembras de los mamíferos tienen dos cromosomas X en todos los núcleos de sus células, mientras que los machos tienen un cromosoma X y otro Y. La ceguera a los colores y la hemofilia son dos de los muchos caracteres determinados por genes presentes en el cromosoma X. La herencia de estos caracteres ligados al sexo sigue un patrón bien definido que no exige la equivalencia en los híbridos recíprocos.
S
i un hombre ciego a los colores se empareja con una mujer que no porta ese carácter, por ejemplo, ninguno de sus hijos será ciego a los colores. Si la madre es ciega a los colores y el padre no, entonces todos los hij os heredarán la anomalía. En ambos casos, las hijas portarán el gen de la
ceguera a los colores, pero no sufrirán la enfermedad. La herencia y manifestación de los caracteres ligados al sexo dependen del sexo de los descendientes, aunque no directamente del sexo del progenitor portador del carácter. La segunda clase de cruzamientos recíprocos no equivalentes pone en juego caracteres controlados por genes que residen fuera del núcleo celular. Ciertos orgánulos subcelulares —mitocondrias en células animales y mitocondrias y cloroplastos en células vegetales— portan su propia información genética. Esos orgánulos se transmiten de generación en generación a tra vés del citoplasma de la célula huevo; por tanto, se heredan exclusivamente por vía materna. El color de las hojas en algunas plantas muestra esa forma de herencia, igual que la encefalomiopatía mitocondrial, un tipo de enfermedad neuromuscular humana. La impronta genómica, la tercera y más reciente de las excepciones a la regla de la equivalencia en los cruzamientos recíprocos, difiere notablemente de los tipos antes mencionados. Los rasgos a los que afecta no dependen necesariamente de genes presentes en los cromosomas sexuales, ni están asociados con orgánulos heredados por vía materna. La impronta puede, al menos en teoría, afectar a cualquier gen celular. Las excepciones ligadas al sexo y a orgánulos de herencia materna descansan sobre una des1. GENES MARCADOS por la impronta, alojados en los cromosomas de óvulos y espermatozoides. Los dos sexos heredan, por consiguiente, unos genes con impronta paterna y otros con impronta materna. Sin embargo, cuando los hijos producen óvulos o espermatozoides, se pierde la impronta precedente, y se induce otra nueva, específica del sexo del individuo en cuestión, en todos los cromosomas de sus gametos.
TEMAS 3
ESPERMATOZOIDE
OVULO FECUNDADO
OVULO
IMPRONTA PATERNA EN EL CROMOSOMA IMPRONTA MATERNA EN EL CROMOSOMA
LA IMPRONTA HEREDADA GUIA EL DESARROLLO DEL INDIVIDUO
CELULA SOMATICA MASCULINA
CELULA SOMATICA FEMENINA
CELULA PRODUCTORA DE OVULOS
CELULA ESPERMATICA
IMPRONTA ORIGINAL ELIMINADA
NUEVA IMPRONTA
TODOS LOS ESPERMATOZOIDES PORTAN LA IMPRONTA PATERNA
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
TODOS LOS OVULOS PORTAN LA IMPRONTA MATERNA
35
CRUZAMIENTOS RECIPROCOS
×
×
×
O
O
×
×
×
O
TODA LA DESCENDENCIA ES EQUIVALENTE
O
DESCENDENCIA NO EQUIVALENTE
2. CRUZAMIENTOS en los que el gen responsable de un carácter es aportado por la madre en uno de los casos y por el padre, en el otro; este tipo de cruzamientos se denominan recíprocos. Para la mayoría de los caracteres, como el aspecto liso en el guisante, no importa cuál de los dos progenit ores porte el gen
igual contribución genética de los progenitores. No ocurre así en los casos de impronta genómica: los progenitores pueden transmitir a la descendencia genes exactamente iguales, aunque con efectos distintos si la impronta recibida difiere en cada uno. Estas nue vas circunstancias han polarizado la atención de muchos biólogos.
(izquierda). Ciertos caracteres, como el color de las hojas en algunas plantas, sólo se heredan a través de la madre (centro). En los caracteres ligados a los cromosomas sexuales, como el color de las alas de la polilla Abraxas, el patrón de herencia es más complejo (derecha).
La transferencia nuclear permitía también a los investigadores crear embriones con constituciones genéticas insólitas, por ejemplo, embriones con las dos series de cromosomas de uno de los progenitores. McGrath, Solter y Surani tenían curiosidad por observar el desarrollo de tales embriones. Crearon ginogenotes (embriones con dos series cromosómicas materran parte del interés actual por nas) y androgenotes (embriones con los caracteres afectados por la dos series de cromosomas paternos); impronta genómica tiene su origen en compararon sus desarrollos con los de los experimentos realizados por James embriones normales. Conviene resaltar que, debido al McGrath, Davor Solter y por M. Azim H. Surani y sus colaboradores. McGrath alto grado de consanguinidad de los y Solter desarrollaron un elegante pro- ratones utilizados en esos experimencedimiento microquirúrgico, denomi- tos, machos y hembras portaban series nado transferencia nuclear, para inter- idénticas de cromosomas (sal vo, por cambiar físicamente la información supuesto, que las hembras carecen de genética entre dos embriones de ratón. cromosoma Y y los machos sólo tienen Esta técnica aprovecha la circunstan- un cromosoma X). Si el desarrollo de cia de que, una vez fecundado el óvulo un embrión de ratón dependiera por un espermatozoide, pero antes de exclusivamente de su dotación de que el embrión comience a dividirse, el genes, en teoría no debería importar núcleo del óvulo y el del espermato- que un ratón recibiese todos los genes zoide permanecen separados durante de uno de los progenitores, o lo que es un breve intervalo de tiempo en el cito- lo mismo, ginogenotes, androgenotes plasma de la célula huevo. Los dos y ratones normales deberían experinúcleos son visibles al microscopio mentar idéntico desarrollo. No es eso lo que ocurre. Los embrioóptico y presentan una posición y nes con dos series de genes de procedentamaño característicos. Con una aguja de cristal hueca muy cia materna o paterna no llevan su fina, se puede extraer selectivamente, desarrollo a término, sino que éste se del óvulo fecundado, cualquiera de los detiene cuando las divisiones alcanzan dos núcleos, o ambos a la vez. Se puede unas pocas docenas de células. Si el así reemplazar uno de los núcleos por desarrollo continúa, cosa que sucede otro procedente de un huevo fecundado ocasionalmente, los ginogenotes y distinto. McGrath y Solter encontraron androgenotes presentan unas curiosas que si sustituían un núcleo espermá- diferencias en las anomalías que tico por otro, o si sustituían un núcleo exhiben. En los ginogenotes de estaprocedente del óvulo por otro, el dios más avanzados, los embriones embrión que resultaba se desarrollaba presentan aberraciones menores miena término, sin distinguirse de un ratón tras que sus placentas y membranas vitelinas (estructuras esenciales para normal de la misma estirpe.
G
36
DESCENDENCIA NO EQUIVALENTE
la nutrición del animal) se hallan severamente atrofiadas. En los androgenotes avanzados se observa el fenómeno opuesto: las membranas vitelinas y placentas parecen casi más normales, mientras que los embriones son débiles y escasamente desarrollados.
C
omo las secuencias de ADN presentes en los cromosomas de los embriones ginogenéticos, androgenéticos y normales eran las mismas, McGrath, Solter y Surani concluyeron que los genes habían sufrido algún tipo de modificación o impronta diferencial, que dependía de su origen, materno o paterno. Este proceso de impronta parecía desactivar selectivamente algunos genes que, en condiciones normales, debían intervenir durante el desarrollo embrionario temprano. De los genes aportados por el padre, algunos decisivos para el desarrollo embrionario parecían estar inactivos; de los aportados por la madre parecían inactivos aquellos cuya participación era imprescindible para la formación de la placenta y la membrana vitelina. Bruce M. Cattanach ofreció otra demostración gráfica del fenómeno de impronta. Cattanach llevaba años investigando el fenómeno de la no equivalencia en los cruzamientos recíprocos. Para el estudio de tales caracteres utilizaba líneas de ratones que portaban una o más parejas de cromosomas fusionados. En tales ratones, algunos cromosomas estaban físicamente conectados y, por tanto, no se podían separar durante la meiosis, el proceso de división celular que da lugar a óvulos y espermatozoides. En consecuencia, durante la división una célula recibiría dos copias de un cromosoma y la otra, ninguna.
TEMAS 3
Si un óvulo con dos réplicas de un cromosoma es fecundado por un es permatozoide sin ninguna, el embrión resultante contendrá el número normal de cromosomas, aunque las dos copias de uno de los cromosomas procederían de la madre. De la misma manera, las dos copias las aportaría el padre si el espermatozoide portase ambos cromosomas y el óvulo ninguno. De acuerdo con la regla de equivalencia de los híbridos recíprocos, todos los animales resultantes de ese tipo de cruzamientos deberían ser idénticos. Sin embargo, los experimentos de Cattanach demostraron inequívocamente que tal regla no se cumplía para varios de los cromosomas del ratón. Cattanach encontró, por ejemplo, que los ratones que heredaban las dos copias del cromosoma 11 de uno de los progenitores diferían en tamaño y peso de los ratones normales. Criados en las mismas condiciones, los ratones con dos cromosomas 11 de origen materno eran anormalmente pequeños, mientras que aquellos que lo heredaban de su padre eran gigantescos. Experimentos similares realizados con otras parejas de cromosomas fusionados producían otras aberraciones características, como la muerte del embrión y anomalías del comportamiento.
paterna; tales modificaciones son reversibles. Pero no se sabe todavía si las modificaciones constituyen el mecanismo primario del proceso de impronta en el genoma o sólo reflejan otro fenómeno bioquímico subyacente y desconocido. No todos mis colegas coinciden conmigo, pero apostaría a que la metilación del ADN es mera consecuencia del
METODO DEL TRANSPLANTE NUCLEAR Técnica para estudiar la impronta genómica que permite fabricar embriones con todos los cromosomas de un mismo sexo 1. OVULOS FECUNDADOS
NUCLEOS DEL ESPERMATOZOIDE
NUCLEOS DEL OVULO
2.
L
os experimentos de Cattanach demostraban también otro punto importante: los efectos de la impronta genómica no persisten en la siguiente generación. La impronta no supone, por tanto, una modificación permanente del cromosoma. Un pequeño ratón macho con las dos copias del cromosoma 11 de su madre produciría descendencia de tamaño normal. Los genes procedentes de la madre pierden su impronta femenina para ser de nuevo etiquetados como genes de macho. Inspirados por los descubrimientos de McGrath, Solter, Surani y Cattanach, investigadores de varios laboratorios (entre ellos el mío) han tratado de determinar si la impronta genómica débese a una modificación directa del ADN. En particular, nosotros hemos estudiado el papel de la metilación del ADN, proceso en virtud del cual pequeños grupos moleculares se engarzan químicamente a una macromolécula de ADN [véase “Una herencia distinta”, por Robin Holliday]. Para nuestra satisfacción, he mos comprobado una frecuente metilación diferencial de genes particulares en función de su herencia, materna o
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
mecanismo primario. Afortunadamente para todos los que estudiamos este fenómeno, todavía podemos acometer muchos experimentos importantes sin necesidad de conocer las causas últimas de la impronta genómica. Sea cual sea el mecanismo por el que se realiza la impronta, ésta se manifiesta de formas que son a menudo extrañas, y algunas veces trágicas.
ELIMINACION DE NUCLEOS
3.
INSERCION DE NUEVOS NUCLEOS
4.
OVULO FECUNDADO CON DOS NUCLEOS PROCEDENTES DE ESPERMATOZOIDES
37
EL EFECTO DE LA IMPRONTA y su observación en algunos de los descendientes de los ratones con cromosomas fusionados. Cuando un ratón normal produce óvulos o espermatozoides (gametos), todos los gametos resultantes portan sólo una copia de cada cromosoma (recuadro). En los ratones con cromosomas fusionados, sin embargo, algunos de los gametos pueden tener dos copias de un cromosoma, o ninguna. Las combinaciones de esos gametos originan animales con dos copias de un cromosoma de uno de los progenitores. CELULA PRODUCTORA DE GAMETOS NORMALES
METODO DE LA FUSION CROMOSOMICA
CELULAS PRODUCTORAS DE GAMETOS CON CROMOSOMAS FUSIONADOS
GAMETOS CON UNA DISTRIBUCION CROMOSOMICA REGULAR
= CROMOSOMA A
GAMETOS CON UNA DISTRIBUCION CROMOSOMICA IRREGULAR
AMBAS COPIAS DEL PADRE MACHO
FECUNDACION
HEMBRA
AMBAS COPIAS DE LA MADRE
= CROMOSOMA B
Las manifestaciones trágicas aparecen en varias enfermedades humanas. La naturaleza provoca a veces situaciones, en el hombre, que son similares a las estudiadas por Cattanach en el ratón. Robert D. Nicholls y sus colaboradores han hecho recientemente un descubrimiento de este tipo en pacientes con el síndrome de Prader-Willi, una enfermedad con síntomas de retraso mental, obesidad extrema, corta estatura y manos y pies desproporcionadamente pequeños. Tras examinar los genomas de pacientes con síndrome de Prader-Willi y los de sus parientes, Nicholls llegó a la conclusión de que muchos pacientes habían heredado las dos copias del cromosoma 15 de sus madres. Nicholls, Joan H. M. Knoll y Charles A. Williams obtuvieron luego un descubrimiento parecido, aunque contrastante, en pacientes con síndrome de Angelman. (Antiguamente, a esas personas se las describía como “marionetas felices”, ya que sonríen constantemente, tienen movimientos espasmódicos y otros síntomas de retraso mental y motor.) Los pacientes presentaban frecuentemente deleciones parciales del cromosoma 15 heredado de la madre; el único cromosoma 15 completo era el del padre. Es sorprendente que dos enfermedades con un cuadro clínico tan dispar puedan estar ligadas a una impronta diferencial de los mismos genes en el mismo cromosoma. Ahora bien, a diferencia de los ratones anormalmente
38
EMBRIONES CON DOS COPIAS DE UN CROMOSOMA DE UNO DE LOS PROGENITORES
grandes y pequeños que Cattanach producía en sus experimentos, los síndromes de Prader-Willi y Angelman no pueden fácilmente atribuirse a las dos caras de la misma moneda, causados por un exceso o un defecto del mismo producto génico. Los estudios de Nicholls y sus colaboradores ilustran la dificultad de predecir la posible reacción de ciertos caracteres ante el proceso de impronta. Sería por tanto útil reexaminar muchos trastornos congénitos en el marco de la hipótesis de la impronta.
CIÓN Y CIENCIA ,
noviembre de 1988]. En ausencia del producto de Rd, una célula muscular se transforma en célula cancerosa y, finalmente, origina un rabdomiosarcoma. Como cada núcleo celular contiene dos copias del cromosoma 11, para que una célula se transforme las dos copias de Rd deben estar inactivas. La primera copia de Rd puede inactivarse de varias maneras; la más simple, una mutación que altere la secuencia de ADN del propio gen. Si se da dicha mutación, cualquier acontecimiento genético adicional que inactive la otra odrían hallarse afectados incluso réplica de Rd hará, probablemente, los caracteres para los que no que la célula se convierta en canceexiste una necesidad obvia de recurrir rosa. Con frecuencia, los episodios a la influencia de la impronta genó- genéticos que destruyen la segunda mica. Así lo ilustran ciertos cánceres Rd borran el cromosoma entero, o la infantiles: el rabdomiosarcoma parte de éste que contiene el gen. Junto con mis colegas Heidi J. Scraembrionario (un tumor muscular), el tumor de Wilm (un tipo de cáncer de ble y Webster K. Cavenee hemos proriñón) y el osteosarcoma (cáncer de puesto un mecanismo alternativo para explicar algunos cánceres pediáhueso). Para explicar en qué medida la tricos. A tenor de nuestra hipótesis, el impronta genómica puede estar impli- episodio que inactiva la primera copia cada en esas enfermedades, quizá sea de un oncogén recesivo no tiene neceútil recordar cómo se supone que se sariamente que ser una verdadera producen esos cánceres. Muchos cán- mutación. Puede ser la impronta ceres obedecen, eso se cree, a la acu- genómica, que inactiva genes diferenmulación de sucesivas mutaciones en cialmente en machos y hembras. (El genes específicos de una sola célula. segundo episodio, que es el que pone El cromosoma 11, por ejemplo, porta en marcha el proceso de transformaun gen, Rd, que pertenece a una fami- ción, podría ser una deleción u otro lia de oncogenes recesivos, genes accidente.) En nuestra opinión, las supresores de tumores o antioncoge- células del rabdomiosarcoma tennes [véase “En busca del antioncogén”, drían, por mor de la impronta, una por Robert A. Weinberg; I N VESTIGA - réplica inactiva del gen Rd en el cro-
P
TEMAS 3
LOS RATONES CON DOS COPIAS DEL CROMOSOMA 11 DE UNO DE LOS PADRES TIENEN TAMAÑOS ANORMALES
TAMAÑO MUY GRANDE (LAS DOS COPIAS DEL PADRE)
TAMAÑO NORMAL (UNA COPIA DE CADA PROGENITOR)
TAMAÑO MUY PEQUEÑO (LAS DOS COPIAS DE LA MADRE)
mosoma 11 intacto. Dicho cromosoma sería aportado por el mismo progenitor en la mayoría de los casos de rabdomiosarcoma embrionario. Nuestro laboratorio, y los de Grady F. Saunders, Manfred Mannens, Masao Sasaki y otros, han encontrado pruebas que apoyan esta teoría. El primer episodio inactivador en el rabdomiosarcoma embrionario, el tumor de Wilms y el osteosarcoma, casi siempre ocurre en un oncogén recesivo presente en un cromosoma de origen paterno. Los datos son congruentes con la participación de la impronta genómica en la génesis de esos tumores. No obstante, esos mismos datos plantean también una dificultad teórica importante. El escollo se presenta cuando la mayoría de los que estudiamos el fenómeno de la impronta genómica la imaginamos como una consecuencia de las grandes diferencias fisiológicas y bioquímicas que existen en la formación de gametos (espermatozoides y óvulos) en machos y hembras. A lo lar go de la mayor parte de su vida adulta, los machos producen miles de millones de espermatozoides a partir de una población de células en continua división. Por el contrario, las hembras nacen con todos los óvulos que producirán en sus años fértiles. A medida que esos óvulos maduran, uno o muy pocos de ellos cada vez, se produce la ovulación, de una forma regular. Si la impronta diferencial fuese sólo reflejo de la dicotomía entre la produc-
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
ción de gametos en machos y hembras, cabría suponer que todos los machos establecerían la impronta en sus genomas de una manera, y las hembras de otra. Ante la falta de pruebas en sentido contrario, suponíamos que todos los miembros de un sexo ejecutarían su impronta de la misma manera. Ahora bien, los datos que relacionaban los cánceres pediátricos con oncogenes recesivos inactivos de procedencia paterna contradecían nuestra presunción. Si todos los machos marcasen con su impronta e inactivasen el gen Rd, por ejemplo, la incidencia de rabdomiosarcoma embrionario sería altísima: con un solo cambio genético en el Rd heredado de la madre, algunas células de cualquier individuo se volverían cancerosas Como esos tumores son raros (afectan, aproximadamente, a uno de cada 20.000 niños), es improbable que todos portemos un oncogén recesivo inactivo y heredado de nuestro padre. No obstante, en los individuos que sufren esas enfermedades, eso es precisamente lo que parece haber ocurrido. Una explicación provisional de esa discrepancia sería que no todos los machos (o hembras, presumiblemente) marcan e inactivan los mismos genes. ¿Cuáles serían las bases de esas diferencias entre los individuos? Si uno es en el fondo un genetista, siempre debe recurrir primero a su disciplina para responder las cuestiones de ese tenor. La explicación gené-
tica requiere la existencia de uno o más genes responsables de la impronta. (No confundirse con los propios genes que reciben la impronta.) En otras palabras, la impronta debe ser un proceso que resulte de la actividad de diversos genes que operan de una manera diferencial en machos y hembras. Personas del mismo sexo con diferentes genes controladores del proceso de impronta diferirán también en su dotación de genes marcados con dicha impronta. La mayoría de los machos, por ejemplo, no inactivarán al gen Rd; sólo lo harán aquellos, poco frecuentes, que porten una copia aberrante de uno de los genes que controlan la impronta. La idea de que la expresión de un gen o la represión de la misma puede ser controlada por otros genes no es nueva. Describe un antiguo y bien conocido fenómeno en genética: la modificación de la dominancia. Muchos caracteres responden a la actividad de otros genes que modifican su expresión. La impronta genómica puede contemplarse como un caso especial de modificación de la dominancia. El único e insólito rasgo de esos genes modificadores que se postulan como implicados en el control de la impronta genómica es su actividad diferencial en machos y hembras.
L
a enfermedad de Huntington (EH) constituye un interesante ejemplo de carácter que parece estar modificado por una impronta genómica específica y ligada al sexo. La EH, una enfermedad neurológica fatal, se hereda de forma dominante: todo el que reciba el gen EH de alguno de sus padres sufrirá la enfermedad. Generalmente, la enfermedad se manifiesta en los adultos, diagnosticándose como edad media a los 38 años. Aproximadamente el 10 por ciento de los casos, no obstante, se manifiestan en la infancia, y afectan a niños de hasta dos años y medio. Como ya habían observado los investigadores médicos en un principio, el 90 por ciento de los niños afectados procedían de familias en las que el padre era el progenitor interesado. Por supuesto, en esos casos, padre e hijo portan el mismo carácter deletéreo, pero la modificación sufrida por el paso a través del padre ha sido la causa evidente de que la enfermedad aparezca en su hijo a una edad más temprana. A lo largo de los años se han ido sucediendo las hipótesis sobre el comportamiento genético de la EH. De
39
3. IMPRONTA PARENTAL de los genes supresores tumorales (como el Rd); ese marchamo puede incrementar la probabilidad de ciertos cánceres. En los individuos que reciben dicha impronta basta con que ocurra un suceso infrecuent e —una mutación puntual, una deleción cromosómica u otro cambio genético— para que la célula se torne cancerosa. Sin la impronta, tales episodios tendrían que ocurrir dos veces.
todos, el modelo de Charles D. Laird es el que más se ajusta a los datos existentes. Introduce como principal innovación el concepto de efecto de posición, un fenómeno bien estudiado en la mosca de la fruta, que determina la expresión variable de ciertos caracteres. A diferencia de los demás caracteres mutantes, éstos presentan el aspecto insólito de no expresarse en todas las células en los tejidos afectados. Por contra, los tejidos son mosaicos formados por células mutadas y otras, diríase, perfectamente normales. La proporción de células que expresan la mutación está controlada por genes modificadores, que pueden cambiar el balance desde un tejido casi normal hasta casi mutante. Laird razonó que, si la variabilidad en la edad de aparición de la EH refle jaba un mosaicismo variable en la expresión del gen de la EH, tal mosaicismo estaba probablemente influenciado por genes modificadores. Un gen modificador que inclinara la balanza del mosaicismo hacia una mayor cantidad de tejido mutante, determinaría un adelanto en la edad de aparición de la enfermedad. La situación contraria retrasaría la edad de aparición. (Hay casos de pacientes de EH que no han sufrido la enfermedad hasta los 70 años.) Laird explicó, además, que la mayor incidencia de casos de EH juvenil por herencia paterna se debía a la localización del gen modificador en el cromosoma X. Como los machos tienen sólo un cromosoma X, cualquier aberración de su gen modificador no podría ser compensada, como sería el caso en las hembras, que portan dos cromosomas X. Es más probable, por tanto, que los varones tengan descendencia
40
en la que el balance del mosaicismo esté inclinado hacia la situación de mayor cantidad de tejido mutante, lo que determina una mayor probabilidad de aparición temprana de la enfermedad. El diez por ciento de los casos de EH juvenil procede de familias en las que la madre, y no el padre, es la afectada. Pero eso es lo esperado; también cabe presumir que existan mujeres con genes modificadores aberrantes en sus dos cromosomas X, aunque esos casos son mucho más raros. Este modelo parece explicar razonablemente bien la genética de tan complicada enfermedad. En mi trabajo he retocado ligeramente el modelo de Laird, para reflejar con mayor precisión el comportamiento de los genes modificadores. Esta pequeña aportación permite una aproximación incluso mayor al comportamiento genético real de la EH.
E
n mi opinión, se puede decir que el modelo de Laird de la genética de la EH, basado en el efecto de posición, casi cierra el círculo de los estudios sobre impronta genómica. Hasta donde llegan mis conocimientos, el primer estudio en profundidad sobre impronta genómica fue realizado por Janice Spofford sobre un efecto de posición en la mosca de la fruta. Su trabajo, publicado en 1959, recibió escasa atención. Desde entonces han ido apareciendo, esporádicamente, otros estudios sobre caracteres genéticos cuya expresión dependía del progenitor que transmitía el gen particular. Caracteres en organismos tan dispares como la mosca de la fruta, levaduras, maíz, ratones y seres humanos, se ven afectados por el fenómeno de la impronta genómica.
A pesar de todo eso, la impronta genómica sigue constituyendo, para muchos biólogos, mera curiosidad limitada a unos pocos caracteres. En algunas ocasiones me han preguntado por qué gasto mi tiempo (y, de paso, el del interpelante) en un fenómeno de tan escasa trascendencia. Siempre he respondido que el número de caracteres afectados por la impronta genómica, aunque desconocido, podría ser importante. Mi respuesta suele provocar una mirada de incredulidad, seguida de una disertación de uno o dos minutos sobre los principios de Mendel, que culmina con el tajante pronunciamiento de que la mayoría de los caracteres no funcionan “de esa manera”. Las críticas tienen su punto de razón. Si la mayoría de los caracteres mostrasen una dependencia absoluta del progenitor que transmite el gen en cuestión, los genetistas lo habrían ad vertido. La clave de la discrepancia, sin embargo, puede muy bien estar en la profundidad con la que los investigadores examinan un carácter particular. Cuando Spofford estudió la expresión en mosaico de los caracteres mutantes en la mosca de la fruta, observó los mismos caracteres en toda la descendencia de los cruzamientos recíprocos, igual que Mendel. Sin embargo, había suficientes diferencias en la expresión del carácter como para que pudiese discriminar qué progenitor había contribuido a ellas. De la misma manera, nuestro trabajo y el de mi colega Alan C. Peterson han demostrado que varios caracteres del ratón son mosaicos. Si uno se pregunta sólo por la presencia de tales caracteres, la respuesta es afirmativa; ahora bien, si la pregunta inquiere cuán intensa es su expresión, entonces apreciarán los efectos de la impronta parental. Para algunos caracteres, el grado de expresión quizá no sea muy importante; para otros, podría resultar decisivo. Por ejemplo, puede significar la diferencia entre padecer el tumor de Wilms o no, o manifestar la EH a los 5 años o a los 70.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA DIFFERENTIAL IMPRINTING SION OF
MATERNAL
AND
AND
EXPRES-
PATERNAL GE-
. D. Solter en Annual Reviews of Genetics, vol. 22, págs. 127-146; 1988. NOMES
A M ODEL
FOR E MBRYONAL R HABDOMYO -
SARCOMA VES
TUMORIGENESIS
GENOME IMPRINTING
THAT
INVOL -
. H. Scrable y
cols. en Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 86. n.o 19, págs. 7480-7484; octubre de 1989. TEMAS 3
El equilibrio de la dosis informativa del cromosoma X Natalia López Moratalla
L
as células de las hembras de los mamíferos contienen dos cromosomas X, mientras que las de los machos tienen un X y un Y. La existencia de estos dos cromosomas supondría para el organismo femenino una doble dosis de la amplia información genética contenida en los cromosomas X, en franco desequilibrio con el organismo masculino. Sin embargo, este problema lo ha resuelto la naturaleza mediante un proceso que tiene lugar durante el desarrollo embrionario de las hembras por el que las células somáticas mantienen sólo uno de sus cromosomas X en estado activo, es decir con capacidad de expresar la información que porta, mientras que el segundo cromosoma X permanece inactivo. Este proceso, que se inicia al comienzo del desarrollo embrionario, tiene lugar al azar sobre los cromosomas X: en unas células puede ser uno y en otras otro el que se mantenga activo en el subsiguiente proceso de diferenciación. De este modo las células somáticas que descienden de una misma célula embrionaria, en la que ya se hizo esa selección, mantendrán siempre el mismo cromosoma X activo y el otro inactivo. En este sentido los tejidos y órganos de las hembras de mamíferos son mosaicos compuestos por grupos clónicos de células en las que el cromosoma X activo se heredó bien del padre o bien de la madre. Un defecto en un gen ligado al cromosoma X, heredado de cualquiera de los progenitores, origina una curiosa enfermedad congénita que se da en las mujeres, la displasia ectodérmica anhidrótica, que afecta a las glándulas sudoríparas. La piel de estas mujeres es un mosaico en el que zonas carentes de glándulas sudoríparas alternan con otras zonas absolutamente normales. Las primeras corresponden al clon de células en las que el cromosoma X que quedó activo es el que contiene el gen defectuoso, mientras que las derivadas de las segundas contienen en su cromosoma activo el gen sano. La inactivación de uno de los cromosomas X ocurre en diferentes momentos del desarrollo embrionario. En los primeros días, tras la implantación en la mucosa uterina, las células que van a dar lugar a los tejidos extraembrionarios inactivan preferentemente el cromosoma X que procede del padre. En cambio, el azar interviene claramente en la selección de uno de los dos cromosomas X en las células que formarán los tejidos del embrión. Más tarde, las células germinales primordiales, a partir de las cuales se formarán los óvulos, reactivarán el cromosoma inactivado, precisamente antes de que tenga lugar la división meiótica que reduce a la mitad la dotación genética. Así se asegura que el óvulo maduro, al que le corresponde exclusivamente uno de los dos cromosomas X del par, lo contendrá en su forma funcional. Este cromosoma, en su forma activa, es necesario, al igual que los demás, para que, si ese óvulo es fecundado, se desarrolle el embrión. Ya se sabe qué gen es el responsable del proceso de inactivación del cromosoma X. Este descubrimiento permite plantear una hipótesis acerca del mecanismo de este minucioso proceso de silenciación selectiva de una parte del mensaje genético. Este gen, denominado Xist, está localizado en la región central del cromosoma, en una zona conocida como zona de inactivación. Los dos cromosomas X han de estar presentes en forma activa para que el gen Xist se exprese. Precisamente por esta razón, ese proceso no ocurre en las células masculinas, que sólo tienen un cromosoma X forCONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
mando parte del par 23. Los productos de la expresión de este gen de uno de los dos cromosomas se fijan precisamente sobre ese mismo cromosoma, inducen un cambio en su estructura y, posteriormente, se produce una metilación de una buena parte de las citosinas de su ADN. Esto hace que queden inactivos tanto él como los cromosomas que se han formado a partir de la replicación de su ADN. El otro cromosoma quedará activo al no expresar el gen Xist, debido posiblemente a una proteína “bloqueadora”, que se une a la región de inactivación e impide la expresión del gen. Esta proteína se encuentra en cantidades tan pequeñas que sólo alcanza para uno de los cromosomas X. ¿Cómo se vuelve de nuevo activo el cromosoma X en las células que van a terminar siendo óvulos? El mecanismo parece ser muy simple: la cantidad de la proteína “bloqueadora” de la inactivación que sintetizan las células precursoras de los gametos femeninos es mayor que la que sintetizan las células somáticas; por ello, la abundancia de esta proteína es lo que permite el proceso de reactivación del cromosoma X inactivo al poder unirse al centro de inactivación de ambos cromosomas.
Inactivación
Avanzado el desarrollo embrionario
Xist
Xa Xa Embrión hembra antes de la implantación
Xa Xi Embrión temprano después de la implantación
Ovogénesis CH3 CH3 CH3
Metilación del cromosoma X inactivo
CH3 CH3 CH3 CH3
Xa Ovulo Activo, Xa
CH3
Xa Xi En todas las células somáticas Inactivo, Xi
INACTIVACION y reactivación de un o de los cromosomas X. Están dirigidas por la expresión de un gen, el Xsit, cuyo producto cierra la expresión de los genes localizados en ese cromosoma. Al comienzo del desarrollo de un embrión de sexo femenino, una molécula “bloqueadora” de la inactivación impide que el otro cromosoma X exprese este gen y como consecuencia se inactive. Por el contrario en las células germinales embrionarias, que en el proceso de diferenciación generarán los óvulos, la cantidad de esta molécula bloqueadora es mayor y los dos cromosomas X quedan activos.
41
Espermatogénesis Cristóbal Mezquita Pla El espermatozoide, una de las células más especializadas del organismo, surge en virtud de una dramática metamorfosis celular. ¿Qué mecanismos moleculares explican este sorprendente proceso de diferenciación?
L
os espermatozoides contienen la información genética requerida para la transmisión hereditaria de los caracteres de la especie y la maquinaria molecular precisa para la preservación, transporte e introducción en el óvulo de dicha información. Las micrografías de la página opuesta muestran la morfología de los espermatozoides del cobayo y del gallo, las dos especies que hemos utilizado fundamentalmente en nuestras investigaciones. Puede obser varse en ellas el volumen diminuto de los núcleos de los espermatozoides y su estilizada forma hidrodinámica. ¿Qué cambios estructurales de la cromatina de las células germinales permiten empaquetar el ADN en un volumen nuclear tan reducido? ¿Cómo se preserva la integridad del mensaje genético que portan los espermatozoides? ¿Qué mecanismos controlan la expresión de la información genética responsable del proceso de diferenciación de las células testiculares? Y
CRISTOBAL MEZQUITA PLA es catedrático de fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Barcelona. Cursó sus estudios de medicina en dicho centro, donde se graduó en 1967 y obtuvo el doctorado en 1974. Su interés por la fisiología de la línea germinal le llevó a investigar el tema en el departamento de química macromolecular de la Universidad Politécnica de Barcelona (entre 1970 y 1972) y en el departamento de biología celular del Baylor College of Medicine, en Houston, Texas, donde fue becario posdoctoral y Visiting Research Associate (entre 1974 y 1978). En los últimos 15 años, además de su dedicación a la docencia de la fisiología, ha seguido utilizando el modelo de la espermatogénesis para investigar los mecanismos implicados en el control de la expresión genética durante la diferenciación celular y su relación con el problema del cáncer.
42
¿cómo se borra ulteriormente el programa de diferenciación para dar lugar al mensaje genético de los espermatozoides, verdadera tabula rasa que transmite todos los caracteres de la especie? Para contribuir a la resolución de estas y otras cuestiones relativas a la biología molecular de la espermatogénesis, iniciamos nuestro trabajo de investigación en este campo a principios de los años setenta. Desde entonces nuestro objetivo fundamental ha consistido en investigar la relación existente entre los cambios de composición, estructura y actividad funcional de la cromatina a lo largo de la espermatogénesis. La diferenciación de las células germinales del testículo constituye un modelo ideal para este tipo de investigaciones. Dadas las evidentes limitaciones de los métodos citoquímicos o de los métodos bioquímicos que parten de la totalidad del testículo, resultaba imprescindible recurrir a técnicas que permitieran la separación de las distintas células germinales o de sus núcleos. Para separar los núcleos de las células testiculares utilizamos el método denominado “velocidad de sedimentación unidad”, que se basa en las diferencias de volumen de las partículas a separar. Cuando estas diferencias son considerables, basta el campo gravitatorio terrestre, fuerza
de sedimentación unidad, para que las partículas de distintos volúmenes se distancien entre sí varios milímetros al cabo de tres o cuatro horas de sedimentación espontánea. El método permite separar los núcleos de las células testiculares gracias a los drásticos cambios de volumen que aquéllos experimentan durante la espermatogénesis.
E
n efecto, el proceso de diferenciación que da lugar a los espermatozoides se inicia con las espermatogonias. Estas células, tras una serie de divisiones, originan los espermatocitos primarios, los cuales llegan a poseer doble cantidad de ADN que las espermatogonias y un volumen nuclear mayor. Al dividirse los espermatocitos primarios (primera división meiótica) originan los espermatocitos secundarios, reduciéndose a la mitad el contenido de ADN y disminuyendo también el volumen nuclear. Los espermatocitos secundarios se dividen a su vez (segunda división meiótica) para dar lugar a las espermátidas, con una nueva reducción a la mitad del contenido de ADN y un volumen nuclear mucho menor. Finalmente, las espermátidas ya no se dividen pero experimentan un notable proceso de metamorfosis nuclear y citoplasmática denominado espermiogénesis que origina los espermatozoi-
1. ESPERMATOZOIDES de cobayo ( arriba) y de gallo (abajo) teñidos con naranja de acridina y observados con el microscopio de flu orescencia, en la página opuesta. Los núcleos cilíndricos de los espermatozoides del gallo ( fluorescencia amari lla) poseen un volumen de unos dos micrómetros cúbicos y contienen alrededor de 1 picogramo de ADN. En un extraordinario proceso de miniaturización, el núcleo de los espermatozoides encierra, muy protegida, la información necesaria para la transmisión hereditaria de todos los caracteres de la especie. Los espermatozoides disponen, además, de la maquinaria molecular precisa para introducir en el óvulo dicha información. El acrosoma ( fluorescencia roja ) contiene las enzimas responsables de la penetración en el óvulo. Los movimientos de la cola propulsan la célula a una velocidad de varios milímetros por minuto. El desplazamiento se realiza con la máxima economía energética gracias a la forma hidrodinámica de los espermatozoides. Aumento × 1500.
TEMAS 3
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
43
1
8
2
7
3
6
4
S
9
una disolución de sacarosa de alta densidad. La figura 4 ofrece un esquema del proceso de separación de los núcleos por el método de la velocidad de sedimentación a fuerza de gra vedad unidad. En su parte superior hay un dispositivo para la creación de un gradiente de sacarosa que llenará la cámara de sedimentación cilindrocónica. El gradiente de densidad no es esencial para la separación, pero estabiliza el líquido y evita que los núcleos una vez separados se mezclen como consecuencia de las corrientes de con vección. Antes de iniciarse la separación, la muestra que contienen los núcleos forma una delgada capa en la superficie del líquido que llena la cámara de sedimentación. Al cabo de 3 o 4 horas, los núcleos forman cuatro capas que corresponden a las siguientes velocidades de sedimentación: 2,0; 1,7; 0,8 y 0,5 milímetros por hora.
L
os distintos tipos de núcleos fueron caracterizados por su morfología y por su contenido en ADN, ARN, proteínas básicas (histonas y protaminas) y proteínas no histonas. La fracción que sedimenta a mayor velocidad, 2,0 milímetros por hora, 2. CELULAS TESTICULARES DEL GALLO en distintos estadios de la espermatogéconsiste en grandes núcleos esféricos nesis. Las espermatogonias (1), tras una serie de divisiones, dan lugar a los esperintensamente teñidos, con una red de matocitos primarios ( 2), los cuales, al dividirse (primera división meiótica), originan cromatina que se extiende a todo el los espermatocitos secundarios ( 3). Los espermatocitos secundarios, a su vez y a espacio nuclear. Estos núcleos pertetravés de la segunda división meiótica, dan lugar a las espermátidas primitivas (4). necen a los espermatocitos primarios Estas células no se dividen, pero experimentan un proceso de metamorfosis nuclear y su contenido de ADN (4,27 picogray citoplasmática denominado espermiogénesis ( 4-9), que origina los espermatozoides (9). La espermatogénesis del gallo es un proceso muy activo que evoluciona más mos) es doble del correspondiente a rápidamente que en otras especies animales (12 días en el gallo frente a 32 días en las células somáticas. Hemos desigla rata). Además de las células germinales, los túbulos seminíferos del testículo nado esta fracción nuclear como estacontienen las células de Sertoli (S). Estas células dividen el túbulo seminífero en dio I. El estadio II corresponde a dos compartimentos, un compartimento basal que contiene las espermatogonias y núcleos con una velocidad de sedilas primeras fases de diferenciación de los espermatocitos primarios y un comparmentación de 1,7 milímetros por timento luminal en el que se encuentran el resto de las células meióticas, las espermátidas y los espermatozoides. El microambiente creado por las células de Sertoli hora. Se trata de núcleos de menor y el íntimo contacto existente entre estas células y las espermátidas es esencial diámetro con una cantidad de ADN para la espermiogénesis. Datos morfológicos obtenidos por I. Zlotnik. aproximadamente igual a la de las células somáticas (2,5 picogramos). Tales núcleos han sido identificados des y que va acompañado de una drás- matozoides de tan sólo 2 micrómetros como pertenecientes a los espermatotica reducción del volumen nuclear. cúbicos. Estas notables diferenci as de citos primarios pequeños, espermatoLa figura 2 representa esquemáti- volumen permiten separar los núcleos citos secundarios y espermatogonias. camente distintas células del testículo de las células testiculares por sus dife- El denominado estadio III corresdel gallo en varios estadios de diferen- rentes velocidades de sedimentación ponde a núcleos con velocidad de sediciación. Puede observarse la notable en el campo gravitatorio terrestre. mentación de 0,8 milímetros por hora reducción del volumen nuclear a Antes de proceder a la separación y contiene núcleos esféricos pequeños medida que progresa la espermatogé- de los núcleos por este método, deben y núcleos de forma irregular. Su connesis. El núcleo de los espermatocitos obtenerse en forma pura, sin contami- tenido de ADN representa la mitad primarios es una esfera de 110 micró- nantes citoplasmáticos y por una vía del propio de las células somáticas. metros cúbicos de volumen. Las esper- que no altere el volumen nuclear. La Estos núcleos pertenecen a las espermátidas primitivas tienen núcleos figura 3 indica esquemáticamente los mátidas redondas primitivas y a las esféricos de sólo 25 micrómetros cúbi- pasos seguidos para el aislamiento y fases iniciales de su diferenciación. cos y, a medida que progresa la esper- purificación de los núcleos de las célu- El estadio IV corresponde a una fracmiogénesis, el núcleo se transforma las testiculares del gallo. La homoge- ción de núcleos alargados con velocien una elipsoide cuyo eje longitudinal neización rompe las membranas celu- dad de sedimentación de 0,5 milímese alarga progresivamente mientras lares y libera la mayoría de los núcleos. tros por hora pertenecientes a las que el transversal se reduce, siendo el Estos pueden separarse del citoplasma espermátidas alargadas y a los esper volumen final del núcleo de los esper- por ultracentrifugación a través de matozoides testiculares. Hemos 5
44
TEMAS 3
designado como estadio V fotografía de las bandas la fracción de núcleos de correspondientes a las espermatozoides obtenicinco histonas (H1, H2B, dos del conducto defeH2A, H3 y H4) obtenidas rente. Esta fracción sedide la cromatina de las menta a la misma velocélulas germinales en discidad que lo hace la fractintos estadios de diferención nuclear de espermáciación. La proporción de tidas alargadas y esperlas diferentes histonas no matozoides testiculares, se modifica a lo largo de la es decir, a 0,5 milímetros espermatogénesis. La hispor hora. tona H1 muestra varios CONDUCTOS TEJIDO En relación con el consubcomponentes con las DEFERENTES TESTICULAR tenido de ADN, la cantimovilidades electroforédad de proteínas básicas, ticas características de proteínas no histonas y esta especie. Componentes ARN varía a lo largo de la de menor movilidad que espermatogénesis del la histona H1 están pregallo. La relación entre sentes en la fracción HOMOGENEIZACION las proteínas básicas y el co rrespondiente a las SACAROSA ISOTONICA AD N pe rm an ec e co ns espermátidas alargadas. tante (alrededor de la uniOtro cambio aparente en la dad) en los estadios inielectroforesis de las histociales, espermatogonias, nas en estas células es una espermatocitos y esperbanda de menor movilidad mátidas primitivas, y electroforética que las dos desciende aproximadabandas H4. La concentramente a la mitad en los ción de este componente ULTRACENTRIFUGACION estadios finales, esperaumenta durante la esperSACAROSA ALTA DENSIDAD mátidas alargadas y miogénesis a expensas de espermatozoides. El conlas dos bandas H4 presentenido de proteínas no tes en los estadios anteriohistonas permanece eleres. La heterogeneidad vado en las espermatog oelectroforética de la hisnias y espermatocitos, tona H4 ha sido atribuida inicia el descenso en las a diferentes grados de aceespermátidas primitivas, tilación de la molécula. disminuyendo drásticaEl patrón electroforético mente en las espermátide las proteínas básicas de das alargadas y espermalas espermátidas alargatozoides. La cantidad de das muestra, además de ARN varía paralelamente las histonas citadas, una al contenido de proteínas proteína básica con una 3. AISLAMIENTO y purificación de nucleos de células testiculano histonas [ véase la movilidad electroforética res del gallo. El testículo del gallo es un órgano intraabdominal figura 5 ]. Provocando la y, a diferencia de lo que ocurre en los mamíferos, la espermato- mucho mayor. Dicha banda lisis de los núcleos y corresponde a la protamina génesis transcurre a la temperatura interna del animal (42 grados Celsius). Cuando alcanza su máximo desarrollo en prilavándolos sucesivamente del gallo. En los espermacon disoluciones de con- mavera, el testículo pesa unos 25 gramos y contiene un extraor- tozoides obtenidos del vaso dinario número de espermátidas (245 10–6 espermátidas por centraciones iónicas deferente, la protamina es gramo). Inmediatamente después de sacrificar al animal se sedecrecientes, obtuvimos paran los testículos, se diseca la cápsula que los envuelve, se la única proteína básica de la cromatina correspon- corta el tejido en pequeños fragmentos y se homogeneíza para la cromatina, no existiendo diente a las distintas fases romper las membranas celulares y liberar los núcleos. Los nú- histonas. M. Nakano, T. de la diferenciación. El cleos son separados del resto de los componentes celulares por Tobita y T. Ando estudiaanálisis de la composición ultracentrifucación a través de una disolución concentrada de ron la protamina del gallo, de la cromatina mostró sacarosa. Los conductos deferentes, a la derecha del esquema consiguiendo aislar, entre superior, son sometidos a los dos mismos procesos de homogecambios similares a los neización y ultracentrifugación para purificar los núcleos de los los años 1970 y 1975, ocho observados en los núcleos. espermatozoides. componentes distintos y Estos resultados son comsecuenciar varios de ellos. parables a los obtenidos Cuando aislamos la protaextrajimos dichas proteínas con ácido por otros autores utilizando métodos mina del gallo en 1974, sospechamos citoquímicos en diferentes especies sulfúrico y las separamos por electro- que la heterogeneidad electroforética animales (crustáceos, equinodermos, foresis en geles de poliacrilamida en demostrada por aquellos autores artrópodos, peces, anfibios y distin- presencia de urea. Las proteínas bási- podía ser un artefacto atribuible a tos mamíferos). cas con diferente número de cargas proteólisis, por lo que tratamos de Para analizar cualitativamente las positivas migran hacia el polo nega- inhibir la actividad proteolítica y, al proteínas básicas de la cromatina a lo tivo con velocidades distintas en estos conseguirlo, logramos aislar la protalargo de la espermatogénesis del gallo, geles. La ilustración 5 muestra la mina del gallo intacta. Utilizando el ×
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
45
mismo procedimiento independientemente, T. Ando y colaboradores confirmaron nuestro resultado y obtuvieron para la citada protamina la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 7.
P
ara investigar los cambios cualitativos que experimentan las proteínas no histonas de la cromatina durante la espermatogénesis, disociamos estas moléculas del complejo cromatínico y las analizamos electroforéticamente. Las proteínas de la cromatina pueden disociarse disol viéndolas con la ayuda de un detergente de carga negativa, el dodecilsulfato sódico. Una vez disociadas las distintas cadenas polipeptídicas quedan recubiertas con las cargas negativas del detergente y pueden separarse en el campo eléctrico creado a través de un gel de poliacrilamida. Las moléculas migran hacia el polo positivo a través de los poros del gel con velocidades que dependen de sus pesos moleculares. En el laboratorio del Departamento de Biología Celular del Baylor College of Medicine en Houston, Texas, en colaboración con Ching Sung Teng, analizamos por el procedimiento citado las proteínas de la cromatina de las células germinales del gallo en
distintos estadios de diferenciación. Las bandas existentes en los estadios iniciales (espermatogonias y espermatocitos) son muy similares. En estas células existe una considerable heterogeneidad en las bandas de elevado peso molecular (80.000-200.000). En las espermátidas primitivas, cuatro bandas de elevado peso molecular y las bandas de pesos moleculares 72.000, 52.000, 40.000 y 28.000 muestran menor densidad. En las espermátidas alargadas, doce componentes de elevado peso molecular y tres bandas de pesos moleculares 80.000, 74.000 y 40.000 disminuyen drásticamente, mientras que cuatro cadenas polipeptídicas de pesos moleculares 86.000, 70.000, 68.000 y 46.000 aumentan. En los espermatozoides sólo son visibles 5 bandas, cuyos pesos moleculares se hallan comprendidos entre 36.000 y 70.000. En experimentos llevados a cabo anteriormente, entre 1972 y 1974, en el Laboratorio de Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Barcelona, en colaboración con S. Vidal-Sivilla, obtuvimos por cromatografía en hidroxilapatita las proteínas no histonas de núcleos de células testiculares de cobayo, previamente separados por velocidad de sedimentación unidad. Observamos
IV
III
II
que la mayoría de las proteínas no histonas de la cromatina de las células testiculares del cobayo con pesos moleculares superiores a los 75.000 dalton eran características de las espermatogonias y espermatocitos. En las espermátidas se observó la desaparición de las bandas de elevado peso molecular y una reducción considerable de las bandas comprendidas entre los pesos moleculares 32.000 y 42.000. Los espermatozoides mostraron una ulterior reducción de las proteínas no histonas. L. S. Hnilica y sus colaboradores obtuvieron resultados similares con células de testículos de rata separadas por el método de velocidad de sedimentación unidad. Las proteínas de peso molecular superior a 84.000 eran características de los espermatocitos y desaparecían junto a las bandas de pesos moleculares 53.000 y 31.000 en las espermátidas.
¿Q
ué relación existe entre los cambios observados en las proteínas de la cromatina y la actividad genética de las distintas células germinales? Para investigar esta relación estudiamos la síntesis de ácido ribonucleico durante la espermatogénesis del gallo. Para detectar dicha síntesis en las diferentes células germinales, incubamos las células in vitro con un
O 3 R T I L I L I M ) / S S E O N E O L L 2 C L I U M N E N E D ( O R E M 1 U N
I 2 1,7 0,8 0,5 VELOCIDAD DE SEDIMENTACION
4. SEPARACION DE NUCLEOS de células testiculares de gallo por el método de la velocidad de sedimentación a fuerza de gravedad unidad. Consta esencialmente de un formador de gradientes, representado en la parte superior del esquema, y de una cámara de sedimentación cilindrocónica. La suspensión nuclear se introduce en la cámara de sedimentación a través de la jeringa representada a la izquierda del esquema, y es seguida de inmediato
46
por el gradiente de sacarosa. La muestra forma una delgada capa en la superficie del gradiente y los núcleos sedimentan espontáneamente con velocidades tanto mayores cuanto mayor es el volumen nuclear. Después de 3 o 4 horas de sedimentación, se obtienen cuatro capas (una por velocidad), representadas aquí en distintos colores, que son recogidas y caracterizadas por criterios morfológicos y de composición química.
TEMAS 3
precursor del ácido ribonucleico, la uridina marcada con tritio. Determinamos luego la cantidad de ácido 1,0 0,8 ribonucleico radiactivo presente en los diferentes tipos nucleares separados por el método de velocidad de sedimentación unidad. Otro procedi0,8 0,6 miento utilizado consistió en aislar primero los núcleos y determinar después su capacidad para sintetizar ) ARN a partir de los correspondientes ) nucleótidos. También incubamos N 0,6 0,4 D pequeños fragmentos de tejido testicu A / N lar con uridina tritiada, determinando D A ( ulteriormente por autorradiografía el N ácido ribonucleico radiactivo existente D A / en los núcleos. 0,4 0,2 N R Los distintos métodos mostraron A que la síntesis del ARN ocurre en los núcleos de las espermatogonias, espermatocitos y espermátidas pri0,2 0,1 mitivas del gallo y cesa cuando los núcleos de las espermátidas inician la metamorfosis que dará lugar a los espermatozoides. No hay, pues, síntesis de ARN en los núcleos de las espermátidas alargadas y de los I II III IV V es permatozoides. Observaciones ESTADIO DE LA ESPERMATOGENESIS similares se han realizado en distintas especies animales. Una mención 5. COMPOSICION QUIMICA DE LOS NUCLEOS aislados de células testiculares del especial merecen los estudios lleva- gallo en distintos estadios de di ferenciación. La cantidad de proteínas básicas (azul dos a cabo por A. L. Kierszenbaum y intenso), proteínas no histonas (rosa) y de ácido ribonucleico (en color azul pálido) desciende a medida que avanza la espermatogénesis. Laura T. Tres, quienes visualizaron el proceso de síntesis de ARN con el microscopio electrónico. Las espermatogonias, los espermatocitos y las ácidos ribonucleicos mensajeros res- de replicación, transcripción y recomespermátidas redondas del ratón sin- ponsables de la diferenciación celu- binación genética. Una proteína no tetizan ARN. Las moléculas de ARN lar ya han sido sintetizados. El histona, posiblemente relacionada aparecen en múltiples puntos de la genoma de las espermátidas despro- con el fenómeno de la recombinación cromatina de las células meióticas y visto de la mayoría de las pr oteínas genética en las células meióticas del premeióticas y sólo en algunos puntos no histonas características de los lirio, fue aislada y caracterizada por de las espermátidas primitivas. No se estadios precedentes queda conver- Y. Hotta y H. Stern. Dicha proteína se observó síntesis de ARN desde el tido en una tabula rasa que sólo será unía con gran afinidad al ADN de una momento en que las espermátidas objeto de nue va pr ogramación espe- sola cadena y facilitaba el proce so de inician el proceso de diferenciación a cífica durante la embriogénesis. Le apertura y cierre de la doble hélice. En Stourgeon y sus colaboradores han 1971, en el Departamento de Química espermatozoides. demostrado que la transición de Macromolecular de la Universidad a presencia de proteínas no histo- células genéticamente activas a Politécnica de Barcelona, investiganas en los núcleos de células ger- células genéticamente inertes en mos, en colaboración con J. A. Suminales activas en la transcripción y distintos modelos experimentales birana, la presencia de una proteína su ausencia en fases avanzadas de la comporta la desaparición de las pro- similar en las células germinales de espermiogénesis, donde cesa toda teínas no histonas de elevado peso la gónada macho de equinodermos del actividad genética, es un hecho cons- molecular, la disminución de un género Holoturia . La proteína se tante en la espermatogénesis de diver- componente de peso molecular encontraba en las células germinales, sas especies. En las células genética- 52.000, posiblemente tubulina, y el pero no era detectable en un tejido mente activas, las proteínas no incremento de una banda de peso somático de los mismos animales. Y. histonas podrían desempeñar distin- molecular 46.000 identificada como Hotta y H. Stern extendieron sus tas funciones en el proceso de la sín- actina. Las proteínas que forman observaciones a distintos mamíferos, tesis del ácido ribonucleico nuclear parte de las partículas que contie- incluido el hombre, y demostraron que heterogéneo y en la formación, trans- nen el ARN nuclear heterogéneo de- la proteína en cuestión estaba presente únicamente en los espermatociporte y estabilización de los ácidos saparecen. Para investigar la relación exis- tos, pero no en otras células testicularibonucleicos mensajeros. El cese de la actividad genética en tente entre las proteínas no histonas res o en células somáticas. En muchas especies animales, adelas espermátidas podría relacionarse y la expresión genética resulta con la pérdida de las proteínas no imprescindible caracterizar indivi- más de la pérdida de proteínas no hishistonas de la cromatina. Cuando dualmente dichas proteínas y estable- tonas y del cese de la actividad genéesta pérdida tiene lugar, todos los cer su posible relación con los proceso s tica, se produce en las espermátidas
L
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
47
una intensa reorganización de la estructura de la cromatina. En efecto, las histonas responsables del empaquetamiento del ADN en todas las células del organismo son desplazadas del núcleo de las espermátidas y su lugar lo ocupa una nueva proteína altamente básica, la protamina. El complejo ADN-protamina (nucleoprotamina) tiene un grado de compactación mucho mayor que el complejo ADN-histonas (nucleohistona). ¿Cómo ocurre la transición de una a otra forma de empaquetamiento? La pérdida de proteínas nucleares y las modificaciones químicas que éstas experimentan antes de ser desplazadas podrían dar lugar a la exposición de sitios del ADN bloqueados e n estadios anteriores de la espermatogénesis. Para investigar esta posibilidad inyectamos actinomicina D radiactiva en testículos de gallo in vivo y determinamos la cantidad de actinomicina que se unía a la cromatina de las diferentes células germinales. La unión de la actinomicina es proporcional al número de sitios del ADN expuestos en la cromatina. La unión de actinomicina D es máxima en las espermátidas alargadas, donde, en relación con los estadios precedentes, la cantidad de proteínas de la cromatina es mínima.
O
6. HISTONAS extraídas de la cromatina de núcleos pertenecientes a célu las testiculares de gallo en distintos estadios de diferenciación (I a IV). Las histonas fueron separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de urea. El gel de la izquierda (T ) muestra el patrón obtenido con las histonas extraídas del embrión de pollo de 11 días y se ha utilizado como referencia. Obsérvese asimismo el cambio registrado en la intensidad de las bandas H4 (b, c) en las espermátidas y la aparición de un componente adicional con menor movilidad electroforética (a), como consecuencia probable de la acetilación.
48
btuvimos la misma conclusión por un método totalmente distinto. Preparamos ARN polimerasa bacteriana y calculamos el número de sitios donde la polimerasa puede iniciar la síntesis de ARN en la cromatina de diferentes células germinales. El máximo número de sitios de iniciación y, por tanto, la máxima exposición del ADN, correspo ndía a las espe rmátidas alargadas. Nótese que no existe relación entre el número de sitios de iniciación para la síntesis de ARN in vitro por la polimerasa bacteriana y la síntesis de ARN que tiene lugar in vivo, pues en estas células no hay transcripción nuclear. Estudiamos, además, la afinidad de las diferentes cromatinas hacia la polimerasa bacteriana, así como la cinética de la unión polimerasa cromatina. Estos estudios y los realizados con la ARN polimerasa eucariótica de germen de trigo demostraron que una parte del ADN de la cromatina de las espermátidas se comporta como el ADN aislado y desprovisto de proteínas. La exposición del ADN en las espermátidas ha sido también observada por métodos citoquímicos. Nuestras investigaciones revelaron que el proceso de transición de
TEMAS 3
diaron algunos de los procesos implicados en dicho desplazamiento. Uno de estos fenómenos consiste en la acetilación de las histonas, modificación química al parecer necesaria para el desempaquetamiento de la nucleohistona en las espermátidas. La acetilación supone la neutralización de determinadas cargas positivas de las histonas y, en consecuencia, la disminución de la interacción entre estas moléculas y el ADN. A diferencia de lo que ocurre en las células germinales genéticamente activas, en las que se detectaron actividades enzimáticas de acetilación y desacetilación de las histonas, con un recambio rápido de los grupos acetilo, en las espermátidas, si bien está presente la actividad acetilasa, la actividad desacetilasa es muy pequeña o no existe, por lo que el recambio de los grupos acetilo es prácticamente nulo. Se obser vó, además, que la espermina ejerce un notable efecto estimulante so bre la actividad acetilasa de la cromatina, mientras que a elevadas concentraciones inhibe la actividad desacetilasa. El incremento de la concentración de poliaminas en el núcleo de las espermátidas podría explicar la intensa acetilación de las histonas que precede a su desplazamiento. Cuando las histonas han sido reemplazadas por la protamina, el ADN del espermatozoide del gallo queda totalmente inaccesible a la actinomicina D y a la ARN polimerasa y muestra un grado de compactación comparable al del ADN de la cabeza de los bacteriófagos.
E 8. LA TRANSICION NUCLEOHISTONA-NUCLEOPROTAMINA tiene lugar en las espermátidas alargadas del gallo. El esquema superior muestra cómo la transición de una a otra forma de empaquetamiento supondría la exposición de sitios del ácido desoxirribonucleico (ADN) como consecuencia del desplazamiento, previa acetilación, de las proteínas de la cromatina. Las poliaminas naturales, fundamentalmente la espermina y la espermidina, mantendrían el ADN en un estado de compactación relativa y lo protegerían mientras tiene lugar el empaquetamiento definitivo en forma de nucleoprotamina. Las fórmulas químicas correspondientes a las poliaminas espermina, espermidina y putrescina con 4, 3 y 2 cargas positivas, respectivamente, se han representado a la izquierda del esquema.
En experimentos realizados in ARN y proteger al ADN expuesto vitro , concentraciones de espermina frente a la acción de las nucleasas y superiores a 2 milimolar inhibían la otros agentes. síntesis de ARN en una mezcla de Aún no conocemos el mecanismo ARN polimerasa de germen de trigo y mediante el cual son desplazadas las cromatina de células germinales. Las histonas y proteínas no histonas de la mismas concentraciones inhibían cromatina de las espermátidas. En el completamente la acción de las nuclea- Laboratorio de Fisiología de la sas sobre la cromatina. Las poliami- Facultad de Medicina de la Universidad nas podrían, pues, bloquear in vivo los de Barcelona, y en colaboración con sitios de iniciación para la síntesis de J. Mezquita y S. Vidal-Sivilla, se estu-
50
l ADN de los espermatozoides, en estas condiciones, puede afrontar la aventura de salir al medio externo en busca del óvulo sin riesgos de alteración del mensaje genético que transporta. Su volumen diminuto y su forma altamente hidrodinámica le permitirán realizar el desplazamiento con la máxima economía energética.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA ACIDIC PROTEINS OF THE NUCLEUS. Dirigido por I. L. Cameron y J. R. Jeter, Academic Press, 1974. CHANGES RING
IN
CHROMATIN STRUCTURE
SPERMATOGENESIS
IN
DU-
MATURING
ROOSTER TESTIS AND DEMONSTRATED THE INITIATION
BY
PATTERN OF RIBONUCLEIC
. Cristóbal Mezquita y Ching Sung Teng en The Biochemical Journal , volumen 170, páginas 203-210, 1977. ITRO ACID SYNTHESIS IN V
TEMAS 3
Las histonas, proteínas reguladoras de genes Michael Grunstein Reputadas antaño puro material de empaquetamiento del ADN nuclear, estas proteínas están capacitadas para ejercer una doble misión: bloquear la activación de muchos genes o promover, por contra, su expresión
L
as histonas se combinan en el núcleo de la célula con largas hebras de ADN, que contienen los genes, para formar la cromatina, el material que constituye los cromosomas. No hace mucho que todavía se suponía que esas proteínas pequeñas no intervenían en la regulación de los genes y tenían la misión exclusiva de servir de material de empaquetamiento celular. Venían a ser una suerte de “bobinas” dotadas de carga positiva, a cuyo alrededor se enrollarían las hebras de ADN cargadas negativamente para así poder encajar en el interior del diminuto núcleo celular. Pero la investigación tenaz acaba de demostrar que nos hallamos ante partícipes activos en la regulación de los genes. Un tipo por lo menos de histonas colabora en la activación: ayuda a iniciar la copia, o transcripción, de la información almacenada en ADN a las moléculas del ARN mensa jero. (Estos transcritos son los moldes a partir de los cuales se sintetizan las proteínas.) Ciertas histonas reprimen también la transcripción. En resumen, si queremos conocer el mecanismo de control de los genes hemos de atender al comportamiento de las histonas. El interés por el mecanismo de activación y desactivación génica obedece, en parte, a que constituye la condición para adentrarse en el desarrollo embrionario de los organismos pluricelulares. Aunque la mayo-
MICHAEL GRUNSTEIN, de origen rumano, enseña, desde 1975, biología molecular en la Universidad de California en Los Angeles. Inició su formación en la Universidad de McGill y la culminó con el doctorado en la de Edimburgo, en 1971.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
ría de las células de un organismo en desarrollo presente la misma dotación de genes, la diferenciación hará que unas se conviertan en neuronas, otras en células sanguíneas y unas terceras en hepáticas, por ejemplo. El estado final varía en gran medida por la acti vación, o desactivación, de distintos genes en el instante apropiado, produciendo mezclas peculiares de enzimas o proteínas que confieren a cada célula sus propiedades características. El ahondar en el proceso de activación y en el de represión de los genes nos facilitará desentrañar el motivo por el que fallan a veces los controles de dichos procesos, con resultados patológicos. A modo de ejemplo, el cáncer puede originarse por culpa de una actividad desbordada de los genes cuyos productos proteicos promueven la replicación de las células o por culpa de la inactividad anómala de los genes que suspenden la replicación. Las funciones reguladoras de las histonas pasaron inadvertidas hasta hace poco. Influyó en ese retraso el haberse conseguido la transcripción tras exponer ADN desnudo (libre de histonas) a extractos celulares que contenían proteínas reguladoras seleccionadas. Ante el éxito de los experimentos “sin células enteras”, se concluyó que, en los organismos, las histonas no participaban en la regulación génica. La falsedad de la conclusión no fue óbice para que ese tipo de estudios, y otros, permitieran adentrarse en los mecanismos de activación de los genes. Investigaciones que, junto con los análisis estructurales de la cromatina, prepararon el camino que terminó conduciendo al descubrimiento de la importancia de las histonas. Desde muy pronto se estableció que los genes de las células eucariotas (nucleadas) poseían, por los menos,
tres segmentos especializados. Entre éstos se encuentra, naturalmente, la región codificadora, que especifica la secuencia aminoacídica de una proteína. Los otros son regiones distintas que influyen sobre el segmento de codificación y determinan si éste ha de copiarse en ARN mensajero y cuántas moléculas de ARN deben sintetizarse.
P
ara que un gen se active, ha de constituirse un grupo especial de proteínas en una región reguladora, que suele recibir el nombre de región promotora proximal. De entrada, una proteína se une a cierta parte de dicho promotor, la caja TATA. Después se van unciendo otras proteínas a la primera, dando lugar a una combinación de proteína y ADN: el comple jo de preiniciación. La caja TATA debe su denominación a la secuencia nucleotídica TATAAATA, porque la abarca en cierto grado. Los nucleótidos, que son los sillares del ADN, se distinguen por su base química: timina (T ), adenina ( A), guanina (G) o citosina (C). Una vez formado, el complejo de preiniciación coloca a uno de sus integrantes —la enzima ARN polimerasa— dentro del promotor proximal, en el lugar de iniciación de la transcripción. La polimerasa, bien alojada, avanza y retrocede a lo largo de la región codificadora (a modo de vagoneta sobre los raíles), sintetizando ARN mensajero. El reconocimiento del ADN por las proteínas del complejo de preiniciación, si se dan las condiciones adecuadas, genera en el tubo de ensayo una transcripción con un nivel bajo, o basal; de ahí viene que a estas proteínas se les llame factores basales. Otras proteínas, las activadoras, se engarzan en un segundo lugar regulador: en la secuencia activadora curso arriba del ADN (“upstream”); el aco-
51
plamiento desencadena la producción máxima de mensajero. En muchos organismos eucariotas, las secuencias activadoras curso arriba del ADN responden también al nombre de intensificadores (“enhancers”).
por una sola molécula de H1. Esta histona, además de agarrarse a la superficie externa del ADN que rodea el octámero, se traba también con ambos tramos de los flancos, o “conectores” (“linkers”), del ADN que ligan un nucleosoma a otro. Pero la histon a a investigación de la química y la H1 no es imprescindible para la forestructura de la cromatina había mación de los nucleosomas. Citemos, determinado, desde hacía tiempo, las como botón de muestra, la levadura cinco categorías fundamentales de de panadero o de cerveza ( Saccharohistonas: H1, H2A, H2B, H3 y H4. Se myces cerevisiae ); este eucariota unidemostró luego, por cristalografía de celular, que ha prestado tantos servirayos X y otras técnicas, que las cios al conocimiento de la regulación “bobinas” donde se arrolla el ADN génica, produce muy poca histona, si eran octámeros, constituidos por ocho es que la produce; lo que no impide moléculas —dos de la histona H4, que abunden los nucleosomas en los combinadas con dos de las histonas cromosomas de la levadura. Por otra parte, la H1 parece promoH3, H2A y H2B. Una cinta formada por 146 nucleótidos de ADN da dos ver la compactación del ADN en los vueltas casi entera s alre dedo r del organismos pluricelulares. En sus octámero, o núcleo de la histona; la células, buena parte de la cromatina se arrolla en fibras de unos 30 nanóunidad resultante es el nucleosoma. En la mayoría de los eucariotas, el metros (mil millonésimas de metro) de ADN queda aún más anclado al sitio diámetro; los arrollamientos abarcan
L
1. PROTEINAS HISTONAS H3 ( azul) y H4 (verde), capaces de doblar el ADN (anillo pardo dorado alrededor de las histonas) en este corte fino, de delante hacia atrás y a través de un mapa tridimensional de un nucleosoma. Los nucleosomas constitu-
52
unos 6 nucleosomas por vuelta. Lo cual contrasta con la cromatina de la levadura de panadero que, en su mayor parte, permanece desplegada; parecida a un cordón (ADN) con nudos (nucleosomas), mide, en su mayor parte, 10 nanómetros de diámetro: la talla de un nucleosoma. Hacia mediados de los años ochenta, algunos habían comenzado a poner a prueba una idea controvertida, la de la posible intervención, en la regulación génica, de otros miembros, amén de las cajas TATA, de los elementos activadores curso arriba del ADN y las proteínas especializadas que se ligan a ellos (los factores basales y las proteínas activadoras). Las histonas podrían tener también algún papel. Veinte años antes, algún que otro trabajo había apuntado la posibilidad de que las histonas bloquearan la transcripción. Pero las pruebas eran muy endebles. En los ochenta, el progreso científico permitía estudios más definitivos.
yen un rasgo estructural característico de los cromosomas de todas las células nucleadas. Se ha demostrado que las histonas ejercen funciones reguladoras de las actividades de los genes contenidos en los cromosomas.
TEMAS 3
Concurría, además, cierto descubrimiento relacionado con la evolución. Los análisis de las secuencias aminoacídicas de las histonas ponían de manifiesto que las proteínas del núcleo histónico apenas diferían de una especie a otra. De manera palmaria, las histonas del guisante se parecen llamativamente a las de la vaca. Siempre que la estructura de una molécula varí a en un míni mo grado de una especie a otra, se entiende que su secuencia de aminoácidos reviste sumo interés para el funcionamiento de la célula. Si las histonas limitaran su misión a servir de instrumento para el plegamiento del ADN, cualquier secuencia, o casi, rica en aminoácidos cargados positivamente podría valer para plegar el ADN, dotado de carga negativa; no hubiera sido necesario conservar, con seme jante rigor y a lo largo de millones de años, las secuencias de aminoácidos.
activadoras —las moléculas que se que responder a cuestiones del tenor unen a las secuencias activadoras siguiente: ¿se incorporan siempre de curso arriba del ADN— ejercerían manera rutinaria las cajas TATA en verosímilmente una influencia diso- los nucleosomas? ¿Reprime la partíciadora en los nucleosomas. Ya en cula nuclear de histonas la transcrip1984, Be verl y M. Emerson y Gary ción cuando se ha unido a los elemenFelsenfeld habían demostrado que las tos TATA? ¿Cómo podrían debilitarse proteínas que se unían a secuencias los enlaces entre octámeros de historeguladoras del ADN obstaculizaban nas y ADN en los nucleosomas ya forla formación de nucleosomas en esos mados? sitios. Más tarde, Luse, Robert G. Roeder y otros generalizaron, cada grupo os grupos encabezados por Dennis por su lado, esa idea. Demostraron que E. Lohr y Wolfram Horz reunielas histonas y los factores basales ron algunas de las pruebas más sólicompetían por acceder a la caja das de la formación frecuente de TATA. nucleosomas en las cajas TATA . En estos laboratorios se modificó el Muchos genes de la levadura de panaorden de exposición del ADN a histo- dero exponen, de manera regular, nas y factores basales. Pues bien, la nucleosomas en el elemento TATA. transcripción sólo se producía si se Entre dichos genes se hallan los que concedía a los factores la oportunidad especificanlasenzimasgalactoquinasa de asociarse con los elementos TATA (GAL1) y la fosfatasa ácida ( PHO5). antes de añadir las histonas. Las his Pusieron también de manifiesto tonas ganaban, por contra, cuando los que la activación de esos genes se competidores se añadían al ADN acompañaba de la liberación, del l sólido respaldo que avala la idea simultáneamente. ADN, de los nucleosomas asociados En el curso de esa serie de experi- con las cajas TATA. Los investigadode la intervención de las histonas en el control génico procede, en parte, mentos, Jerry L. Workman, Roeder y res sabían que se producía cierto grado de los estudios en medios libres de su equipo de la Rockefeller se apunta- de disociación en los genes activos, ya células. En 1986, Joseph A. Knezetic ron un curioso hallazgo. Sus datos que las nucleasas (enzimas que romy Donald S. Luse combinaron histonas sugerían que, si el ADN se exponía pen el ADN) cortaban con mayor solcon moléculas de ADN que contenían simultáneamente a histonas y extrac- tura las regiones portadoras del elegenes de un adenovirus humano. tos celulares dotados de factores basa- mento TATA, corte que sólo es posible Cuando introdujeron fracciones de las les y proteínas activadoras, la suerte si el ADN se endereza lo suficiente células humanas que incluían los fac- se inclinaba a favor de los factores para quedar expuesto a la acción de tores basales (entre ellos, ARN poli- basales. Estos se anclaban en las cajas las nucleasas. merasa), los nucleosomas recién for- TATA, a pesar de la presencia de hisPero no acababa de quedar clara la mados impidieron que los factores tonas, e impedían así que las cajas relación causal. ¿Debíase a los camTATA se incorporasen en los nucleoso- bios estructurales del nucleosoma la incoaran la transcripción. El grupo de Roger D. Kornberg mas. El grupo de James T. Kadonaga transcripción? ¿O eran acaso estos demostró entonces que la inclusión había demostrado con técnicas pare- cambios una consecuencia del deslizaselectiva de cajas TATA en los nucleo- cidas que los activadores bloqueaban miento de la ARN polimerasa a lo somas evitaba que la ARN polimerasa la represión de la transcripción por la largo del gen? iniciara la transcripción. Kornberg y, histona H1 in vitro. A finales de los ochenta, mi labora¿Qué sugerían esos resultados? Una torio decidió abordar el problema de de manera independiente, Donald D. Brown lograron, además, otro avance posibilidad del mayor interés: las pro- la manipulación de los genes de las importante. Al inducir la formación de teínas activadoras podrían colaborar, histonas de la levadura. La biología y nucleosomas en el seno de la región directa o indirectamente, a debilitar la la industria cervecera habían descicodificadora, no se bloqueó la trans- unión entre histonas y ADN en las célu- frado ya buena parte de la dotación cripción. (La investigación ulterior las; en concreto, un activador podría génica de ese organismo; así que optademostraría, sin embargo, que los alterar algún factor basal en el complejo mos por él. Como también resultó una nucleosomas podían frenar las idas y de preiniciación, capacitando a la pro- suerte el disponer entonces de herrateína para disociar los nucleosomas y mientas que permitían hacer cortes y venidas de la ARN polimerasa.) Considerados en conjunto, estos ganar acceso al elemento TATA. empalmes y combinar los elementos Los estudios con extractos celulares genéticos de las levaduras con fines resultados indican que las histonas podrían colaborar en la represión de son muy útiles, lo que no significa que experimentales. los genes dentro de células enteras. los resultados reflejen, necesariaSi lográbamos impedir la síntesis de Sin suspender del todo la transcrip- mente y con precisión, el funciona- las histonas, evitaríamos, pensábación dentro de la región codificadora, miento de las células en los organis- mos, que las cajas TATA de muchos podrían evitar que los factores basales mos. Así pues, en paralelo con el genes normalmente reprimidos quedaencerrasen el ADN. E inversamente, trabajo sobre extractos celulares sen atrapados en los nucleosomas. Si si los genes habían de activarse, pare- libres, y en ocasiones en respuesta a en tales circunstancias se produjeran cía probable que las partículas núcleo esa técnica, varios laboratorios, los ARN mensajeros de estos genes, de las histonas se desengarzaran de incluido el mío de la Universidad de habríamos demostrado que es la sepala caja TATA. California en Los Angeles, se centra- ración de las histonas lo que posibilita A tenor de otras pruebas con extrac- ron en el papel desempeñado por las la transcripción, no sólo en el tubo de tos libres de células, las proteínas histonas en las células vivas. Había ensayo sino también en las células
L
E
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
53
Estructura del nucleosoma
S
e forma un nucleosoma (a ) cuando las histonas se combinan entre sí, haciendo que el ADN ( el tubo de la representación esquemática ) dé un par de vueltas en torno al complejo de histonas resultante. Esta partícula, o núcleo nucleosómico, abarca en su centro dos copias de la histona H3 ( azul ) y otras dos de la H4 (verde ). El tetrámero H3-H4 está flanqueado por dos pares H2A-H2B, o dímeros ( amarillo y púrpura ), uno de los cuales no se ve. Cada molécula de histona se proyecta en una cola (cintas pálidas ) desde la partícula nuclear hacia el exterior, preparada para interaccionar con otras moléculas. (Se desconoce la conformación exacta de la cola.) En muchos organismos (quizá no en todos), la histona Hl (estructura gris a la izquierda ) facilita el anclaje de ADN en la partícula nuclear. Nucleosomas y ADN libre de histonas que los mantiene unidos forman la cromatina (b-d ). Al promover el empab quetamiento de los nucleosomas, la histona Hl ayuda a la cromatina a enrollarse en fibras de 30 nanómetros S (esquema y micrografía en b ). Los genes O R comprendidos en el ADN dentro de T E esas fibras de 30 nanómetros de diáme- M O tro permanecen inactivos. El desenro- N A llamiento de la cromatina hasta alcan- N 3 zar una conformación de 10 nanóme- 0 tros (c ) la hace más propicia para la activación de los genes. Para que los genes acaben tornándose activos, el ADN debe desenrollarse parcialmente de los nucleosomas por las secuencias implicadas en la regulación génica (d ).
a
NH2
+
+ +
+
+
54
+ NH 2 +
+ +
H2A +
H3 H1
H2B +
+
H4
NH 2
+
+ +
+
+ NH2
+ +
+
+
+
+
+
+ NH2
ADN
+ +
+
NH2
NH 2
PARTICULA NUCLEAR DE LA HISTONA
c
tenían que exponer a la presencia de glucosa la levadura alterada genéticamente.
A
+ +
S O R 0 T 1 E M O N A N
l principio del tratamiento, las células atravesaban distintos estadios del ciclo vital de la levadura. A diferencia de lo que ocurre con muchas células de mamíferos (por ejemplo, las neuronas), las células de levadura crecen sin solución de continuidad y se dividen (por gemación), a no ser que las condiciones ambientales amenacen la supervivencia de las nuevas células. Conforme los cromosomas del organismo se van duplicando durante la división celular, los dos conjuntos se segregan. Uno se entrega a la yema emergente, que
ADN
NANOMETROS
NUCLEOSOMA
vivas. El hallazgo indicaría también que las histonas pueden reprimir los genes en las células vivas. Min Han y Ung-Jin Kim suspendieron la síntesis de las histonas adaptando una técnica diseñada por Mark Johnston. Introdujeron elementos reguladores del gen de la galactoquinasa en las regiones codificadoras de los genes que determinan histonas. Sustituyeron entonces estos genes por las versiones normales en las células de levadura. Cuando las células así alteradas se cultivan en un medio enriquecido en glucosa, la secuencia reguladora de la galactoquinasa evita la transcripción de los genes asociados a ella. Por tanto, para detener la síntesis de histonas Han y Kim sólo
COLA
NH 2
d
acaba desprendiéndose para convertirse en célula independiente. Suspendida la síntesis de histonas, las células de levadura alteradas genéticamente reprodujeron su ADN una vez sin dificultad. Pero éste portaba aproximadamente la mitad del número habitual de nucleosomas. Y lo que encerraba mayor interés: los análisis de los productos de la digestión con nucleasa indicaban que la mayoría de los nucleosomas que quedaban no ocupaban las posiciones acostumbradas; estaban, por contra, colocados al azar. Más aún, nuestros hallazgos señalaban que las cajas TATA, habitualmente incluidas en los nucleosomas, se encontraban ahora en libertad. De este modo, los cromosomas se
TEMAS 3
asemejaban al ADN desnudo, satisfaciendo así nuestros requisitos experimentales. Han y Kim procedieron a medir la cantidad de ARN producido por muchos genes en levaduras deplecionadas de nucleosomas. En 1988 descubrieron que sólo los genes activados en respuesta a dicho vaciado nucleosómico pertenecían al tipo inducible. Genes que permanecen silenciosos a no ser que la célula quede expuesta a un cambio en el nivel de un azúcar, un aminoácido determinado u otro estímulo similar. A la inversa, los genes encargados de la intendencia doméstica, cuyos productos se necesitan permanentemente para el cumplimiento de las funciones celulares, no se acti varon por encima de lo ordinario. Este último resultado no debe sorprender, si es correcta la afirmación de que los nucleosomas reprimen la transcripción. Es de esperar que los genes de uso continuo carezcan de nucleosomas en sus cajas TATA, antes incluso de que se acometan los ensayos. Los procedimientos diseñados para eliminar las histonas del ADN no tienen por qué afectarlos.
1
FACTORES BASALES
SECUENCIA ACTIVADORA CURSO ARRIBA DEL ADN
PROMOTOR PROXIMAL
REGION CODIFICADORA
LUGAR INICIADOR DE LA TRANSCRIPCION
2
CAJA TATA
ARN POLIMERASA ARN MENSAJERO
3 PROTEINAS ACTIVADORAS
l examen atento de los gene s indu- 2. MODELO DE LA ACTIVACION GENICA centrado en el ADN desnudo, libre de histonas. Los genes incluyen una región codificadora (banda azul en el extremo de cibles proporcionó un apoyo más la derecha en 1), que especifica la secuencia aminoacídica de una proteína, y dos directo a la hipótesis de la represión. regiones reguladoras importantes: el promotor proximal (banda amarilla) y la Por manipulación genética, Han y secuencia activadora curso arriba del ADN (banda verde); estas dos regiones deterLinda K. Durrin descubrieron que, minan si se sintetiza o no la proteína codificada. El modelo sostiene que, si un gen para muchos de esos genes, la elimi- tiene que activarse ( 2), las proteínas conocidas por factores basales (rojo) deben nación de los nucleosomas en torno a ensamblarse sobre la caja TATA dentro del promotor (segmento amarillo en el extremo de la izquierda). Este ensamblaje coloca un factor basal —la enzima ARN las cajas TATA conducía a la síntesis polimerasa— sobre el punto de iniciación de la transcripción, o sitio I (segmento de ARN mensajero, síntesis que movió amarillo en el extremo de la derecha), que capacita a la enzima para copiar, o transa pensar que los factores basales se cribir, la información de la región codificadora en el ARN mensajero (el molde a hallaban unidos a las cajas TATA. La partir del cual se sintetiza la correspondiente proteína). El ligamiento d e las llamatranscripción se produjo faltando das proteínas activadoras (violeta en 3) a la secuencia activadora curso arriba del incluso secuencias activadoras curso ADN se traduce en una ulterior estimulación d el complejo basal (flecha segmentada) y eleva la transcripción a su grado máximo ( flecha gruesa). arriba del ADN; ello indica que basta la eliminación de los nucleosomas asociados con las cajas TATA para iniciar tamente que el núcleo de histona se de Winston desarrolló su técnica a la la transcripción en su nivel basal. disocie de la caja TATA. La liberación sombra del descubrimiento del laboPara algunos genes, sin embargo, de dicha partícula facilita que los fac- ratorio de Gerald R. Fink: en algunas hubo que restablecer la secuencia acti- tores basales se asocien a la caja TATA células mutantes de levaduras, el seg vadora curso arriba del ADN al objeto y formen un complejo de preiniciación, mento “transponible” TY, del ADN, se de que la transcripción alcanzara su generando con ello una transcripción inserta cerca de la caja TATA del gen velocidad máxima. de nivel basal. HIS4 . ( HIS4 no especifica una hisPara mi grupo, semejante comporEn la segunda etapa, independiente tona; codifica una enzima relacionada tamiento debe entenderse en el sen- de las histonas, los activadores esti- con el empleo de histidina, un aminoátido de que, al formarse los nucleo- mulan el complejo de preiniciación cido.) La inserción hace que la transsomas, las histonas reprimen la para alcanzar la máxima síntesis de cripción comience dentro del elemento transcripción en las células vivas. ARN . En nues tra op inión, pues , TY y no por el gen HIS4. Este error Basándonos en los estudios in vitro, muchos consiguen a veces la activa- supone la producción de un transcrito hemos propuesto un modelo mejorado, ción in vitro en ausencia de histonas sin sentido, incapaz de dirigir la sínen dos etapas, para explicar la activa- porque podrían estar replicando sólo tesis de la proteína His4. ción génica. los episodios finales del proceso de El grupo de Winston demostró que, En la primera, la etapa de activa- activación. si alteraba el número de copias de los ción dependiente de histonas, las proEn 1988 Fred Winston y su equipo genes de las histonas H2A y H2B en teínas activadoras colocadas sobre la reunieron otros datos celulares que la levadura, se esquivaba el efecto secuencia activadora corriente arriba denunciaban la implicación de las his- re presor de TY y se obtenía la del ADN consiguen directa o indirec- tonas en la regulación génica. El grupo transcripción correcta del gen HIS4.
E
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
55
Experimentos in vitro decisivos n las postrimerías de los años ochenta, el estudio realizado con extractos
E de células humanas evidenció que las histonas y los factores basales competían por el acceso a las cajas TATA, con victoria habitual de las histonas (experimento 1), salvo cuando concurrían circunstancias especiales (experimentos 2 y 3 ). Y así comenzó a sospecharse que las proteínas activadoras, o las proteínas sobre las que éstas influyen, podrían ser los agentes que liberan las cajas TATA de los nucleosomas en el interior celular para proceder a la transcripción. EXPERIMENTO 1
Cuando se expone el ADN simultáneamente a histonas y factores basales, las histonas forman nucleosomas en torno a las cajas TATA y bloquean el acceso de los factores basales.
HISTONAS
+
FRACCION CELULAR QUE CONTIENE LOS FACTORES BASALES
+ CAJA
ADN
NO HAY TRANSCRIPCION
TATA
EXPERIMENTO 2
COMPLEJO DE PREINICIACION
ETAPA 1
+
Cuando se expone el ADN a los factores basales, antes de que se introduzcan las histonas (etapa 1), aquéllos se ensamblan cabe las cajas TATA y cierran el paso a las histonas añadidas posteriormente (etapa 2 ).
ETAPA 2
+
TRANSCRIPCION
EXPERIMENTO 3
+
+
SECUENCIA ACTIVADORA ADN ARRIBA
Cuando se expone el ADN simultáneamente a histonas, factores basales y proteínas activadoras, estas últimas facilitan el acceso y unión de los factores basales a las cajas TATA, y bloquean el acceso de las histonas.
PROTEINAS ACTIVADORAS TRANSCRIPCION
56
Este le vantamiento de la represión de HIS4 dejaba claro que, en la regulación génica, correspondía a las histonas un papel que nadie había pensado concederles antes. Los datos acumulados prestan sólido respaldo a la idea según la cual no puede explicarse adecuadamente la regulación génica si sólo se atiende a las interacciones entre ADN y proteínas no histonas. La eliminación de la represión controlada por las histonas constituye el primer paso, necesario, para la activación de un gen eucariota silencioso. Y si ello es así, lo importante ahora estriba en conocer cómo se relajan los lazos que mantienen unido el núcleo de histona a la caja TATA.
C
omparto con mis colaboradores el convencimiento de que esa rela jac ión res ulta , verosímilmente, de uniones específicas entre proteínas activadoras, o un intermediario suyo, y el segmento de la “cola” de una de las histonas, la H4. Cada histona se divide dentro de la bobina octamérica en dos dominios fundamentales. El dominio central, o nuclear, que incluye el extremo carboxílico (COOH) de la proteína, se enrolla en hélices hidrofóbicas muy prietas. Estas hélices se enredan a su vez para configurar el componente mayoritario del octámero de histonas. Por contraste, el dominio de la cola, que incluye el extremo amino (NH2), es hidrofílico. Permanece suelto, como un cabo. La razón de que abordáramos el posible papel regulador de las colas de las histonas debióse, en parte, a lo demostrado por Harold Weintraub y por James Whitlock y Robert T. Simpson; a saber: que los cabos tenían poco que ver con el ensamblaje y estabilidad de los nucleosomas. Se extienden a modo de prolongaciones de las hélices. Comparados con los dominios del núcleo, están potencialmente más abiertos a las interacciones con otras moléculas en el entorno local de la cromatina. Otros trabajos, un tanto desconcertantes, avivaron también nuestro interés por las “colas”. En 1977, el grupo de Vincent G. Allfrey había observado que la transcripción solía ir acompañada de la adición de grupos acetilo (CH3CO) a las colas de las histonas. Cabía esperar que esas adiciones neutralizaran las cargas positi vas de las colas, lo que a su vez podría provocar una interrupción potencial de la interacción entre colas y ADN dotado de carga negativa. (No sabemos todavía si la acetilación precede o sigue a la transcripción.) El ha llazgo
TEMAS 3
sugería que las colas podrían liberar Toda esa gavilla de pruebas viene a soma. El desplazamiento de los dímede las cajas TATA a los nucleosomas. indicar que, cuando las proteínas acti- ros podría, a su vez, desenrollar parte En 1991 Durrin daba consistencia vadoras, o las accesorias de éstas, se del ADN del nucleosoma y quedar al a semejante posibilidad. Al eliminar unen a un lugar específico de la cola, alcance de los factores basales. los aminoácidos comprendidos entre puede inducirse un cambio conforma- Después del paso de la ARN polimela posición 4 y la 23 de la cola de la cional en la histona. Este cambio rasa, los dímeros H2A-H2B podrían histona H4, quedaron bloqueados en puede llevar a la separación temporal reasociarse de nuevo con los tetrámebuena medida varios de los genes de de las histonas H2A y H2B del nucleo- ros H3-H4, con la consiguiente reapala levadura normalmente inducibles, incluidos los implicados en el metaboCRUZAMIENTO DE FUSION CELULAR lismo de la galactosa. La inhibición CELULAS DE indujo a pensar que todo el segmento LEVADURA eliminado, o parte de él, interactuaba normalmente con la maquinaria de la transcripción. El hallazgo de Durrin nos llevó a amplificar la etapa de activación dependiente de las histonas en nuestro modelo de regulación de los genes. Y avanzamos la hipótesis según la cual las proteínas activadoras, o las LOCUS DE CRUZAMIENTO LOCUS DE CRUZAMIENTO LOCUS MAT proteínas sobre las que influyen, desHML-ALFA EN RES ERVA HMR a EN RESERVA plazan a las histonas de la caja TATA mediante la unión específica con algún segmento de la región comprendida 1. ELIMINACION 2. SE PRODUCE DE LOS GENES UNA COPIA DE CADA entre los aminoácidos 4 y 23 de la cola ORIGINALES UNO DE LOS GENES de la histona H4. HMR a
P
odemos ya imaginarnos hoy un mecanismo en cuya virtud esa unión facilitaría la transcripción. Nuestras ideas arrancan del modo en que entendemos la formación de los nucleosomas y de lo que ocurre en su liberación. Abraham Worcel tuvo mucho que ver en nuestro enfoque. Sugirió que el primer paso hacia la construcción del nucleosoma era el ensamblaje de dos moléculas de histona H3 y dos moléculas de histona H4, que originaba un tetrámero. El ADN envolvía entonces al te trámero, entrando en contacto con las cuatro moléculas. (Felsenfeld, Alan P. Wolffe y Kensal E. Van Holde han confirmado la estabilidad del tetrámero, amén de mostrar que en muchos aspectos se comporta como un nucleosoma entero.) Otros trabajos prueban que esta estructura parcial dirige la adición subsiguiente de dos pares o dímeros de histonas H2A-H2B al tetrámero, incorporación que promueve, a su vez, el retorcimiento ulterior del ADN en torno al núcleo de la partícula. Bradford B. Baer y Daniela Rhodes han comprobado también que los nucleosomas desprovistos de sus dímeros H2A-H2B son menos eficaces que los intactos cuando se trata de bloquear la transcripción. A mayor abundamiento, Vaughn Jackson y Roger Chalkley señalan que las histonas H2A y H2B pueden disociarse fácilmente del tetrámero y transferirse de un nucleosoma a otro.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
3. LOS GENES COPIADOS SE I NSERTAN EN EL LOCUS MAT
4. LA ACTIVACION DE LOS GENES DE HMR a EN EL LOCUS MAT HACEN QUE LA CELULA PRODUZCA EL FACTOR “SEXUAL” a
FACTOR a
LOCUS DE CRUZAMIENTO EN RESERVA SIR 3
REGION SILENCIADORA
COLA DE H4
NUCLEOSOMA
PROTEINAS SIR PROTEINA NO IDENTIFICADA
REGION SILENCIADORA
3. CELULAS DE LEVADURA sorprendidas en el momento del cruzamiento ( fotogra fía de la izquierda) y después de la fusión ( fotografía de la derecha). Para que se produzca la fusión, el tipo “sexual” (o “sexo”) de una de las células tiene que ser alfa, y el de la otra a. Tres loci genéticos — HML-alfa, MAT y HMRa— en un mismo cromosoma (arriba) capacitan a las células de levadura para cambiar de un tipo “sexual” a otro. El cambio acontece cuando se eliminan (1) los genes del locus MAT y se reemplazan por un duplicado de los genes del HML —alfa o del HMRa ( 2 y 3), los llamados loci de cruzamiento en reserva. Los genes originales de estos loci silenciosos no están nunca activados, pero la inserción de sus duplicados permite que las copias se transcriban ( 4). Aquí los genes HMRa se han copiado en el locus MAT , con lo que la célula pasa a ser del tipo a. El detalle de la parte inferior muestra que un segmento de la cola de la histona H4 contribuye a mantener en silencio los loci en reserva de cruzamiento. La cola ejerce su efecto al interaccionar ( flechas interrumpidas ) con la proteína Sir 3, perteneciente a uno de los varios grupos de proteínas Sir (gris) que ayudan, a las secuencias silenciadoras de ADN situadas en ambos extremos de los loci (bandas blancas), a reprimir los genes dentro de esas regiones.
57
1. ETAPA DE ACTIVACION DEPENDIENTE DE HISTONAS NH2
PROTEINAS ACTIVADORAS
a
COLA DE H4 SITIO I SECUENCIA ACTIVADORA ADN ARRIBA
PARTICULA NUCLEO DE HISTONAS
CAJA TATA
H2A-H2B
b
COMPONENTES DE LA PARTICULA NUCLEO DISOCIADA
REGION CODIFICADORA
ARN POLIMERASA
ARN MENSAJERO
2. ETAPA DE ACTIVACION INDEPENDIENTE DE HISTONAS
4. EL MODELO EXPANDIDO DE LA ACTIVACION DEL GEN defiende la intervenci ón de las histonas en el proceso de transcripción que se desarrolla en las células. El modelo propone que, para que comience la transcripción, las proteínas activadoras (violeta en 1a) deben interaccionar directa o indirectamente ( flecha segmentada) con la cola de la histona H4 en la caja TATA (cinta delgada que emerge del núcleo de la partícula verde ). La interacción conduce a la disgregación parcial de la partícula nuclear por la razón verosímil de que se suelten H2A y H2B ( pequeños fragmentos verdes en 1b ). La disgregación conduce al ligamiento de la caja TATA a factores basales (complejo rojo) y a un nivel bajo de transcripción. El nivel máximo de transcripción se conseguiría de manera parecida a como lo sugiere el modelo del ADN desnudo para la activación del gen (2).
rición de los nucleosomas detrás de la polimerasa.
N
os sorprendió bastante ver que, al examinar las propiedades de los diferentes segmentos de la cola de la histona H4, éstos tenían a veces responsabilidades antagónicas. Así, mientras ciertos aminoácidos entre los números 4 y 23 se necesitan para la transcripción de varios genes, una parte de la cola participa en la represión de otros genes. Paul S. Kayne identificó una importante función inhibidora de la cola de la histona H4: ayuda a reprimir los loci de cruzamiento en reserva. Las le vaduras de cerveza poseen dos de estas regiones genéticas, que deben permanecer perpetuamente en silencio, ya que las células en las que se
58
encuentran activas se tornan incapacitadas para el cruzamiento, es decir, no pueden fundirse entre sí. Las células se cruzan cuando están en el estado haploide, aportando su juego de cromosomas. La fusión de dos células haploides engendra una célula diploide, algo semejante a lo que ocurre con la unión de un espermatozoo y un óvulo, que produce un embrión diploide, portador de su propia dotación de cromosomas, en la que están representadas tanto la aportación paterna como la materna. Kayne demostró que la deleción de los aminoácidos 15 a 19 de la cola de la histona H4 debilitaba grandemente la capacidad de apareamiento de las levaduras. La causa de ello yacía en la activación génica de regiones antes reprimidas. En nuestro laboratorio, y
también en los de M. Mitchell Smith y de Jack Szostak se ha visto que basta la deleción de un aminoácido de las posiciones 16 a 19 para que se produzca un efecto semejante. Así pues, la presencia de todo el conjunto de esos aminoácidos constituye una condición necesaria para mantener reprimidos los loci de cruzamiento en reserva. Lianna M. Johnson ha demostrado que la mayoría de los aminoácidos entre las posiciones 21 y 29 constituyen un requisito adicional para reprimir los mismos genes. Asimismo, ha comprobado que la sustitución de uno de dos aminoácidos presentes en la proteína Sir 3 puede contrarrestar el déficit de la capacidad de cruzamiento inducida por la mutación en H4. El cambio en la proteína Sir promovió la represión de los loci de cruzamiento en reserva y la estimulación del cruzamiento. El hecho de que un defecto en la histona H4 quede contrarrestado por un defecto en la proteína Sir apoya la idea de que la histona H4 y la proteína Sir intervienen de manera rutinaria en la represión de los loci de cruzamiento en reserva. Los loci de cruzamiento en reserva residen cerca de los extremos, o telómeros, del cromosoma III de la levadura. Para Daniel E. Gottschling las colas de la histona 4 están implicadas también en la represión de otros genes vecinos de los telómeros de la levadura. El grupo de Gottschling descubrió un fenómeno sorprendente: de las mutaciones de la H4 que levantan la represión de los loci de cruzamiento en reserva, algunas vencen la represión de genes insertados artificialmente en regiones próximas a los telómeros. Ocurre lo mismo con la carencia de proteínas Sir. En resumidas cuentas, los genes que residen cerca de los telómeros quedan maniatados como si se tratara de los loci de cruzamiento en reserva. Además de revelar nuev os detalles sobre el funcionamiento de las histonas, el análisis del cruzamiento nos ha proporcionado una poderosa herramienta para el estudio de las histonas. Un haz de defectos genéticos, que responde al nombre colectivo de mutaciones swi (del inglés “switch”, interruptor), bloquean la activación del gen de la levadura que codifica cierta enzima esencial para la determinación del tipo “sexual”. (La levadura puede corresponder al tipo a o al tipo alfa.) Ira Herskowitz ha obser vado la existencia de otras mutaciones (las sin) que anulan ese bloqueo; hay una mutación de éstas en el gen de la histona H3, señal de que la región
TEMAS 3
alterada de la histona H3 puede vadoras curso arriba del ADN, o inteninfluir sobre la actividad del gen. El sificadoras, están incluidas en los descubrimiento de otras mutaciones nucleosomas. ¿Cómo se las arreglan? sin acabará indicando posiblemente Apoyándonos en los descubrimienla existencia de segmentos regulado- tos de Helen M. Blau podríamos, con res adicionales de los genes de las lógica, responder que ciertas proteíhistonas. Esas mutaciones contribui- nas (tal vez distintas de los activadorán, sin duda, a identificar las proteí- res) logran desplazar de los intensifinas que controlan genes mediante su cadores a los nucleosomas. Cabe influjo en las histonas. también que los genes que la célula En esa misma onda, se ha obser- humana ha de activar en un momento vado en el laboratorio de Winston que y silenciar en otro (como ocurre con la los efectos de las mutaciones snf , mayoría de los genes de la levadura) generadas por Marian Carlson son porten intensificadores que persistan muy parecidos a los producidos por las en estado de alerta, prestos a intervemutaciones swi. Las proteínas deter- nir, exentos de nucleosomas. minadas por las versiones normales Hay que trabajar duro todavía de los genes mutados podrían facilitar antes de dominar los mecanismos de la liberación de los nucleosomas y, con acción celular de las histonas, trátese ello, quitar las trabas para la trans- de levaduras o de otros organismos. cripción. El esclarecimiento y análisis Sabemos ya lo suficiente para abjurar de las mutaciones swi, snf y otras que del viejo dogma que atribuía a la parafecten a la estructura de la croma- tícula nuclear de histonas un papel de tina se han convertido en objetivos bobina pasiva. Hemos probado, con prioritarios de la investigación en otros autores, que las tales partículas regulación génica. están capacitadas para activar y para Por ser la histona H3 semejante a reprimir genes. Las distintas histola histona H4 en muchos aspectos nas, así como los dominios específicos (incluido su patrón de acetilación y su dentro de sus moléculas, dan cuenta papel en la formación y estabilización de sus efectos. Y acariciamos la idea de los nucleosomas), es razonable de que ciertas proteínas reguladoras esperar que la cola de la histona H3 que colaboran con los ac tivadores concontrole genes a la manera de la cola trolen los genes al unirse específicade la histona H4. Podría, por ejemplo, mente al ADN y a ciertos dominios predecirse que la cola de la histona H 3 críticos de las histonas. participe en la supresión de los loci del Nos toca ahora recoger otro guante: apareamiento silencioso. Pero no lo descifrar las funciones que la hace. Más aún, Randall K. Mann ha naturaleza ha asignado a los pequemostrado que se requiere la cola de la ños segmentos del interior de los histona H3 para la represión de dominios histónicos e identificar qué muchos de los genes que, para proteínas interactúan con tales activarse, necesitan la cola de la his- segmentos. Muchos investigadores, tona H4. cuya inspiración permanecía aletarPara explicar por qué las histonas gada al enfrentarse con las histonas, H3 y H4 desempeñan esas funciones están hoy volcados de lleno a ese dispares, es obligado conocer mejor la esfuerzo. La exploración de la estrucinteracción entre dichas moléculas y tura de la cromatina se ha convertido otras proteínas, así como entre aqué- de repente en una nueva frontera, llas y el ADN. No se ha determinado sugerente y atractiva, del estudio de aún la función celular de las histonas la regulación génica. H2A y H2B, aunque sepamos que no se comportan igual que las histonas H3 y H4. BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA Buena parte de cuanto se conoce a N UCLEOSOME LOSS A CTIVATES YEAST propósito de la regulación génica por DOWNSTREAM PROMOTERS IN VIVO. Min las histonas procede de los estudios Han y Michael Grunstein en Cell, volurealizados con levaduras. En éstas, men 55, páginas 1137-1145; 23 de dilas secuencias activadoras curso ciembre de 1988. Y EAST HISTONE H4 N-TERMINAL SEQUENarriba del ADN permanecen, tal CE IS REQUIRED FOR P ROMOTER ACTIVAparece, exentas de nucleosomas. En TION IN VIVO. Linda K. Durrin, Randall las células humanas, una fracción K. Mann, Paul S. Kayne y Michael notable de la cromatina se encuentra Grunstein en Cell, vol. 65, págs. 1023en la conformación de 30 nanómetros. 1031; 14 de junio de 1991. Ello significa que, durante el deCHROMATIN AS AN ESSENTIAL PART OF THE TRANSCRIPTIONAL MECHANISM. Gary sarrollo de las células humanas, Felsenfeld en Nature, vol. 355, n.o 6357, podría reclamarse la activación de págs. 219-223; 16 de enero de 1992. algunos genes cuyas secuencias acti-
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
59
El gen de la histona H 1 Jovita Mezquita Pla Un gen que codifica la proteína responsable de la organización espacial de la cromatina y condiciona el estado de diferenciación de cada tipo celular
E
l ADN contiene, escrita en un alfabeto de cuatro letras, la información necesaria para que las células se desarrollen y dividan. La molécula de ADN proporciona, además, la base del proceso evolutivo que ha generado la ingente variedad de formas vivas que conocemos. El descubrimiento por James Watson y Francis Crick, en 1953, de la estructura en doble hélice del ADN permitió comprender de qué manera esta molécula almacenaba la información genética y cómo podían producirse múltiples copias de tal información. Cada una de las cuatro piezas básicas que constituyen la molécula de ADN, denominadas nucleótidos, contiene una de las cuatro bases nitrogenadas siguientes: adenina ( A), citosina (C), guanina (G) y timina (T ). Los nucleótidos se unen entre sí a través de dos tipos de enlaces: los enlaces covalentes fosfodiéster, que engarzan las posiciones 5 y 3 de dos nucleótidos formando una cadena, por ejemplo, 5 - ATGCAATTAGCG-3 , y las uniones no covalentes por puentes de hidrógeno entre las bases A-T y C-G, que acoplan la cadena constituida a otra complementaria; siguiendo con el ejemplo anterior, sería 3 -TACGTTAATCGC-5 . A través de estos enlaces, los nucleótidos van creando la doble cadena de ADN, que adopta una conformación helicoidal. En la cadena de nucleótidos hallamos escrita la información necesaria para programar el crecimiento y la diferenciación de las células. Cuando la doble cadena se abre al ′
′
′
′
′
JOVITA MEZQUITA PLA es profesora titular del Departamento de Ciencias Fisiológicas de la Facultad de Medicina de la Universidad de Barcelona, donde dirige la sección de ácidos nucleicos del grupo de Genética Molecular. Su principal línea actual de investigación versa sobre la expresión de genes en la línea germinal espermatogénica.
60
′
romperse los puentes de hidrógeno, la información codificada en las se cuencias de nucleótidos puede copiarse y llevarse a término. El tamaño de la molécula de ADN de doble hélice, variable, se cuenta por miles de millones de nucleótidos. Para acomodar una molécula de esas dimensiones en un volumen limitado como el del núcleo celular resulta imprescindible empaquetarla de una forma sumamente compacta. El empaquetamiento deberá ser, al propio tiempo, reversible a fin de que, en cualquier momento, la información contenida en determinadas secuencias sea accesible a los mecanismos de copia que conlleva la expresión genética. El empaquetamiento de la molécula de ADN en el núcleo celular corre a cargo de las histonas. Estas proteínas básicas forman con el ADN un complejo que en las preparaciones histológicas teñidas destaca por su aspecto coloreado, por cuya razón recibe el nombre de cromatina, que está constituida por ciertas unidades denominadas nucleosomas. Constan éstos de ocho moléculas de histonas —un par de cada uno de los cuatro tipos siguientes: H 4, H 3, H 2A y H 2B— y un segmento de ADN que las envuelve dando un par de vueltas a su alrededor. Una quinta histona, la H 1, de mayor tamaño que las anteriores, sella el par de vueltas que el ADN describe en torno a las histonas restantes y organiza a los nucleosomas en una estructura de orden superior: en la superestructura de la cromatina.
El carácter regular y la gran precisión con que las histonas organizan el ADN en los nuc leo somas que dan reflejados en la rigidez evolutiva con que se ha conservado la secuencia de esas proteínas. La superestructura de la cromatina varía en mayor medida que la subestructura nucleosómica, lo que posiblemente tenga que ver con una mayor flexibilidad en el mantenimiento de la secuencia de la histona H 1 a lo largo de la evolución.
L
as histonas H 1 presentan una conformación caracterizada por un dominio globular, la “cabeza”, y dos extremos extendidos, la “nariz” y la “cola”. La variación evolutiva de la histona H 1 se refleja principalmente en los extremos de la molécula, que se distinguen por su alto contenido en restos de lisina. Este aminoácido confiere a los extremos de la molécula un carácter policatiónico que es el responsable de su conformación desplegada y de su capacidad para interactuar con el ADN. La sustitución de lisinas por arginina, otro aminoácido de tamaño similar y asimismo dotado de carga positiva, aunque interactúa más intensamente con el ADN, confiere a las variantes de H 1 un mayor poder condensante. Cuando se afirma que las histonas H 1 se unen al ADN cooperativamente se quiere indicar que la unión de una molécula de H 1 resulta muy favorecida si antes se ha engarzado en la molécula de ADN otra histona H 1. La cooperación posibilita que un determi-
1. CONFORMACION DE LA HISTONA H 1. Esta proteína está constituida por una cabeza de conformación globular, que apenas ha sufrido cambios a lo largo de la evolución, y por dos extremos: la nariz y la cola. Más variables en su evolución, las dos últimas adoptan una conformación extendida; predominan en éstas los aminoácidos de carga positiva (lisinas). En la cola se encuentran las tres serinas, susceptibles de fosforilarse. En el esquema de la derecha se detalla la secuencia de aminoácidos de la molécula histónica, simbolizados con una letra: A, alanina; E, ácido glutámico: V, valina; P, prolina: K, lisina; G, glicina; S, serina; L, leucina; I, isoleucina; R, arginina; Y, tirosina; D, ácido aspártico; N, asparagina; T, treonina y Q, glutamina. Los aminoácidos con carga positiva se destacan en rojo y las serinas fosforiladas, en azul.
TEMAS 3
NARIZ
CABEZA
COLA
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
61
nado dominio del ADN se repliegue o expanda súbitamente. La expansión de un dominio es necesaria para la activación genética. La condensación del ADN provocada por las histonas H 1 puede intensificarse con la fosforilación de estas moléculas, fenómeno que se ha observado durante el proceso de división celular, cuando un segmento de ADN de cinco centímetros, por ejemplo, viene a recluirse en cinco micrómetros. El aminoácido fosforilado es la serina, resto situado estratégicamente en los dominios terminales de la histona H 1. La fosforilación permitiría el entrecruzamiento mediante interacciones electrostáticas de dichos dominios terminales.
cas, como la H 5, H 1o y la H 1t, en células que no se dividen, y, por último, hay variantes mínimas, detectadas en proporciones cambiantes, en diferentes tejidos. Conocemos esa extensa variabilidad de las histonas H 1 merced a los análisis electroforéticos y cromatográficos, que ponen de manifiesto diferencias en el tamaño y en la carga de estas proteínas. Ante la dificultad que implica verificar dicha variabilidad mediante la determinación de la secuencia de aminoácidos, nos propusimos caracterizar las variantes de la H 1 analizando la secuencia de sus genes. Ello permitiría, además, el estudio de las secuencias que regulan la expresión genética de esta proteína. Gracias a la introducción de las a función de las histonas H 1 podría regularse a través de modifi- técnicas de ingeniería genética y de caciones químicas de estas moléculas recombinación bacteriana se ha a van—pensemos en la fosforilación men- za do extraordinariamente en el cionada— y por histonas H 1 con dife- conocimiento de las secuencias de rentes secuencias de aminoácidos. La ADN y del significado de las mismas. cromatina de células distintas o dife- Llamamos gen al segmento de ADN rentes dominios de la cromatina de que contiene la información necesaria una misma célula podrían contener para copiarse en una secuencia de ARN variantes específicas de la histona H 1. (transcripción) que, a su vez, dará lugar, Esta posibilidad viene avalada por los en muchos casos, a una secuencia de hechos siguientes: la H 1 es la histona aminoácidos, es decir, a un péptido o que ha desarrollado una más amplia a una proteína; este último proceso variabilidad a lo largo de la evolución; recibe el nombre de traducción. Igual que el ADN, el ARN es un se han observado variantes de esa histona durante la diferenciación polímero lineal de nucleótidos; distíncelular, en respuesta a la estimulación guese de aquél, sin embargo, en que hormonal y en células transformadas; posee la base uracilo (U ) en el lugar existen variantes extremas específi- de la base timina y en contener ribosa
L
en vez de desoxirribosa. La secuencia del ARN, formada con las bases A, U , C y G, surge de la copia de determinados segmentos del ADN de acuerdo con el principio de complementariedad: A se copia en U , T en A, C en G y ésta en C. Para ello, la doble hélice se abre en sus dos hebras componentes, una de las cuales se copiará en ARN. Terminada la fase de transcripción, o copia, el ADN torna a enhebrar la doble hélice, en tanto que e l ARN permanece en su configuración de cadena única. El ARN podrá dar lugar a la síntesis de una proteína en el proceso de traducción, en el que cada triplete nucleotídico o codon se encarga de la incorporación de un aminoácido, estableciéndose así una secuencia de aminoácidos o proteína.
E
n el genoma, los genes pueden encontrarse aislados, y se transcriben por separado, o bien encontrar se en un determinado dominio, transcribiéndose conjuntamente. Otras veces, los genes se presentan reunidos formando un conjunto, y cada gen del conjunto se transcribe por separado, aunque puedan hacerlo de una manera coordinada. Los genes de las histonas se disponen en el genoma formando un conjunto o “cluster”. Las investigaciones que condujeron a la determinación del gen de la histona H 1 las llevamos a cabo en el departamento de bioquímica médica de la Universidad de Calgary, bajo la dirección del profesor Gordon H. Dixon. El modelo utilizado fue la trucha arco iris ( Salmo gairdnerii ). Junto T T C A T G a la determinación de la secuencia del C T G N gen de la histona H 1 abordamos un A T A G C D T G C A A proyecto más amplio, en colaboración G T G A C G A C con Wayne Connor y Robert J. WinkA C fein, del mismo laboratorio, en el que secuenciamos un segmento del genoma de la trucha que contenía el conjunto N de los genes de las histonas. D A Nos servimos de una genoteca de C G G T T C T C G G G T T T C T T C C A C T T C trucha construida en el vector lambda Charon 4A. (Una genoteca es una G C C A A G A G C C C A A A G A A G G U G A A G m colección de fragmentos de ADN repre N R sentativos del genoma entero, inser A tados en un vector, que suele ser un fago capaz de replicarse en una bacteria y multiplicar así el ADN introdu A A A A N A A A A A I N N I cido.) Utilizando enzimas de restric I N N N I N N N E I L I I I I N T L R S S S S O A I I I I A E O ción, enzimas que reconocen secuencias L R L L L L V S R A P de cuatro a seis pares de bases, se P puede cortar el ADN genómico y el 2. DOBLE HELlCE DE ADN con sus nucleótidos complementarios unidos por enla- ADN del fago, para reconstruir luego ces de hidrógeno. Ciertos segmentos de ADN se transcriben en moléculas de ARN. moléculas híbridas del fago con cada Algunas de éstas, los ARNm, dan lugar, por traducción, a moléculas proteicas. Cada uno de los fragmentos del genoma. tres nucleótidos sucesivos (codon o triplete) determinan un aminoácido. La figura Estas moléculas híbridas de genoma ilustra parte de la secuencia del gen de la histona H 1 de la trucha, su transcripción y fago pueden empaquetarse in vitro y su traducción en proteína. En rojo se destaca un pentapéptido que se repite tres y construir así partículas viables de veces en la secuencia de la histona.
62
TEMAS 3
ENZIMA Eco RI bacteriófago que, en presencia de células bacterianas en cultivo, se multipli5’ G A AT T C 3’ carán produciendo círculos claros, las 3’ C T T A A G 5’ placas de lisis, que destacan de entre las zonas de bacterias intactas. De este modo se puede disponer de un número de placas de lisis que, en con- 5’ G AATTC junto, representa la genoteca. Cada 3’ C T T A A G placa de lisis contiene moléculas recombinantes idénticas o clones. Por simple contacto de estas placas con un ENZIMA Hae III filtro de nitrocelulosa o con una membrana de nailon se puede transferir 3’ 5’ GGCC suficiente cantidad de ADN para pro5’ CCGG 3’ ceder a la selección de clones de interés, en nuestro caso clones portadores de genes de histonas. La selección se 5’ GG CC realiza por hibridación del ADN, des3’ CC GG naturalizado previamente (es decir, con sus dos cadenas separadas), con fragmentos de ADN, también desnaENZIMA Sst I turalizados, que tengan el suficiente grado de complementariedad: son las GAGCTC 3’ 5’ llamadas sondas. La genoteca de truC T C G A G 5’ 3’ cha se hibridó inicialmente con una sonda del gen H 4 de Xenopus ; dado que esta histona se ha mante nido casi inalterada a lo largo de la evolución 5’ GAGCT C biológica, cabía esperar que la homo- 3’ C T C G A G logía en el ADN fuese estrecha. Con esta sonda se detectaron 35 clo- 3. ACCION DE LAS ENZIMAS DE RESTRICClON sobre la molécula del ácido desoxirribonucleico. Esas enzimas reconocen secuencias cortas, de cuatro a seis pares nes positivos. Se multiplicó una docena de bases sucesivas (azul). La secuencia reconocida por la enzima se fragmenta de de ellos para preparar ADN y caracforma simétrica o asimétrica; en el último caso se generan extremos de cadena terizarlo. Se empezó por construir el simple. La figura recoge las secuencias reconocidas y cortadas por las enzimas: EcoR1, Hae III y Sst1. La enzima EcoR1 genera un extremo 5 libre, mientras que la mapa de restricción de cada ADN. Las enzimas de restricción permitían loca- enzima Sst1 da lugar a un extremo 3 libre. lizar las secuencias por ellas reconocidas. Las enzimas más útiles para construir el mapa de restricción eran las había un gran parecido en la organi- corría el riesgo de que se uniera a que cortaban pocas veces, esto es, las zación de estos clones, con identidad secuencias poco específicas. Era una que reconocían secuencias de ADN en el mapa de restricción en una situación típica de estringencia baja poco frecuentes. Con cada enzima, o extensión de 10 kilobases. Uno de los de la hibridación. La hibridación de fragmentos del mediante la combinación de dos, se clones, el lambda TH 3, difiere algo, y clon lambda TH 2 con la sonda H 1 de digería el ADN (es decir, se fragmen- a él nos referiremos más adelante. Vayamo s al seg undo paso en la Dro sop hila mostraba un resultado taba) y se determinaba en geles de agarosa el tamaño de los fragmentos caracterización. Consistió en determi- que variaba desde la ausencia de banproducidos. En esos geles, la movilidad nar la localización exacta de cada ge n das en condiciones de relativa estrindepende del tamaño y se expresa en de las histonas dentro del conjunto. gencia hasta la aparición de varias pares de bases (pb) o en miles de pares Sondas construidas con genes de his- bandas positivas cuando se reducía la de bases (kilobases, Kb). Para determi- tonas de Xenopus , erizo de mar y Dro- estringencia. Para ver si los fragmennar esos tamaños se separaban para- sophila resultaron adecuadas para la tos positivos contenían el gen H 1, lelamente, en la misma electroforesis, localización de los genes H 3, H 4 y secuenciamos los que hibridaban con fragmentos de ADN de tamaño cono- H 2B. El gen H 1 oponía una dura resis- mayor intensidad; ante nuestra sortencia a su localización con una sonda presa, observamos que estábamos cido (marcadores). de un gen H 1 de Drosophila . Variando secuenciando el gen H 2A, todavía no as bandas de ADN separadas se la temperatura o la concentración, o localizado. La localización del gen H 1 visualizaban con luz ultravioleta, ambas, durante la hibridación y el se consiguió finalmente con una sonda después de teñir el gel con bromuro de lavado, lográbase modificar la unión H 1 de tritón. En todos los clones se encontraron etidio. Averiguado el tamaño de los de la sonda con secuencias sólo parcialmente complementarias. Realilas cinco histonas, en el siguiente fragmentos generados por las enzimas de restricción, se construyó el mapa zando la hibridación a temperaturas orden: H 4- H 2B- H 1- H 2A- H 3, orientapor superposición de los mismos. Para bajas de 37 a 40 grados C y a una das en el mismo sentido. El que la determinar el mapa de restricción de fuerza iónica elevada (0,9 molar), y orientación de los genes sea la misma los clones que presentaban los genes la vando posteriormente a tempera- significa que la información que codide las histonas se utilizaron las enzi- tura ambiente y sin disminuir la con- fican, a diferencia de lo que ocurre en mas Eco R1, Bam H 1, Xho1 y Sst1. Los centración de sal, la hibridación de la otros conjuntos de genes de histonas, resultados pusieron de manifiesto que sonda resultaba ser mayor, aunque se se halla en la misma cadena de ADN. ′
′
L
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
63
3’ 5’
3’ 5’
3’ 5’
ADN GENOMICO
BACTERIOFAGO
DIGESTION PARCIAL CON Eco RI
CORTAR CON Eco RI ELIMINAR PIEZA CENTRAL
PIEZAS GENOMICAS
BRAZOS DE BACTERIOFAGO
MEZCLAR Y LIGAR
ADN RECOMBINANTE
EMPAQUETAMIENTO “IN VITRO”
INFECCION Y LISIS
BACTERIA
TRANSFERIR ADN A MEMBRANA Y DESNATURALIZAR
HIBRIDAR
LAVAR Y HACER AUTORRADIOGRAFIA
64
Para la secuenciación de estos genes, que constituían un total de 7000 pares de bases, se siguió el procedimiento de Maxam y Gilbert, que explicaremos inmediatamente. A tal fin hubo que volver a clonar determinados fragmentos de ADN en un vector distinto del lambda Charon 4A. La secuencia se obtuvo a partir del clon lambda TH2, que contiene el conjunto de genes de las histonas en un fragmento del genoma, de unas diez kilobases, inserto en un vector de unas 30 Kb. Para la secuenciación era conveniente simplificar la complejidad de ese sistema y reconstruir moléculas recombinantes en que tanto el ADN insertado como el vector tuviesen tamaños mucho menores. Seleccionamos, con enzimas de restricción, fragmentos de parte o de la totalidad de cada gen. Tales fragmentos, que se obtenían como moléculas biológicamente activas a partir de geles de agarosa, se introdujeron en un vector pequeño, de unas cuatro kilobases: el vector pBR322. Se trata de un plásmido capaz de replicarse en una bacteria con independencia del genoma de esta última. Contiene, además, una secuencia que le confiere resistencia a la penicilina, y que nos permitía seleccionar las bacterias que transportaban el plásmido o el híbrido recombinante, ya que en presencia de penicilina no crecen las demás bacterias. De esta forma se multiplicaron las moléculas recombinantes en un vector pequeño, consiguiéndose cantidades de ADN del orden del miligramo. Para la inserción de los fragmentos de interés en el vector, los extremos de ambos ADN han de disponer de terminaciones compatibles, generadas 4. CONSTRUCCION de una genoteca y aislamiento, a partir de la misma, de clones que contienen secuencias específicas. La parte central de la molécula de ADN del bacteriófago lambda es sustituible por fragmentos de ADN genómico, de tamaño comprendido entre 10 y 20 kilobases. La molécula recombinante que resulta puede empaquetarse in vitro; es decir, en presencia de proteínas específicas que forman una cápside, el ADN dará lugar a partículas del bacteriófago lambda y podrá infectar una bacteria. Una vez introducido el ADN en la bacteria, se multiplicará allí por replicación, produciéndose múltiples copias de ADN y partículas víricas que matarán la bacteria por lisis. Cada bacteria es infectada por un solo bacteriófago y, según la proporción de bacterias infectadas, se formará un número variable de placas de lisis. Las placas de lisis que alojan clones de interés se identifican por autorradiografía, después de desnaturalizar el ADN, trans ferir lo a una membra na e hibridarlo con la sonda pertinente.
TEMAS 3
con enzimas de restricción. En la construcción de subclones H 1 no siempre lográbamos que la enzima cortase el fragmento de interés y el vector. Recurríamos entonces a los ligadores (“linkers”), moléculas de una decena de pares de bases que se acoplaban a los extremos del ADN y que contenía n el sitio de restricción adecuado.
I R I
o t c s E S
I R I
o t c s E S
I H
m a B
I H
m a B
I I I
I R
I o o o o t s h h h c S X X X E
I I I
I R
I t I o o o o t s s h h h c S S X X X E
E
l método de secuenciación de Maxam y Gilbert comprende varias etapas. La primera consiste en cortar I I I I H I I I R I R I t I o o o R el ADN con una enzima de restricción m o t t o o c s a s s h h h c c E S B S S X X X E E que produzca extremos 5 que se proyecten libres, como en el caso de EcoR 1. Conviene que el grupo 5 fosfato se proyecte libre para el desarrollo de las reacciones que se suce I I I I H den a continuación; en efecto, su ren I I I R R I I I I t I o o o R m o t t o t t o c s s c s a s s h h h c dimiento cae drásticamente cuando el E S S E S B S S X X X E fosfato 5 queda dentro de la doble cadena de ADN; las reacciones en cuestión son dos: una defosforilación a cargo de una fosfatasa que elimina I I I I el grupo fosfato y una fosforilación que H I I I I R R I I I I I t I o o o R m o o t t t o t t o incorpora fósforo radiactivo P32 a par c h s s s c s a s s h h h c E X S S S E S B S S X X X E tir de ATP(P32) y una enzima quinasa. Se producen así dos extremos marcados radiactivamente, uno de los cuales se elimina con una segunda enzima de I restricción. El ADN, marcado en un I I I H I I I R R I I t I o o o R m o o t t o solo extremo, se reparte en cuatro c c s a s s h h h c E E S B S S X X X E muestras, cada una de las cuales se procesará con un reactivo químico que destruye, selectivamente, una o dos bases de ADN. Se controla el tiempo de la rea cción, I I I I H H I I I R I en general intervalos breves de varios I t I o o o R I m m o t t o t c s a s s h h h c s a minutos, para que las reacciones sean E S B S S X X X E S B parciales y se produzca una proporción adecuada de cada tipo de modificación posible. Sólo los fragmentos que conecten con el extremo radiacti vo 5. MAPA DE RESTRICCION de los clones con genes de histonas, en este caso genes aparecerán en las autorradiografías, de histonas de trucha. Se muestra la localización de las secuencias reconocidas por con lo que el proceso queda simplificado las enzimas EcoR1, BamH1 y Xho1. Obsérvese la identidad en el mapa de restricción a lo que ocurra a tales fragmentos de la región EcoR1-EcoR1 central que contiene los genes de las cinco histonas. El marcados. Los fragmentos comple- clon lambda TH3, que se muestra en la parte superior de la figura, presenta ciertas mentarios se separan por desnatura- diferencias, como es la ausencia de una de las secuencias de Sst1; viene, a continualización. Separando por electroforesis ción, el clon lambda TH2, a partir del cual se secuenciaron los genes de las hist onas; por último, se ofrecen otros clones, que se caracterizan por contener, en los extreen gel de poliacrilamida los productos mos, fragmentos EcoR1-EcoR1 adicionales. de las cuatro reacciones químicas, se pueden observar bandas escalonadas, que difieren una de otra en un solo del gen consta de 206 restos, distri- otro codon de lisina. Bastaría sustinucleótido. Para determinar la buidos en los tres dominios estructu- tuir el nucleótido central ( AAG por secuencia, se leen las bandas sucesi- rales típicos de estas proteínas; abun- AGG o AAA por AGA) para obtener un vas equivalentes al nucleótido modifi- dan las lisinas y alaninas y escasean triplete de arginina: AGG , AGA . El cado en cada carril. La resolución con las argininas. Al parecer, un conte- hecho de que, no obstante la fácil susque se separan los fragmentos dismi- nido alto en lisinas (63 en esta H 1) y titución de un triplete por otro, se nuye al aumentar su tamaño. Para bajo en argininas (un par) resulta fun- mantenga el codon de lisina en esta secuenciar el gen H 1 entero por este damental para ciertas H 1, mientras H 1 abona la hipótesis de una fuerte procedimiento hubo que ampliar su que en otras variantes lo caracterís- selección en favor de la lisina en un mapa de restricción a fin de disponer tico es lo contrario, una mayor propor- grupo de histonas H 1. Asimismo, ción de argininas y menos lisinas. sugiere que ambos aminoácidos, lisina de sitios adecuadamente localizados. En este gen, de las 63 lisinas, 57 y arginina, aunque muy similares en ¿Cuáles son las características estructurales del gen H 1 secuenciado? están determinadas por el triplete tamaño y carga, deben cumplir una La secuencia de aminoácidos deducida AAG y sólo seis por el triplete AAA, el función muy distinta en su interac′
′
′
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
65
I R
o c E
ción con el ADN en la cromatina. En el extremo final de la molécula hallamos, triplicada, la secuencia lys-serpro-lys-lys, pentapéptido cuyas serinas se fosforilan durante el proceso de división celular.
H4
En un gen eucariota, la región codificadora de una secuencia de nucleótidos se inicia siempre con el triplete AT G , equivalente al aminoácido metionina, y acaba con un triplete de terminación: TAA, TAG o TGA. En el
H2B
H1
H2A
H3
a E
B
N
L
C
E
gen H 1, el codon de terminación es TAA. Por delante y por detrás de esta región codificadora se hallan las secuencias reguladoras. En el gen H 1, 127 pares de bases antes del codon metionina (posición –27) se encuentra la secuencia TTTAA, que sería el equi valente a una secuencia promotora (TATAA) de otros genes. Estas secuencias, reconocidas por la enzima ARN polimerasa II —responsable de la transcripción del ADN—, dirigen a dicha enzima, con precisión, hacia el lugar donde se iniciará la transcripción y garantizan que esto ocurra de forma eficiente.
S
e desconoce la repercusión exacta que pueda tener en esta secuencia la sustitución de una A por una T , aunB C que no se descarta que afecte al rendimiento de la transcripción. En la posición –31 se ubica la secuencia alternante repetida GTGTGTGTGTTT , cuyo B C significado se desconoce. La secuencia AAACA CA, descrita como elemento específico de los genes H 1 por L. S. PLASMIDO Coles y J. R. E. Wells, aparece dos veces en este gen H 1, en las posiciones –206 (aga AAACACAag) y –733 (aaga AAACACAca). La transcripción del gen H 1 comienza con la secuencia AATAG en posición –93. Este sitio de iniciación u origen B C del ARN se determina preparando piezas genómicas complementarias a la región 5 del ARNm. Las piezas preparadas eran de dos tamaños: las pequeñas, de unos 100 nucleótidos, no sobrepasaban el origen del ARNm (fragmento 1); las más largas sobrepasaban dicho origen (fragmento 2). Ambos fragmentos se marcaron en su extremo 5 . En N el caso de fragmento 1, la pieza se C extendió con la enzima transcriptasa inversa hasta alcanzar el origen del ARNm. En el caso del fragmento 2, la pieza se cortó con nucleasa S1, enzima N que actúa sobre el ADN de cadena única y, por consiguiente, digería el ADN que rebasaba el sitio de iniciación. El segmento final de ADN, obtenido en ambas condiciones, se caracterizó en geles de acrilamida, visuaN C lizándolo por autorradiografía. Al igual que ocurre en los otros genes de las histonas, inmediatamente después de la región codificada se halla la secuencia 5 -GGCTCTTTTAA GAGCCAC-3 , formada por dos mita6. CONSTRUCCION DE SUBCLONES a partir de fragmentos de ADN del clon lamb- des complementarias entre sí. Dicha secuencia señala la terminación del da TH2. En la parte superior de la figura se muestra la posición relativa de los cinco genes de histonas: H 4, H 2B, H 1 y H 3; debajo de los mismos, uno de los frag- ARNm. A una distancia de 15 y 28 mentos seleccionados para la construcción de subclones del gen de la histona H 1. nucleótidos encontramos, respectivaEn uno de esos subclones se insertó el fragmento B-C ( BamH1-Cla1) en los sitios de mente, las secuencias AAA AGC y restricción BamH1 y Cla1 del vector pBR322. Otro de los subclones se construyó a , esta última duplicada. El ATTCCA partir de este último, eliminando parte de la molécula, al cortar con N (Nco1) y re ARNm del gen H 1 se transcribiría ligar el fragmento que contenía la inserción. a
′
′
′
′
66
TEMAS 3
DOBLE CADENA DE ADN
G
G+A
T+C
C
T G
CORTAR Y MARCAR LOS EXTREMOS
T G T
CORTAR Y SEPARAR LAS PIEZAS
G A A
AISLAR LA CADENA MARCADA
T
DESECHAR
G T TRATAR CADA MUESTRA CON UN REACTIVO QUIMICO QUE ACTUA SELECTIVAMENTE SOBRE LA BASE INDICADA
T G
G
A
T
C
T G A T G C CONTROLAR LA REACCION PARA QUE SE GENEREN FRAGMENTOS A PARTIR DE CADA POSICION C
C
G
T
A
G
T
C A
CADENA ANALIZADA
G
SEPARACION DE FRAGMENTOS POR TAMAÑO EN ELECTROFORESIS Y VISUALIZACION POR AUTORRADIOGRAFIA G R O Y A M
A
T
T C
C
CCGTAGT
A
G CCGTAG
G
T
CCGTA
G CCGT
A I C N E U C E S
A CCG
T
CC C
7. SECUENCIACION por el método de Maxam y Gilbert. Se corta el ADN mediante una enzima de restricción y se marcan los extremos 5 fosfato con fósforo radiactivo (P32). El fragmento así marcado se corta de nuevo con una segunda enzima de restricción y se aísla el ADN que se va a secuenciar, que se hallará marcado radiactivamente sólo en uno de sus extremos. Este fragmento se somete, por separado, a la acción de cuatro reactivos químicos distintos, que actuarán selectivamente sobre las bases G, A, T y C, modificando una proporción variable de las mismas para dar lugar a un conjunto de moléculas de ′
C
todos los tamaños posibles, cortadas específicament e en el nivel de las bases señaladas. Los fragmentos resultantes se separan en geles de acrilamida y los que son radiactivos, por conectar con el extremo 5 , quedan patentes en la autorradiografía. Las bandas en cuestión aparecen escalonadas y difieren una de la inmediata siguiente en un nucleótido. La lectura de esta escalera, desde el final del gel, donde se alojan los fragmentos más próximos al extremo marcado 5 , y en sentido ascendente, nos da la secuencia en la dirección 5 –3 . A la derecha se muestra la autorradiografía de un segmento de la secuencia del gen H 1. ′
sobrepasando todas estas secuencias, ARNm procedentes de extractos hepáhasta una longitud desconocida, para ticos, renales y testiculares, separaser luego procesado, es decir, cortado, dos de acuerdo con su respectivo a través de un mecanismo en el que tamaño en geles de agarosa y transestas secuencias servirían de señales feridos a una membrana de nailon, de reconocimiento. mostraron, tras hibridarlos con la ¿Se transcribe el gen H 1 in vivo? sonda del gen H 1, una sola banda; Los estudios que realizamos con ésta destaca en el extracto gonadal,
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
C A
G
R O N E M
A
′
′
′
es mucho menos intensa e n el riñón y resulta mínima en el extracto de tejido hepático. Tales datos señalan que no existe heterogeneidad en lo relativo a tamaños moleculares, o bien que, si hubiera ARNm del gen H 1 de distinto tamaño, éstos no hibridarían con la sonda utilizada.
67
68
TEMAS 3
Ante los hechos obse rvados cabe preguntarse sobre el posible polimorfismo del gen H 1 en la trucha arco iris. Entre las variantes reseñadas de H 1, algunas —pensemos en la H 5— difieren tanto que pueden considerarse incluso como no pertenecientes a la familia del gen H 1. El gen H 5 se caracteriza, además, por encontrarse aislado en el genoma, es decir, sin formar parte del conjunto de genes de las histonas. ¿Existen en el genoma de la trucha variantes del gen de la histona H 1 que no formen parte del con junto?
P
ara resolver esa cuestión se digirió el ADN genómico con enzimas de restricción. Ello nos aclararía si era posible obtener algún fragmento que, presentando un gen H 1, se distinguiera nítidamente de los fragmentos portadores del gen H 1 en los clones analizados. Utilizando genomas procedentes de truchas distintas o de tejidos distintos, los resultados indicaron siempre que los fragmentos que hibridaban con la sonda H 1 eran los esperados a tenor del mapa de restricción de los clones conocidos. Además, el número de copias H 1 encontrado en el genoma de la trucha (unas 145) coincidía con el número de copias hallado para los otros genes de histonas. Los resultados daban pie a dos posibles interpretaciones: que los genes H 1 variantes estuvieran en los clones caracterizados sin que las diferencias aparecieran en las cortas secuencias reconocidas por las enzimas de restricción o que las diferencias de secuencia en las variantes H 1 bastaran para que no hibridaran con la sonda del gen H 1 secuenciado. Seyedin y Cole describieron, en 1981, variantes de la proteína H 1 en la trucha, sirviéndose de la separación cromatográfica. En extractos de hígado aparecían seis picos cromatográficos, ocho en el riñón y uno solo en el tejido testicular. En 1977, McLeod y colaboradores, trabajando en el mismo laboratorio de Gordon H. Dixon, habían obtenido la secuencia proteica de la histona H 1 de
testículo de trucha. Comparando la su expresión genética diferencial. secuencia encontrada por McLeod con Siendo, como se ha dicho anteriorla deducida del gen secuenciado, se mente, la histona H 1 la que controla observan ciertas diferencias en las la superestructura de la cromatina, regiones menos conservadas de la de la mano de esa proteína puede recomolécula. En el extremo inicial: serina rrerse un doble camino: el de la exprepor alanina, alanina por serina en dos sión genética del gen a la histona, y la posiciones, alanina por isoleucina y vía inversa, de la histona al gen. En glicina por valina; en la parte globular este último caso se trata de descifrar se registra un solo cambio, ácido glu- el papel que esta proteína ejerce contámico por glutamina; en la cola, las trolando la accesibilidad de los genes diferencias consisten en reorganiza- en la cromatina a la maquinaria mociones de fragmentos de secuencia lecular responsable de su expresión idéntica y en la presencia de un pép- fenotípica. tido adicional de 12 aminoácidos en el gen secuenciado. Existe la posibilidad ara estas investigaciones, la líde que variantes de este tipo, con nea germinal espermatogénica modificaciones en unos cuantos ami- es tudiada en nuestro laboratorio noácidos, se den y se organicen en el constituye un modelo ideal. A lo largo genoma, de forma idéntica a la de los de la espermatogénesis ocurren camclones caracterizados. bios drásticos en la estructura y fun¿Qué sucede con el clon lambda ción del genoma que se acompañan TH3? Este difiere del resto de clones de cambios cualitativos y cuantitapor haber perdido un sitio de restric- tivos en las histonas H 1. Las implición en la región codificadora del gen caciones de los avances en el conode la histona H 1. Nos preguntamos si cimiento de los mecanismos de se trataba de una variante H 1 y expresión genética para descifrar los secuenciamos por entero la región del procesos que conducen a la diferenclon correspondiente a esta histona. ciación de las células normales o a su Descubrimos que se trataba de un gen transformación cancerosa resultan con una deleción, es decir, carente de evidentes. Pero, además, el modelo parte de la secuencia, justamente la investigado permitirá, utilizando el que corresponde a la nariz y a la parte genoma de la línea germinal como globular. Sólo quedan 177 pares de hilo de Ariadna, llegar hasta los bases que codifican la cola de la H 1 y mecanismos que programan el delas secuencias reguladoras de los sarrollo embriológico y que se encuenextremos 5 y 3 . El hecho de que sea tran en la base de las futuras caracla cola de la proteína H 1 la responsable terísticas fisiológicas o patológicas de que esta histona entre en el núcleo del individuo y la especie. y el que secuencias parecidas a esta cola estén implicadas en la introducción de otras proteínas en el núcleo plantean una cuestión del máximo BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA interés: ¿desempeña la cola alguna HISTONE GENES STRUCTURE , ORGANIZAfunción in vivo? No podemos contestar TION & R EGULATION. Dirigido por G. S. mientras no se detecte el gen, tal como Stein, J. L. Stein y W. F. Marzluff. John se encuentra en el clon lambda TH3, Wiley & Sons, 1984. en el genoma o en el ARNm. ORGANIZATION OF THE H ISTONE G ENES IN Estas investigaciones y otras poste ALMO GAIRDNE THE RAINBOW TROUT (S riores realizadas en el Laboratorio de RII ) . W. Connor, J. Mezquita, R. J. Genética Molecular de la Facultad de Winkfein, J. C. States y G. H. Dixon en Journal of Molecular Evolution, vol. 20, Medicina de la Universidad de Barpágs. 227-235; 1984. celona se encaminan a completar la ORGANIZATION AND NUCLEOTIDE SEQUENcaracterización de los genes de la hisCE OF RAINBOW TROUT HISTONE H 2A tona H 1 con el objeto de poder abordar AND H 3. W. Connor, J. C. States, J. Mez-
P
′
′
8. GEN DE LA HISTONA H 1. La región codificadora se inicia con el triplete ATG; a éste le siguen los demás tripletes que se traducirán en la secuencia de la proteína H 1. El final de la región codificadora se reconoce por el triplete TAA. Delante y detrás de dicha región aparecen las secuencias que pueden desempeñar una función reguladora; en la región 5 , la secuencia promotora TTTAA, las secuencias específicas de los genes H 1, AGAAAACACA y la secuencia alternante GTGTGTGTGT . En la región 3 , la secuencia de 16 nucleótidos GGCTCTTTTAAGAGCC, con dos mitades complementarias de siete nucleótidos, marca el final de la molécula de ARNm. Las secuencias que siguen a esta región 3 se cortarán después de la transcripción por un mecanismo en el que se hallan implicadas, probablemente, las secuencias AAAAGCGC y TTCCA. En azul se representan las secuencias que sólo existen en el gen o que son eliminadas del ARNm antes de la traducción. ′
′
′
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
quita y G. H. Dixon en Journal of Molecular Evolution, vol. 20, págs. 23ó250; 1984.
AN H 1 HISTONE GENE FROM R AINBOW ALMO GAIRDNERII ). J. Mezquita, TROUT (S
W. Connor, R. J. Winkfein y G. H. Dixon en Journal of Molecular Evolution, vol. 21, págs. 209-219; 1985.
HISTONE H 4 AND H 2B GENES IN RAINBOW T ROUT (S AL MO GAIRDNERII ) . R. J.
Winkfein, W. Connor, J. Mezquita y G. H. Dixon en Journal of Molecular Evolution, vol. 22, págs. 1-19; 1985. 69
Antonio García-Bellido Génesis y desarrollo de una nueva ciencia
N
o aparece en las negritas de las gacetillas sedicentes de Drosophila melanogaster , que defendí en la Universidad culturales. Ni es de cuna aristocrática, aunque lo Complutense en 1962. Y me casé.” No da por terminada su sugieran sus apellidos realengos, García-Bellido y fase de formación. Con María Paz Capdevila, su mujer y, García de Diego. Tiene, por contra, a sus espaldas, anchas andando el tiempo, compañera de investigación, se marcha espaldas, una herencia de saber de rara singularidad en la al Instituto de Anatomía Comparada de la Universidad de España contemporánea. Hijo de iberista afamado, nieto de Zurich para trabajar con E. Hadorn; ha empezado ya a publicar en alemán algunos artículos sobre fisiología y diferencialexicógrafo famoso y hasta cuñado de experto filólogo. Buscar la raíz de las cosas —llámense fundación de colo- ción celular, que remata con el escrito, en colaboración con nias foceas del Mediterráneo occidental o establecimiento de Hadorn, sobre proliferación de cultivos celulares de castros astures, derivación de este participio del español de Drosophila. Hita o etimología de aquel aoristo griego— debió ser preo“Volvimos a España en 1965 y, después de unos meses, cupación familiar que hubo de compartir, como si algo suyo empecé mi segundo período posdoctoral en el Instituto de Tecnología de California.” Los dos años que transcurren aquí fuera, en los años menesterosos de la posguerra. Antonio García-Bellido nació en Madrid en 1936. “En la con A. H. Sturtevant y E. Lewis no son de mero discente. biblioteca de mi padre, enriquecida además con la del “Sturt”, del mítico trío (con Bridges y Muller) que apuntala paleontólogo Hugo Obermaier que nos la legó, había libros la escuela de Morgan, es ya un anciano, “muy brioso que no de divulgación cientíse perdía ninguna lecfica. De su lectura surción del seminario donde gió mi vocación por la yo exponía lo que estábamos realizando en biolobiología del desarrollo; el cómo y el porqué se gía del desarrollo en hace un organismo a Europa. Era quizás el más capacitado para partir de un huevo.” García-Bellido entra a maravillarse ante el deslos diecisiete años en la pliegue y transformación celular, fenómenos desUniversidad de Madrid, de donde sale licenciado conocidos para los acosen biología a los 22. tumbrados a trabajar en No existió en la cortes histológicos fijaEspaña de la primera dos”. mitad del siglo una línea García-Bellido esboza investigadora sostenida ya lo que será su teoría apogenética del deen el campo de la genética, por más que figuras sarrollo, enfoque alteraisladas (Fernández nativo a la explicación Nonídez y, sobre todo, Antonio García-Bellido inició una nueva línea de la genética atraído por el clásica o epigenética; de Antonio de Zulueta) rea- cómo y el porqué se hace un organismo a partir de un huevo acuerdo con esta última, lizaran algunos trabajos en las células embrionadecorosos. Pero es una genética morganiana, estática, que rias iniciales los campos morfogenéticos de regulación defiatiende a la relación de vecindad de los genes en el cromo- nidos por distribución de morfógenos determinan la diferensoma o su estructura interna. ciación de células genéticamente iguales o inespecíficas. En la tesis apogenética de García-Bellido, el genoma activo de García-Bellido le interesaba, por contra, de qué modo cada célula determina un comportamiento celular específico, los genes van configurando paso a paso el organismo y corresponde a éste organizar las células en sistemas supraembrionario, la morfogénesis. Se recibía en sus años estu- celulares. diantiles, y se recibe, una enseñanza dogmática, de apuntes. Tal visión fisiológica del desarrollo la ha ido consolidando Enfrascarse en el laboratorio o consultar otras fuentes podía en las seis áreas de investigación donde ha demostrado un acarrear varapalos inmisericordes, como el suspenso en gené- interés mayor: bases genéticas del reconocimiento celular, tica que estuvo a punto de anotarse en su brillante expediente mosaicos genéticos y mapas del blastodermo, análisis clonal académico por ir más allá de la lección dictada. de sistemas en desarrollo, genética de las células somáticas, Aprende por su cuenta alemán e inglés. Sale al extranjero. transregulación y sintagmas genéticos e interacciones inter“Después de una estancia de siete meses en el departamento celulares en la morfogénesis. Se adentró en la primera de zoología de Cambridge con el profesor W. B. Wigglesworth, durante su estancia en Zurich, en la segunda y tercera líneas empecé la tesis doctoral, sobre fenogenética del locus furrowed estando ya en California, inició las dos siguientes a comien-
A
70
TEMAS 3
el alcance de los mismos. “Nos proponemos en este artículo (lo firma con P. A. Lawrence) describir la investigación sobre el desarrollo de los epitelios intactos y, de manera particular, ué pautas se siguen en la formación de los epitelios los importantes resultados e ideas del profesor Antonio de las alas y patas de la mosca del vinagre? En el García-Bellido y su grupo de Madrid, que todavía no son laboratorio de Hadorn aborda las bases genéticas del recono- suficientemente conocidos. Es nuestra intención explicar con cimiento celular realizando experimentos de disociación de la mayor nitidez posible la naturaleza de esas ideas y el tipo células procedentes de discos imaginales con su reagrupación de experimentos acometidos para respaldarlas.” y metamorfosis posterior, que revelan unas configuraciones Crick y Lawrence se refieren a la tercera línea de inquisicomplejas y propias del disco de origen. (Los discos imagina- ción mencionada: el análisis clonal de sistema en desarrollo les son grupos de células larvarias que intervienen en la que le condujo al descubrimiento de los compartimentos formación de las estructuras del adulto. En Drosophila hay supracelulares. 19, nueve pares más el disco genital, único.) Creíase, y lo En la investigación del linaje celular se parte de mosaicos defendía Hadorn, que la configuración en patrones normales genéticos producidos por recombinación genética inducida de los agregados celulares nacía ex novo a partir de células por rayos X. Los clones de células mutantes permiten deterindiferenciadas. minar distintos parámetros cuantitativos, desde el número de García-Bellido diseña un nuevo ensayo con células mar- células que hay en el primordio hasta la ubicación de las cadas extraídas de discos imaginales distintos o de diferentes estructuras que estamos investigando o la emigración local regiones del mismo disco imaginal y de ciertas células, así como establecer prueba su tesis de la autonomía celular, propiedades cualitativas: morfología de es decir, se da un alto grado de determi- “No quiero que nadie los clones, segregación de los linajes nación celular en la diferenciación de que originan las estructuras buscadas y los tipos cuticulares y poseen las célu- envejezca a mi lado. otras. las implicadas unas propiedades de Prefiero incorporar gente (Algo menos espectacular, pero no reconocimiento que tienen que ver con menos decisivo para los trabajos de la posición que ocupaban en el disco nueva a las nuevas ideas García-Bellido fue el sacar del terreno de origen. Esta línea de investigación, de la erudición biológica la recombiobjeto ahora de análisis molecular en y a las nuevas líneas de nación cromosómica que se opera diversos laboratorios, la irá refinando investigación. Sí, me durante la división celular normal, la solo o en colaboración con alguno de mitosis, y en aprovechar las posibilidagusta seguir por mí sus primeros doctorandos en el Instituto des que le ofrecía la inducción de mutade Genética del Consejo Superior de mismo el proyecto del ciones letales.) Investigaciones Científicas. El fruto más divulgado del análisis Algo tendrá que ver su afición a la comienzo al fin. Otra clonal ha sido la cartografía del embrión filosofía (dedicó su discurso de ingreso cosa son los seminarios. en desarrollo, esos mapas con un lejano en la Academia de Ciencias a una lecparecido con el de los cuatro colores Ahí es donde cada uno da tura chomskyana de la genética) y a la que dividen los territorios que más tarde música de cámara con su estilo de tra- la medida de sí mismo.” habrán de conformar los segmentos de bajo solitario. “No quiero que nadie la mosca, sus capas germinales y hasta envejezca a mi lado. Prefiero incorporar las quetas o los tricomas. gente nueva a las nuevas ideas y a las Se expresa con claridad precisa nuevas líneas de investigación. Sí, me gusta seguir por mí cuando habla. Cordial. No mira el reloj. Duro y seco con el mismo el proyecto del comienzo al fin. Otra cosa son los provincianismo regionalista, en todos los sentidos, que ha seminarios. Ahí es donde cada uno da la medida de sí empapado la médula de la investigación y docencia españomismo.” las. Reacio al direccionismo petulante: “He sufrido por la impotencia, por la frustración de ver que la sugerencia que a autonomía de la célula le permite investigar el análisis parece razonable, positiva y justa no puede llevarse a cabo genético de la herencia celular en los discos imaginales. por la malicia y la desidia o cobardía de los responsables de Se ocupa así de alelos letales en mosaicos genéticos para la acción.” definir el tiempo de acción de los genes, valorar el efecto de las mutaciones en la proliferación y en la diferenciación a combinación del análisis genético y la clonación celucelulares, y, en general, explorar los procesos de desarrollo lar desembocó también en su idea de los genes selectodurante el período que media entre la formación del cigoto y res. Los selectores, con los realizadores, son jerarquías de la constitución del organismo a término. No es poca la vir- genes que convierten señales genéticas específicas de positualidad de ese análisis, extendido hoy al plano molecular, ción en operaciones de desarrollo y, a la postre, en diferenque permite acotar la función de este o aquel gen, así como ciación celular espacial. Son la clave para comprender, hoy, identificar redes de regulación génica. el tamaño, la forma del ala o el patrón de venación en Pero las ideas y los trabajos de laboratorio de García- Drosophila. Pero la existencia de compartimentos y conserBellido no hubieran llegado tan pronto a los manuales (el vación de los mismos genes selectores y realizadores en otros “Alberts”, por ejemplo), ni por supuesto sería hoy miembro organismos hace pensar que mañana, quizás, entenderemos de la Regia Sociedad Londinense, de la Academia Nacional cómo se generan las circunvoluciones del cerebro humano. estadounidense de Ciencias y cien más, si Francis Crick, el El camino está abierto. descubridor con Watson de la estructura helicoidal del ADN, no hubiera reconocido desde la tribuna de Science en 1975 Luis Alonso zos del decenio de los setenta, y en los años ochenta la última.
¿Q
L
L
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
71
Carbohidratos en el reconocimiento celular Nathan Sharon y Halina Lis Las células colocan en su superficie azúcares que hacen de señales de reconocimiento para otras células. Los medicamentos dirigidos hacia esas moléculas servirán para detener la infección y la inflamación
E
n 1952 Aaron Moscona separó las células de un embrión de pollo al incubarlas en una solución enzimática y agitarlas sua vemente. Pero no permanecían aisladas, sino que volvían a reunirse en un nue vo agre gado. Mosc ona observó también que, cuando las células retinianas y las hepáticas convergían así, las retinianas emigraban hacia el interior de la masa celular. Tres años después, Philip L. Townes y Johannes Holtfreter realizaron un experimento semejante con células de embriones de anfibio, que en este caso se reorganizaban para producir las capas de tejidos de donde procedían. Estos experimentos, sumados a incontables observaciones, ponen de manifiesto la capacidad de las células para reconocerse entre sí y responder en conjunción. Los espermatozoides, por ejemplo, distinguen los ovocitos de su propia especie de los gametos femeninos de otras, y se unen sólo con los primeros. Algunas bacterias se asientan, de preferencia, en el intestino o en el tracto urinario, mientras que otras lo hacen en órganos diferentes. Está, pues, justificado, el interés por descifrar el lenguaje de las interacciones celulares. Aunque se desconocen las bases químicas de la mayoría de los fenómenos de reconocimiento
NATHAN SHARON y HALINA LIS se hallan adscritos al departamento de biofísica del Instituto Weizmann en Rehovot. Durante lasgos años han trabajado juntos en el estudio de carbohidratos complejos y lectinas, proteínas que se unen selectivamente a los carbohidratos.
72
celular, han ido surgiendo algunas explicaciones bastante satisfactorias a lo largo del último decenio. Las proteínas, que median en la mayoría de las reacciones químicas en el interior de las células, también aparecen en su superficie, donde, por supuesto, desempeñan su cometido. Abundan, sin embargo, los indicios de que los hidratos de carbono o carbohidratos (también llamados azúcares) son los marcadores principales del reconocimiento celular; de los avances en ese terreno se beneficiarán, sin duda, la prevención y el tratamiento de las enfermedades. Los biólogos aceptan que las células se reconocen entre sí gracias a la existencia de parejas de estructuras complementarias situadas en su superficie: una estructura acomodada en la superficie de una célula porta información que la estructura de otra puede descifrar, idea que generaliza la hipótesis de la llave y la cerradura, formulada en 1897 por Emil Fischer, para describir la especificidad de las interacciones entre enzimas y sustratos. Paul Ehrlich la amplió en 1900 para explicar la elevada especificidad de las reacciones del sistema inmunitario. Y en 1914 Frank Rattray Lillie hizo uso de la misma hipótesis para señalar el reconocimiento mutuo de óvulo y espermatozoide. Hacia los años veinte, la hipótesis de la llave y la cerradura se había convertido en uno de los postulados centrales de la biología celular, lo que impidió que la naturaleza e identidad de las moléculas del reconocimiento celular siguieran envueltas en el misterio. Para la mayoría, la idea de que esas moléculas fueran los carbohidratos parecía descabellada.
La familia de los carbohidratos está integrada por monosacáridos (azúcares simples como la glucosa y la fructosa) y por oligosacáridos y polisacáridos, compuestos por monosacáridos enlazados. Hasta finales de los sesenta creíase que los carbohidratos se limitaban a una función energética (en forma de monosacáridos y de moléculas de reserva como el almidón, un polisacárido) o a una función estructural (los polisacáridos celulosa en las plantas y la quitina en el exoesqueleto de los insectos). Las otras dos familias fundamentales de compuestos biológicos —los ácidos nucleicos, portadores de la información genética, y las proteínas— se erigían, por razones estructurales obvias, en candidatos ideales para desempeñar una gama más amplia de funciones. Ademá s, poseían una estructura compleja. A diferencia de lo que ocurre con los nucleótidos en los ácidos nucleicos y con los aminoácidos en las proteínas, que sólo se traban de un único modo, los monosacáridos, unidades componentes de oligosacáridos y polisacáridos, presentan distintas posibilidades de unión entre sí. Dos monosa-
HORMONA
GLICOPROTEINA
TEMAS 3
cáridos idénticos dan lugar a 11 disacáridos diferentes, mientras que dos aminoácidos idénticos sólo producen un dipéptido. Cuatro nucleótidos diferentes originarán 24 tetranucleótidos distintos, mientras que cuatro monosacáridos diferentes podrían configurar hasta 35.560 tetrasacáridos. Tamaña diversidad estructural representa una ruina para el químico de azúcares, al mismo tiempo que un enorme beneficio para la célula: hace posible que los polímeros constituidos por monosacáridos sean excelentes portadores de información. Los carbohidratos incorporan mucha más información por unidad de peso que los ácidos nucleicos o las proteínas. En el lenguaje de los azúcares, las palabras se escriben apoyándose no sólo en la variedad de monosacáridos, sino también en los diferentes enlaces que los unen y en la presencia o ausencia de ramificaciones. Se tardó en tomar conciencia clara de la participación de los carbohidratos. Hacia los años cincuenta, por ejemplo, se sabía ya que los polisacáridos inyectados estimulaban la producción de anticuerpos en los animales. Se conocía también que los grupos sanguíneos AB0 están determinados por azúcares de la superficie de las células de la sangre y que el virus de la gripe se une a los hema tíes a través del ácido siálico, un azúcar. Pero hasta
la década siguiente no se convirtieron en centro de atención.
E
se cambio se debió a dos hechos. El primero fue el descubrimiento de que todas las células llevan una cubierta de azúcares, constituida en su mayor parte por glicoproteínas y glicolípidos, dos tipos de carbohidratos complejos en los que los azúcares están unidos a proteínas y lípidos respectivamente. Se conocen ya varios millares de glicoproteínas y glicolípidos, número que crece a un ritmo vertiginoso. Tamaña diversidad tiene su sentido: el repertorio de las estructuras ubicadas en la superficie de la célula según ésta se desarrolle, enferme o entre en fase de diferenciación. El conjunto de carbohidratos de una célula cancerosa diverge del que porta una célula normal. Las lectinas propiciaron también el cambio. Estas proteínas se combinan con los azúcares con presteza, gran selectividad y reversibilidad. Suponíase que las lectinas eran un a tributo exclusivo del mundo vegetal, hasta que se descubrió su presencia en toda la escala orgánica. Suelen aparecer en
la superficie de las células, situadas estratégicamente para combinarse con los carbohidratos de las células vec ina s. Pos een una especi fic idad notabilísima: no sólo distinguen entre monosacáridos, sino también entre diferentes oligosacáridos. A propósito de la interacción entre lectinas y carbohidratos en el reconocimiento celular, debemos reseñar el trabajo de G. Gilbert Ashwell y de Anatol Morell, quienes en 196 8 sepa-
BACTERIA
CELULA VIRUS
TOXINA
1. CARBOHIDRATOS DE LA SUPERFICIE CELULAR, puntos de anclaje para otras células, bacterias infecciosas, virus, toxinas, hormonas y muchas otras moléculas. Los carbohidratos intervienen en la emigración de las células durante el desarrollo embrionario, los procesos infecciosos y otros fenómenos. Los compuestos constituidos por carbohidratos que están unidos químicamente a proteínas reciben el nombre de glicoproteínas; si los carbohidratos están unidos a lípidos, hablaremos de glicolípidos.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
73
raron enzimáticamente unas cuantas moléculas de ácido siálico de ciertas glicoproteínas del plasma sanguíneo, y las inyectaron en conejos. Aunque las glicoproteínas persisten durante algún tiempo en la circulación de la sangre, vieron que desaparecían en seguida las moléculas deficientes en ácido siálico. Ashwell y Morell observaron que las glicoproteínas acababan en el hígado. La eliminación de los ácidos siálicos había dejado desnuda la galactosa de las glicoproteínas, y las galactosas expuestas se habían unido a una lectina de las células hepáticas. Se demostró luego que, si eliminaban los ácidos siálicos y las galactosas al descubierto, volvía a su valor normal la velocidad de eliminación, fuera de la sangre, de las moléculas. A partir de estos resultados, llegaron a la conclusión de que las cadenas laterales de carbohidratos
de las proteínas servían quizá de marcadores para identificar cuáles han de ser eliminadas de la circulación para su degradación ulterior.
A
semejanza de los carbohidratos de superficie, las lectinas sufren cambios que coinciden con los estados fisiológicos y patológicos de la célula. En 1981 Reuben Lotan y Abraham Raz demostraron que las células tumorales procedentes de ratón o de hombre portan una lectina de superficie que no se encuentra en las células normales; más tarde se evidenciaría la implicación de esa lectina en el desarrollo de metástasis. Trabajando con embriones de ratón, Sen-itiroh Hakomori y Ten Feizi han demostrado que, cuando un óvulo fecundado se divide, las estructuras de los carbohidratos de las células embrionarias resultantes cambian de
acuerdo con patrones característicos. Uno de los carbohidratos es el trisacárido conocido por antígeno 1 embrionario específico del estadio (SSA-1), o también Lewisx (Lex). Aparece en el estadio de 8 a 16 células, cuando el embrión, hasta entonces un agrupamiento celular más o menos suelto, adquiere una estructura esférica, lisa y compacta. El grupo de Hakomori ha demostrado que un compuesto soluble que lleva unidades múltiples del mismo trisacárido inhibe el proceso de compactación e interrumpe la embriogénesis. Otros carbohidratos, de estructura muy parecida, no intervienen para nada. De lo que se infiere que el trisacárido Le x desempeña algún papel en el proceso de compactación. Los carbohidratos adhesivos son, pues, esenciales en el desarrollo embrionario. Con el tiempo iremos
Complejidad estructural de los carbohidratos
C
arbohidratos, ácidos nucleicos y proteínas llevan información biológica escrita en sus estructuras. Pero son los carbohidratos los que ofrecen una mayor capacidad para el transporte de información merced a su variedad de conformaciones. Sus unidades estructurales, los monosacáridos, pueden unirse entre sí en varios puntos dando lugar a diferentes formas lineales o ramificadas; en el ejemplo que se muestra abajo, el carbohidrato ramificado es una
entre muchas otras estructuras que pueden formarse a partir de cuatro moléculas idénticas de glucosa. Los aminoácidos en las proteínas, así como los nucleótidos en los ácidos nucleicos, generan sólo estructuras lineales, lo que restringe su diversidad. El péptido (un fragmento de proteína) que se muestra abajo es la única estructura posible que se obtiene a partir de cuatro moléculas del aminoácido glicina.
AMINOACIDO (GLICINA)
PEPTIDO (TETRAGLICINA)
MONOSACARIDO (GLUCOSA)
CARBONO
74
OXIGENO
OLIGOSACARIDO (TETRAGLUCOSA RAMIFICADA)
NITROGENO
HIDROGENO
TEMAS 3
dominando los pormenores de dicha participación. Sabemos bastante ya sobre la adhesión bacteriana a las células hospedadoras y la adhesión de los leucocitos a los vasos sanguíneos. Las interacciones mejor entendidas conciernen a la adhesión microbiana, ob jeto de estudio desde hace una veintena de años y modelo de otras formas de reconocimiento celular mediada por carbohidratos.
P
ara ejercer su acción dañina, los virus, las bacterias y los protozoos deben adherirse a la superficie de un tejido de un organismo sensible. Los agentes infecciosos que carecen de esa capacidad son barridos de esos sitios potenciales de infección por los mecanismos de limpieza del organismo. Los microorganismos que lleguen a las vía s res pir ato ria s sup eri ore s, por ejemplo, podrán ser tragados y luego destruidos por el ácido del estómago. Los del tracto urinario podrán ser arrastrados por la orina. Las primeras pistas acerca del mecanismo de la adhesión bacteriana se las debemos a J. P. Duguid. En los años cincuenta Duguid demostró que muchas cepas de Esch eric hia coli (enterobacteria que puede colonizar otros tejidos) y bacterias emparentadas se adhieren a células del revestimiento epitelial de los tejidos y a los eritrocitos. En presencia de bacterias pega jo sa s, lo s he ma tí es fo rm an cúmulos —un fenómeno al que se da el nombre de hemaglutinación. Para averiguar cómo se unen las bacterias a las células, Duguid las expuso a una gama amplia de compuestos. Vio que sólo el monosacárido manosa y azúcares afines inhibían la hemaglutinación. Observó, asimismo, que las cepas bacterianas responsables de la hemaglutinación sensible a la manosa tenían apéndices pilosos submicroscópicos en su superficie. Estas estructuras miden de 5 a 10 nanómetros de ancho por varios centenares de largo. Les dio el nombre de fimbrias, palabra latina que significa flecos. Por aquel entonces, Charles C. Brinton, Jr., describió las mismas estructuras y les dio el nombre de pili, vocablo latino que significa pelos. Ambos términos se siguen usando. Llegamos a los años setenta, cuando aparecieron los primeros trabajos del grupo de Ronald J. Gibbons sobre la adhesión selectiva de bacterias a nichos de la cavidad oral. Gibbons observó que el Actinomyces naeslundii colonizaba la superficie epitelial de niños (sin dientes o con ellos) y adultos. Por el contrario, la bacteria A.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
2. ADHESION SELECTIVA de las bacterias a los tejidos. A través de las fimbrias, las bacterias se unen a ciertos carbohidratos de la superficie celular. Estas interacciones determinan qué tejidos son susceptibles de la invasión bacteriana.
viscosus, emparentada con aquélla, no medraba en la boca hasta que los dientes ya habían salido de las encías; prefiere los dientes a las superficies epiteliales de la boca.
L
a especificidad de la adhesión bacteriana a un tejido determinado, lo sabemos ahora, constituye un fenómeno general: E. coli, agente causal común de las infecciones del tracto urinario, abunda en los tejidos que rodean los conductos que unen el riñón a la vejiga, pero no frecuenta el tracto respiratorio superior. Por su lado, los estreptococos del grupo A, que colonizan sólo el tracto respiratorio superior y la piel, raramente producen infecciones del tracto urinario. La adhesión bacteriana varía no sólo de un tejido a otro, sino también entre especies y, en ocasiones, entre individuos de la misma especie a tenor de la edad, constitución genética y estado de salud. A principios de los setenta, los equipos de R. Sellwood y Richard A. Gibbons estudiaron la infectividad de la cepa K88 de E. coli. Estas bacterias, pesadilla de granjeros, producen diarrea en el cochinillo. El grupo de Gibbons vio que las bacterias K88 se adherían a las células abdominales de los cochinillos expuestos, pero no a las de los cerdos adultos o del hombre, que son resistentes a la infección de tales microor-
ganismos. Los mutantes de bacterias que habían perdido la capacidad de unirse a las células intestinales se mostraron también incapaces de infectar a los animales. Además, algunos cochinillos presentaban una resistencia genética a las K88: ni siquiera las bacterias potencialmente virulentas podían unirse a las células de su intestino. Con la se lección genética de cerdos inmunes se logró una progenie resistente a las K88. El organismo causante de la gonorrea, Neisseria gonorrhoeae , es otro ejemplo de especificidad de especie y tejido. Se adhiere a las células humanas de los epitelios genital y oral, pero no a las células de otros órganos o de otras especies animales. Ahí reside el motivo de que el hombre sea hospedador exclusivo de la N. gonorrhoeae y de que otros animales no contraigan la gonorrea. La propuesta avanzada en 1977 por Itzhak Ofek, David Mirelman y uno de nosotros (Sharon) dio un gran impulso al estudio de la adhesión bacteriana. Afirmábamos que la adhesión bacteriana estaba mediada por las lectinas bacterianas de superficie que se unían a los azúcares complementarios de la célula hospedadora. La idea se ha asentado. Se ha comprobado que las bacterias producen lectinas específicas de ciertos carbohidratos y dependen de esas proteínas para
75
adherirse a un tejido del hospedador, primer paso del proceso infectivo. Las lectinas mejor caracterizadas son las que corresponden a las fimbrias del tipo 1 de E. coli, que se unen, de preferencia, a las glicoproteínas de superficie que contienen manosa. Por los estudios de Catharina SvanborgEdén conocemos el funcionamiento de las fimbrias P, que interaccionan específicamente con la substancia P de los grupos sanguíneos, un glicolípido muy común en cuya composición entra el disacárido galabiosa. Los equipos de Karl-Anders Karlsson y Victor Ginsburg han cartografiado las especificidades de lectinas de una amplia gama de cepas bacterianas.
D
e esas investigaciones se deduce que las bacterias no se unen sólo a los extremos de los carbohidratos de superficie; se traban también con azúcares del interior de la estructura. Además, diferentes ba cterias pueden engarzarse en zonas diversas del mismo carbohidrato. Y si en una célula queda expuesta una sola cara de oligosacárido, aquélla se unirá a bacterias de una clase y no a otras. La capacidad de los azúcares de superficie para servir de puntos de unión depende de la presencia de los glúcidos, así como de su accesibilidad y modo de presentación. Se está consolidando la idea según la cual la unión de las bacterias a los azúcares de superficie de la célula hospedadora marca el comienzo de la infección. Se aduce, por ejemplo, que las células epiteliales del tracto urinario de los individuos que carecen de la substancia P de los grupos sanguíneos no se unen a las bacterias E. coli portadoras de fimbrias P; estos individuos son mucho menos sensibles a la
infección bacteriana que el resto de la población. Pero las bacterias se unirán a las células epiteliales si éstas se recubren antes con un glicolípido sintético que contenga galabiosa. Las células intestinales de cochinillos resistentes a E. coli K88, el agente causal de la diarrea, carecen del macrocarbohidrato al que se engancha la bacteria. Aunque se desconoce la estructura exacta del carbohidrato, se sabe que está presente en los cochinillos sensibles y ausente en el cerdo adulto, por cuya razón las bacterias no logran instalarse en el intestino del cerdo adulto y colonizarlo, en tanto que infectan al lechal. Otro caso interesante es el de la cepa K99 de E. coli. Al igual que la K88, la cepa K99 produce diarrea en animales estabulados pero no en el hombre. Menos específica que la K88, infecta terneras, corderos y lechones. Las bacterias K99 se unen a un glicolípido que contiene ácido N -glicocolilneuramínico (un tipo de ácido siálico) ligado al lactosilcerámido. Este glicolípido, presente en cochinillos, terneras y corderos, está ausente en las células del cerdo adulto y del hombre, que a su vez contienen ácido N -acetilneuramínico, un análogo del ácido siálico no enlazante. En este caso, una pequeña diferencia entre dos azúcares similares —la sustitución de un grupo acetilo por otro glicolilo— se detecta rápidamente por las bacterias, lo que explica la gama de hospedadores de la infección. Las ideas que se acaban de exponer han recibido un nuevo respaldo de los experimentos con dos lectinas de las fimbrias de E. coli que infectan el LINFOCITO CON DIFERENTES RECEPTORES DE APOSENTAMIENTO
tracto urinario del hombre y del perro. Amba s lect inas reconocen la galabiosa, si bien una se une sólo a las células del epitelio humano y la otra sólo a las células del perro. Los glicolípidos de la superficie de las células que llevan galabiosa varían de forma sutil; las pautas de unión de las lectinas se ajustan a la vinculación de la cepa de E. coli con el hospedador.
A
l ser la adhesión bacteriana un hecho clave en el proceso de la infección, la investigación médica está considerando seriamente el uso de azúcares para su prevención y tratamiento. Los azúcares que selectivamente inhiben la adhesión podrían actuar como distractores moleculares, interceptando los patógenos antes de que alcanzaran su correspondiente tejido. En colaboración con Ofek, Moshe Aronson y Mirelman, iniciamos esa línea en 1979. Inyectamos una cepa de E. coli específica de manosa en la vejiga urinaria de ratones. En algunos animales, inyectamos también alfametilmanósido, un azúcar que en el tubo de ensayo inhibía la adhesión bacteriana a las células epiteliales. La presencia del azúcar redujo la colonización bacteriana del tracto urinario. Svanborg-Edén ha realizado experimentos análogos con E. coli portadora de fimbrias P que infecta el riñón del ratón. Incubó las bacterias en soluciones de globotetraosa, un azúcar que se encuentra en el glicolípido de las células renales. Inyectó luego esas bacterias en los ratones y persistieron en el riñón durante menos tiempo que las bacterias sin tratar. James A. LINFOCITO EMIGRANDO FUERA DE LA VENULA
RECEPTOR DE APOSENTAMIENTO (SELECTINA L)
CARBOHIDRATOS
PLACA DE PE YER
U LA C E L E L IA L O T E N D
I C O F E R E R I P O A T I C L I N F O I G L GA N
76
3. LEUCOCITOS DEL SISTEMA INMUNITARIO: defienden el organismo frente a la infección saliendo de la circulación y emigrando a los tejidos. El primer paso implica la adhesión selectiva de los leucocitos a las paredes de las vénulas del endotelio alto ( fotografía). La adhesión depende de las selectinas, que se unen a los
TEMAS 3
Roberts obtuvo resultados semejantes en experimentos con monos: la incubación de E. coli de fimbrias P con un azúcar semejante a la galabiosa retrasó el desarrollo de las infecciones del tracto urinario. Los glicopéptidos pueden oponerse también a la unión de las bacterias a los tejidos del hospedador. En l990, el grupo de Michelle Mouricout demostró que las inyecciones de glicopéptidos obtenidos del plasma sanguíneo de vacas protegían a las terneras recién nacidas frente a dosis letales de E. coli. Los glicopéptidos con azúcares para los que la bacteria tiene afinidad desanima la adhesión de las bacterias al intestino de los animales tratados. La verdad es que, para bloquear la adhesión bacteriana, no se necesitaría ni siquiera un carbohidrato —valdría cualquier agente que pugnara por enlazarse con la lectina bacteriana o el carbohidrato de la superficie de la célula hospedadora. En ese contexto, Edwin H. Beachey y sus colaboradores han utilizado anticuerpos frente a la manosa para evitar la infección de ratones con determinados E. coli específicos de manosa. Los anticuerpos se unen a la manosa de las células, bloqueando los sitios de unión de la bacteria. Los resultados experimentales avalan la posibilidad de terapias
antiadhesivas en las enfermedades bacterianas. Nuevos estudios en torno a la acción de los azúcares sobre la célula hospedadora y las lectinas bacterianas habrán de conducir al diseño de mejores inhibidores bacterianos. Un punto relacionado con este enfoque se considera ya como algo seguro: puesto que los agentes infecciosos —incluidas bacterias diferentes dentro de la misma cepa— pueden tener una amplia gama de especificidades de carbohidratos, parece imprescindible conjugar diversos inhibidores para prevenir o tratar estas enfermedades. Las interacciones intercelulares dirigidas por carbohidratos no se limitan a los fenómenos patológicos; inter vienen en el funcionamiento normal del sistema inmunitario, cuyos componentes principales son los leucocitos. Este grupo lo integran diversas células —linfocitos, monocitos y neutrófilos— que actúan de forma con junta para eliminar bacterias y otros intrusos, y para mediar en la respuesta inflamatoria de los tejidos afectados. Aunque los leucocitos circulan por la sangre, es en los espacios extravasculares donde llevan a cabo sus funciones principales. El endotelio, recubrimiento interno de los vasos sanguíneos, atrae a los leucocitos y los dirige al lugar donde se
carbohidratos de otras células. Las selectinas L, de aposentamiento, situadas en la superficie de los linfocitos, determinan sobre qué células endoteliales se fijarán. Una vez que el linfocito se ha unido al endotelio, tiene ya el camino preparado para salir de la circulación sanguínea.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
requiere su presencia. El proceso exige un reconocimiento entre leucocitos circulantes y células endoteliales exquisitamente regulado y mediado, quizá, por una familia de lectinas estructuralmente emparentadas. Se las suele llamar selectinas porque son moléculas mediadoras del contacto selectivo entre las células; también se las denomina moléculas LEC-CAM (acrónimo de la expresión inglesa “leucocyte-cell, or lectin, adhesion molecules”). Las selectinas, proteínas complejas muy asimétricas, presentan una configuración en mosaico poco habitual. Constan de tres tipos de dominios funcionales: uno que sirve de ancla para fijar la selectina a la membrana celular; otro dominio que forma la mayor parte de la molécula, y un tercero, localizado en el extremo extracelular de la molécula y cuya estructura semeja la de las lectinas animales que actúan sólo en presencia de iones calcio. La unión de las moléculas de carbohidrato a ese dominio es fundamental para el funcionamiento de las selectinas en las interacciones entre las células.
H
ace unos 10 años, Eugene C. Butcher e Irving L. Weissman establecieron los criterios para entender de qué modo las selectinas (cuya existencia se desconocía) dirigen el tráfico de los linfocitos. Los linfocitos se caracterizan por un rasgo muy peculiar: patrullan por el organismo en busca de antígenos bacterianos o víricos. Con ese propósito, los linfocitos salen del torrente circulatorio y recorren los ganglios linfáticos, las amígdalas, las adenoides, las placas de Peyer y otros órganos linfoides secundarios; la emigración de los linfocitos es selectiva y cada uno busca el órgano correspondiente. Para abandonar la circulación, se unen a las vénulas del endotelio alto, unos vasos sanguíneos de menos de 30 micras de luz. Con una técnica especial que Hugh B. Stamper, Jr., y Judith J. Woodruff desarrollaron, Butcher y Weissman observaron que la especificidad del aposentamiento está dictada por la interacción selectiva de los linfocitos con las vénulas de endotelio alto en los órganos diana. Butcher y Weissman consiguieron un anticuerpo monoclonal, el MEL-14, que se une a los linfocitos que emigraron a los ganglios linfáticos periféricos. En los cortes de tejido, los anticuerpos bloquearon la adhesión de los linfocitos a las vénulas de endotelio alto de dichos tejidos, pero no de otros órganos linfáticos. Cuando se inyecta en el ratón, el MEL-14
77
FARMACO DE CARB OHIDRATOS
BACTERIA
FARMACO DE LECTINA LECTINA
CARBOHIDRATO DE SUPERFICIE
CELULA
4. BLOQUEO DE LA ADHESION BACTERIANA para combat ir la infección. Como preludio de la infección, las lectinas de la superficie bacteriana se unen a la superficie de los carbohidratos de la célula hospedadora susceptible (a). Los fármacos
inhibe la emigración de los linfocitos a los ganglios linfáticos periféricos. Butcher y Weissman demostraron también que su anticuerpo se une a la membrana del linfocito a través de la selectina L, glicoproteína responsable de la unión específica de los linfocitos a las vénulas de endotelio alto y conocida también por receptor de aposentamiento. Si las vénulas de endotelio alto pertenecientes a ganglios linfáticos se exponen a soluciones de selectina L, los linfocitos pierden su adhesividad: las moléculas de selectina L ocupan todos los sitios potenciales de unión a las células endoteliales. Y, a la in versa, como Steven D. Rosen ha demostrado, ciertos azúcares pequeños y polisacáridos de mayor tamaño pueden bloquear también las interacciones entre lifocitos y vénulas endoteliales. En esos casos, los azúcares se han unido
a la selectina. L. Weissman, por un lado, y Laurence A. Lasky y Rosen, por otro, demostraron en 1989 que el receptor de aposentamiento es el mediador de la adhesión de los linfocitos a las células endoteliales.
cinas estimulan las células endoteliales de las vénulas y provocan en ellas la expresión de las selectinas E y P que se ubican en su superficie. Los leucocitos se adhieren a las moléculas que sobresalen de su superficie porque su cubierta de carbohidratos contiene diferencia de lo que ocurre con el estructuras complementarias. Una receptor de aposentamiento, las vez que se ha unido a la pared de una otras dos selectinas suelen recalar en vénula, el leucocito abandona la sanlas células endoteliales, y aun enton- gre escurriéndose entre dos células ces sólo cuando atraen a los le ucocitos. endoteliales adyacentes. Estas dos selectinas aparecen en las Michael P. Bevilacqua descubrió en 1987 una de éstas, la selectina E células endoteliales en momentos (ELAM-1). Dos años después, era des- diferentes y reclutan tipos distintos de cubierto el tercer miembro, la selectina leucocitos de la sangre. Las células P (antes GMP-140 y PADGEM) por endoteliales tienen una reserva Rodger P. McEver y Bruce y Barbara interna de selectina P que pueden colocar en su superfice en cuestión de Furie, en trabajos independientes. Cuando un tejido se infecta, segrega minutos después del comienzo de una en reacción defensiva citocinas, grupo infección. La selectina P puede, por al que pertenecen la interleucina-1 y tanto, atraer leucocitos que actúan en el factor de necrosis tumoral. Las cito- las primeras fases de la defensa inmu-
A
5. EFECTOS SELECTIVOS de los carbohidratos sobre las bacterias. Las bacterias de E. coli poseen una lectina para el glicolípido P. Las bacterias incubadas en presencia del azúcar
78
que porten carbohidratos parecidos podrán evitar la adhesión al unirse a las lectinas (b); o también, los fármacos que se parezcan a las moléculas de lectina podrían tener el mismo efecto al ocupar los sitios de enlace de los carbohidratos (c).
manosa conservan su adhesividad al tejido epitelial (izquierda). Un constituyente del glicolípido P se une a la lectina de la bacteria, lo que impide su adhesión (derecha).
TEMAS 3
6. LAS CELULAS CANCEROSAS presentan carbohidratos poco corrientes en su superficie, lo que puede explicar sus propiedades invasivas. La oncoterapia habrá de recurrir a medicamentos que bloqueen la adhesividad de las células anormales.
nitaria. La selectina E, en cambio, sólo se sintetiza en las células endoteliales cuando se requiere, por lo que tarda más en aparecer.
E
l mecanismo que ayuda a los leucocitos a abrirse paso a través de la barrera endotelial, indispensable para que puedan cumplir sus funciones y combatir la infección, tiene su talón de Aquiles: permite la acumulación leucocitaria en puntos inadecuados provocando disfunciones, hinchazón y dolor. La inflamación de la artritis reumatoide, por ejemplo, se produce cuando los leucocitos penetran en las articulaciones y liberan enzimas proteolíticas, radicales libres del oxígeno y otros factores tóxicos. Otro ejemplo es el de las alteraciones hísticas debidas a la interrupción temporal del flujo sanguíneo en el ataque cardíaco. Cuando el flujo sanguíneo se reanuda, los leucocitos de la sangre destruyen los tejidos alterados por la falta de oxígeno. En teoría, cualquier fármaco que bloquee la adhesión de los leucocitos y su ulterior salida del vaso sanguíneo gozará de propiedades antiinflamatorias. La clave para el desarrollo de tales fármacos está en la estructura de las regiones enlazantes de las moléculas de selectina y en la estructura de los carbohidratos donde se enganchan. Investigación que corre paralela a la de la síntesis de carbohidratos inhibidores de las selectinas E y P. Para que una terapia antiadhesiva sea eficaz, los fármacos deben cumplir un doble objetivo: evitar la salida inoportuna de los leucocitos del
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
torrente y facilitar, por contra, su abandono en el lugar idóneo. No se trata de nada inalcanzable, ya que las especificidades de las moléculas de adhesión varían de un tejido a otro. Aparte de su implicación en la inflamación, las moléculas de adhesión celular pueden ejercer otros efectos dañinos, verbigracia, la diseminación de las células cancerosas por todo el organismo a partir del tumor principal. El carbohidrato que reconoce la selectina E se expresa en células de diversos tumores, incluidos algunos cánceres. Bevilacqua acaba de exponer que por lo menos un tipo de células cancerosas se une específicamente a la selectina E expresada en el endotelio activado. Quizá para promover sus propias metástasis, algunas células malignas recluten la adhesión de moléculas de las defensas del organismo; en cuyo caso, los medicamentos antiadhesivos podrían tener también propiedades antimetastásicas.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA LECTINS AS CELL RECOGNITION MOLECULES. N. Sharon y H. Lis en Science, volumen 246, páginas 227-234; 1989. GLYCOBIOLOGY: A GROWING FIELD FOR DRUG DESIGN. Karl-Anders Karlsson en Trends in Pharmacological Science, volumen 12, número 7, páginas 265-272; julio de 1991. CARBOHYDRATES AND GLYCOCONJUGATES: UPWARDLY MOBILE SUGARS GAIN STATUS AS INFORMATION -BEARING M OLECULES. K. Drickamer y J. Carver en Current Opinion in Structural Biology, vol. 2, n.o 5, págs. 653-654; octubre de 1992.
79
Glicoesfingolípidos Sen-itiroh Hakomori La composición de esas moléculas de membrana se altera espectacularmente durante la diferenciación celular y con la aparición de un cáncer. Cabe explotar esos cambios para mejorar el diagnóstico y el tratamiento de las neoplasias
E
n 1951 una mujer de 66 años ingresó en un hospital de Charlottesville, Virginia, para que le extirparan un tumor maligno de estómago. Su grupo sanguíneo era del tipo O , comúnmente conocido por donante universal. Las pruebas de laboratorio demostraron, sin embargo, que en su suero había también anticuerpos capaces de reaccionar contra casi todos los tipos de células sanguíneas excepto las suyas propias. No se encontraron donantes cuya sangre fuese compatible con esos anticuerpos. La operación entrañaba, por tanto, un gran riesgo, pues probablemente habría de efectuarse durante su transcurso alguna transfusión sanguínea. Para calibrar la magnitud del riesgo al que se iba a exponer se le realizó una pequeña transfusión de 25 mililitros de sangre de tipo O. Como se presumía, la reacción inmunitaria de la mujer fue dramática: en su suero aumentó la concentración de anticuerpos contra la sangre del donante hasta una parte por 512. Las pruebas realizadas recomendaban que, para evitar mayores ries-
SEN-ITIROH HAKOMORI tiene a su cargo el programa de oncología bioquímica del Centro Fred Hutchinson de Investigación del Cáncer, de Seattle. También enseña microbiología en la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington. Tras licenciarse en medicina por la Universidad de Tohoku, Japón, en 1952, y doctorarse en 1956 por el Instituto de Bioquímica, disfrutó de una beca de investigación en el Hospital General de Massachusetts y la Facultad de Medicina de Har vard, integrándose luego en el claustro docente de Tohoku. En 1963 volvió al Hospital General de Massachusetts y, tres años más tarde, ocupó plaza de profesor visitante en la Universidad de Brandeis. En 1975 se integró en el Hutchison Center.
80
gos, se le extirpase sólo parte del estómago. Algo de tejido canceroso debía, por tanto, quedar en el cuerpo de la paciente. No obstante, para sorpresa y satisfacción de todos, ese tejido maligno desapareció después de la operación. La mujer vivió hasta los 88 años sin rastros de cáncer. ¿A qué se debió la espectacular recuperación de la mujer? Poco después de la intervención quirúrgica, los trabajos de Philip Levine, de la Fundación Ortho, sugirieron las primeras respuestas. En el examen rutinario de los grupos sanguíneos sólo se estudia el sistema ABH , clasificándose la sangre y los tejidos en los ya familiares tipos O, A, B y AB. Existen, sin embargo, muchos otros sistemas de grupos sanguíneos, y la expresión o supresión de varios antígenos en cada uno de esos sistemas determina un grupo sanguíneo distinto e independiente. Para uno de esos sistemas, denominado P, la paciente en cuestión fue el primer caso conocido cuyos tejidos normales carecían a la vez de dos marcadores inmunológicos específicos, los antígenos P y P1. La falta de esos marcadores inmunológicos define un tipo raro de sangre dentro del sistema P; al grupo sanguíneo en cuestión se le denomina p. Según se ha comprobado posteriormente, sólo una de cada 100.000 personas presenta el grupo sanguíneo p. Cuando Levine analizó el suero de la mujer descubrió otra interesante peculiaridad: contenía anticuerpos contra los antígenos P y P1, que sólo se forman en presencia de esos dos antígenos. ¿De dónde procedían? La hipótesis de Levine era que probablemente los expresara el tumor. Treinta años después de la operación se analizó en nuestro laboratorio una muestra de tejido del tumor de aquella mujer, guardado congelado en el laboratorio de Levine. Nuestro aná-
lisis demostraba que el tejido contenía, efectivamente, dos tipos de antígenos, uno que reaccionaba contra anticuerpos anti- P y otro que lo hacía contra anticuerpos anti- P1. Encontramos también que ambos antígenos pertenecían a la clase de moléculas denominadas glicoesfingolípidos, que aparecen embebidas en las membranas celulares por todo el organismo. Como su nombre indica, los glicoesfingolípidos poseen una parte lipídica (sustancia soluble en grasa) y otra de azúcar. El prefijo esfingo indica que la parte lipídica de la molécula es una esfingosina. Se confirmó así la primitiva conclusión de Levine, según la cual los anticuerpos del suero de la mujer los habían inducido antígenos incompatibles localizados en el tumor.
L
a enérgica respuesta inmunitaria de la mujer frente a la sangre del donante derivó de la presencia de anticuerpos anti- P y anti- P1 en su sistema; en circunstancias normales los toleraba porque sus tejidos sanos carecían de los antígenos P y P1. Con la transfusión, no obstante, recibió antígenos P y P1 que estimularon la rápida producción de más anticuerpos anti- P y anti- P1. La presencia masiva de anticuerpos probablemente desencadenó una compleja reacción por parte de las células del sistema inmunitario, que provocó la destrucción selectiva de las células del tumor, portadoras de los antígenos incompatibles P y P1. Se sabe desde hace algún tiempo que todas las células animales y algunas vegetales poseen glicoesfingolípidos. Pero apenas si los investigadores habían prestado atención a esas moléculas, cuya función biológica estaba lejos de conocerse. Son numerosos los estudios que han establecido que los antígenos de los grupos sanguíneos y
TEMAS 3
NUCLEO DE
NUCLEO DE
TIPO GANGLIO
TIPO GLOBO GRUPO N -ACETIL
GRUPO
N -ACETIL-
GALATOSAMINA
N -ACETIL
GALACTOSA GLUCOSA GALACTOSA
N -ACETILGALATOSAMINA
GALACTOSA
LACTOSA CERAMIDA
NUCLEO LACTO
NUCLEO LACTO
DE TIPO 1
DE TIPO 2 N -ACETIL-
GLUCOSAMINA
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
N -ACETIL-
GLUCOSAMINA
1. MODELOS MOLECULARES correspondientes a las cuatro estructuras nucleares básicas de los glicoesfingolípidos, sustancias que suelen integrarse en la membrana plasmática que recubre la célula. Todos los glicoesfingolípidos constan de una cadena de carbohidrato unida en ángulo recto al lípido ceramida. En su mayoría se ajustan a una de estas estructuras básicas, definidas por la identidad y el tipo de enlace químico de los azúcares más próximos a la ceramida. En todas estas estructuras, la ceramida aparece unida a una glucosa, y ésta a una galactosa. En los glicoesfingolípidos de la serie ganglio (arriba, a la izquierda) la cadena se continúa en el azúcar N acetilgalactosamina, al cual se enlaza otra molécula de galactosa. Las dos galactosas llevan unido un azúcar, el ácido siálico, no mostrado aquí. En la serie globo, la cadena inicial glucosa-galactosa se continúa en otra galactosa y una N -acetilgalactosamina (arriba, a la derecha). En la serie lacto, por el contrario, la cadena inicial se prolonga en el azúcar N -acetilglucosamina y una galactosa. Según la posición que adopte el último enlace, las moléculas de la serie lacto se subclasifican en moléculas de tipo 1 (abajo, a la izquierda) y de tipo 2 (aba jo, a la derecha). Los glicoesfingolípidos de la serie lacto pueden alargarse y ramificarse; entre la gran variedad de moléculas a que dan lugar se cuentan los antígenos de los grupos sanguíneos del importante sistema ABH . Los modelos se muestran en su conformación de mínima energía.
81
otros muchos que se modifican o divide y diferencia; resultan, pues, expresan de manera anómala durante esenciales para que el organismo el desarrollo de tumores malignos son crezca y se desarrolle acordemente. glicoesfingolípidos, lo que ha susci- Según se sabe, la regulación del crecitado el interés por esos compuestos de miento la realizan, al menos, de dos los inmunólogos que investigan los maneras. Por una parte, detectan la orígenes del cáncer y, a su vez, ha densidad de células similares en su generado gran cantidad de informa- veci ndad y esti mula n o inhiben la ción sobre la función que desempeñan división celular y, por otra, gracias a en la vida de las células, en el cáncer su interacción con proteínas receptoy en otras enfermedades. ras de la superficie celular bloquean Por encontrarse dispuestos sobre la la respuesta celular a los factores de membrana celular, los glicoesfingolí- crecimiento que se encuentren en el pidos participan activamente en la medio que rodea a las células. regulación de las interacciones que Dada la omnipresencia e importansuelen establecer las células normales cia de las funciones reguladoras de los con su medio ambiente. Así, por ejem- glicoesfingolípidos, no sorprende su plo, en el animal ejercen de marcado- implicación en numerosas enfermedares característicos de ciertos órganos des graves. Según parece, constituyen y median en los procesos de comuni- el sitio de infección de varios tipos de cación y reconocimiento entre células. virus y bacterias. Su papel en el cáncer Además, la expresión de los glicoesfingolípidos sobre la superficie celular CADENAS cambia a medida que la célula se DE CARB OHIDRATO
lo ilustra el caso de la mujer portadora del grupo sanguíneo p: los tipos de antígenos de grupos sanguíneos expresados sobre la superficie de las células normales y las poblaciones relativas de cada tipo de antígeno cambian durante el desarrollo de los tumores malignos. Hay que tener en cuenta, no obstante, que no es del todo correcto hablar de antígeno de grupo sanguíneo, ya que tales antígenos no sólo se encuentran en la sangre, sino también en muchos tejidos. Además, alcanzan elevadas concentraciones en la superficie de todos los tipos de células epiteliales, que forman el revestimiento mucoso de numerosos órganos. Más del 90 por ciento de todos los cánceres humanos derivan de células epiteliales. La reciente comprobación de la naturaleza glicoesfingolipídica de los
SUPERFICIE EXTERNA DE LA MEMBRANA
FOSFOLIPIDO
MEMBRANA PLASMATICA
SUPERFICIE INTERNA DE LA MEMBRANA
GLICOESFINGOLIPIDOS GLICOPROTEINA GLICOPROTEINA REGION HIDROFOBA
REGIONES HIDROFILAS
LIGANDO
GLICOPROTEINA
A
B
MEMBRANA PLASMATICA GLICOESFINGOLIPIDOS
82
C
2. MEMBRANA PLASMATICA, la envoltura externa de la célula. Se representa en el esquema como una bicapa formada básicamente por moléculas de fosfolípidos. Las de glicoesfingolípidos, presentadas como ristras de bolas de color, correspondientes a diversos azúcares, se sitúan en la capa externa de la membrana. Los azúcares hidrófilos se disponen sobre la superficie de la membrana, en el medio acuoso que rodea la célula. En perpendicular queda la región hidrófoba de la molécula, la ceramida, que ancla la estructura entera en la bicapa. La membrana aloja igualmente otras muchas moléculas, así glicoproteínas, otros tipos de glicolípidos y colesterol (no mostradas aquí). La porción periférica de la cadena de carbohidrato de los glicoesfingolípidos puede presentar la misma estructura que la parte periférica de la cadena de carbohidrato que se encuentra unida a las glicoproteínas. El color señala esas similitudes. El diagrama de la izquierda muestra los efectos de las interacciones que se establecen entre glicoesfingolípidos y otras moléculas de la superficie celular. Los glicoesfingolípidos cuyas cadenas de carbohidratos quedan expuestas en la superficie pueden actuar de receptores de l igandos que se unen a la célula (a). También pueden asociarse a otros glicoesfingolípidos (b) o a proteínas de membrana (c).
TEMAS 3
CERAMIDA ESFINGOSINA CERAMIDA O
GLUCOSA GALACTOSA ACIDO SIALICO
UNION AL RESIDUO DE AZUCAR
H
H
H
C
C
C
C
H
H N
OH
H
C
H
H
C
C
H
H
H
L-FUCOSA N -ACETILGALACTOSAMINA
antígenos de grupos sanguíneos ha permitido establecer un nexo de unión entre la poderosa metodología inmunológica y un conjunto importante y diverso de conocimientos bioquímicos. Una consecuencia de ello es la verificación de que los cambios de antígenos de grupos sanguíneos observados cuando se origina un cáncer pueden generalizarse a otro tipo de moléculas. Los bioquímicos han identificado otros glicoesfingolípidos no relacionados con los antígenos de grupos sanguíneos, cuya composición y metabolismo se alteran espectacularmente cuando una célula normal se transforma en cancerosa por distintos agentes víricos y químicos. Los análisis inmunoquímicos de los glicoesfingolípidos tumorales demuestran que muchos antígenos asociados a procesos cancerosos son formas de antígenos de grupos sanguíneos modificadas químicamente.
E
sos importantes descubrimientos experimentales han avivado el interés por conocer la estructura fundamental de los glicoesfingolípidos y su papel en la vida de la célula. El primero de éstos lo halló, en 1874, Johann Ludwig W. Thudichum, en el
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
H
C
C
H
. ..
C
H
H
H
H
H
H
H
C
C
C
C
C
H
H
H
H
H
. ..
H
COLA DE ACIDO GRASO
N -ACETILGLUCOSAMINA
3. ESTRUCTURA MOLECULAR de los glicoesfingolípidos más importantes, presentada de forma esquemática. Arriba se muestra un diagrama detallado de la ceramida. En el resto de los dibujos esa molécula se presenta como un pequeño rectángulo de color amarillo, unido a las cadenas de azúcares, que aparecen como hexágonos de color de acuerdo con las indicaciones de la clave de la izquierda. Los glicoesfingolípidos de la fila superior no se ajustan a ninguna de las cuatro estructuras básicas comunes a la mayoría. En la segunda fila se muestran las moléculas de la serie ganglio, en la tercera las de la globo y, en las dos inferiores, las de lacto. El glicoesfingolípido Lea es la única molécula que pertenece a la serie lacto de tipo 1; las demás son del tipo 2.
H
LACTOSILCERAMIDA
GALACTOCEREBROSIDO
GD3 GM3
GM1
SSEA-4
GALACTOGLOBOSIDO (SSEA-3)
Lea
Lex DIMERICO (FH4)
cerebro. Thudichum lo denominó cerebrósido. Investigadores posteriores encontraron que el cerebro y los tejidos nerviosos son ricos en glicoesfingolípidos. De hecho, durante muchos años los principales estudios sobre esos compuestos los realizaron neurobiólogos y neuroquímicos. Pese al volumen de tra ba jos acumula dos desde entonces, el romántico prefijo de esfingo, introducido por Thudichum, no ha perdido validez. En la mitolog ía griega, la monstruosa Esfinge, parte
HEPTASACARIDO Lex (SSEA-1)
Ley
mujer y parte león alado, aterrorizó la ciudad de Tebas, devorando a todo aquel infeliz que no acertara a resolver sus enigmas. La función de muchos glicoesfingolípidos en las estructuras neuronales sigue constituyendo un enigma. Se conoce desde hace tiempo la estructura molecular de los glicoesfingolípidos. La morfología de la molécula recuerda una L: uno de los brazos lo forma una cadena de carbohidrato, esto es, de residuos de azúcar. El otro
83
GLICOESFINGOLIPIDO PRECURSOR
GLICOESFINGOLIPIDO INTERMEDIO
ANTIGENO ANTIGENO
ANTIGENO
ANTIGENO
A2
ANTIGENO
A1
A
ANTIGENO
P 1
ANTIGENO
H
ANTIGENO
P k
P (GLOBOSIDO)
B
A
ANTIGENO DE FORSSMAN
4. ANTIGENOS DE LOS GRUPOS SANGUINEOS, de importancia clínica fundamental en relación con los problemas de compatibilidad de sangre y tejidos. También son glicoesfingolípidos. El diagrama muestra las interrelaciones qu ímicas y estructurales de dos sistemas de grupos sanguíneos. Los colores utilizados responden también a la clave de la figura 3. El sistema mejor conocido es el ABH , aunque la molécula precursora de todos los antígenos que pertenecen a ese sistema es la misma que la del sistema P (arriba). Todas las células pueden clasificarse de acuerdo con cada uno de esos sistemas. En el sistema ABH , las células de tipo O presentan una molécula precursora intermedia y el antígeno H . Además, las células de tipo A y B presentan los antígenos A y B, respectivamente. Las células de tipo AB ofrecen los cuatro antígenos. En algunas personas de tipo A ese antígeno presenta una forma más larga, que se conoce como A1. En otras, las de tipo A2, la cadena no se alarga tanto. Las estructuras de los antígenos A1 y A2 las determinaron Henrik Clausen y Levery. En el sistema P, las raras células del tipo P k sólo expresan el antígeno P k y su precursor glicoesfingolípido. Las células de tipo P2 presentan ambos antígenos, el P k y el P, o globósido, derivado del primero. Las células del tipo P1 presentan el antígeno P1 además de los antígenos del sistema P propios de las de tipo P2. Donald M. Marcus resolvió la estructura del sistema P. Aproximadamente una de cada cinco personas lleva en sus tejidos el antígeno Forssman, que deriva del globósido.
84
es un lípido denominado ceramida [véase la figura 3 ]. Los dos brazos de la L constituyen, pues, dos componentes distintos. La cadena de carbohidrato es hidrófila e interactúa con el medio acuoso que rodea a la célula. El segundo componente, la ceramida, es hidrófobo y tiende por tanto a repeler las moléculas de agua de la vecindad. Tanto la ceramida como la cadena de carbohidrato presentan gran variabilidad estructural. Se conocen hasta 130 variedades de glicoesfingolípidos; de ellas, unas 40 corresponden a la estructura denominada ganglio, 10 a la estructura globo y 60 a la lacto, según la secuencia de azúcares que compongan la cadena de carbohidrato y la naturaleza de los enlaces que unan los azúcares [véase la figura 1 ]. El resto de los glicoesfingolípidos permanece sin clasificar. Es limitado el número de combinaciones que se pueden dar entre los componentes de un glicoesfingolípido, pues ciertas estructuras de carbohidratos se unen preferentemente a determinadas ceramidas, según se encuentren en unas células y tejidos u otros. menudo, la misma secuencia de azúcares que hay en la estructura lacto (pero no en las ganglio o globo) aparece unida a proteínas. Dado que la especificidad antigénica suele depender de la secuencia del azúcar, y no del sustrato de ceramida o proteína al que vaya unido, los anticuerpos de los antígenos que constituyen los grupos sanguíneos pueden también reconocer ciertas glicoproteínas. El reconocimiento de las cadenas de azúcares presentes en las glicoproteínas explica la presencia de antígenos de los grupos sanguíneos en los revestimientos mucosos, así como en las secreciones. Los gangliósidos, clase importante de glicoesfingolípidos descubierta en 1936 por Ernst Klenk, ilustran ese tipo de distribución de los glicoesfingolípidos en función del tejido. Klenk sólo encontró gangliósidos en el cerebro, si bien posteriormente otros in vestigadores los han hallado también en las membranas celulares de todos los tejidos. Los gangliósidos se caracterizan por poseer en sus cadenas de carbohidratos un azúcar acídico, el ácido siálico. Ciertas membranas de las neuronas son particularmente ricas en gangliósidos que contienen más de un tipo de ácido siálico en sus cadenas de carbohidratos. Sus patrones de distribución difieren de unas células a otras y de unas
TEMAS 3
especies a otras, como ya sugiriera Tamio Yamakawa en 1952. La inclusión de las moléculas de glicoesfingolípidos en las membranas celulares resulta favorecida desde el punto de vista energético. Y la mayoría lo está. La membrana celular viene a ser (según un modelo simple) una bicapa formada principalmente por fosfolípidos y colesterol. La molécula de fosfolípido, como el glicoesfingolípido, posee una cabeza hidrófila y dos colas hidrófobas compuestas por carbohidratos. En un recipiente lleno de agua, las moléculas de fosfolípidos y de colesterol forman espontáneamente una vesícula esférica cuyo es pesor equivale a dos capas de moléculas. Los grupos hidrófilos de la capa interna se disponen mirando hacia el agua del interior de la vesícula y, los de la capa externa, hacia el agua situada fuera de la vesícula. Las colas hidrófobas de las dos capas de moléculas que forman la superficie de la vesícula no quedan, por tanto, en contacto con el agua. Las membranas celulares presentan ese mismo tipo de organización general que las moléculas de fosfolípidos. La matriz de fosfolípido y colesterol puede, no obstante, contener otras muchas sustancias, fundamentalmente moléculas de proteína y glicoesfingolípidos. En general, la membrana plasmática que reviste la superficie celular es mucho más rica en glicoesfingolípidos que las membranas de los orgánulos intracelulares. Además, los glicoesfingolípidos de la membrana plasmática parecen localizarse exclusivamente en la parte externa de la bicapa. Las dos colas de carbohidratos de la ceramida se anclan en el interior hidrófobo de la membrana y le confieren rigidez estructural. La cadena de carbohidrato se sitúa en el exterior de la superficie celular, casi en perpendicular a las colas de carbohidrato. Tal disposición expone las moléculas a las sustancias extracelulares, a menos que las oculten proteínas u otros glicoesfingolípidos alojados en las inmediaciones. Una de las consecuencias más importantes que se derivan de la naturaleza glicoesfingolipídica de los antígenos de los grupos sanguíneos es que son productos génicos secundarios. En otras palabras, su estructura no la determina el ADN igual que determina la secuencia de aminoácidos de una proteína. La síntesis de un glicoesfingolípido contempla una serie de reacciones, catalizadas por las enzimas glicosiltransferasas. Tales enzimas determinan, en la membrana, la secuencia del azúcar.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
100 A L O A N R E A G I ) P T E S J N A A A T V I E N50 T I D E S C A I O R P C O N P S ( E A L S E U L R E P C
ANTIGENOS SSEA-3 Y SSEA-4
Ley
ANTIGENO SSEA-1 (HEPTASACARIDO Lex)
0 1
2
4
8
16
32
64
NUMERO DE CELULAS
COMPACTACION
5. PATRON DE APARICION y desaparición de algunos antígenos gl icoesfingolípidos, en función del estadio de preimplantación del embrión de ratón. El antígenoSSEA-1 aparece en el estadio de 8 a 32 células; su concentración desciende rápidamente t ras agruparse las células en el estadio denominado de compactación (línea de color ). Según disminuye el nivel de SSEA-1, aumenta el del antígeno Le y ( curva gris), de características químicas muy similares a las del SSEA-1, pues posee una fucosa adicional en la galactosa terminal. Los antígenos SSEA-3 y SSEA-4 presentan un alto nivel de expresión hasta la fase temprana de la compactación, desapareciendo casi por completo en el estadio de 32 células (línea negra). Los glicoesfingolípidos mencionados quizás intervengan en la regulación del reconocimiento intercelular y el crecimiento de los tejidos.
Reconocen secuencialmente un nucleótido de azúcar, la molécula que dona el azúcar, así como un sustrato precursor, al que se transfiere el residuo. Las únicas moléculas que participan en el proceso cuyas estructuras se transcriben directamente a partir del ADN son las enzimas glicosiltransferasas. Saul Roseman propuso que la síntesis de gangliósidos seguía ese mecanismo.
L
a síntesis de glicoesfingolípidos está sujeta a dos tipos de control. El primero es común a la síntesis de muchas otras enzimas: la transcripción de la secuencia de bases del ADN y su traducción en las correspondientes enzimas puede acelerarse o reprimirse activando o inhibiendo secuencias especiales de ADN, los promotores, secuencias exaltadoras. O bien, puede alterarse con gran rapidez la actividad de las glicosiltransferasas en las membranas por medio de pequeñas modificaciones químicas de moléculas de enzimas ya existentes. Tales modificaciones influyen tanto en la distribución de las enzimas por las membranas como en las interacciones que establezcan con los sustratos allí presentes. Es más, la expresión de los glicoesfingolípidos en la superficie de
las membranas celulares no sólo depende de su tasa de síntesis, sino también de su organización y de la que adopten otras moléculas de membrana. Su accesibilidad a los anticuerpos u otras sustancias externas puede verse afectada por la proximidad que guarden con otras moléculas [ véase la figura 2]. La existencia de más de un mecanismo de control de la expresión de los glicoesfingolípidos determina que su concentración sobre la superficie celular resulte mucho más sensible a los cambios del medio ambiente, por pequeños que sean, que, por ejemplo, la concentración de una proteína. Los rápidos cambios de la expresión de los glicoesfingolípidos podrían derivar de una regulación coordinada de los genes que determinan las enzimas implicadas en su síntesis, de la competencia entre varias enzimas por su sustrato o de un cambio de orientación y exposición de los antígenos glicoesfingolipídicos que se hallen ya sobre la superficie celular. En mi laboratorio, y en otros, se ha comprobado recientemente que durante el desarrollo embrionario ciertos glicoesfingolípidos se exhiben en algunos tipos celulares durante muy breve tiempo. Sugieren esos hallazgos
85
que los glicoesfingolípidos guardan una estrecha relación con los mecanismos de crecimiento y diferenciación celular. A las células, que han de enfrentarse con los continuos cambios que se dan durante el desarrollo, les debe resultar más eficaz alterar glicoesfingolípidos que proteínas. Según parece, los glicoesfingolípidos influyen sobre la célula y su crecimiento de dos formas principales. Modulan las funciones de algunas de las proteínas que residen en la membrana plasmática y actúan, junto con las proteínas, como marcadores de superficie, necesarios para mantener una adecuada comunicación intercelular. Los primeros indicios de que los glicoesfingolípidos intervenían en el funcionamiento de las proteínas de membrana se obtuvieron tras comprobarse que ambos tipos moleculares se encontraban estrechamente asociados en las membranas. Tal proximidad quedó demostrada en los estudios de Clifford Lingwood y en los de Tae Hwa Ji. Ranwel Caputto y sus colaboradores encontraron que los glicoesfingolípidos del cerebro activaban la ATPasa, proteína que libera la energía necesaria para la transmisión de mensajes por los nervios. Las proteínas receptoras, incrustadas en la membrana plasmática, cons-
tituyen a menudo uno de los eslabones induce la incorporación de un grupo fundamentales de la compleja secuen- fosfato en el receptor, acción que cia de acontecimientos previos a la parece instarle un cambio conformamitosis, que así se llama el proceso de cional; ese tipo de alteraciones perdivisión de las células somáticas. mite la agrupación de los receptores Estudios recientes realizados por Eric en la superficie de la membrana. Los Bremer, en colaboración con Daniel F. receptores, y los factores de creciBowen-Pope, Elaine W. Raines y miento que llevan unidos, penetran, a Russel Ross, indican claramente que continuación, en la célula. ciertos glicoesfingolípidos pueden Cuando se añaden los glicoesfinromper ese eslabón e inhibir el creci- golípidos GM 1 o GM 3 a células culti vad as en presen cia de fac tor es de miento celular. crecimiento, queda bloqueada la n circunstancias normales, para prolife ración celular. Es más, las que las células animales sufran proteínas receptoras de las membramitosis se requiere la presencia de nas de las células cuya proliferación ciertas hormonas extracelulares espe- se inhibe ante GM 1 o GM 3 no tienen cíficas, denominadas factores de cre- el grupo fosfato, efecto que parece cimiento, que se unen a proteínas específico de GM 1 y GM 3 ; ningún receptoras específicas en determina- otro glicoesfingolípido provoca esos dos puntos de la parte externa de la resultados. Razonamos, en consemembrana plasmática. Las proteínas cuencia, que el funcionamiento del receptoras son macromoléculas aloja- receptor es sensible a los glicoesfindas en la membrana; parte de la molé- golípidos que le rodean. Merece cula queda en el interior de la célula señalarse que, cuando las células y parte en el exterior. La porción cito- sufren transformación por virus plasmática es en realidad una enzima, tumorígenos, las correspondientes cuya misión consiste en catalizar la células tumorales presentan un conadición de grupos fosfato a diversas tenido más bajo de GM 3 en algunos proteínas del citoplasma, incluido el tipos de tumor y de GM 1 en otros. propio receptor. Por lo que se ve, Las reducciones pueden correlaciocuando el factor de crecimiento se une narse con una pérdida del control al receptor, la enzima asociada con su sobre el desarrollo celular ejercido porción citoplasmática se activa e por los glicoesfingolípidos.
E
MEMBRANA DE LA CELULA A
BACTERIA E. COLI
PROTEINA DE LAS FIMBRIAS GLICOESFINGOLIPIDO DE LA SERIE GLOBO
GLICOESFINGOLIPIDO Le x
ESTRUCTURA COMPLEMENTARIA DE Le x
MEMBRANA DE LA CELULA B
6. RECONOCIMIENTO INTERCELULAR, esquematizado en dos supuestos, según parece que se desarrolla entre dos células animales y entre una bacteria y una célula hospedadora. Las proteínas de membrana de las dos células animales ( izquierda) reconocen la estructura del antígeno SSEA-1 alojado en la superficie de la célula contraria. Tal reconocimiento es típico de los embriones de 8 a 32 células, no implan-
86
MEMBRANA DE LA CELULA HOSPEDADORA
tados aún. Las proteínas de las fimbrias de una bacteria Escherichia coli patógena (derecha) reconocen los azúcares internos de los glicoesfingol ípidos de la serie globo presentes en una célula hospedadora y los utilizan como sitios de infección. Los azúcares de los glicoesfingolípi dos se han coloreado de acuerdo con la clave de la figura 3. (Dibujos de Hank Iken.)
TEMAS 3
No debe concluirse, sin embargo, que los glicoesfingolípidos estén siempre asociados con la inhibición del crecimiento y la diferenciación celular. Estudios realizados por Yoshitaka Nagai y sus colaboradores indican que la adición de otro glicoesfingolípido, el llamado GQ1b, a neuronas tumorales embrionarias induce la formación de células nerviosas maduras, además de otros muchos cambios. Luego Masaki Saito, Hisao Nojiri y sus colaboradores observaron que cuando ciertas células de leucemia de ratón se incuban con GM 3 se diferencian en macrófagos.
A
demás del papel que desempeñan en la regulación de proteínas, a los glicoesfingolípidos les corresponden ciertas funciones celulares propias. La más importante es la de acuñar diferencias, en el nivel celular, entre las especies, entre los individuos de una misma especie e incluso entre células de un mismo individuo. Los antígenos de grupos sanguíneos constituyen un buen ejemplo de la variación de los glicoesfingolípidos entre individuos de la población humana. El estudio de los cambios que sufren los marcadores glicoesfingolípidos durante el desarrollo celular normal y durante el canceroso ha despertado gran interés. Es el caso, por ejemplo, del antígeno SSEA-1 (por stage-specific embryonic antigen), descubierto por Davor Solter y Barbara B. Knowles. Para detectar la presencia de ese antígeno se utilizan anticuerpos específicos contra él. Se comprueba así que no está en el óvulo fecundado, el hue vo, aunque a veces se le detecta entre la tercera y quinta división celular, es decir, en embriones formados por 8 o 32 células. En ese estadio, las células del embrión sufren el denominado proceso de compactación, durante el cual se adhieren fuertemente unas a otras para maximizar sus contactos intercelulares. Superado el proceso, la concentración de SSEA-1 desciende rápidamente. Reiji Kannagi, Steven B. Levery, Edward Nudelman, Ten Feizi y sus colaboradores identificaron la estructura química del SSEA-1. Se trata de una cadena de carbohidrato, Le x, situada en un glicoesfingolípido o en una glicoproteína. Bruce Fenderson y Uri Zehavi, Susan J. Kimber y sus colaboradores descubrieron que cuando se añade Le x o su estructura conjugada a embriones, se inhibe la compactación en el estadio de 16 a 32 células. Presumiblemente, la presencia de la estructura Le x en una célula
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
7. ANTIGENO FH4, cuya presencia está asociada con un tumor, representado aquí por un modelo generado por ordenador. En el dibujo de la izquierda el área sombreada corresponde a la región hidrófoba de la molécula, que quizás interactúe con los anticuerpos. El antígeno FH4 ha resultado ser la forma dimérica del glicoesfingolípido Le x y presenta un elevado nivel de expresión en cánceres humanos derivados de células gastrointestinales. El modelo (arriba) es obra de Levery, Stenkamp y Watenpaugh.
le permite “percibir” la cercanía de dole impermeabilidad al agua y a los otras células. Al añadir Le x se entor- electrólitos hidrosolubles de la célula. pece el complejo proceso de adhesión Gracias a los trabajos de van Heycelular, basado probablemente en una ningen se avivó el interés por deterafinidad específica entre Le x y sus minar si nuevos glicoesfingolípidos receptores superficiales. La compac- actuarían también de receptores de tación seguirá la pauta apropiada al otras toxinas y factores bioactivos. descender el nivel de Le x después del Algunos investigadores han demostrado que los gangliósidos interactúan estadio de 32 células. Según parece, muchas toxinas bac- (aunque no necesariamente como terianas, así como organismos víricos receptores) con muchas sustancias de y microbianos, explotan esa capacidad importancia biológica, como la toxina de los glicoesfingolípidos de mediar en del botulismo, el interferón, las interlas interacciones entre las células y su leucinas, la serotonina, las hormonas medio ambiente. Las primeras prue- y el virus Sendai. Vari os grupos de inve stig adores bas de que los gangliósidos interactuaban con la toxina del tétanos las obtuvo han obtenido pruebas de que ciertos William E. van Heyningen, hace ya glicoesfingolípidos específicos de la muchos años. Estudios posteriores superficie de una célula hospedadora indican que el gangliósido GM 1 es el interactúan con proteínas de parásireceptor específico de la toxina del tos víricos y bacterianos. Investigatétanos y también de la del cólera. dores de Finlandia y Suecia descubrieEsta última no invade la célula, sino ron que ciertas estirpes de la bacteria que actúa sobre la membrana, restán- Escherichia coli que producen pielo-
87
nefritis, una infección de las vías urinarias y de los riñones, presentan en su superficie unas estructuras fibrilares finas: fimbrias. Las proteínas de las fimbrias interactúan con el glicoesfingolípido globósido y con sus precursores químicos. Probablemente constituya esa interacción el primer paso de la infección de la célula hospedadora. Karl-Anders Karlson y sus colaboradores marcaron radiactivamente la bacteria E. coli causante de las infecciones urinarias. Investigaron entonces las interacciones que se establecían entre esas bacterias y un grupo de glicoesfingolípidos que habían separado en una capa fina de gel de sílice. De los 32 glicoesfingolípidos ensayados, los únicos que se unían a las bacterias eran los portadores de cierta cadena de tres azúcares empalmada a la ceramida de la molécula. Si a esa cadena de tres azúcares se le añadían otras cadenas de azúcares dispuestos de forma arbitraria, las
bacterias no se unían. Sugieren esos experimentos que las proteínas de superficie de las bacterias son capaces de reconocer breves secuencias internas de azúcares que podrían exhibir una gama amplia de glicoesfingolípidos de la célula hospedadora.
C
on las técnicas de Karlson se han fijado también los puntos de unión de ciertos tipos de bacterias de la “flora intestinal” normal del tubo digestivo. Se trata de bacterias inofensivas y beneficiosas para el hospedador, pues inhiben el crecimiento de las patógenas. Así, por ejemplo, las propionibacterias, comunes en el intestino, poseen una proteína de superficie capaz de unirse a un glicoesfingolípido muy común: la lactosilceramida. La estructura de carbohidrato de la lactosilceramida es el precursor químico de la mayoría de los glicoesfingolípidos conocidos. De hecho, los dos azúcares que se enlazan al componente ceramídico de la lacto-
8. EXPRESION DEL ANTIGENO FH4 en ciertas fases del desarrollo humano y en un tumor gastrointestinal. La tinción castaño oscura de las fotomicrografías corresponde a la unión del anticuerpo monoclonal FH4 con el antígeno. La coloración de la foto superior izquierda indica un elevado nivel de expresión del antígeno en células epiteliales de estómago de un embrión de algo más de cinco semanas (38 días). La de la parte superior derecha muestra las células epiteliales de estóma-
88
silceramida son idénticos a los dos primeros azúcares de la cadena de tres reconocida por la bacteria E. coli que provoca las infecciones urinarias. Mientras que las toxinas y las infecciones víricas o bacterianas se sirven de los glicoesfingolípidos presentes en las células sanas, el crecimiento canceroso está claramente asociado a glicoesfingolípidos alterados. No cabe duda de que ese cambio expresa alguna anormalidad subyacente. Cualquiera que sea la causa, la alteración de la población de glicoesfingolípidos podría obstruir una parte esencial de los recursos de que dispone la célula para mantener su vida social ordenada. No sorprendería descubrir que la alteración glicoesfingolipídica fuese una de las causas principales de las caóticas e indisciplinadas interacciones sociales que son características de las células cancerosas. El tipo de cambio producido en los glicoesfingolípidos depende de la
go de un feto de 120 días. En este caso sólo se colorea la parte más interna de los pliegues del revestimiento del estómago. El epitelio del estómago de adultos prácticamente no se tiñe (abajo, a la izquierda). En la imagen inferior derecha se observa coloración en las células correspondientes a un cáncer de estómago, pero no en las normales. Los antígenos que se expresan tanto en células tumorales como durante el desarrollo fetal se denominan oncofetales.
TEMAS 3
célula hospedadora y del agente canA cerígeno. Algunas células tumorales B acumulan glicoesfingolípidos simples; quizás esté bloqueada la síntesis de 4 los más complejos, derivados de aqué- H F llos. Otras, en particular las proceden- O N tes de cánceres epiteliales humanos, E G I ) sintetizan cadenas de carbohidratos T S N A I poco usuales y acumulan nuevos gli- A L R A E coesfingolípidos: los neoglicolípidos. R D T Tanto los glicoesfingolípidos precur- N I B EPITELIO O EPITELIO I R sores como los neoglicolípidos se iden- S A DE ESTOMAGO DE COLON E tificaron como antígenos asociados a R S E INTESTINO E P D X tumores en estudios clásicos realiza- E A D dos con anticuerpos de conejo. Pero esa E I N D U comprobación de que las células tumo- D ( A rales generaban variantes glicoesfin- I D golipídicas no pudo explotarse conve- S N C D nientemente hasta el desarrollo de los E T N I anticuerpos monoclonales, técnica que pusieron a punto en 1976 George Kohler y Cesar Milstein. Los anticuer0 1 2 3 4 5 7 9 pos monoclonales poseen una gran EDAD DEL EMBRION (SEMANAS) afinidad específica por un solo antígeno. Se identifica rápidamente la 9. NIVELES DE EXPRESION del antígeno FH4 durante el desarrollo fetal humano. presencia de un antígeno por medio de En las células epiteliales del estómago la expresión de FH4 alcanza su máxima inun anticuerpo monoclonal unido a una tensidad cuando el embrión tiene entre cinco y siete semanas. En el epitelio de colon e intestino la intensidad máxima se observa entre las siete y nueve semanas. molécula marcada. Para elaborar una abundante can- En cánceres diferenciados de estómago o de colon el nivel de expresión del antígetidad de anticuerpos monoclonales no FH4 es comparable al del epitelio letal ( A, B). En cánceres indiferenciados de estómago o de colon no se expresa el antígeno FH4. Esas células cancerosas se paespecíficos de antígenos de tumor es recen a las células embrionarias de los estadios tempranos (C, D). preciso inyectar primero el antígeno en ratones. Se fusionan luego células de bazo del ratón inmunizado con que reaccione preferentemente con el reciendo en las células del recién células de tumor de ratón. Las células antígeno que se había preparado con nacido y el adulto [ véase la figura 8 ]. Los antígenos de superficie que exhiasí obtenidas, denominadas hibrido- anterioridad. mas, combinan la capacidad de creciHemos aplicado ese procedimiento ben ese comportamiento se denominan miento ilimitado propia de las células a la elaboración de anticuerpos mono- antígenos oncofetales, pues se encuendel tumor con la capacidad de las célu- clonales dirigidos contra una amplia tran en cantidades similares tanto en las del bazo para generar anticuerpos. variedad de nuevas estructuras aso- células cancerosas como en ciertos Ya se han identificado y caracterizado ciadas con tumores. En sus estudios momentos del desarrollo de algunos químicamente, en razón de su especi- sobre los antígenos Le x y Le y, regula- tipos de células embrionarias. Se conoficidad por anticuerpos monoclonales, dos en función del desarrollo, Nu del- cen ya varios antígenos oncofetales. más de diez tipos de antígenos glico- man, Levery y Kannagi encontraron Vale también de ejemplo un derivado esfingolipídicos asociados a tumores. que muchos tejidos tumorales poseían siálico de la forma Le x dimérica, defigran cantidad de glicoesfingolípidos nido antigénicamente por el anticuerpo ada hibridoma produce un anti- muy parecidos a Le x y Le y. Entre los FH6. Abunda en los tejidos fetales, cuerpo distinto, lo que obliga a nuevos antígenos se contaban formas pero no en el tejido gastrointestinal seleccionar los adecuados. La mayoría diméricas y triméricas de Le x y formas adulto, aunque sí va asociado con de los inmunólogos que trabajan con que llevaban unidas ácido siálico. tumores gastrointestinales. Ese tipo tumores se sirven al efe cto de la estra- Yasuo Fukushi y Kazuo Abe han con- de hallazgos supone un sólido apoyo tegia de la perdigonada: inyectan en el seguido anticuerpos monoclonales experimental a las frecuentes obserratón antígenos sin caracterizar, pro- capaces de distinguir varios tipos dife- vaciones de que las células cancerosas se parecen a las células, relativamente cedentes de tejidos tumorales, y a con- rentes de Le x. Uno de esos anticuerpos, denomi- indiferenciadas, de los primeros estatinuación, entre los hi bridomas resultantes, buscan los que reaccionan nado FH4, reacciona específicamente dios del desarrollo embrionario. Otro antígeno oncofetal importante contra los antígenos específicamente con el antígeno Le x dimérico, pero no asociados al tumor. En nuestro labo- con su forma simple. Utilizando ese es el derivado siálico de un glicoesfinratorio utilizamos un método menos anticuerpo, convenientemente mar- golípido llamado antígeno Lea. Hilary convencional. En primer lugar obte- cado, Fukushi encontró que las célu- Koprowski y sus colaboradores logranemos y caracterizamos química- las epiteliales gástricas de embriones ron obtener un anticuerpo monoclomente un glicoesfingolípido asociado de 35 a 45 días presentaban un alto nal contra el antígeno Lea. El antícon un tipo específico de cáncer. A nivel de expresión de la forma dimé- geno fue aislado y luego carac terizado continuación se inyectan en el ratón rica de Le x. En los fetos de 100 días el por Victor Ginsburg, John L. Magbacterias recubiertas con el glicoesfin- antígeno se expresaba sólo en las nani y sus colaboradores. Dado que los golípido. De esa manera, lo que se áreas más ocultas y profundas del anticuerpos monoclonales sólo se busca posteriormente es un hibridoma epitelio gástrico e intestinal, desapa- unen a la cadena de carbohidrato del
C
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
89
glicoesfingolípido, también reconocen a esas cadenas cuando las portan glicoproteínas del suero que no están unidas a células. Los anticuerpos contra los derivados siálicos de los glicoesfingolípidos Lea y Le x, por ejemplo, reaccionan con el suero de pacientes que padecen cáncer. Los antígenos circulantes se detectan con facilidad, por lo que su presencia resulta muy útil en el diagnóstico oncológico. El estudio de ese tipo de antígenos constituye uno de los principales objetivos de las investigaciones clínicas. Los antígenos glicoesfingolipídicos unidos a células constituyen la gran esperanza de la lucha contra el cáncer. Le x y sus análogos, las formas Le x y Le y diméricas y triméricas, por ejemplo, están asociados a células tumorales y no se encuentran libres en el suero. En principio, y una vez identificados los anticuerpos específicos de antígenos asociados a tumores, podría administrarse a los pacientes tales anticuerpos, que detectarían preferentemente las células cancerosas que presentan poblaciones alteradas de antígenos asociados a tumores y las destruirían por medio de complejos mecanismos instados por los propios anticuerpos y por ciertos tipos de células especializadas. La desaparición gradual del tumor maligno de la mujer de grupo sanguíneo p respondió, sin saberse, a ese mecanismo. Los trabajos inmunológicos han demostrado que muchos anticuerpos monoclonales dirigidos contra antígenos asociados a tumores son, en realidad, específicos de glicoesfingolípidos. Los resultados de al menos dos estudios clínicos parecen justificar algunas de las esperanzas más optimistas. En uno de ellos, un grupo de investigadores dirigidos por Lloyd J. Old y Kenneth O. Lloyd desarrollaron un anticuerpo con gran afinidad por el glicoesfingolípido GD 3 . Alan N. Houghton y sus colaboradores administraron el anticuerpo a 12 pacientes con melanoma, una forma virulenta de cáncer que produce tumores oscuros en la piel y que, en última instancia, genera metástasis e invade diversos órganos. En tres de los 12 pacientes se observó una clara regresión del melanoma y otros cuatro mostraron una respuesta variada. En el segundo de los estudios, Ronald B. Herberman administró anticuerpos anti-GD3 a otros 12 pacientes de melanoma. El anticuerpo lo prepararon y caracterizaron Ralph A. Reisfeld y sus colaboradores. Nue vamente el anticuerpo resultó eficaz en tres de
90
los 12 casos, aunque otros tipos de anticuerpos antimelanoma no surgieron efecto. Aunque el glicoesfingolípido GD3 se halla en cantidades moderadas en tejidos normales del riñón y en cantidades más elevadas en la retina, ninguno de los pacientes sufrió daños en esos órganos que fuesen imputables al tratamiento con los anticuerpos. Los únicos efectos negativos observados fueron reacciones inflamatorias de la piel alrededor del melanoma, observaciones que resultan muy alentadoras y sugieren que los antígenos glicoesfingolipídicos de las células tumorales son más susceptibles de ataque por parte de los anticuerpos que los mismos antígenos presentes en tejidos normales.
S
e han propuesto varias estrategias para eliminar o matar las células tumorales, basadas en la especificidad de los anticuerpos monoclonales. De utilizarse anticuerpos unidos a isótopos radiactivos, éstos se adherirían a las células tumorales y las irradiarían o indicarían con precisión su posición en el cuerpo. Todo ello facilitaría el tratamiento radiactivo ulterior o la extirpación quirúrgica del tumor. Si los anticuerpos portaran drogas tóxicas se mataría, también de forma selectiva, las células tumorales.
No se olvide que los anticuerpos constituyen el medio natural y más eficaz de que se sirve el organismo para aislar y acabar con las células enfermas. Un anticuerpo monoclonal, como cualquier otro anticuerpo, no sólo se une a la célula que posee un determinado antígeno, sino que también la señala para que el sistema inmunológico del organismo la destruya. El afortunado accidente clínico ocurrido hace ya tantos años podría traducirse, gracias a los trabajos de muchos investigadores, en el origen de un tratamiento fácil y eficaz contra muchas formas de cáncer.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA HANDBOOK OF LIPID RESEARCH, VOL. 3: SPHINGOLIPID BIOCHEMISTRY. Dirigido
por J. N. Kanfer y S. Hakomori. Plenum Press, 1983.
A R EVIEW OF THE I MMUNOGENIC AND I MMUNO -M OLUDATORY P ROPERTIES OF GLYCOSPHINGOLIPIDS . D. M. Marcus en
Molecular Immunology ,
vol. 21, n.o 11, págs. 1083-1091; noviembre, 1984.
TUMOR-ASSOCIATED CARBOHYDRATE A N-
TIGENS . Sen-itiroh Hakomori en Annual Review of Immunology, vol. 2, págs. 103-
126; 1984.
La vitamina A y su cohorte Tim Beardsley
L
os antiguos egipcios sabían que en el hígado hay poderosos elementos medicinales. Solían tratar con jugos extraídos de esta víscera la ceguera nocturna y otras enfermedades de los ojos. Al principio activo que mejoraba la visión del egipcio se le conoce hoy por retinol o vitamina A. Pero esta sustancia química liposoluble sirve para muchas cosas más, amén de excitar el pigmento sensible a la luz que posibilita la visión. La vitamina A y su familia pertenecen a un grupo escogido de sistemas maestros de control que orquestan la formación y el funcionamiento de la célula y desempeñan un papel clave para protegerla contra el cáncer. Para George Wolf, de la Universidad de California en Berkeley, “la vitamina A ha pasado a ocupar una posición central en la biología”. Efectivamente, uno de sus productos, el ácido retinoico, interviene en la diferenciación celular de los embriones. Un error genético que afecta a su acción desemboca en una forma de leucemia. Y otras variantes químicas de la vitamina A, los retinoides, son poderosas—y peligrosas—drogas: una de ellas protege contra ciertos cánceres, pero también es causa de defectos de nacimiento. El cuerpo extrae la vitamina A de los alimentos, bien sea directamente o bien fragmenTEMAS 3
tando betacarotenos, pigmentos de color anaranjado que dan ese tono a las zanahorias. En los países industrializados, es casi desconocida la deficiencia de vitamina A, pero, según una estimación, 500.000 niños pierden cada año la vista en los países pobres por falta de esta vitamina. Y muchos hasta mueren. La deficiencia de vitamina A impide el crecimiento y aumenta la sensibilidad a las infecciones.
L
a vitamina A ejerce su poder protector actuando en las células que tapizan la piel, la córnea, los pulmones y el tracto digestivo. Las anomalias cutáneas, algunas de las cuales semejan alteraciones cancerosas, fueron los primeros entre los muchos efectos de la deficiencia de vitamina A que se observaron en humanos. Ya a comienzos de nuestro siglo los investigadores se percataron de que una carencia grave de esta vitamina origina en las ratas cáncer de estómago. Intrigados, los investigadores han experimentado con retinoides sintéticos. Uno de ellos, el ácido trans-retinoico, se emplea para el tratamiento del acné grave. Otros retinoides y el betacaroteno suprimen las alteraciones malignas en células desarrolladas en cultivo y en animales de experimentación. Richard C. Moon, del Instituto de Tecnología de Illinois, ha demostrado que un retinoide sintético llamado 4-HPR suprime los cánceres de mama en las ratas. Los datos epidemiológicos proporcionan ulteriores pruebas de que hay un nexo entre los retinoides y el cáncer. Muchos investigadores han confirmado que quienes contraen la enfermedad es probable que tengan bajos niveles de retinol en la sangre y que consuman menos betacaroteno del promedio conveniente. En los países desarrollados la gente consume ya más vitamina A de la que se necesita, por lo que los esfuerzos investigadores se han enfocado sobre el betacaroteno. El único incomodo que causa éste, si se toma en exceso, es el de poner amarillenta la piel. El efecto antioxidante del betacaroteno fue puesto en claro hace poco en los resultados preliminares de un estudio sobre los efectos de la aspirina en los trastornos cardíacos. Según Charle s H. Hennekens, de la Facultad de Medicina de Harvard, un subgrupo de los participantes que tomaron betacaroteno tuvieron menor incidencia de ataques combinados de apoplejía y de corazón, por la posible razón de que el betacaroteno inhibió la oxidación de los depósitos de colesterol.
L
os resultados de un estudio de cinco años de duración sobre la posible actividad anticancerosa del betacaroteno, dados a conocer por un equipo dirigido por E. Robert Greenberg, de la facultad de medicina de Darmouth, fueron, sin embargo, decepcionantes. No pudieron demostrar ningún efecto protector contra el cáncer de piel en sujetos que habían padecido anteriormente el mal. El Instituto Nacional del Cáncer estadounidense anunció a comienzos de 1996 que dos estudios clínicos patrocinados por él sobre la posible eficacia a largo plazo del betacaroteno para prevenir el cáncer y la enfermedad coronaria habían proporcionado resultados negativos. Uno de ellos se había suspendido antes de tiempo porque, sorprendentemente, surgieron dudas de que los participantes en la prueba no estuviesen incurriendo en mayores riesgos de contraer cáncer que quienes no tomasen betacaroteno. El segundo estudio no presentó estos signos alarmantes, pero, tras doce años de aplicación, tampoco puso de manifesto ninguna ventaja de tomarlo. Gregor Eichele, del Baylor College de Houston, y Christina Thaller han elucidado la acción de estas substancias. Han demostrado que, a través del brote embrionario del ala, se va produciendo una gradual concentración de ácido retinoico que influye en el proceso evolutivo de las células. Alterando la concentración del ácido retinoico se hace que las alas desarrollen dedos supernumerarios. Esto indica que el ácido retinoico es un “morfógeno” que dirige el desarrollo normal. “El ácido retinoico impone un programa”, explica Eichele: “es una molécula de instrucción”. Hace algunos años Pierre Chambon, de la Universidad Louis Pasteur de Estrasburgo, y Ronald M. Evans, del Instituto Sal k para Estudios Biológicos, hicieron cada uno por su cuenta un descubriCONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
2. EL ACIDO RETINOICO influye en el crecimiento, según se patentiza con estas dos alas de embrión de p ollo. El ala normal ( a la izquierda) tiene tres dedos. En la otra ( derecha), perteneciente a un embrión tratado con ácido retinoico, se ha desarrollado un par de dedos extra. Foto: Gregor Eichele.
miento que supuso un gran adelanto hacia la explicación de cómo logran los retinoides sus poderosos efectos. Hallaron que los núcleos de las células contenían receptores —proteínas enlazantes— que modificaban la actividad de los genes cuando se les unía ácido retinoico (y probablemente otros retinoides). Desde entonces, se han encontrado varios receptores de esos, aunque sus funciones exactas siguen siendo oscuras. “Sabemos que los receptores son afectados de distintos modos por varios retinoides”, dice Chambon. Algunos regulan su propia velocidad de producción, mientras que otros tienen complejas interacciones con otros sistemas receptores que hay en el núcleo celular. La presencia de estos receptores le sugiere, a Eichele, que los retinoides pueden formar parte de un sistema señalizador que controla la actividad de los genes. Entre los genes cuya actividad se sabe que viene condicionada por el enlazamiento del ácido retinoico está el que da origen a la laminina, proteína de la matriz que mantiene fijas las células. Eichele conjetura que el ácido retinoico podría afectar a la comunicación intercelular. Hay también receptores para el ácido retinoico fuera del núcleo, cuya función se desconoce.
A
ntonio Simeone y sus colegas, del Instituto Internacional de Genética y Biofísica de Nápoles, han demostrado que el aumento de concentración del ácido retinoico activa sucesivamente a los miembros de una clase de genes homeobox. Este podría ser un indicio importante para averiguar cómo actúa el ácido retinoico, opina Chambon. Se sabe que los genes de ese tipo desempeñan un papel clave en la especificación de las sendas epigenéticas (desarrollísticas), desde luego en los invertebrados y probablemente también en los mamíferos. Cree Eichele que la importancia que el ácido retinoico tiene en el desarrollo puede explicar su capacidad para hacer que las células cancerosas reviertan a su carácter estable. El grupo de Hugues de Thé, del Instituto Pasteur de París, informó recientemente que es probable que en la leucemia promielocítica esté implicado un receptor nuclear del ácido retinoico. Descubrieron que en las células cancerosas el gen para un receptor de ácido retinoico aparece a menudo desplazado y fusionado con un gen antes desconocido, donde es probable que él origine un producto anómalo. Ese producto anómalo —sugiere de Thé— tal vez bloquee a los genes que normalmente son regulados por el ácido retinoico y desarbole el control. “Dado que el ácido retinoico interviene en la diferenciación y en el desarrollo de las células, no es demasiado sorprendente que ejerza su efecto sobre los tumores”, recalca Chambon. “Si promueve u obstaculiza a otros factores reguladores, no lo sabemos.” 91
Genes con homeobox y el plan corporal de los vertebrados Eddy M. De Robertis, Guillermo Oliver y Christopher V. E. Wright Esta familia de genes emparentados determina la forma del cuerpo. Subdivide al embrión a lo largo del eje cabeza-cola en campos celulares que se transformarán en miembros y otras estructuras
D
e un óvulo fecundado, de apa riencia homogénea, surge gradualmente, por división celular, un embrión formado de piel, músculos, nervios y otros tejidos. Sin embargo, mucho antes de que la mayoría de las células del cuerpo naciente comiencen a especializarse, se halla ya establecido un esquema que define las principales regiones del cuerpo: la cabeza, el tronco, la cola, etcétera. Este esquema permite que combinaciones aparentemente idénticas de tejidos se dispongan en estructuras anatómicas claramente diferenciadas, como pudieran ser brazos y piernas. Los embriólogos han realizado en épocas recientes grandes avances en el conocimiento de los mecanismos que controlan este proceso, otrora misterioso. Las poderosas técnicas de la biología molecular han permitido aislar y caracterizar genes particulares que intervienen en algunas de las decisiones relativas al establecimiento del
EDDY M. DE ROBERTIS, GUILLERMO OLIVER y CHRISTOPHER V. E. WRIGHT han trabajado en colaboración en la Universidad de California en Los Angeles (UCLA). De Robertis se doctoró en bioquímica por la Universidad de Buenos Aires en 1975. Desde 1985 ocupa la cátedra Norman Sprague de química biológica de la facultad de medicina de UCLA. Oliver obtuvo su licenciatura en ciencias biológicas en la Universidad de la República Oriental del Uruguay en 1980 y su grado en biología molecular en la Universidad de México en 1984. Es profesor de bioquímica en su alma mater, Uruguay. Wright, que se doctoró en bioquímica por la Universidad de Oxford, en 1984, enseña biología celular en la facultad de medicina de Vanderbilt.
92
esquema corporal embrionario. La clave reside en una familia de genes, conocidos como genes con homeobox (caja homeótica), que subdividen al embrión temprano en campos celulares dotados de la capacidad de transformarse en tejidos y órganos específicos. El proceso de desarrollo de Xenopus laevis, una rana sudafricana, constituye un ejemplo adecuado de cómo toma forma un vertebrado. Los embriólogos modernos prefieren trabajar con este anfibio porque en toda época del año puede inducirse a la hembra a poner alrededor de 1500 huevos grandes y fácilmente fecundables. Dado que todos los vertebrados se desarrollan de forma parecida, la mayoría de los mecanismos de la embriogénesis temprana de la rana son también aplicables a peces, pollos, seres humanos y otros animales. Uno de los rasgos sobresalientes de las primeras fases del desarrollo es su rapidez. Una célula huevo fecundada de Xenopus se divide en dos al cabo de aproximadamente 90 minutos. A continuación, las células se dividen sincronizadamente cada 30 minutos, hasta alcanzar el número de 4000. En este estadio, el embrión se denomina blástula media y tiene la forma de una esfera hueca. A simple vista, todas las células parecen idénticas; no obstante, algunas de ellas, situadas alrededor del ecuador de la blástula media, ya están destinadas a volverse la capa celular llamada mesodermo. La formación del mesodermo viene inducida por factores de crecimiento proteicos liberados por las grandes células vitelinas situadas en el polo inferior del embrión. La totalidad de la capa mesodérmica termina por desplazarse hacia el interior del embrión, durante el pro-
ceso de gastrulación. Hacia el fin de este proceso, se hallan delimitadas tres capas con potenciales de desarrollo diferentes: el mesodermo, el endodermo y el ectodermo. El mesodermo da origen a la mayor parte del cuerpo, incluyendo la columna vertebral, los músculos, los huesos y la pared del cuerpo. El endodermo genera la capa epitelial de tejido que reviste el tracto digestivo y otros varios órganos, tales como el pulmón, el hígado y el páncreas. El ectodermo da lugar a la piel y el sistema nervioso.
E
l ectodermo se transforma en sis tema nervioso en respuesta a señales químicas difundidas a partir del mesodermo subyacente. Las señales inducen un engrosamiento de parte del ectodermo, que forma una estructura denominada placa neural. (En este estadio, el embrión se denomina néurula.) A continuación, los bordes de la placa neural se pliegan uno hacia otro, en tanto que el medio se hunde en el cuerpo embrionario. Finalmente, los bordes se fusionan para formar un tubo neural, que se convierte en la base del cerebro y la médula espinal. La determinación del eje anteroposterior (cabeza-cola) del embrión constituye la piedra angular del desarrollo, porque proporciona la línea central a lo largo de la cual se desarrollará el resto de las estructuras. Ross G. Harrison demostró que las células embrionarias están destinadas a transformarse en miembros y otras estructuras anatómicas específicas muy poco después de completada la gastrulación. En 1918 Harrison extrajo pequeños fragmentos de mesodermo de los flan-
TEMAS 3
cos de néurulas de anfibios y los trasplantó en los flancos de otras. Cuando el tejido trasplantado provenía de una región determinada del donante, siempre daba origen a un miembro anterior adicional en el receptor. Harrison observó que, si bien el mesodermo tenía en esos embriones la
apariencia de una capa uniforme, las células de algún modo ya sabían a qué parte del cuerpo pertenecían. Una de las peculiaridades notadas por Harrison fue que el embrión podía formar un miembro anterior aun cuando él retirara todo el mesodermo que normalmente hubiera dado origen
1. LOS GENES CON HOMEOBOX controlan el desarrollo de animales tan dispares como Drosophila melanogaster (la mosca de la fruta) y el ratón. Estos genes dividen al embrión, a lo largo del eje cabeza-cola, en bandas con diferentes potenciales de desarrollo. La ubicación de un gen con homeobox en un cromosoma corresponde al lugar donde se expresa en el cuerpo: procediendo de izquierda a derecha, los genes controlan regiones
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
a dicho miembro. Interpretó este hallazgo en el sentido de que la zona de mesodermo circundante tenía también el potencial de inducir y controlar el crecimiento de los miembros. Esta extensa zona, con potencial para expresar una estructura, tomó el nombre de campo morfogenético.
del cuerpo más cercanas al extremo anterior del animal. Todos los genes con homeobox parecen tener un origen evolutivo común. En el presente diagrama se han coloreado en forma similar los genes con homeobox relacionados en Drosophila y en el ratón y las regiones corporales que controlan en cada animal. El mecanismo que determina la cabeza, el tronco y la cola pudiera haber surgido una sola vez en el curso de la evolución.
93
Tras Harrison, numerosos investigadores llevaron a cabo experimentos de trasplante en embriones de anfibios. Estos estudios permitieron establecer que el mesodermo constituye la capa celular crucial que especifica qué extremo del embrión es cabeza y cuál cola. El mesodermo de la néurula de anfibios se cartografió, o subdividió, en campos morfogenéticos para varios órganos: branquias, balancines (estructuras que aseguran que los renacuajos permanezcan erguidos), oídos, miembros anteriores, miembros posteriores, cola, etcétera. Dentro de cada campo morfogenético, el potencial de formación de órganos variaba gradualmente. En consecuencia, se postuló que cada campo morfogenético contenía un “campo de gradientes” de información, para determinar cada órgano. Como se explicará más adelante, el comportamiento de estos campos de gradientes se corresponde estrechamente con los modelos de expresión de determinados grupos de genes. Los estudios relativos al control ejercido por el mesodermo sobre el
plan corporal de anfibios hechos con Una vez que la ingeniería genética la técnica de trasplantes terminaron dio a los científicos medios para aislar en las postrimerías de la segunda gue- genes, se desató la carrera por descurra mundial, siendo reemplazados por brir y aislar genes homeóticos. David estudios genéticos referidos a la S. Hogness y Welcome Bender aislamanera en que el cuerpo adquiere ron los genes Ultrabithorax , Abdo forma. Edward B. Lewis inició en 1948 minal-A y Abdominal-B en el complejo un análisis genético profundo de bithorax a principios de 1980. Walter mutaciones homeóticas en la mosca de J. Gehring, Richard L. Garber, Matla fruta Drosophila melanogaster . La thew P. Scott y Thomas C. Kaufman mutación homeótica provoca la susti- aislaron los genes del complejo Antentución de una parte del cuerpo por un a napedia, incluyendo los denominados estructura cuya ubicación normal Labial, Proboscapedia, Deformado y correspondería a otro sitio. Por ejem- Antennapedia. plo, las moscas mutantes bithorax tienen dos pares de alas en ve z de uno; esultó crucial el descubrimiento, las mutantes Antennaped ia portan hecho por Gehring y su colega patas adicionales donde deberían William J. McGinnis en 1983, de qu e poseer antenas. el gen Antennaped ia contenía una Lewis descubrió que las transfor- secuencia de ADN que se encontraba maciones homeóticas podían deberse también en otro gen rector del dea mutaciones en genes individuales, sarrollo. (A las secuencias similares aun cuando se hubieran necesitado de ADN en genes diferentes se les cientos de genes activos para crear las llama secuencias conservadas.) Dado alas y patas con la ubicación anormal. que las secuencias conservadas de Por consiguiente, era razonable supo- ADN pueden hibridarse, o aparearse, ner que las mutaciones afectaban a unas a otras, era posible marcar genes rectores que dirigían la activi- radiactivamente la secuencia condad de varios genes subordinados. servada de ADN de Antennapedia y
2. EL PLAN CORPORAL DE LOS VERTEBRADOS se establece mediante la formación y el movimiento, químicamente inducidos, de capas celulares, como se ve en el desarrollo de Xenopus laevis, una rana sudafricana. A través de divisiones celulares rápidas (a-c), el huevo fecundado se transforma en una esfera de células hueca. Las grandes células vitelinas del polo inferior del embrión liberan factores de crecimiento que inducen la
94
R
transformación de las células suprayacentes en la capa mesodérmica (color azul). El mesodermo constituye la capa crítica, que determina la polaridad anteroposterior del embrión. Otras dos capas celulares —el ectodermo (color marrón) y el endodermo (color amarillo)— quedan establecidas durante la gastrulación, proceso mediante el cual el mesodermo emigra hacia el interior del embrión (d-e). El mesodermo induce la transforma-
TEMAS 3
3. TRASPLANTES en que se injerta mesodermo de u n embrión en estadio de néurula en otro embrión: originarán la formación de miembros u órganos adicionales. Si se trasplanta mesodermo de l a región de los miembros anteriores, por ejemplo (a), el embrión receptor tendrá un miembro anterior supernumerario (b). Experimentos de este tipo hechos con anfibios han permitido a los embriólogos identificar los campos morfogenéticos que determinan el desarrollo de diversas estructuras (c).
emplearla como sonda para localizar otros genes que contuvieran la misma región. Así fue como Gehring y McGinnis aislaron Ultrabithorax , Deformado y otros genes homeóticos. También Scott identificó la región
conservada de ADN, de forma inde- seguir los grandes avances realizados pendiente. en los estudios sobre Drosophila, se Una nueva comprobación significa- nos hizo evidente que, si queríamos tiva obtenida por McGinnis fue que llegar a un conocimiento comparable otros invertebrados, tales como los del desarrollo de los vertebrados, ciempiés y los gusanos de tierra, de los deberíamos identificar en ellos los cuales se supone que han evolucionado genes rectores. los insectos, poseen también la misma Sin embargo, la falta de conocimiento región conservada de ADN. Resultaba acerca de la genética de las ranas pareclara la existencia de una relación cía una barrera infranqueable para entre las estructuras moleculares de lograr nuevos avances. Aun cuando se numerosos genes cuyo control sobre el disponía de estudios razonables sobre desarrollo celular embrionario se la genética de ratones, no existían canhallaba comprobado. La región conser- didatos verdaderos en lo concerniente vada de ADN de cada gen homeótico a genes rectores de la embriogénesis. fue apodada “homeobox”. El homeobox codifica una secuencia ecidimos intentar lo que en aquel de 60 aminoácidos, muy similar en los momento parecía un experiproductos proteicos de la mayoría de mento loco: aislar un gen similar a los genes homeóticos. En la proteína, Antenna pedia del ADN de rana, con esa secuencia se conoce como el las sondas de homeobox de las moscas homeodominio. Su función consiste en de la fruta de McGinnis y Gehring. reconocer y unirse a secuencias espe- Había pocas razones para creer que el cíficas de ADN en los genes regulados ADN de rana contuviera ese gen o que por genes homeóticos. los genes de especies tan poco empaLa cadena polipeptídica del homeo- rentadas pudieran ser significativadominio consta de cuatro hélices, una mente similares. No obstante, creímos de las cuales es responsable del reco- que el intento valía la pena. Algunos nocimiento de una secuencia especí- de nuestros colegas eran escépticos en fica de ADN. Debido a que e sta hélice cuanto a que ese experimento pudiera es casi idéntica en todas las proteínas funcionar y dos de nuestros alumnos con homeodominios, todas estas pro- declinaron trabajar en ello. teínas se unen a secuencias bastante Pronto nos encontramos celebránsimilares de ADN. Al unirse a genes dolo con una botella de champaña. en una célula, las proteínas con homeo- Tuvimos éxito al primer intento, tradominios activan o reprimen la expre- bajando con Andrés E. Carrasco. sión de esos genes subordinados. Analizamos la secuencia de ADN del Nuestro trabajo de investigación gen de rana que habíamos aislado, llasobre homeoboxes se inició en 1983, mado actualmente XlHbox 1, y confircuando uno de nosotros (De Robertis) mamos que contenía la región del tenía su laboratorio en el mismo piso homeobox. Este descubrimiento dejaba que Gehring. Nos veníamos intere- claro que, por fin, podía disponerse de sando en el desarrollo de Xenopus lae- un gen que controlaba directamente el vis desde hacía ya cierto tiempo. Al desarrollo de los vertebrados.
D
ción de parte del ectodermo en placa neural (rojo) en el estadio de néurula ( f-g). Como se ve en el corte transversal (h-i), la placa neural se cierra sobre sí misma y se convierte en tubo neural, predecesor del cerebro y de la médula espinal en el animal adulto ( j). (P. J. Wynne.)
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
95
REGION CONECTORA
H2N
COOH
REGION VARIABLE
HOMEODOMINIO
1
2
3
4
HELICES
4. PROTEINAS CON HOMEODOMINIOS, unidas al ADN, regulan la expresión génica. Se componen de una región variable, la que determina una actividad proteica específica, una pequeña región de articulación conectiva y un homeodominio, secuencia de sesenta aminoácidos, que es similar en todas las proteínas de este tipo. Esta secuencia es codificada por las regiones de homeobox de los genes. El homeodominio consta de cuatro hélices alfa (1-4), una de las cuales (rojo) reconoce y se une a una secuencia específica de ácido desoxirribonucleico en los genes blanco, o diana. (E. Bell.)
Mal podíamos imaginar, tras este primer experimento, que llevaría seis años más, y el esfuerzo de laboratorios de todo el mundo, confirmar que los genes con homeobox de vertebrados están directamente involucrados en el control del desarrollo. Aun así, los avances iniciales en el estudio de mamíferos fueron rápidos. Trabajando con ratones, Frank H. Ruddle y Peter Gruss aislaron numerosos genes con homeobox; Dado Boncinelli obtuvo éxitos similares con genes humanos. Las proteínas codificadas por todos estos genes con homeobox se diferencian mucho unas de otras, salvo en la región muy conservada del homeodominio.
celular durante el desarrollo? La observación de las regiones donde las proteínas producto de los genes con homeobox se localizan en el cuerpo del embrión, en varios estadios del desarrollo, aporta un indicio a la respuesta. La proteína de Xenopus XlHbox 1, por ejemplo, se encuentra en una banda estrecha de células, situada detrás mismo de la cabeza del embrión de la rana. Esta banda está formada tanto por el mesodermo como por la médula espinal anterior y la cresta neural. En estas capas hísticas, el límite anterior y el límite posterior de expresión de XlHbox 1 guardan una clara alineación. Porque el mesodermo induce, según es sabido, las características anteroposteriores del tejido neural, parece posible que el mesodermo que expresa XlHbox 1 induzca también la expresión del mismo gen en células de la placa neural suprayacente.
La lista de proteínas con homeodominios creció en 1988, al lograrse la primera purificación de factores de transcripción. Estos factores son proteínas que aumentan la expresión de determinados genes diana. Al secuentros genes con homeobox tienen ciarse los factores de transcripción, se actividad en regiones diferentes. encontró que algunos de ellos conte- Basándose en los patrones de exprenían homeodominios, lo que indicaba sión de los genes con homeobox, podeque eran productos de genes con regio- mos concebir el embrión de vertebranes de homeobox. Tales investigacio- dos subdividido en campos celulares nes bioquímicas confirmaron, de anteroposteriores con diferentes forma independiente, que los genes potenciales de desarrollo. Esta subdicon homeobox regulaban la actividad visión del cuerpo embrionario precede de otros genes. a la formación de órganos o estructuPero, ¿de qué modo orquestan los ras específicos. genes con homeobox la diferenciación Aun cuando los homeodominios codificados por diferentes genes con homeobox son muy similares entre sí, para identificarlos se puede recurrir a difeConsenso rencias características en sus secuenRKRGRTTYTRYQTLELEKEFHFNRYLTRRRRIEIAHALCLTERQIKIWFQNRRMKWKKEN cias de aminoácidos. Algunos homeoLabial dominios se asemejan mucho más NNS---NF-NK-LT--------------A------NT-Q-N-T-V----------Q--RV estrechamente que otros. Tomando PGGL--NF-TR-LT---------K--S-A--V---AT-G-N-T-V----------Q--RE como criterio estas similitudes y difeHox-2.9 rencias, resulta interesante destacar que determinados homeodominios de Deformado mamíferos se parezcan mucho a aqueP--Q--A---H-I--------Y--------------T-V-S-----------------Dllos producidos por determinados genes P--S--A---Q-V--------Y---------V--------S-----------------DH Hox-2.6 de la mosca de la fruta. Al analizar patrones de expresión de varios genes con homeobox de Antp -----Q-----------------------------------------------------embriones de ratón, Robb Krumlauf y -----Q---------------Y--------------T----------------------Denis Duboule realizaron importanHox-2.3 tes observaciones, cada uno por su lado. Con anterioridad se había Abd-B demostrado que, lo mismo en verteVRKK-KP-SKF---------L--A-VSKQK-W-L-RN-Q-----V----------N--NS brados que en invertebrados, los genes SRKK-CP--K----------L--M----D--H-V-RL-N-S---V----------M--Lcon homeobox se agrupaban en comHox-2.5 plejos, o grupos, en un cromosoma. En otras palabras, en la molécula lineal 5. TODOS LOS HOMEODOMINIOS son esencialmente similares, pero los producidos de ADN que compone un cromosoma, por genes de determinados insectos y mamíf eros guardan un parecido muy estrecho. Aquí se muestran secuencias de aminoácidos de varios homeodominios. Los genes los genes con homeobox están dispues Labial, Deformado, Antp y Abd-B provienen de la mosca de la fruta, Drosophila; y tos en un orden preciso, de izquierda los cuatro genes Hox análogos provienen de ratones. Las letras representan amia derecha. noácidos en todas las secuencias. El guión indica que el aminoácido es el mismo Krumlauf y Duboule descubrieron que en la fila del consenso, un promedio de t odas las secuencias de homeodominios. inesperadamente que, en ratones, el (E. Bell.)
96
O
TEMAS 3
6. INHIBICION de una proteína con homeodominio. Dicha inhibición puede alterar el destino de los tejidos embrionarios. En los renacuajos normales (izquierda), la proteína Xl Hbox 1 se expresa en una región definida de la médu la espinal
orden de los genes con homeobox de un complejo se correspondía directamente con el lugar de expresión de los genes. Los genes con homeobox situados cerca del extremo izquierdo de un comple jo se expresan en las regiones posteriores del cuerpo y los genes de la derecha se expresan más cerca de la cabeza. Lewis había observado el mismo patrón en Drosophila, muchos años antes. Todos los vertebrados poseen cuatro complejos de homeobox, cada uno de ellos localizado en cromosomas distintos. Es probable que estos complejos hayan surgido a lo largo de la evolución mediante la duplicación de un único grupo de genes con homeobox en invertebrados. Cada ser humano posee, pues, cuatro genes que se parecen, por ejemplo, al gen Abdominal-B de la mosca de la fruta y otros cuatro similares al Deformado. Un principio unificador se aplica a todos los complejos de homeobox: los genes que se expresan en zonas posteriores se alojan a la izquierda y, a la derecha, los que se expresan en zonas anteriores. Así, en el ADN cromosómico, los genes con homeobox se dis ponen en el mismo orden en el que se expresan a lo largo del eje anteroposterior del cuerpo. Tal disposición extraordinaria puede haberse producido a consecuencia de que los genes con homeobox deban activarse en un orden determinado. Se van acumulando las pruebas sobre cómo se produce este despliegue secuencial de genes con homeobox. El ácido retinoico (compuesto relacionado con la vitamina A, que en ocasiones puede provocar graves defectos en recién nacidos) y los factores de crecimiento peptídicos constituyen buenos candidatos para proveer esas pistas posicionales en los embriones de vertebrados. Podrían transmitir esa información mediante la activación selectiva de genes con homeobox en el mesodermo, elemento clave en la determinación del plan corporal.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
anterior (azul). Si se inyectan anticuerpos contra la proteína XlHbox 1 en un embrión unicelular, tal región se transformará en el mielencéfalo (rojo) del renacuajo resultante (dibujo de la derecha).
Mediante el agregado de ácido retinoico a células embrionarias en cultivo, el grupo de investigación de Boncinelli demostró que el compuesto activaba numerosos genes con homeobox. Douglas A. Melton comprobó que el factor de crecimiento de fibroblastos (que induce la formación del mesodermo en el embrión temprano) activaba selectivamente los genes posteriores con homeobox en el embrión de rana. Ken W. Y. Cho mostró que una proteína parecida al TGF β (factor de crecimiento transformante β) activaba sólo genes anteriores.
U
na vez activados, ¿especifican los genes con homeobox las identidades y destinos de las células embrionarias, dando por consiguiente forma al cuerpo y dirigiendo la constitución de los órganos? ¿O son indirectos sus efectos? Los resultados de dos experimentos proporcionan argumentos en favor de un papel directo. En el primer ensayo, inyectamos anticuerpos dirigidos contra la proteína XlHbox 1 en embriones unicelulares de Xenopus. Los anticuerpos se fijaron a la proteína y la inactivaron durante el período crucial en el que se
establece el plan corporal. Al examinar los renacuajos que se desarrollaron, descubrimos que los tejidos que normalmente expresaban XlHbox 1, y que deberían haberse transformado en una sección de la médula espinal anterior, se habían transformado, por contra, en estructuras del mielencéfalo. En efecto, la “pérdida de función” del XlH box 1 transformó parte de la médula espinal en una estructura más anterior. En el segundo ensayo, Gruss y Michael Kessel inyectaron ADN que contenía un gen con homeobox de ratón en embriones de ratón. El segmento de ADN se diseñó de manera que el gen con homeobox se expresara en la totalidad del cuerpo, incluso en regiones donde no lo hubiera hecho en condiciones normales, tales como la cabeza y el cuello. Los ratones resultantes presentaban frecuentemente defectos graves en la cabeza (verbigracia, fisura palatina). Más interesante aún, poseían una vértebra adicional y un disco inter vertebral en la base del cráneo; algunos tenían un par de costillas supernumerarias en la región del cuello. Así, la “ganancia de función” de un gen con homeobox inducía transformaciones
7. LOS GENES CON HOMEOBOX se expresan en bandas discretas a lo largo del eje anteroposterior del embrión. Por ejemplo, en el renacuajo de Xenopus laevis, el gen XlHbox 1 se expresa en una región del tronco anterior del cuerpo. La proteína producida por el gen se encuentra en los núcleos celulares de tejidos tanto mesodérmicos (azul) como ectodérmicos (rojo). El miembro anterior crece enteramente a partir de células del mesodermo que expresan la proteína XlHbox 1.
97
8. EN ESTAS TINCIONES de brotes de miembros se pueden observar gradientes de proteínas con homeodominios. En el brote de ala de pollo (izquierda), la mayor concentración de proteína Hox 5.2 se encuentra en los núcleos celulares cercanos a la región posterior (borde derecho). En el brote de aleta
pectoral del pez cebra (derecha), la concentración más elevada de proteína XlHbox 1 está en la región anterior (borde izquierdo). La aleta pectoral es el precursor del miembro anterior de los tetrápodos. Los gradientes son mecanismos eficaces para transmitir la información de posición.
homeóticas exactamente similares a máximo se encuentra a lo largo del bable que inter ven gan señ ale s de las observadas en las mutaciones de la lado posterior y el extremo distal del comunicación intercelulares, parecimosca de la fruta. miembro, un patrón exactamente das a las involucradas en la formación Hay otros trabajos que indican que inverso al establecido para XlHbox 1. del eje y tal vez mediadas por factores los genes con homeobox cumplen un de crecimiento o ácido retinoico. papel en la especificación de la identi Además de cuanto nos ha aclarado n embriones de rana, pollo y ratón dad celular. Como se dijo antes, los se pueden detectar gradientes sobre el desarrollo embrionario, el genes con homeobox se expresan inten- proteicos de XlHbox 1 y de Hox 5.2. En estudio de los genes con homeobox ha samente en bandas a lo largo del eje el desarrollo de los miembros anterio- aportado nuevas perspectivas sobre anteroposterior, en la fase temprana res también están comprometidos la evolución. Debido a que el orden de del desarrollo. Más tarde, cuando los otros genes con homeobox. Duboule los genes con homeobox es similar en órganos de estas regiones se están for- identificó otros tres genes con homeo- vertebrados e invertebrados, los primando, los mismos genes con homeo- box adyacentes al Hox 5.2, que se acti- meros complejos con homeobox debiebox se expresan de nuevo con intensi- van secuencialmente a medida que la ron haber evolucionado, eones atrás, dad. En estos estadios más tardíos, los punta de la extremidad crece. El orden en platelmintos u otros organismos genes con homeobox parecen propor- en que los genes se activan corres- primitivos, antepasados comunes de cionar etiquetas moleculares que ponde al orden que presentan en el los seres humanos y de los insectos. recuerdan a las células el lugar del ADN. Sería interesante saber si los organisembrión donde se originaron. Gradientes de proteínas o de otras mos pluricelulares más primitivos El desarrollo del miembro anterior moléculas constituyen indicadores con polaridad anteroposterior, como constituye un caso muy esclarecedor. apropiados para especificar las posi- los rotíferos, poseen también compleLa totalidad del campo del miembro ciones celulares y para orientar con jos de genes con homeobox. La asomanterior se deriva de la banda de mes- eficacia sus destinos. Por ejemplo, las brosa conservación de los complejos odermo que expresa XlHbox 1. Las células de una insinuación o brote de a través de la evolución sugiere que, células proliferan en la banda y for- miembro pueden formar dígitos sepa- una vez encontrada una vía eficaz de man un brote (una insinuación) de rados respondiendo, de manera dife- determinación del eje anteropostemiembro anterior que, en Xenopus , rente, a cantidades variables de una rior, resultó más fácil producir nueaparece hacia la tercera semana des- proteína. Sería menos económico el vas form as corporales modifica ndo pués de la fecundación. que una proteína diferente especifi- ese sistema que creando métodos En este estadio, el mesodermo del cara cada dígito. totalmente nuevos. brote de miembro anterior parece uniLa actividad de los genes con homeoEn conclusión, el análisis de los graforme, pero contiene un gradiente de dientes de proteínas con homeodomi- box ofrece también claves para entenla proteína de XlHbox 1. O sea, que la nios durante el desarrollo de los der la posible evolución de estructuras proteína abunda más en los núcleos miembros revela que la misma batería anatómicas específicas. Una inquiecelulares situados a lo largo del lado de genes con homeobox que establece tud científica antigua se refería al anterior del brote del miembro —el el eje cabeza-cola vuelve a usarse más origen del brazo, o del miembro antelado que da origen al dígito mayor— y tarde para determinar las posiciones rior, de los tetrápodos, por ejemplo. menos en los núcleos del lado poste- celulares durante el desarrollo de los Puesto que los peces primitivos denorior, que da origen al dígito menor. miembros. Las proteínas con homeo- minados celacantos poseían aletas Mientras el miembro crece y se con- dominios se encuentran en los núcleos pectorales con articulaciones óseas, la forma, la concentración de proteína celulares, como se podría esperar de creencia generalizada era que el brazo XlHbox 1 se mantiene en el nivel más las proteínas combinadas de ADN que había evolucionado de las aletas pecelevado cerca del hombro, en el extremo activan y desactivan genes. Aún se torales. proximal del brazo. Por contra, la pro- ignora la manera en que se establecen El trabajo de Anders Molven y Charteína producto de otro gen, el Hox 5.2, los gradientes de proteínas nucleicas les B. Kimmel presta apoyo a esta establece un gradiente cuyo nivel en los brotes de ex tremidades. Es pro- teoría. El XlHbox 1 se expresa en pri-
E
98
TEMAS 3
mer lugar en una región circular del mesodermo lateral, correspondiente al campo de la aleta pectoral. En este estadio, la expresión del gen se corresponde exactamente con la de un campo morfogenético definido por Harrison en 1918. A medida que las células proliferan, la proteína XlHbox 1 forma un agudo gradiente en el brote de aleta pectoral, similar al gradiente encontrado en insinuaciones de miembros anteriores de ranas, pollos y ratones. Este patrón hace pensar que XlHbox 1 es un gen antiguo, cuya función en el gradientecampo del miembro antecede a la aparición de estructuras tetrápodas del tipo de los dígitos. Probablemente sea mucho lo que se pueda aprender abordando la embriología comparada de los vertebrados en el ámbito de la expresión génica.
L
levará mucho tiempo entender con exactitud cómo cooperan entre sí los genes para organizar células que, a partir de un huevo aparentemente homogéneo, originen un renacuajo nadador, pero el estudio molecular del desarrollo de los vertebrados ya ha progresado mucho. La expresión de los genes con homeobox puede proporcionar una explicación molecular a los gradientes-campos reconocidos por los embriólogos experimentales hace muchos decenios. Los genes que controlan el eje anteroposterior tienen un grado de conservación en el espectro zoológico que sobrepasa las expectati vas más delirantes de los investigadores. Se han identificado moléculas que pudieran intervenir en la transmisión de la información posicional, como el ácido retinoico y los factores de crecimiento. Ahora se plantea la posibilidad de investigar cómo cambia la forma del cuerpo en el transcurso de la evolución. Puede que algún día los que hoy son estudiantes bisoños puedan responder preguntas simples del tenor siguiente: ¿en virtud de qué difiere un brazo de una pierna? ¡Qué buen momento para comenzar!
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA A GRADIENT OF HOMEODOMAIN PROTEIN IN ENOPU S D EVELOPING F ORELIMBS OF X
. Guillermo Oliver et al. en Cell, vol. 55, n.o 6, págs. 10171024; 23 de diciembre de 1988. AND MOUSE EMBRYOS
V ARIATIONS
OF
CERVICAL V ERTEBRAE
AFTER EXPRESSION OF A H OX 1.1 TRANS-
¿Niño o niña?
E
n la especie humana el sexo se determina fundamental y primariamente por el par de cormosomas 23, XX en la mujer y XY en el varón. Como cada gameto tiene sólo la mitad de la dotación genética, a un espermatozoide le puede tocar llevarse un cromosoma X y a otro le puede corresponder un Y. Si el azar reparte bien la suerte, habrá igual número de representantes de uno y otro. Para el óvulo, en cambio, esa rueda de la fortuna no existe, y en el reparto todos se quedarán siempre con uno de los X. Si un espermatozoide con dotación X fecunda a un óvulo, el cigoto desarrollará caracteres femeninos. En cambio, si el fecundante es Y, el cigoto generado desarrollará caracteres masculinos. El tipo de cromosomas del par 23, heredados en el momento de la fecundación, define, por tanto, el sexo genético. Los 22 pares de cromosomas restantes (44 autosomas) son equivalentes en el cigoto femenino y en el masculino. Una serie de los 22 pares procede del padre y tiene tod a ella la impronta, la estructura propia de la herencia paterna. Difiere, por tanto, de la otra serie, que lleva la impronta propia de la herencia materna. En alguna ocasión, aunque con muy escasa frecuencia, puede darse alguna anomalía en el proceso de fecundación. Las células germinales de los progenitores, por ejemplo, pueden sufrir alguna alteración, que acciden talmente conduzca a la pérdida o a la repetición de uno de los dos cromosomas del par 23, los denominados cromosomas sexuales. Tales anomalías genéticas originan alteraciones funcionales y malformaciones que se reflejan en las glándulas sexuales, las gónadas, y en los caracteres sexuales secundarios. Instrucciones para el desarrollo
Normalmente es la presencia de un cromosoma Y lo que hace que un embrión se desarrolle como individuo de sexo masculino. Para que el cromosoma Y pueda realizar su función ha de estar completo y poder así expresar las instrucciones que le corresponde portar en su estructura. En los últimos años se ha identificado el gen llamado SRY en la región 1 del brazo corto del cromosoma Y, que tiene información para la síntesis de un factor determinante del testículo, el TDF. Este factor hace que en la séptima semana de gestación se inicie el proceso de masculinización del embrión humano activando en cascada los genes que causan la transformación de las gónadas embrionarias indiferenciadas en testículos fetales. Una vez que éstos se han formado, comienzan a segregar la hormona testosterona, que dirige el desarrollo del tracto urogenital y los genitales masculinos al transformar las estructuras embrionarias conocidas como conductos de Wolf y las prominencias labioescrotales. Además, las células de Sertoli de ese testículo embrionario producen la hormona antimulleriana, que destruye las estructuras embrionarias denominadas conductos de Müller a partir de los cuales se generarían órganos femeninos, tales como el útero, la vagina y las trompas de Falopio, si del cromosoma Y no emanaran las instrucciones de retroceso. ¿Quiere esto decir que la diferenciación de las glándulas femeninas no está determinada genéticamente? Durante bastante tiempo se pensó que así era; que la diferenciación del cigoto hacia el tipo femenino era la forma espontánea, mientras que el desarrollo masculino vendría a ser como una corrección de éste, debida a las instrucciones escritas en los genes del cromosoma Y, sin embargo, datos recientes han permitido saber que la diferenciación femenina no es una diferenciación por defecto, sino que existe una vía embriogenética para el desarrollo del ovario, paralela a la vía comentada para el desarrollo de los testículos. En 1994 se ha descrito la existencia de una región del cromosoma X ODF, que favorece el desarrollo del ovario e inhibe el desarrollo del testículo. Esta zona contendría los genes de la feminidad, designados como Od o DSS. Una vez formado el ovario en el embrión femenino, éste comienza a sintetizar y segregar estrógenos que dirigen la diferenciación del conducto de Müller y de las prominencias labioescrotales hacia los órganos sexuales femeninos. Existen por tanto dos vías perfectamente diferenciadas en el desarrollo sexual normal del embrión masculino o femenino. Y de forma similar a lo que ocurre si accidentalmente se altera el número de los cromosomas de este par 23, también se presentarán anomalías con características clínicas variadas, si el cigoto hereda los cromosomas X o Y sin los genes que controlan este proceso, o con más de una copia de ellos.
. Michael Kesset et al. en
GENE IN M ICE
Cell, vol. 61, n.o 2, págs. 301-308; 20 de
abril de 1990.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
Ana Carmen Marcuello y Natalia López Moratalla
99
100
TEMAS 3
Base molecular del desarrollo Walter J. Gehring ¿Cómo se establece la arquitectura básica de un embrión? El descubrimiento de un corto segmento de ADN, la llamada caja homeótica, puede suministrar una parte crucial de la respuesta para un número bastante amplio de especies
U
no de los grandes misterios de la biología es el modo en que la información lineal contenida en el ADN genera un organismo tridimensional específico en el curso de su desarrollo a partir del huevo fecundado. Cada órgano del animal adulto lleva a cabo una tarea concreta y consta de tejidos especializados. A su vez, los tejidos están constituidos por células también especializadas. Estas muestran sólo una pequeña parte del gran potencial genético del huevo fecundado. La fracción de ese potencial
genético utilizado en una célula depende de qué genes suyos se expresen y cuáles no. Cada célula se caracteriza por un patrón determinado de genes, activos e inactivos, que sufre cambios secuenciales a medida que el desarrollo avanza. Dado que el genoma de un organismo superior (su genética completa) puede contener hasta 50.000 genes, no parece probable que cada gen se regule individualmente. Hay que pensar que los genes se regulan en grupos, con un gen “rector” que controle la acción de cada grupo. Aunque hace ya tiempo que este esquema se viene considerando plausible, ha costado encontrar los genes rectores. En los últimos años se fueron identificando algunos de los genes rectores que controlan el desarrollo. Resulta claro que para que éste proceda de forma correcta deben regularse con precisión tanto el momento en que ocurren los distintos procesos del desarrollo como la organización espacial de los tejidos del embrión. Los genes identificados tienen que ver con ambas funciones. Un grupo de genes hallado en el nematodo transparente Caenorhabditis elegans
desempeña, por lo que parece, un papel crucial en la regulación temporal de la diferenciación celular del mismo. Sin embargo, los resultados más sorprendentes se refieren a la organización espacial del embrión y provienen de trabajos realizados con la mosca Drosophila melanogast er . Usando los nuevos métodos de la biología molecular, hemos observado en mi laboratorio que muchos de los genes que controlan la organización espacial de Dro so phila comparten cierto segmento de ADN. Este seg-
WALTER J. GEHRING es catedrático y director del departamento de biología celular del Biocenter de la Uni versidad de Basilea. Naci ó en Zurich, en cuya universidad se educó, licenciándose en zoología en 1963 y doctorándose en 1965. Preparaba su tesis sobre la mosca Drosophila cuando se interesó por la genética molecular, que desde entonces ha constituido su campo de investigación. Tras cinco años de docencia en la Universidad de Yale vol vió a Suiza. Gehring se unió al claustro docente del Biocenter poco después de su fundación, en 1971.
1. PATRON DE EXPRESION del gen dentellado ( engrailed). Se aprecia aquí en la distribución de 14 zonas brillantes en una sección fina de un embrión de la mosca del vinagre, Drosophila melanogaster . Las zonas brillantes denuncian la presencia de transcritos dentellados (moléculas de ARN mensajero que llevan la información del gen), que se acumulan en los lugares del embrión donde el gen se expresa. La figura reproduce una sección longitudinal de un embrión a las seis horas de la fecundación. En este estadio el embrión ya se ha dividido en los segmentos característicos del cuerpo de la mosca (clave a la izquierda). Existen, por lo menos, tres segmentos cefálicos ( Md, Mx, Lb), tres segmentos torácicos (T1-T3) y ocho segmentos abdominales completos ( A1-A8). (Los segmentos abdominales, que formarán finalmente la parte posterior del insecto, se han desplazado sobre la superficie dorsal en un complejo movimiento de desarrollo.) Cada segmento se divide en un compartimiento anterior ( A) y otro posterior ( P). El gen dentellado ( engrailed) se expresa en los 14 compartimientos posteriores y contribuye a proporcionarles su identidad. Los transcritos dentellados se detectaron mediante la técnica llamada de hibridación in situ. Se aplicó ADN marcado radiactivamente procedente del gen dentellado a una sección del embrión. El ADN hibridó, es decir, se unió selectivamente, con el mensajero ARN de dentellado (ARNm). Se cubrió el tejido con una emulsión fotográfica y se reveló. La porción de ADN radiacti vo de los híbridos ADN ARN impresionó los granos de plata de la emul sión, dando puntos brillantes.
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
101
cutícula (cubierta exterior). Una mutación particular en el gen llamado lin-14 hace que el gusano mude dos veces más. Durante las etapas supernumerarias el desarrollo de la cutícula se retrasa: a pesar de que el animal ha alcanzado la madurez sexual, la cutícula es todavía larvaria. Del efecto de esas mutaciones puede deducirse que el cronogén lin-14 normal (tipo silvestre) tiene por misión provocar la diferenciación de las células formadoras de cutícula que producirán la del adulto en el momento correcto. Se han encontrado también otros cronogenes que intervienen en la diferenciación de muchos más lina jes celulares. El control cronológico de los procesos del desarrollo reviste una importancia destacada en organismos 2. OOCITO DE DROSOPHILA MELANOGASTER, o huevo sin fecundar. Se forma como C. elegans , cuyo esquema formadentro de una estructura ovárica llamada folículo; la ilustración superior lo muestivo se basa en linajes celulares invatra en un corte transversal. El oocito y 15 células nutricias se forman a partir de la riantes. Pero la mayoría de los orgamisma célula precursora en cuatro ciclos de divi sión celular. Los puentes citoplasnismos no se desarrollan así. De hecho, máticos permiten que las células nutricias transfieran al huevo ácido ribonucleico, C. elegans está situado en un extremo proteínas y orgánulos celulares. Entre las sustancias así transferidas podrían hallarse moléculas que establezcan la polaridad inicial del zigoto (huevo fecundado) del espectro de esquemas de desarrollo. en las etapas tempranas de la embriogénesis. En el otro extremo del espectro se encuentran el ratón y otros organismos mento, llamado caja homeótica, pauta de desarrollo del pequeño nema- cuyas células embrionarias gozan de podría permitir a los genes que lo todo. El embrión de C. elegans se de- una flexibilidad considerable. Una contienen regular la acción de agru- sarrolla de tal manera que la cronolo- célula de embrión precoz de ratón paciones de otros genes. gía de los acontecimientos tiene puede terminar en casi cualquier Cuando el gen que contiene la caja especial importancia. Las células del estructura adulta. Su destino no viene homeótica se traduce en una proteína, embrión de C. elegans muestran poca determinado por el lugar que tenga en la caja homeótica produce una secuen- flexibilidad. Estos gusanos tienen un un linaje fijo, sino por la posición espacia de aminoácidos que, así se cree, se número fijo de células y el destino de cial que ocupe, más o menos por casuaune a la doble hélice de ADN. Al fijarse casi todas ellas está predeterminado lidad, en el embrión precoz. La mayoría de los organismos se al ADN de unos genes concretos, la por su linaje. Se puede conocer la encuentran entre estos extremos. Así proteína podría activarlos o reprimir- genealogía de cada una de las 959 , que ha aportado la parte Drosophila los. Si la batería de genes adecuada se células del adulto y remontarse a traactivara en un grupo de células del vés de sus predecesoras hasta el huevo principal de cuanto conocemos sobre el embrión de Drosophila, esas células fecundado. Las genealogías de estas control genético del desarrollo. Thomas se encauzarían por el camino que con- células no varían esencialmente de un Hunt Morgan, introductor de duce a la conversión en parte de un gusano a otro, a menos que el animal Drosophila en el laboratorio a princiala; la activación de una batería dis- haya sufrido una mutación. Para dar pios de este siglo, se sirvió de ella para tinta de genes en un segundo grupo de lugar a las estructuras especializadas demostrar la base cromosómica de la células podría llevarlas a la formación del adulto, los linajes deben ramifi- herencia y el orden lineal de los genes en los cromosomas. Drosophila tiene de una parte de una pata. Más aún, la carse en el momento preciso. algunas características que la convierimportancia de la caja homeótica trasciende el ámbito de Drosophila . La ydney Brenner comenzó los estu- ten en un organismo excepcional para secuencia común de ADN se ha encondios de C. elegans en los años el estudio de la herencia. Recordemos, trado en una gama de organismos que sesenta. Desde entonces varios inves- entre otros rasgos, sus cromosomas va desde los gusanos hasta los seres tigadores han descubierto genes que politénicos gigantes, presentes en humanos. Quizá la caja homeótica controlan el momento en que se asig- muchas células, sobre todo en las de las encierre la clave que abra los meca- nan los destinos a los distintos linajes glándulas salivales. Mientras que los nismos de desarrollo en los organis- celulares. Dichos genes, llamados cro- cromosomas de la mayoría de los seres mos superiores. Se cumplan o no esas nogenes, se han descubierto al obser- contienen una copia de cada gen, los esperanzas, resulta incontrovertible var los efectos causados en ellos por cromosomas politénicos de Drosophila que en los últimos años la biología del las mutaciones. Las mutaciones espe- incluyen hasta 1000 copias de cada desarrollo ha entrado en la fase en que cíficas en los cronogenes alteran el gen, alineadas unas con otras a modo las explicaciones pueden buscarse en desarrollo de los linajes celulares, pro- de cerillas en su caja. Gracias a esa el nivel molecular. vocando que se separen antes o des- abundancia, los genes individuales se El hecho de que los genes que con- pués de lo que les correspondería en pueden teñir y observar en el microstrolan la secuencia temporal de acon- el organismo normal. C. elegans suele copio óptico en forma de bandas oscutecimientos que ocurren en la atravesar cuatro etapas larvarias y ras. Además Drosophila es muy prolíembriogénesis fueran descubiertos una adulta. Al final de cada etapa, el fica, con un tiempo de generación corto en C. elegans se debe, en parte, a la gusano muda y adquiere así una nueva y un genoma relativamente pequeño.
S
102
TEMAS 3
El desarrollo de un ejemplar de Drosophila comienza en el ovario de la hembra, donde una célula germinal primitiva inicia una secuencia muy especializada de división celular. La célula germinal se divide cuatro veces, dando 15 células nutricias y el oocito que más tarde se transformará en el huevo. Dentro de una estructura llamada folículo, las células nutricias alimentan al huevo. Proteínas, moléculas de ARN y orgánulos como las mitocondrias penetran en el oocito a través de canales que lo conectan con las células nutricias. La contribución de estas células ayuda a construir el huevo y a prepararlo para la fecundación. Esta acontece cuando el huevo y el espermatozoo se unen; el zigoto resultante contiene cromosomas de
ambos padres. Casi inmediatamente, el núcleo del zigoto se divide; los núcleos hijos empiezan una serie de divisiones rápidas, una cada 10 minutos. Siempre que los núcleos se dividen, debe doblarse la cantidad de ADN en la célula. Esta formidable tarea mantiene plenamente ocupados a los núcleos del zigoto, sin que lleguen a expresarse muchos genes zigóticos. En el modo habitual de división celular, los núcleos quedan separados por membranas celulares recién formadas. No ocurre así con los núcleos hijos del zigoto de Drosophila : comparten, mientras se dividen, un citoplasma común. Durante las primeras divisiones, los núcleos están dispersos por el citoplasma. Tras la octava división, cuando hay 256 núcleos, éstos
3. ETAPAS INICIALES del desarrollo de un embrión de Droso phila . Conllevan repetidas divisiones de los núcleos en un citoplasma común. El espermatocito penetra en el huevo a través del micropilo, que está en la parte anterior del oocito (1). El núcleo del espermatocito se une al del huevo. Poco después de la fecundación comienzan ciclos sincronizados de división nuclear que doblan el número de núcleos cada 10 minutos ( 2-8). Concluida la octava división, cuando hay 256 núcleos,
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
inician su marcha hacia la superficie del huevo, hacia la capa llamada córtex; ubicados ya en el citoplasma cortical, se distribuyen por la periferia en una capa cuyo espesor viene a medir el de un núcleo. En este momento del desarrollo se activa por fin un núme ro sustancial de genes zigóticos. Después de 13 ciclos de división, las membranas celulares empiezan a dividir el citoplasma común y se forman las células. La monocapa celular resultante recibe el nombre de blastodermo. El embrión se desarrolla rápidamente en las horas siguientes, sufriendo una compleja reorganización espacial. En el proceso de gastrulación se forman las capas celulares interiores. Quizás el rasgo más sobresaliente de la transformación espacial sea la división del
éstos empiezan a desplazarse hacia el córtex, o periferia, del huevo (9). Llegados a los 512 núcleos, se forman las primeras membranas celulares en torno a un grupo de células de la parte posterior del huevo (10). Estas “células polares” originarán las células germinales de la mosca adulta. Los otros núcleos siguen dividiéndose en el córtex (11-14). Con 6000 núcleos en la periferia, las membranas separan los núcleos en una monocapa: el blastodermo (15).
103
embrión en segmentos correspondientes a los segmentos del insecto adulto. Además de tres segmentos, por lo menos, que se retraen más tarde hasta el interior de la cabeza y a los que llamamos Md, Mx y Lb, existen
otros tres segmentos torácicos (denominados T1, T2 y T3) y ocho segmentos abdominales completos (que van del A1 al A8). Al día siguiente de la fecundación, el embrión sale del huevo y se trans-
forma en una larva que mantiene el patrón segmentario del embrión. La larva muda dos veces, se convierte en pupa y, tras la metamorfosis, emerge la mosca adulta. La mosca adulta está organizada también en segmentos. Ahora bien, los tejidos de la epidermis adulta no se derivan directamente de la cubierta exterior de la larva, sino que provienen de los discos imaginales, que son pequeñas bolsas de epitelio que hay en el cuerpo de la larva. Mientras transcurre la metamorfosis, las bolsas se evaginan (se doblan hacia fuera) y se convierten en estructuras adultas. Así, a cada lado del cuerpo un disco produce el ojo y la antena; tres discos dan lugar a las patas, que se encuentran unidas a los tres segmentos torácicos, y un disco origina el ala y una parte importante del segmento torácico medio, al cual va unido el ala. Los discos imaginales sirven, pues, de bloques de construcción para el ensamblamiento del cuerpo adulto.
L
a facilidad con que se deja manipular el genoma de Drosophila ha posibilitado reconstruir la genealogía de las células desde las estructuras adultas hasta sus orígenes embrionarios. También ha permitido averiguar cuándo los grupos de células quedan abocados a cumplir sus destinos particulares. Se pueden usar dosis de rayos X controladas con precisión pa ra
4. ENTRE LAS ETAPAS TARDIAS del desarrollo embrionario de Drosophila melanogaster se incluyen la división del cuerpo en segmentos y movimientos morfogenéticos complejos. Poco después de la formación del blastodermo algunas de sus regiones quedan determinadas o destinadas a formar estructuras corporales específicas. Por medio de varios tipos de experimentos se ha podido remontar la genealogía de las estructuras hasta las partes del blastodermo en donde se originaron. El resultado es un “mapa de destinos” del blastodermo, en el cual los segmentos corporales aparecen como bandas consecutivas (1). El embrión se alarga y los segmentos abdominales se desplazan por la superficie dorsal en la dirección anterior ( 2). En esta etapa se expresa el gen dentellado (engrailed) y se subdividen los segmentos. El embrión se estrecha de nuevo, los segmentos abdominales retroceden hacia la parte posterior y los límites segmentarios se hacen visibles ( 3). El embrión sale del huevo convirtiéndose en una larva que muda dos veces, pupa y se transforma en adulto (4). El adulto está segmentado, pero su cubierta externa no se deriva de la larva. Las estructuras adultas proceden de unas bolsas de células, llamadas discos imaginales, que se encuentran en el cuerpo de la larva.
104 TEMAS 3
5. LA NASOBEMIA es una mutación que hace crecer patas en la cabeza de Drosophila en vez de las antenas correspondientes. La mutación transforma los discos imaginales, que originarían las antenas, en el tipo de disco que crea el par medio de los tres pares de patas de la mosca. Del efecto produci do por la mutación
se dedujo que el objetivo del gen normal era asegurar que cada disco imaginal forme la estructura adulta correcta. La Nasobemia fue descubierta por el autor en 1965. Pertenece a un grupo de mutaciones que transforma una estructura en otra situada en otro segmento; dichas mutaciones se llaman homeóticas.
inducir mutaciones y recombinacio- res de los segmentos embrionarios y nes genéticas (intercambios de ADN larvarios cuanto a los de los discos imaentre cromosomas) en los embriones ginales, que formarán estructuras de Drosophila. Los efectos de dichas adultas. Experimentos realizados en aberraciones genéticas sirven de mar- mi laboratorio al inicio de los años cadores de células o núcleos concretos. setenta mostraron que, desde la etapa Las unidades marcadas pueden de blastodermo precoz, los precursores seguirse hasta la mosca adulta para de los discos imaginales se ven obligaaveriguar en qué momento quedaron dos a formar o estructuras adultas determinadas, es decir, comprometi- anteriores o estructuras adultas postedas en la producción de una parte riores. Los embriones blastodérmicos concreta de la larva o del adulto. precoces pueden desgajarse en células Usando estos métodos se ha visto que individuales, que luego pueden “cultiantes de la formación del blastodermo varse”, transplantándolas al interior los núcleos poseen una flexibilidad de la cavidad abdominal de una mosca total. Un núcleo puede colonizar cual- adulta o de una larva. Las células traquier parte del citoplasma cortical y tadas así alcanzan su desarrollo comlos descendientes de un núcleo pre- pleto en cultivo y forman estructuras blastodérmico pueden encontrarse adultas. Cuando se realizó este experidespués en cualquier zona de la mosca mento, las células procedentes de la adulta. El clon, o grupo de células parte anterior del blastodermo produdescendientes, tiende a mantenerse jeron únicamente estructuras adultas unido, pero puede formar parte de anteriores, mientras que las células de cualquier estructura adulta. la parte posterior del blastodermo dieSin embargo, poco tiempo después ron lugar únicamente a estructuras de la constitución del blastodermo, el adultas posteriores. proceso de determinación empieza a Se analizó el destino de células indiavanzar rápidamente. La determina- viduales marcándolas genéticamente ción inicial afecta tanto a los precurso- en el blastodermo y siguiendo su de-
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
sarrollo hasta la fase adulta, cuando la progenie de la célula marcada forma un clon. Se vio que los clones respetaban los límites segmentarios: ni siquiera los clones de gran tamaño marcados cruzaban el límite entre un segmento y el adyacente. Este resultado ponía de manifiesto que las células del blastodermo estaban ya forzadas a transformarse en parte de un segmento concreto. Se obtuvo más in formación destruyendo grupos pequeños de células de blastodermo con un microhaz proveniente de un láser: un haz de radiación ultravioleta enfocado con mucha precisión. El destino de las células destruidas se puede inferir observando los defectos que aparecen en el adulto. Al representar sobre una imagen del blastodermo los datos proporcionados por el microhaz, se obtiene un “mapa de destinos” del blastodermo, que correlaciona las regiones de éste con las estructuras del cuerpo. Los segmentos larvarios y adultos aparecen en el mapa como un patrón ordenado de bandas. Así pues, la arquitectura segmentada de Drosophila se encuentra ya
105
cios sobre el mecanismo de determinación, a partir de las observaciones realizadas sobre tres curiosos tipos de mutaciones que alteraban el proceso de desarrollo de Drosophila: mutaciones de efecto materno, mutaciones de segmentación y mutaciones homeóticas. Algunas mutaciones de efecto materno intervienen en la polaridad espacial del embrión. Por ejemplo, en un folículo normal las células nutricias se encuentran solamente cerca del polo anterior del huevo. En la mutación dicefálica ( dicephalic) las células nutricias se encuentran en ambos polos. Dichos folículos bipolares producen embriones que poseen dos conjuntos de estructuras anteriores unidas por el centro y carecen por completo de estructuras posteriores.
D
6. FUSHI TARAZU es un gen de segmentación, es decir, un gen cuya acción es necesaria para que el embrión de Drosophila melanogaster se divida correctamente en segmentos. Un embrión con el gen silvestre —normal— de fushi tarazu tiene como mínimo el conjunto entero de tres segmentos cefálicos, tres segmentos torácicos y ocho segmentos abdominales completos (ilustración superior ). Durante el desarrollo, los segmentos de cabeza se retraen dentro del cuerpo y por tanto no son visib les. El borde anterior de cada segmento está señalado por una banda de diminutas proyecciones llamadas dentículas. Las bandas denticulares aparecen en la ilustración en forma de bandas blancas que cruzan las imágenes. Los embriones que han sufrido una mutación en el gen fushi tarazu carecen de algunas partes de los segmentos corporales alternados y las partes restantes están fusionadas (ilustración inferior ). Por ejemplo, la parte posterior de A2 se encuentra ausente junto con la parte anterior de A3; la parte ausente de A3 incluye la banda denticular. Las restantes partes de A2 y A3 se han fusionado para producir un segmento compuesto A2/3. Se trata de una mutación letal, es decir, el embrión resultante presenta la mitad del número normal de segmentos y muere antes de salir del huevo.
establecida en la fase blastodérmica y los grupos de células del blastodermo están asignados a un segmento del cuerpo de la larva y del adulto. Sin embargo, la asignación de destinos celulares no se acaba en la fase blastodérmica. En cuanto quedan establecidos los segmentos se asigna cada una de sus células a la mitad anterior o a la posterior, quedando el segmento dividido en dos compartimientos: uno anterior y otro posterior. Tras la formación de los compartimientos, se determinan las estructuras adultas. Primero se distinguen unos de otros los discos imaginales. Los discos contienen muchas regiones pequeñas, que se corresponden con una parte de la estructura adulta, tal como el
106
segundo segmento de una pata. Los destinos de estas regiones pequeñas se asignan durante una serie de pasos que, por lo que parece, no terminan hasta los últimos días de la larva. En el momento de la metamorfosis, cada grupo pequeño de células determinadas en el disco imaginal se transforma, bajo la influencia de hormonas, en la estructura adulta correspondiente. La conclusión general de los experimentos de marcaje genético fue que las células del embrión de Drosophila iban quedando determinadas en una serie de grados cada vez más finos que no concluía hasta la metamorfosis. ¿Cómo se ejecuta esta serie de etapas? Mucho antes de la era de la genética molecular se obtuvieron algunos indi-
e los datos genéticos cabe inferir que estos monstruos de dos cabezas débense a defectos en el genoma de sus madres. Las hembras de Drosophila homozigóticas para la mutación dicefálica, que tienen dos copias del gen deficiente, producen folículos aberrantes (y de ahí embriones aberrantes), sea cual fuere la contribución genética del padre. Las madres heterozigóticas, con un gen deficiente y otro normal, producen únicamente huevos normales. Este resultado muestra que la polaridad anteroposterior se establece cuando se forma el huevo en el ovario bajo el control del genoma materno. Otros mutantes de efecto materno alteran la polaridad dorsoventral. Las observaciones de los mutantes de efecto materno inducen a pensar que el citoplasma del hue vo contiene sustancias que definen las coordenadas espaciales del futuro embrión. Después de la fecundación, cuando los núcleos se desplazan hasta el córtex del huevo, encuentran estas sustancias y quedan determinados a cumplir unos destinos concretos según su posición en el citoplasma cortical. El interés de los mutantes de efecto materno reside en que ponen de manifiesto que algunos de los primeros pasos en el proceso de la determinación ocurren bajo la influencia del genoma materno y no bajo la del genoma del huevo fecundado. Sin embargo, poco se sabe actualmente sobre las sustancias codificadas por los genes maternos que dotan al citoplasma del huevo de su polaridad espacial. Hay algunos indicios de que el ARN mensajero materno (ARNm) almacenado en el huevo contribuye a la especificación de la polaridad dorsoventral, pero la mayoría de las demás sustancias citoplásmicas que
TEMAS 3
intervienen en estos procesos siguen etcétera. Me he sentido fascinado por sivos segmentos posteriores precisan siendo desconocidas. En cambio, las mutaciones homeóticas desde la activación de uno o más genes durante los últimos años se ha adelan- 1965, cuando, trabajando como estu- homeóticos adicionales para conseguir tado considerablemente en la com- diante graduado en la Universidad de su carácter. prensión del funcionamiento de los Zurich, descubrí un mutante que tenía Resultaba tan profunda la alteragenes de segmentación y de los genes patas en la cabeza en vez de antenas. ción que producen las mutaciones homeóticos. De hecho, estos dos tipos Buscando un nombre para la muta- homeóticas y las mutaciones de segde genes han constituido la puerta de ción, me vino a la mente una creación mentación que obligó a pensar si los acceso al nivel molecular de la biología de Christian Morgenstern, poeta ale- genes correspondientes no servirían del desarrollo. mán que describía una criatura fan- para organizar el proceso normal del La mayoría de las mutaciones de tástica llamada el Nasobemo, que desarrollo. Dado que una mutación de segmentación y de las mutaciones caminaba sobre su nariz. La coinci- segmentación entorpece el establecihomeóticas se expresan sólo después dencia me divirtió y decidí llamar miento de los segmentos embrionarios, de la activación del genoma zigótico Nasobemia a la mutación. parece razonable que el gen normal durante la formación del blastodermo. regule la construcción correcta de esos Cada mutación de segmentación se a clase de mutaciones a que per- segmentos. Puesto que una mutación interfiere de una forma concreta en la tenece Nasobemia es amplia y homeótica produce patas donde debedivisión ordenada del embrión en diversa. Se le ha dedicado un conside- rían crecer antenas, el gen normal subunidades repetitivas. Uno de los rable número de trabajos. Se ha visto tiene que ser responsable de la formamutantes de segmentación más nota- que, en Drosophila, la mayoría de los ción de patas en el lugar adecuado. bles es fushi tarazu, expresión japonesa genes homeóticos se distribuyen en dos Ahora bien, cualquier gen capaz de que significa “segmentos insuficien- grupos. Uno, que constituye el com- organizar semejantes procesos fundates”. En un embrión fushi tarazu faltan plejo Anten napedia , comprende los mentales en el desarrollo normal debe partes de ciertos segmentos y las par- genes que determinan las estructuras funcionar regulando muchos otros tes incompletas están fusionadas con adultas de la cabeza y de los segmentos genes. Mediante experimentos de los segmentos adyacentes. Así, la parte torácicos anteriores. Nasobemia se genética bacteriana se había demosanterior de los segmentos Mx, T1, T3, presenta en el complejo Antennapedia. trado ya que grupos amplios de genes A2, A4, A6 y A8 se fusiona con la parte El otro complejo se llama bithorax e podían regularse por la acción de un posterior de los segmentos que les incluye los genes que controlan la gen singular, que codifica una proteína siguen [véase la figura 6 ]. El resultado determinación de los segmentos torá- que se fija al ADN e inhibe o activa la es un embrión que tiene siete segmen- cicos posteriores y los abdominales. transcripción de los grupos en cuestión. tos en lugar de 14 y muere antes de Edward B. Lewis, basándose en su Parecía, pues, que el modelo bactesalir del huevo y transformarse en análisis exhaustivo del complejo bitho- riano suministraba un modelo plausilarva. Fushi tarazu es una mutación rax, propuso que cada segmento poste- ble del funcionamiento de los genes más entre el gran número de ellas que rior del adulto está determinado por la rectores del desarrollo. Sin embargo, afectan al patrón segmentario. actividad combinada de un único grupo hasta 1978 dichas ideas pertenecían al Sin embargo, los trastornos más de genes homeóticos. Según el modelo dominio de la especulación, porque no espectaculares del desarrollo de Dro- de Lewis, la determinación del segundo existían métodos adecuados para aissophila son los producidos por las segmento torácico (el segmento más lar y experimentar con genes de demutaciones homeóticas. La mutación anterior de los controlados por el com- sarrollo en organismos superiores. homeótica conlleva la transformación plejo bithorax) requiere un número En el intervalo de unos cuantos de una parte del cuerpo en otra situada mínimo de genes homeóticos. Los suce- años, la situación cambió drásticanormalmente en un segmento distinto. Los resultados de dichas transformaciones son grotescos y desconcertantes. Alas que crecen en el lugar de los ojos, patas en el lugar de la probóscide (tubo de alimentación), patas que se transforman en antenas,
L
7. SE EXPRESA EL FUSHI TARAZU en pares de segmentos en el embrión precoz. La ilustración muestra la sección fina de un embrión a las dos horas y media de su fecundación. Los círculos pálidos, apreciables con mayor nitidez en el lado derecho de la imagen, son núcleos que acaban de llegar al córtex y no están todavía separados por membranas celulares. Las bandas oscuras
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
son de ARNm del gen fushi tarazu localizadas por medio de hibridación in situ. (Los granos de plata pueden aparecer oscuros o brillantes en la imagen fotográfica escogiendo el sistema óptico apropiado.) Cada banda abarca dos segmentos embrionarios, como muestra la clave. Esta sección no contiene los segmentos de la cabeza. Si así fuera, se verían siete bandas oscuras, no seis.
107
8. SE LLAMA DOMINIO HOMEOTICO a la secuencia de aminoácidos correspondiente a la caja homeótica. La caja homeótica es un trozo corto de ADN que se encuentra en más de una docena de genes homeóticos y de genes de segmentación de Drosophila, así como en genes procedentes de una amplia gama de organismos superiores. La ilustración muestra la secuencia de 60 aminoácid os (designados por su código de tres letras) en los dominios homeóticos que resultan de cinco genes. Son el gen MO-10 de ratón, el gen MM 3 de rana y tres genes de Drosophila: Antennapedia, fushi tarazu y Ultrabithorax. El gen de Antennapedia se ha utilizado como patrón de comparación. Las discrepancias entre el dominio homeótico de Antennapedia y los de otros genes aparecen en blanco. Los cinco dominios homeóticos son bastante similares. Este parecido sugiere que el dominio homeótico cumple la misma función en las cinco proteínas y que la presión selectiva ha impedido que las secuencias de aminoácidos varíen mucho de un caso a otro. No se conoce bien el funcionamiento de las proteínas que contienen el dominio homeótico. En efecto, siendo todos los dominios homeóticos ricos en lisina (lys) y arginina (arg), dos aminoácidos básicos, éstos podrían permitir al domi nio homeótico fijarse en el ADN. Al unirse a secuencias específicas de ADN, esas proteínas podrían regular la acción de muchos otros genes y ejercer así un control en el desarrollo. La región por donde la proteína se une al ADN está constituida por una secuencia de nueve aminoácidos, idéntica en los cinco dominios homeóticos (color intenso).
mente con la aparición de métodos de de ellos. El gen de Antennapedia, que clonación de genes que permiten su d i o s u n o m b r e a l c o m p l e j o aislamiento sin disponer de ninguna Antennapedia, fue aislado por Richard información bioquímica sobre sus pro- Garber y Atsushi Kuroiwa. El primer ductos. Inmediatamente varios gru- paso consistió en reunir un conjunto pos de investigación se dispusieron a de fragmentos de ADN consecutivos, purificar los genes homeóticos de que se solapaban parcialmente, y que Drosophila. David S. Hogness y sus abarcaban la región cromosómica a la colegas abrieron camino con sus expe- que pertenecía Antennapedia. Esto se rimentos con el complejo bithorax, llevó a cabo por el método llamado mientras que mi grupo se centró en “paseo a lo largo del cromosoma”, orilos genes del grupo Ante nnapedia . ginal de Hogness. El paseo cromosóCuando se logró purificar los genes mico se basa en la índole complemenhomeóticos, viose que eran sorpren- taria de las dos cadenas de la hélice dentemente grandes y complejos. Así, de ADN, gracias a lo cual pueden el gen Antennapedia abarca 100.000 hibridar, o sea, formar una molécula pares de bases de nucleótidos, un de doble cadena. Si dos trozos de ADN número inusitadamente alto. Ade- procedentes de cadenas opuestas de más, los genes homeóticos tienen una la doble hélice están ligeramente estructura compleja que comprende superpuestos, hibridarán en la región muchos exones separados por intro- de superposición. Al “pasear” se nes. Los intrones son secuencias de empieza con un fragmento de ADN ADN que se transcriben en ARN, para corto que se sabe cercano al deseado. desprenderse inmediatamente de lo Mediante la hibridación, se identifica transcrito; únicamente resisten los otro pedazo de ADN, solapante con el exones, que se empalman y forman el fragmento conocido en su extremo y ARN maduro. En el procesamiento de prolongándose hacia el gen deseado. lo transcrito, de Antennapedia , se Repitiendo el proceso, se puede cubrir pueden desechar hasta 60.000 pares y aislar el segmento cromosómico de bases en un solo intrón. completo que incluye al gen. Para llegar a este conocimiento Tras reunir el conjunto de fragmensobre la estructura de los genes homeó- tos de ADN, era necesario conocer la ticos hubo que esperar a aislar alguno localización precisa del gen Anten-
108
napedia en el segmento cromosómico. Para encontrarlo, aislamos primeramente un clon de ADNc, un fragmento de ADN complementario al ARNm de Antennapedia. El clon hibridaría las secuencias de ADN cromosómico complementarias con la molécula de ARNm. Se empleó este clon a modo de sonda que descubriera la secuencia de ADN que codifica el ARNm de Antennapedia. Para nuestra sorpresa, dicha sonda no hibridaba sólo con las secuencias codificantes de Antennapedia, sino también con secuencias de un gen vecino, gen que resultó ser fushi tarazu, lo que puso de manifiesto que fushi tarazu y Antennapedia compartían un corto fragmento de ADN. (Matthew P. Scott llegó por su cuenta a la misma conclusión.) Quisimos comprobar la posibilidad de que la secuencia común fuera característica de los genes homeóticos. Para ello examinamos un gen en el complejo bithorax llamado Ultrabithorax. Mi colega William J. McGinnis encontró ese fragmento de ADN en Ultrabithorax. El sorprendente descubrimiento en mi laboratorio de este segmento común de ADN, en 1983, instó una búsqueda inmediata por todo el genoma de Drosophila. Con esa corta secuencia común por sonda, no tardamos en identificar más de una docena de genes que contenían secuencias similares. Dado que muchos de los genes recién aislados correspondían a mutantes homeóticos conocidos, llamamos caja homeótica a la secuencia común. Al parecer, todos los genes que incluyen la caja homeótica son homeóticos o están implicados en la determinación de la organización espacial del embrión. Casi todos ellos se alojan en el complejo Antennapedia o en el comple jo bithorax. Se sabía que los genes de estos dos complejos estaban implicados en la determinación de la organización espacial y ya se habían identificado muchos de ellos. Sin embargo, algunos otros genes que poseen la caja homeótica están en otras partes del genoma, sin que se les haya conseguido identificar por medio de mutaciones. Es de notar que entre los genes que contienen la caja homeótica se encuentran genes de segmentación, como fushi tarazu, y genes implicados en la división de los segmentos en compartimientos, como el gen dentellado ( engrailed). A pesar de que los efectos físicos de los genes de segmentación y de los genes de compartimentación pueden diferir mucho de los producidos por los genes homeóticos, el descubrimiento de la presencia de la caja homeótica en los tres grupos
TEMAS 3
muestra que comparten un elemento janza que las secuencias de nucleótidos mera indicación de que el dominio significativo. El descubrimiento de de las propias cajas homeóticas. (Esto homeótico pudiera estar implicado en este elemento común refuerza la hipó- es posible porque un mismo aminoá- las uniones con el ADN surgió de una tesis de que las tres clases se cido puede ser codificado por más de comparación por ordenador con encuentran entre los genes rectores un triplete, que es un grupo de tres secuencias conocidas de ADN. En la que dirigen el desarrollo. No se sabe nucleótidos.) Por ejemplo, las cadenas búsqueda se detectó una pequeña todavía si todos los genes que contie- de aminoácidos correspondientes a las homología, pero aun así significativa, nen la caja homeótica derivan de un cajas homeóticas del gen Antennapedia entre la caja homeótica y trozos de antecesor común o su parecido estriba y del gen MM 3 de Xenopus comparten genes en dos especies de levadura, únicamente en el exón que contiene la 59 de sus 60 aminoácidos, una homo- llamados genes MAT. Cada gen MAT caja homeótica. Los próximos trabajos logía sorprendente si se considera que codifica una proteína que regula todos deben encaminarse a resolver pronto los vertebrados e invertebrados se los genes necesarios para controlar la esta importante cuestión. separaron hace más de 500 millones de diferenciación de las levaduras en años. La similitud entre las cadenas de uno u otro de los dos tipos de apareastablecida la existencia de la caja aminoácidos implica que todos los miento existentes o para la formación homeótica en la mosca, nos apres- dominios homeóticos funcionan aproxi- de esporas. La proteína realiza su tamos a descubrirla en nuevos geno- madamente del mismo modo y que ha función uniéndose a secuencias espemas. No nos sorprendió encontrar la habido una intensa presión selectiva cíficas de ADN que se encuentran al secuencia común en otras especies de para evitar la pérdida de su función. comienzo de los genes a regular (hacia ¿Cuál podría ser esa función común? el extremo 5 del ADN). La homología Drosophila y en insectos en los que se sabía que se producen mutaciones Tal como indicaba antes, una de las parcial entre la caja homeótica y las homeóticas, como los escarabajos. El primeras hipótesis fue que los genes secuencias del gen MAT de la levaexamen de los gusanos anélidos, ante- rectores operaban dirigiendo la sínte- dura sugiere una función similar para cesores de los insectos, mostró que sis de proteínas que se unen al ADN. el dominio homeótico. también poseen la caja homeótica. Sin La caja homeótica es bioquímicaSi el dominio homeótico controla la rebajar el interés de este hallazgo, mente compatible con tal modelo. determinación, la expresión de los muchísimo más sorprendente fue des- Muchas proteínas que se unen al genes que poseen la caja homeótica se cubrir que los vertebrados la presen- ADN poseen regiones ricas en ami- debe regular con precisión en el tiempo tan también. En colaboración con mi noácidos básicos. El dominio homeó- y en el espacio durante la embriogécolega Edward De Robertis y su grupo, tico, que forma parte de proteínas nesis. El patrón espacial de la el nuestro consiguió aislar la primera mayores, es rico en lisina y arginina, expresión genética se está estudiando caja homeótica de vertebrado, de la dos aminoácidos básicos. Una pri- en la actualidad mediante la hibridarana Xenopus laevis. Todos los demás verte bra dos estud iad os pos ter ior mente, seres humanos incluidos, manifestaron poseer secuencias homólogas o similares. De acuerdo con un ensayo provisional de revisión, la caja homeótica está presente en todos los grupos de animales segmentados. Aunque no se ha detectado en la mayoría de los grupos de animales que carecen de segmentos, sí parece hallarse en los erizos de mar. Los primeros indicios sobre el modo de acción de la caja homeótica en el plano molecular (a nivel molecular, si transigimos con el anglicismo) se obtuvieron al comparar las secuencias de ADN de varias cajas homeóticas. Ya se han establecido más de una docena de estas secuencias. Del cotejo de las mismas se ha visto que la homología entre secuencias de cajas homeóticas se circunscribe a una región de 180 pares de bases. La homología fluctúa entre el 60 y el 80 por ciento, según los genes. Todas las cajas homeóticas 9. SE HA DADO EL NOMBRE DE DEFORMADO ( DEFORMED) a un gen homeótico que parece especificar la identidad de los segmentos cefálicos posteriores en el estudiadas hasta el momento pueden embrión de Drosophila. La fotografía muestra una sección de un embrión poco traducirse en cadenas de aminoácidos, después de la formación del blastodermo; la región anterior cae en la parte superior lo que sugiere que la caja homeótica izquierda y la posterior en la inf erior derecha. La banda brillante señala la posición codifica un dominio, o segmento fun- de los transcritos Deformado tal como se detectan en la hibridación in situ. En el cional, de una proteína. A este dominio mapa de destinos, la situación de la banda brillante corresponde a los segmentos se le ha llamado dominio homeótico. cefálicos posteriores. Además, las moscas portadoras de una mutación en el gen Deformado tienen defectos en esos segment os. Parece que el gen Deformado de tipo Las secuencias de aminoácidos corres- silvestre hace falta para la correcta formación de la región posterior de la cabeza. pondientes a las distintas cajas homeó- Muchos datos recientes sugieren que la identidad de los segmentos del cuerpo de ticas guardan entre sí mayor seme- la mosca Drosophila está especificada por genes homeóticos.
E
′
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
109
ción in situ (con ello se quiere decir que no se trabaja en el tubo de ensayo, sino en los tejidos del organismo). Esta técnica se basa en la hibridación de un trozo de ADN de cadena sencilla de un gen con el correspondiente transcrito ARNm. Dado que el ARNm se acumula en las regiones del embrión donde se expresa el gen, la hibridación puede mostrar el patrón espacial de la expresión génica. Las sondas se preparan purificando genes que contienen la caja homeótica y marcándolos radiactivamente. Una gota de solución que contenga la sonda se deposita sobre una sección fina del embrión de Drosophila. Se deja que la
sonda hibride con su transcrito y se cubre la sección con una emulsión fotográfica. Dejada la preparación sensible un tiempo adecuado, se revela la emulsión y entonces las sondas radiactivas de ADN ligadas a ARNm homólogo aparecen en forma de granos oscuros o claros, según sea el sistema óptico elegido. Ernst Hafen y Michael Levine refinaron esta técnica en mi laboratorio para posibilitar la detección de transcritos procedentes de genes homeóticos. Algunos de los resultados más interesantes de la hibridación in situ se han obtenido usando fushi tarazu por sonda. Los transcritos de fushi tarazu
se empiezan a detectar en los núcleos alineados en el citoplasma cortical, antes de que se formen las membranas celulares. A medida que los núcleos se van dividiendo, aumenta la transcripción y muy pronto los granos oscuros forman un espectacular diagrama de siete bandas alrededor del blastodermo. El mapa de destinos muestra que esas zonas corresponden precisamente a las siete secciones ausentes en el mutante fushi tarazu . Una vez constituidos los segmentos embrionarios, desaparecen los transcritos. De estos resultados se deducen dos puntos importantes sobre el funcionamiento de fushi tarazu. Al inicio de la
10. LOS TRANSCRITOS ANTENNA PEDIA se acumulan diferencialmente en los segmentos del embrión, como vemos en esta sección de un embrión en las últimas etapas de su desarrollo. En esas fases postreras de la embriogénesis la segmentación se observa con toda nitidez en el sistema nervioso central, que forma un ganglio por cada segmento corporal. Antennapedia se expresa muy poco en el primer ganglio torácico. En cambio, lo hace fuertemente en el segundo ganglio torácico y débilmente en los segmentos siguientes. La expresión diferencial puede ser parte del mecanismo por el cual los genes homeóticos confieren identidades específicas a los segmentos del embrión de Drosophila melanogaster .
110
TEMAS 3
embriogénesis, el gen normal se debe expresar en secciones alternas para que se establezca el plan segmentario; luego ya no es necesario. El hecho de que el gen normal de fushi tarazu se exprese espacialmente con precisión antes de que se formen las membranas celulares, implica que los propios núcleos tienen un “sensor” que les permite identificar su posición en el citoplasma cortical. Mi opinión es que el sensor constituye una región de control adyacente al gen fushi tara zu y a otros genes implicados en la elaboración del patrón segmentario. Se in vestigó sobre esta posibilidad creando un gen artificial que incluía la región de control del gen fushi tara zu y el gen bacteriano de la enzima beta-galactosidasa. La expresión del gen sintético queda controlada por la secuencia de fushi tarazu, pero la proteína producida por el gen es la bacteriana. Se inserta el gen artificial en un embrión de Drosophila. La expresión del gen de beta-galactosidasa se detecta por reacción química que excita un colorante. Cuando se realiza el experimento se encuentra la betagalactosidasa distribuida según un diagrama de siete franjas que coincide cabalmente con el patrón de los transcritos de fushi tarazu . Queda claro que después de la entrada del núcleo en el citoplasma cortical, una sustancia interactúa con la región de control de fushi tarazu y activa o bloquea el gen según la posición del núcleo en el córtex. A su vez, el producto proteínico de fushi tarazu puede ir a regular un grupo de otros genes de una manera coordinada con precisión. Fushi tarazu es uno más entre los genes cuya expresión se ha investigado por hibridación in situ. Otros experimentos han ayudado a esclarecer cómo se completa el plan segmentario. Se sabe que el gen dentellado ( en grailed) es necesario en el compartimiento posterior de cada segmento. La hibridación in situ indica que, poco después de que fushi tarazu se ex prese, los transcritos de engrailed se distribuyen según un patrón de 14 franjas estrechas, correspondientes al compartimiento posterior de los segmentos. Por lo que se manifiesta, el embrión se divide primeramente en segmentos que luego se subdividen en compartimientos. El mejor lugar para seguir la acción de los genes homeóticos e s el sistema nervioso ventral, que en posteriores fases del desarrollo embrionario forma un ganglio por cada segmento corporal. Empleando la caja homeótica como sonda, se ha clonado una serie de genes homeóticos
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
cuyos transcritos se acumulan en ganglios ventrales consecutivos. Cada gen se expresa con más fuerza en un segmento concreto y con menos fuerza en todos los segmentos posteriores a ése. Eso concuerda con la hipótesis de Lewis, según la cual la actividad de una combinación específica de genes homeóticos determina la identidad de los distintos segmentos.
M
uchos laboratorios siguen investigando para consolidar y extender los conocimientos obtenidos con la identificación de la caja homeótica. Si el dominio homeótico se fija al ADN, será importante saber dónde y cómo. Además, aunque los genes poseedores de cajas homeóticas regulen la actividad de muchos otros genes, ellos mismos deberán ser regulados a su vez. Desentrañar la regulación de los reguladores constituirá otro paso importante, que podrá además conducir a identificar los factores citoplasmáticos del huevo que proporcionan la información posicional. Todo este trabajo febril marca la frontera entre dos eras. En la era premolecular se avanzó mucho en el conocimiento del momento en que se asignan los destinos a las células embrionarias. En la era molecular, se averiguará cómo ocurre ello. Los mecanismos moleculares subyacentes a dicho desarrollo pueden resultar mucho más universales de lo que se había sospechado.
COLABORADORES DE ESTE NUMERO Traducción:
Santiago Torres: Genes inteligentes, Una herencia distinta, Impronta parental de los genes , Glicoesfingolípidos y Sustitución dirigida de genes; Rafael Alvarado: La fecundación en los mamíferos ; Esteban Santiago: Las histonas, proteínas reguladoras de genes, Carbohidratos en el reconocimiento celular ; J. M. García de la Mora: La vitamina A y su cohorte; M.ª Verónica Etchart: Genes con homeobox y el plan corporal de los vertebrados; Rosa María Aguilar y Juan Modolell Mainou: Base molecular del desarrollo; Ernesto Sánchez-Herrero: Arquitectos moleculares del diseño corporal ; Joandomènec Ros: Cosecha de homeobox. Página
Fuente
6 8 9
Tomo Narashima Michael Goodman Michael Xevine, Manfred Frasch ( abajo, derecha) Michael Goodman Graeme Mardon ( arriba), William J. McGinnis (centro ), Mario R. Capecchi (abajo) Charles R. Kissinger y Carl O. Pabo (izquierda), Nikola P. Pavletich y Carl O. Pabo ( derecha ) Michael Goodman Robert T. N. Tjian ( arriba), Douglas A. Melton (abajo) Paul M. Wassarman Neil O. Hardy Paul M. Wassarman ( izda.), Neil O. Hardy (centro y dcha.) Neil O. Hardy David M. Phillips Paul M. Wassarman Shirley M. Taylor, Lesley A. Michalowsky y Peter A. Jones, Universidad de California del Sur, Facultad de Medicina George V. Kelvin Carol Donner Patricia J. Wynne C. Mezquita y J. Vives Mañé T. Sellés C. Mezquita T. Sellés Timothy J. Richmond, Biblioteca del Inst. Federal de Tecnología de Suiza, Zurich Ian Worpole; Barbara A. Hamkalo, Univ. de California, Irvine Ian Worpole Stephen J. Kron y Gerald R. Fink, Whitehead Institud ( arriba); Ian Worpole (dibujo) Ian Worpole Jovita Mezquita y Magda Mària Tomo Narashima Jared Schneidman/JSD Cortesía de Kazuhiko Fujita, Esc. Univ. de Medicina en Juntendo, Tokyo Kathleen Katims/JSD Cortesía de Steven Rosen, Univ. de California, San Francisco Kathleen Kayims/JSD ( arriba), cortesía de Kazuhiko Fujita, Esc. Univ. de Medicina en Juntendo, Tokio (abajo) Photo Researchers, Inc. Steven B. Levery, Centro Fred Hutchinson, Ronald E. Stenkamp y Keith D. Watenpaugh, Washington Hank Iken, Walken Graphics Steven B. Levery, Centro Fred Hutchinson para la investigación del cáncer, Ronald E. Stenkamp y Keith D. Watenpaugh, Washington Yasuo Fukushi, Univ. de Tohoku, Japón Hank Iken, Walken Graphics Patricia J. Wynne Edward Bell Patricia J. Wynne G. Oliver ( izquierda), A. Molven, Univ. de Oregón (derecha ) Walter J. Gehring Tom Prentiss Walter J. Gehring Tomo Narashima William McGinnis ( arriba), Tomo Narashima ( abajo) Tomo Narashima William McGinnis ( abajo) Jered Schneidman/JSD Tomo Narashima Tomo Narashima Jered Schneidman Design Mario R. Capecchi ( arriba), Tomo Narashima ( abajo)
10 11 12 13 14 17 18 19 20 21 22 25 26-31 35 36-40 43 44-47 48 49-50 52 54 55-56 57
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA CLONING OF AN X. L AEVIS GENE EXPRESSED DURING E ARLY E MBRYOGENESIS C ODING FOR A PEPTIDE REGION HOMOLOGOUS TO D ROSOPHILA HOMEOTIC GENES. Andrés
E. Carrasco, William McGinnis, Walter J. Gehring y Eddy M. De Robertis en Cell, vol. 37, n.o 2, págs. 409-414; junio, 1984.
A HOMOLOGOUS P ROTEIN-C ODING S EQUENCE IN D ROSOPHILA HOMEOTIC GENES AND ITS CONSERVATION IN OTHER META-
. William McGinnis, Richard L. Garber, Johannes Wirz, Atsushi Kuroiwa y Walter J. Gehring en Cell, vol. 37, n.o 2, págs. 403-408; junio, 1984.
58 61-68 72-73 74 75 76 77 78 79 81 82-87 88
ZOANS
FLY AND FROG HOMOEO DOMAINS SHOW HOMOLOGIES WITH YEAST M ATING TYPE REGULATORY PROTEINS. John C. W. She-
pherd, William Mcginnis, Andrés E. Carrasco, Eddy M. De Robertis y Walter J. Gehring en Nature, vol. 310, n.o 5972, págs. 70-71; 5 de julio de 1984.
ISOLATION OF A HOMOEO BOX-CONTAINING GENE FROM THE E NGRAILED REGION OF D ROSOPHILA AND THE SPATIAL DISTRIBU TION OF ITS TRANSCRIPTS . Anders Fjose,
William J. McGinnis y Walter J. Gehring en Nature, vol. 313, n.o 6000, págs. 284289; 24 de enero de 1985.
89 90 93-95 96 97 98 100-101 102-104 105-110 113 114 115 116 117 118 121 122-125 126
111
Arquitectos moleculares del diseño corporal William McGinnis y Michael Kuziora La introducción de un gen humano en una mosca nos evoca escenas cinematográficas de un relato fantástico. Más importante: sirve para demostrar que las formas corporales de todo los animales se definen por mecanismos casi idénticos
T
odos los animales se desarrollan a partir de un huevo fecunda do que, tras experimentar múltiples tandas de división, origina, por lo común, millones de células embrionarias. Mediante un sorprendente proceso de autoorganización, en vuelto todavía en el misterio, estas células se disponen formando un organismo completo en el que hueso, músculo, cerebro y piel se integran en un conjunto armónico. El proceso fundamental es constante, no así los resultados: seres humanos, ratones, moscas y gusanos representan un amplio muestrario de diseños corporales. Ante semejante diversidad, los biólogos suponían que los arquitectos moleculares de la morfología corporal —procesos genéticos que controlan el desarrollo embrionario en las diferentes especies— serían también muy variopintos. Pero hay pruebas convincentes de que un grupo de genes relacionados entre sí, los llamados genes HOM en invertebrados y genes Hox en vertebrados, dirige aspectos similares del diseño corporal en todos los embriones animales. Al menos en lo concerniente a algunos sistemas moleculares que moldean nuestra forma, los seres humanos nos parecemos, seguramente,
WILLIAM McGINNIS y MICHAEL KUZIORA investigan el papel ejercido en el desarrollo por la superfamilia de genes con secuencia homeótica. McGinnis enseña biofísica en Yale. Investigando en la Universidad de Basilea descubrió con Michael Levine la secuencia homeótica en genes de Droso phila . Kuziora es profesor en Pittsburgh.
112
mucho más de lo que nos gustaría a gusanos e insectos, nuestros parientes lejanos. Tanto, que en los laboratorios se han empleado genes Hox de ratón y humano para guiar el desarrollo de embriones de la mosca del vinagre. El relato histórico sobre estos arquitectos moleculares universales se remonta a los estudios genéticos que iniciara Edward B. Lewis, quien ha pasado gran parte de los últimos 40 años estudiando el complejo bithorax, un pequeño grupo de genes homeóticos de Drosophila melanogaster , la mosca del vinagre. El término griego Homeo significa “semejante”; por lo mismo, se denominan homeóticos aquellos genes de la mosca que, tras sufrir mutación, adquieren capacidad de transformar un segmento de su cuerpo en la réplica de otro. Las mutaciones en los genes del complejo bithorax suelen producir este tipo de defectos en el desarrollo de la parte posterior del plano corporal de la mosca. El equipo de Thomas C. Kaufman ha descubierto un segundo grupo de genes homeóticos de la mosca, el complejo Antenna pedia (que debe su nombre al gen fundador del complejo, Antenna pedia). Las mutaciones en estos genes producen defectos homeóticos en la parte anterior del cuerpo. Ocurre a menudo en biología que ciertos defectos raros observados en animales extraños encierran la clave para resolver problemas importantes. Pocos fenómenos producen mayor extrañeza que las alteraciones del diseño corporal causadas por las mutaciones homeóticas; a modo de botón de muestra: algunas mutaciones del gen Antennapedia determinan que las antenas de la cabeza de la mosca del vinagre se transformen en un par supernumerario de patas
torácicas. Para mayor admiración, algunos individuos que desarrollan las patas supernumerarias sobreviven, se alimentan e incluso se aparean con moscas normales. Los Antennapedia que llegan a adultos constituyen una rareza, puesto que casi todas las mutaciones inducidas en genes homeóticos producen defectos embrionarios letales en Droso phila. Pero también estos embriones que mueren pueden enseñarnos mucho. A este respecto, Ernesto Sánchez-Herrero y Ginés Morata descubrieron que la eliminación de los tres genes del complejo bithorax — Ultrabithora x , abdominal-A y Abdominal-B— resultaba letal. Sin embargo, estos embriones mutantes viven lo bastante para desarrollar estructuras especializadas que ponen de manifiesto la transformación de los ocho segmentos abdominales en segmentos torácicos.
D
e sus estudios genéticos iniciales sobre el complejo bithorax Lewis extrajo dos importantes conclusiones. La primera, que la función normal de estos genes homeóticos estriba en conferir a las células identidades espaciales (o posicionales) inequívocas en diferentes regiones a lo largo del eje anteroposterior de la mosca. Esto es, los genes les “dicen” a las células si forman parte de la cabeza, el tórax o el abdomen de la mosca. Estas identidades son hasta cierto punto abstractas, por cuanto las coordenadas espaciales asignadas por los genes homeóticos se interpretan de diversa forma en distintos estadios de desarrollo. Ant enn apedia confiere identidad torácica lo mismo durante el período embrionario que durante el
TEMAS 3
1. EMBRIONES de vertebrados (peces, salamandras, pájaros, corderos y humanos) y su estrecho parecido mutuo en etapas precoces de su desarrollo. La mosca del vinagre Drosophila y otros invertebrados siguen un desarrollo muy diferente, pero en los primeros estadios comparten con los vertebrados un patrón de expresión común de los genes con secuencia homeótica. Tal descubrimiento revela que, pese a las diferencias en el aspecto final de los animales, éstos usan genes estrechamente emparentados para especificar partes del cuerpo a lo largo del eje anteroposterior (o cabeza-cola).
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
113
la región anterior del abdomen la función del gen Ultrabithorax, Antenna pedia se encargará del desarrollo de esa región. Por consiguiente, estructuras asociadas sólo con el tórax (región que Antennapedia contribuye a especificar) aparecen también en posiciones más rezagadas. Las mutaciones que expresan un gen homeótico en una posición incorrecta provocan también transformaciones homeóticas. Así, se originan las mutaciones Antennapedia en las moscas adultas cuando se activa el gen Ant ennapedi a en la cabeza, lugar donde suele hallarse inactivo. En resumen, las pruebas genéticas indican que son necesarios todos los genes del complejo HOM para especificar el destino de las células situadas en cierta posición del eje anteroposterior durante el desarrollo: cabeza posterior, tórax, etcétera. Más importante (y más revelador de su función biológica) resulta el hecho de que la actividad de cada gen del complejo HOM es suficiente, según parece, para determinar el destino de algunas células por lo menos, aun cuando éstas no se encuentren bajo la influencia normal de un gen dado.
L
os genes del complejo HOM son virtualmente los únicos de Drosophila que gozan de esas propieda2. TRANSFORMACIONES HOMEOTICAS se producen en moscas del vinagre que des. También comparten una interehan sufrido mutaciones en genes homeóticos. A modo de ejemplo, las mutaciones sante semejanza estructural, al ser del gen Antennapedia pueden hacer que aparezcan cinturones de dentículos torátodos ellos miembros de la familia cicos (espínulas) en las cabezas de las larvas (arriba, a la derecha). Otra consecuengénica con secuencia homeótica. Esta cia de la mutación es que, a las moscas mutantes, les salen patas donde debía haber caja homeótica, como también se la antenas (abajo, a la derecha). A la izquierda se muestran una larva y un adulto normales. llama, es una secuencia de ADN que contiene las instrucciones para la sínpupal del ciclo vital de la mosca, aun- están en el ADN de todas las células tesis de un grupo emparentado de que las estructuras (órganos sensoria- de la mosca, pero sólo se expresan en homeodominios, regiones proteicas de les, patas, alas, etcétera) que se de- algunas. Cuando se activan, estos un tamaño de 60 aminoácidos. El presarrollan en el tórax difieren en larvas genes se copian en moléculas de ARN fijo homeo- proviene de su descubriy adultos. mensajero, que sirven de molde para miento inicial en las proteínas HOM La segunda conclusión importante a la síntesis de proteínas HOM. Antes de Drosophila. Desde entonces se han la que llegó Lewis fue que el orden de que las regiones del embrión mues- encontrado homeodominios con varios lineal que presentan los genes del com- tren signo alguno de su destino final, grados de similitud en otras muchas plejo bithorax en el cromosoma de la los genes del complejo HOM se activan proteínas. Los correspondientes a las mosca se corresponde exactamente con en bandas celulares sucesivas a lo proteínas HOM de Drosophila revelan el orden de las regiones corporales que largo del eje anteroposterior. Algunas una estrecha semejanza mutua, indidichos genes especifican a lo largo del de estas bandas de activación se sola- cio de parentesco. De ahí les viene la eje anteroposterior del embrión. La pan, pero cada gen del complejo HOM denominación de homeodominios de misma relación se mantiene en el caso tiene un límite de activación anterior la clase Antennapedia. de los genes del complejo Antennapedia. propio en el plan corporal. ¿Qué función bioquímica desemUnidos por estas características comuSi la deleción del gen o algún inci- peñan estas proteínas HOM? No podenes, los genes de los complejos bithorax dente similar impide la expresión de mos dar todavía una respuesta satisy Antenna pedia reciben la denotación una proteína HOM, las células factoria. Pertenecen a un grupo de de complejo HOM . embrionarias, que abundan en esa proteínas que se unen al ADN en las La observación de los lugares del proteína, experimentan a menudo zonas reguladoras de los genes. La embrión donde se muestran activos una transformación homeótica, trans- combinación apropiada de estas prolos genes del complejo HOM nos puede formación debida a un gen homeótico teínas enlazadas en un elemento regullevar a comprender, siquiera en de reserva ya activo en las mismas lador del ADN señalará la activación parte, cómo determinan éstos las posi- células y que puede reemplazarle con o la represión de un gen, es decir, el ciones axiales en el plan corporal de su propia información posicional. Por comienzo o la interrupción de la sínla mosca del vinagre. Los genes HOM ejemplo, si se elimina de las células de tesis de la proteína determinada por
114
TEMAS 3
ese gen. Se ha demostrado que la El primer desafío que se nos plan- miento a 37 o C durante un breve región del homeodominio de las pro- teaba era crear genes que codificaran período. ( Drosophila vive a 25 oC, pero teínas HOM constituye la fracción que las proteínas homeóticas quiméricas puede tolerar 37 oC durante una o dos interacciona directamente con los que deseábamos. Esto fue factible gra- horas sin sufrir efectos dañinos.) sitios de unión al ADN. cias a las técnicas de ADN recombi- Pudimos ensayar la capacidad de las Llama poderosamente la atención nante de corte y empalme de pequeños proteínas quiméricas para actuar el contraste ofrecido entre la seme- segmentos del ADN génico. Si la inge- sobre los elementos reguladores de los janza estruct ural de las prot eínas niería genética se ejecuta debidamente, genes diana en sus posiciones cromoHOM y sus efectos, diversos y especí- los dominios pueden trasladarse con sómicas normales y en su entorno ficos. Se trata de una familia de pro- suma precisión de una proteína a otra embrionario natural —una prueba teínas que se unen, todas, al ADN y conservando sus características funcio- rigurosa que remeda de cerca las conderivan, presumiblemente, de un nales. Teníamos luego que asegurar- diciones habituales en las que operan mismo polipéptido ancestral de la nos de que los genes quiméricos fueran estas proteínas. clase Antennapedia . Pero cumplen activos en todos los tejidos embrionaPuesto que las proteínas HOM tiemisiones dispares en el desarrollo: rios. Para ello recurrimos a un método nen homeodominios muy similares, se una proteína determina que unas desarrollado años atrás por Gary unen a sitios de ADN casi idénticos en células se conviertan en parte de la Struhl que requería la unión del gen a los ensayos de laboratorio. Al princicabeza, otra que lo hagan en parte del secuencias de ADN regulador que pue- pio parecía probable que las caractetórax, etc. Parece probable que las den activarse por choque térmico rísticas que dotaban de especificidad proteínas HOM designen diversas moderado. Por último, insertamos funcional a cada proteína se encontraposiciones a lo largo del eje anteropos- nuestras quimeras del gen HOM indu- sen fuera del homeodominio —en las terior regulando la expresión de lo que cibles por calor en los cromosomas de regiones de la proteína más idiosinquizá sean grandes grupos de genes Droso phila mediante la técnica de crásicas. Sin embargo esa suposición subordinados (genes diana). La espe- transformación por elementos P. resultó ser errónea. cificidad funcional de las proteínas Observamos que, si sustituíamos el HOM puede residir, por tanto, en las as moscas de Drosophila así trans- homeodominio nativo de una proteína diferencias entre ellas que las permiformadas portarían en adelante Deformed por un homeodominio Ultraten regular, de modo selectivo, ciertos los genes quiméricos en todas las célu- bithorax, la proteína quimérica perdía genes en los embriones. las de su cuerpo; y ellos producirían su capacidad para regular la expresión Con el fin de conocer mejor esta las proteínas quiméricas en cualquier del gen Deformed en el embrión. En especificidad, en 1986 decidimos cons- momento del desarrollo con sólo subir cambio, la nueva proteína actuaba truir proteínas HOM quiméricas, for- la temperatura de la cámara de creci- sobre la expresión del gen Antennamadas por elementos procedentes de distintas fuentes. (La quimera era un monstruo de la mitología griega que tenía cabeza de león, vientre de cabra y cola de dragón.) Pensamos que, ensayando la función de estas proteínas quiméricas, podríamos definir qué subregiones de las proteínas HOM determinan sus propiedades reguladoras selectivas. Para nuestros primeros experimentos escogimos las proteínas HOM Deformed, Ultrabithorax y Abdominal-B, que tienen homeodominios estructuralmente similares: el de la proteína Deformed es idéntico al de la proteína Ultrabithorax en 44 de sus 66 aminoácidos; no comparten, sin embargo, un parecido generalizado en otras regiones. Cada una de estas proteínas influye también en otros genes de la familia HOM . Así, la proteína Deformed activa selectivamente la expresión de su propio gen; la proteína Ultrabithorax reprime la expresión del gen Antennapedia; y la proteína Abdominal-B regula su propio gen y los de otras proteínas en el complejo HOM , entre ellos An tenn apedia , Ultrabithorax y abdominal-A. Cabía, pues, apro vechar esas relaciones de autorregulación y regulación cruzada 3. COMPLEJOS GENICOS con secuencia homeótica, identificados en invertebrados y vertebrados. Drosophila tiene genes HOM , cuyo orden en el cromosoma de la mospara comprobar las funciones especí- ca es el mismo que las regiones del cuerpo cuyo desarrollo controlan en el eje anteficas de las proteínas HOM quiméri- roposterior. Ratones y seres humanos portan genes Hox, emparentados con los cas. miembros del complejo HOM y muestran idéntica disposición espacial y funcional.
L
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
115
4. LLAMANSE HOMEODOMINIOS ciertas regiones muy similares de 60 aminoácidos, presentes en las proteínas codificadasportodoslosgenescon secuencia homeótica. Cada letra de la secuencia consenso representa un aminoácido; se muestran desviaciones de esta secuencia para varias proteínas HOM y Hox estrechamente emparentadas.
nalidad de estas proteínas más restrictivo que el aplicado por nosotros. Pese a lo cual, sus resultados corroboraron la idea de que buena parte de la especificidad funcional de las proteínas HOM (aunque no toda) reside en las pequeñas diferencias existentes dentro del homeodominio o en regiones adyacentes.
T
pedia —prácticamente como lo haría una proteína Ultrabithorax normal. Al transferir el homeodominio Ultrabithorax a la proteína Deformed habíamos transferido también, veíase, sus capacidades reguladoras selecti vas. Otro experimento de intercambio de homeodominios dio resultados similares. Una proteína Deformed con un homeodominio Abdominal-B en lugar del suyo propio imitaba la especificidad reguladora de una proteína Abdominal-B. Las proteínas quiméricas no se comportaban exactamente como las proteínas de las que derivaban sus homeodominios. Lo mismo la proteína quimérica Deformed/Ultrabithorax que la Deformed/Abdominal-B activaban la expresión de sus genes diana, mientras que las proteínas Ultrabithorax y Abdominal-B normales la reprimían. Cabe suponer que regiones de
odos estos descubrimientos nos sugerían que había una posibilidad real de que ciertos experimentos que ya estaban en marcha en nuestro laboratorio, un tanto osados y para los que sólo teníamos ligeras esperanzas la proteína Deformed situadas fuera de éxito, proporcionaran resultados del homeodominio proporcionan una interesantes. Se trataba de ensayos fuerte función activadora que estaba funcionales, en embriones de Drosocapacitada para actuar con cualquiera phila , de proteínas con homeodomide estos homeodominios HOM. En nios de ratón y humanos. Antes de coherencia con esa idea, la proteína seguir, conviene conocer qué se sabe Deformed presenta algunas regiones acerca de los genes Hox de mamífericas en aminoácidos que caracterizan ros. los “dominios de activación” de otras A lo largo de los últimos nueve años proteínas reguladoras génicas. se han encontrado genes que contienen Richard Mann, David S. Hogness, secuencias homeóticas de la clase Greg Gibson y Walter J. Gehring han Antennapedia en los cromosomas de llevado a cabo experimentos similares muchas especies animales, además de sobre la especificidad funcional de las Drosophila. Esos genes se han estuproteínas HOM. Los ensayos se basa- diado en ranas, ratones y seres humaron en la evaluación de las transfor- nos, donde se denominan genes Hox maciones homeóticas que las proteí- (abreviatura de secuencia homeótica, nas HOM mutantes y las quiméricas “homeobox”, en inglés). En el ratón y en inducían en el desarrollo de las mos- el hombre los genes Hox se agrupan en cas. Abordaron los efectos de las pro- cuatro grandes complejos localizados teínas HOM en el desarrollo, y no sólo en diferentes cromosomas. En cuanto a sus efectos sobre la expresión génica; su organización y sus patrones de por ello, usaron un criterio de funcio- expresión embrionaria, los genes de los
5. EXPRESION del gen Deformed en embriones de mosca, revelada por la tinción marrón; suele estar restringida a una banda de células que se convierten en estructuras cefálicas posteriores (a la izquierda). Los embriones con genes Defor-
116
med transferidos mediante ingeniería producirán la proteína Deformed en todas las células del organismo tras una breve exposición al calor (derecha). Las anomalías del desarrollo permiten inferir la función del gen HOM .
TEMAS 3
complejos Hox comparten un asombroso parecido con los genes del complejo HOM de la mosca. Por ejemplo, se pueden identificar genes Hox cuya estructura se acerca a la de los genes HOM labial, proboscipedia, Deformed, Antennapedia y Abdominal-B . Los genes Hox y HOM equivalentes se disponen en el mismo orden lineal, dentro de sus complejos respectivos. Un ulterior paralelismo observaron, por un lado, Denis Duboule y Pascal Dollé y, por otro, el equipo de Robb Krumlauf. Recabaron pruebas concluyentes de que los patrones de ex presión de los dos tipos de genes eran similares. Es decir, los genes Hox se activan a lo largo del eje cabeza-cola en las etapas iniciales del desarrollo embrionario del ratón en el mismo orden relativo que se activan los genes HOM en el eje anteroposterior de Drosophila. Las semejanzas estructurales entre las proteínas de mosca y de ratón se limitan principalmente a las regiones del homeodominio. La secuencia de aminoácidos del homeodominio de la proteína Antennapedia de la mosca y la secuencia de aminoácidos del homeodominio de la proteína HoxB6 del ratón son casi idénticas (difieren sólo en cuatro posiciones de 61); significa ello que estas dos proteínas se parecen entre sí más de lo que Antennapedia se parece a cualquier otra proteína HOM de la mosca. Desde un punto de vista ev oluti vo, esta informa ció n sugiere que HoxB6 y Antennapedia son homólogos estructurales —esto es, descienden de un gen ancestral común diferente del que dio lugar, pongamos por caso, a Abdominal-B o Deformed. Siguiendo el mismo razonamiento, la similitud entre el complejo HOM y los complejos Hox indica que el antepasado común más reciente de Drosophila , el ratón y los seres humanos —una criatura con aspecto de gusano que vivió, más o menos, hace unos 700 millones de años— tenía un protocomplejo de genes con secuencia homeótica de la clase Antennapedia. El tipo y la disposición exactos de los genes en ese complejo siguen siendo un misterio. Sin embargo, guiándonos por los complejos HOM y Hox actuales podemos estar seguros de que ese protocomplejo primitivo contenía homólogos estructurales de labial , probosciped ia , Def orm ed , Ant enn apedia y Abdominal-B. Esta visión general de la evolución de los genes HOM y Hox está sustentada firmemente por la investigación que Richard W. Beeman y Rob E. Denell han realizado sobre los genes homeóticos del escarabajo; lo corrobo-
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
6. LAS DIANAS GENETICAS de las proteínas con homeodominio están determinadas en buena medida por las regiones del homeodominio de dichas proteínas. Por ejemplo, una proteína quimérica Deformed que lleva un homeodominio Ultrabithorax actúa sobre los mismos genes que lo hace Ultrabithorax. Sin embargo, el efecto regulador de la quimera —activación— se asemeja más al de Deformed debido a las regiones de la proteína situadas fuera del homeodominio.
ran publicaciones recientes de muchos HoxA7 se expresa anormalmente delaboratorios, que demuestran que el sarrollan deformidades en el oído y el gusano primitivo Caenorhabditis ele- paladar y, en algún caso, presentan gans también tiene un comple jo HOM , transformaciones homeóticas de las aunque remota, claramente emparen- vértebras cervicales. tado con los complejos HOM de El experimento inverso, muy delicado, consiste en bloquear la función Drosophila y Hox de vertebrados. de un gen Hox . Osamu Chisaka y odo este respaldo estructural, Mario R. Capecchi lo han acometido aunque sugerente, no nos permite para HoxA3, y Thomas Lufkin y Pierre aún afirmar de manera tajante que las Chambon para HoxA1 . Han demosproteínas HOM y Hox cumplen la trado que algunas estructuras de las misma función durante el desarrollo regiones anteriores del embrión de de los embriones. No se olvide que los ratón dependen de esos genes. La complejos génicos de la mosca y el mutación del gen HoxA3 origina ratoratón han estado en diferentes linajes nes, que mueren al poco de nacer con evolutivos durante cientos de millones un complejo conjunto de deformidades de años, con tiempo de sobra para en cabeza y cuello (estructuras óseas desarrollar capacidades nuevas o anómalas en el oído interno y cara y di vergentes. Por tanto, las seme janzas ausencia de timo). Tales deformidades recuerdan el de estructura y expresión podrían ser caprichos históricos y no indicadores síndrome de DiGeorge, una enfermefieles del parecido funcional entre las dad congénita humana, lo que abre la esperanza de que el estudio de los proteínas HOM y Hox actuales. Una manera de abordar el problema genes HOM y Hox nos lleve a entender es explorar los efectos biológicos de los defectos hereditarios del hombre. genes Hox en embriones de vertebrados Habrá que avanzar mucho más antes y compararlos con lo que se conoce de desentrañar la participación de los acerca de los efectos de los genes HOM genes Hox en el diseño del desarrollo en invertebrados. Por eje mplo, ¿causa de ratones y humanos. Pero los expetransformaciones homeóticas la acti- rimentos mencionados, y otros que se vación ectópica o la inhibición especí- están incoando, confirman que los fica de la función de un gen Hox genes Hox y HOM desempeñan misiodurante el desarrollo del ratón? En nes similares. En nuestro laboratorio nos propusibusca de una respuesta, el equipo de Peter Gruss creó cepas de ratones mos abordar una comparación directa, cuyos embriones producen proteína comprobando si las proteínas Hox pueHoxA7 en la cabeza y en la región den ocupar el lugar de las proteínas cervical anterior. La proteína HoxA7 HOM en el desarrollo embrionario de (que es similar a las proteínas Drosophila. En teoría, conseguiríamos Ant ennaped ia y Ultrabithorax del el intercambio con la sustitución del complejo HOM ) abunda en las regio- gen HOM de una mosca por su homónes cervical posterior y torácica ante- logo Hox; éste se expresaría cuando y rior y está ausente de las regione s más donde lo hubiera hecho el gen HOM . anteriores. Algunos ratones en los que Pero no podemos acometer todavía un
T
117
7. LAS MOSCAS MUTANTES DEFORMED exhiben varias anomalías en la cabeza, entre ellas la ausencia de la mitad inferior de los ojos compuestos. Las mismas deformidades pueden inducirse haciendo que las larvas expresen la proteína HOXD4.
¿Qué cabe deducir de estos experimentos sobre intercambio de genes entre especies? En primer lugar, refuerzan nuestras conclusiones de que los propios homeodominios determinan gran parte de la especificidad reguladora de las proteínas: fuera de la región del homeodominio, las proteínas homólogas de moscas y vertebrados tienen poco en común. Además, los experimentos sugieren que, desde una óptica funcional, las proteínas homólogas son, hasta cierto punto, intercambiables y tienen “significados” similares para los embriones durante sus fases iniciales de desarrollo. El sistema para determinar la posición en el eje anteroposterior ha cambiado poco en los últimos 700 millones de años. Si asociamos a un rompecabezas la complicada red de interacciones entre las proteínas encargadas de regular los genes dentro de un organismo, las proteínas homólogas de mosca y mamíferos serían piezas que encajarían en los mismos sitios. Planteándonos así el sistema HOM/ Hox , se pone de relieve también todo lo que nos queda por aprender todavía: hemos de identificar aún las otras piezas del rompecabezas que permiten a las proteínas HOM y Hox regular genes y cumplir una función específica.
experimento así; la técnica actual no su propio gen, en lo que constituye un puede abarcar y manipular genes ente- ciclo de retroalimentación positivo.) La ros. Pero sí pudimos aproximarnos al proteína humana HOXD4 remedaba, ideal: usando secuencias de ADN de pues, los efectos de la expresión inade Hox unidas a elementos reguladores cuada de Deformed, ya que —al menos inducibles por calor, logramos que en parte— promovía la expresión impron algún momento del intervalo todas las células de una mosca en de- pia de Deformed. Pese a todo, pudimos que media entre hace 600 millosarrollo expresaran una proteína Hox. comprobar que HOXD4 actuaba como nes y mil millones de años, se desarroLa primera proteína que sometimos una réplica, débil pero específica, de su lló el sistema HOM/Hox. Muchos ania este tipo de prueba, con Nadine homólogo de Drosophila. males han dependido desde entonces McGinnis, fue HOXD4, proteína Alentado por este resultado, Jarema de él para determinar la posición axial humana equivalente a la HoxD4 de Malicki examinó la función de la pro- durante el desarrollo. ¿Es el único sisratón. (De acuerdo con la nomencla- teína de ratón HoxB6 durante el de- tema genético de desarrollo que se ha tura genética normalizada, la abre- sarrollo de la mosca. La proteína conservado? Parece improbable. Se viatura Hox se escribe con mayúscu- HoxB6, que Klaus Schughart y Frank han encontrado indicios de que otros las al referirse a los genes humanos.) H. Ruddle identificaron y caracteriza- genes reguladores de ratón y de mosca El gen que codifica esta proteína ron, tiene un homeodominio muy simi- presentan una estructura muy similar humana, que tiene un homeodominio lar al de la proteína Antenna pedia. Los y son activados en el mismo tejido o en semejante al de la proteína Deformed efectos de la expresión de la proteína tejidos homólogos. La exploración de de la mosca, fue aislado y caracteri- HoxB6 en las células de la mosca las funciones de estos nuevos genes y zado en 1986 por Fulvio Mavilio y durante su desarrollo eran espectacu- de su interacción con el sistema HOM/ Edoardo Boncinelli. lares e inconfundiblemente homeóti- Hox promete revelar muchos más desEn Dro sop hil a , cuando el gen cos. En las larvas de Droso phila la pro- cubrimientos fascinantes sobre la evo De formed se expresa fuera de sus lími- teína HoxB6 hizo que gran parte de la lución y el funcionamiento de los prites normales en el eje anteroposterior, región cefálica se desarrollara como si mitivos sistemas genéticos, auténticos provoca anomalías cefálicas, como fuera torácica: en vez de un esqueleto arquitectos moleculares del plan corausencia de la porción ventral de los larvario cefálico, las moscas transfor- poral de los animales. ojos. Ante nuestro asombro, la expre- madas producían cinturones de dentísión de la proteína humana HOXD4 en culos, filas de espínulas habitualmente las células de la mosca en desarrollo dispuestas en la parte ventral del tórax causa las mismas deformidades. Sin de Droso -phila . En los adultos de BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA embargo, no pudimos atribuir estos Drosophila, HoxB6 producía la transHOMEOBOX GENES AND AXIAL PATTERNING. cambios enteramente a la proteína formación homeótica de las antenas en William McGinnis y Robb Krumlauf en humana: nuestros experimentos indica- patas torácicas. Ya fueran larvarias o Cell, volumen 68, número 2, páginas 283302; 24 de enero de 1992. ban que esta proteína también instaba adultas, las transformaciones homeótiT M AKING OF A F LY: T HE G ENETICS OF HE la expresión del gen Deformed de la cas eran muy similares a las producidas A NIMAL DESIGN . Peter A. Lawrence. mosca. (Recordemos que un efecto nor- por la expresión inadecuada de la proBlackwell Scientific Publications, 1992. mal de la proteína Deformed es activar teína Antennapedia en todo el cuerpo.
E
118
TEMAS 3
Cosecha de homeobox John Rennie Rennie
C
uando un esbozo de tejido de un embrión madura espontáneamente en un brazo completamente formado, lo l o hace siguiendo órdenes. Estas órdenes las imparten genes homeobox, homeobox, una familia de genes “maestros” que asigna el destino destino del desarrollo. Los genes homeobox, característica ubicua de hongos y animales pluricelulares, podrían hallarse también en las plantas. Un equipo de investigadores del Centro de Expresión Genéti Gené tica ca del Departamento de Agricultura de los EE.UU. y de la Univer Universidad sidad de California en Berkeley descubrieron genes vegetales homeobox, ho meobox, llegando a afirmar que esos genes constituyen constit uyen un grupo universal de reguladores que, por más de mil millones de años, han venido dictándoles a las células en qué tenían que acabar. A lo largo de los años ochenta, genéticos y embriólogos advirtieron que ciertas mutaciones, muy complejas, que se operaban en la mosca del vinagre tenían su raíz en determinados genes. Esas mutaciones homeóticas, así se las llamó, eliminaban segmentos corporales enteros o provocaban la aparición de extremidades en lugares insólitos. Los mutantes Antennapedia, por ejemplo, tenían patas donde debieran haber tenido antenas. Los genes mutados parecían supervisar la actividad de otros genes y, a través de ellos, la diferenciación de grupos enteros de células durante el desarrollo. La investigación posterior reveló que muchos de los genes responsables de las mutaciones homeóticas mostraban un estrecho parecido a lo largo de cierta secuencia, la secuencia homeobox. Con otros estudiosos William J. McGinnis, ahora en la Univer Universidad sidad de Yale, Yale, demostró posteriormente que podía haber genes homeobox muy similares en todo el reino animal y hasta hast a en las levaduras. Pero, curiosamente, los múltiples intentos por observarlos en plantas dispares fracasaron sin remedio. No los buscaba, sin embargo, el equipo de Sarah Hake, de Berkeley, Berkeley, aunque tampoco se sorprendieron cuando un gen homeobox les salió al paso. Estaban trabajando en cierta mutación del maíz, la llamada Knotted (nudosa). Las hojas de los mutantes Knotted están están desfiguradas por nudos, o protuberancias arremolinadas de las vasos laterales. Los nudos “parecen formar un grupo de células que continúan dividiéndose, rodeadas por otras células que han dejado de hacerlo”, explica Hake. “Divergen de los tumores. Todas las células se encuentran en una lámina sana y bien definida. Imagínese usted un niño que intenta con el dedo hacerse un siete en el jersey.” jersey.”
proteínas conocidas. Había, en efecto, suficientes similaridades entre la proteína codificada y los productos de genes homeobox para que Hake clasificara el gen Knotted entre entre los que contenían un homeobox. Recapitulando, señala Hake, resulta claro por qué fracasaron los intentos previos en busca de esos genes en las plantas. El método habitual implicaba la técnica de hibridación cruzada, en la que hebras de ADN complementarias de un homeobox servían de sondas para otras. Sin embargo, la divergencia entre secuencias de ADN vegetal y animal es tan grande que las moléculas sonda basadas en genes animales no se podían adherir a los genes vegetales. “Con la existencia ya de un motivo vegetal conocido, resultará más fácil obtener genes homeobox vegetales.” vegetales.” Hake y su grupo han identificado varios homeobox más en el maíz, tomate y arroz. Aunque los genes homeobox vegetales difieren bastante de los que se encuentran en animales y hongos, las semejanzas siguen sugiriendo que todos los homeobox descendieron de un gen en el antepasado común de los organismos, que vivió hace mil mi l millones de años. El papel de un gen de tales características (“homeoboxoide”) en este antepasado unicelular es motivo de especulación. Cabe la posibilidad, señala McGinnis, de que el gen regulara la transformación de aquellos organismos unicelulares en varias formas distintas. Una vez hubo evolucionado la pluricelular, pudo haberse orientado esa función hacía la producción de diferentes tipos celulares en distintas regiones del cuerpo.
E
l descubrimiento de los genes en las plantas continúa definiendo el rango de actividades por ellos reguladas añade Matthew P. P. Scott, un pionero de la investigación i nvestigación de homeobox en la Universidad de Stanford. “La cuestión central es muy importante. ¿Por qué un determinado tipo de molécula reguladora se halla implicado en un determinado proceso?” Y prosigue: “¿Se trata de un mero accidente histórico que establece cuáles de estos tipos de proteínas se hallan implicados?” O, como Shakespeare podría haber expresado: ¿Por qué eres tú, homeo?
L
as células de las vasos laterales que han dejado de dividirse son anormales: poseen características de células de la vaina, o base de la hoja. Asimismo, en los mutantes Knotted la la lígula (una pequeña balda de tejido epidérmico que normalmente se encuentra entre la hoja plana y la vaina) crece en la misma hoja. Para el grupo de Hake, todos los rasgos del mutante vendrían causados por células que exhiben un comportamiento normal en sitios impropios o en momentos inadecuados. Como tales, recordaban las mutaciones homeóticas observadas en la mosca del vinagre. “Las lígulas en un sitio impropio no ofrecen la espectacularidad de las mutaciones Antennapedia”, comenta, “pero, en cierto sentido, son análogas”. Tras varios años de trabajo consiguieron identificar el gen responsable de la mutación Knotted . Dedujeron la secuencia de amínoácidos que determinaría y la compararon con las de otras CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
MAIZ MUTANTE KNOTTED (izquierda) y su correspondiente versión normal ( derecha). La anomalía se da en un gen homeobox que regula la diferenciación y provoca que algunas células foliares expresen rasgos indebidos. Fotografía: Bruce Veit. Veit.
119
Sustitución dirigida de genes Mario R. Capecchi La biología de los mamíferos mamíferos está experimentando una auténtica revolución, revolución, impulsada por una nueva técnica que qu e permite crear ratones portadores de mutaciones controladas controladas de cualquier gen conocido
L
as células de nuestro organismo portan en su núcleo un manual de instrucciones donde se especifican sus distintas funciones. Aunque Aun que ese manual es el mismo para todas, cada estirpe celular —hepáticas, epidérmicas y otras— echa mano de un capítulo ca pítulo diferente para cumplir su propia misión. El manual contiene, asimismo, la información en cuya virtud un embrión unicelular, el óvulo fecundado, fecundado, se convierte, primero, en feto y, luego, en bebé. Y a demás sigue suministrando información mientras el niño madura física e intelectualmente. Cada uno de nosotros es irrepetible; en efecto, el manual difiere ligeramente de un sujeto a otro, de suerte que en él están especificadas casi todas las características físicas y muchas de las claves del comportamiento que nos individualizan. Manual tan extraordinario se llama genoma. Está escrito en forma de nucleótidos, nucleótidos, con un alfabeto de cuatro letras: le tras: adenilato ( A), citidilato ( C), guani guanilato lato (G) y timidilato ( T ). ). Igual que la secuencia de letras de una palabra determina determina su significado, así la secuen secuencia cia de nucleótidos del ADN encierra la información. En cada división celular se replica el manual entero: una copia por cada célula resultante. resultante. En humanos y ratones, el genoma viene a constar de unos tres mil millones de nucleótidos. Con mi grupo de la Universidad de Utah he desarrollado la técnica que permite cambiar una letra, una frase o varios párrafos del manual de ins-
MARIO R. CAPECCHI enseña CAPECCHI enseña genége nética tica en la Universidad de Utah. Suyas son las técnicas descritas aquí. Además, ha contribuido al estudio de la síntesis de proteínas y ha participado en el descubrimiento de los intensificadores de ADN.
120
trucciones de las células de un ratón. Reescribiendo partes del texto y evaluando las consecuencias de esa alteración de las instrucciones sobre el desarrollo del múrido, o sobre su operación posterior, podemos desentrañar las peculiaridades del programa que gobierna dichos procesos. Las unidades funcionales del manual son los genes. Escogemos uno y cambiamos su secuencia específica de nucleótidos: alteraremos su función. Para mayor claridad: si sospecháramos la participación de cierto gen en el desarrollo cerebral, podríamos preparar embriones de ratón en los que el gen normal estuviera “fuera de combate”, anulado del todo. Si por culpa de esa inactivación nacieran ratones con malformaciones cerebelares, sabríamos que el gen en cuestión era decisivo para la formación del cerebelo. El proceso mediante el cual se introducen cambios específicos en la secuencia de nucleótidos de un gen se denomina sustitución dirigida de genes (“gene targeting”).
humanas: fibrosis quística, cáncer y aterosclerosis, por citar algunas. El entusiasmo despertado por la técnica de sustitución se alimenta con otra esperanza, la de su promesa de ahondar en el conocimiento generado por el proyecto genoma. Aspira esta magna empresa a establecer la secuencia se cuencia nucleotídica de todos los genes genes que componen el genoma humano y el del ratón (unos 200.000 genes en cada caso). Se ha identificado sólo la función de un pequeñísimo porcentaje de genes de cada una de esas especies. La secuencia de nucleótidos de un gen determina los aminoácidos que deben ensartarse para formar una proteína dada. (Las proteínas llevan a cabo la mayoría de las actividades celulares.) La propia secuencia de aminoácidos de una proteína suministra, a su vez, importantes
L
a información que se obtenga con los experimentos de sustitución génica en los ratones debiera sernos útil a los humanos, pues el 99 por ciento, ciento, y algún pico más, de los genes coinciden en ambas especies y cumplen similares cometidos. Esa línea de in vestigación en el ratón arroja luz no sólo sobre las etapas del desarrollo embrionario humano, sino también sobre la constitución de nuestro sistema inmunitario y su intervención en la lucha contra las infecciones. Es de presumir que esa técnica de sustitución nos conduzca más lejos, hasta el funcionamiento del cerebro huma humano no y la forma en que ciertos defectos génicos se traducen en enfermedad. A propósito de esto último, se está aplicando la técnica para provocar en ratones modelos de enfermedades
1. MUTACION DIRIGIDA de un gen celular. El procedimiento consiste en introducir copias mutadas del gen (moléculas verdes y amarillas de la izquierda) en las células y dejando que una copia ocupe el lugar del gen original (molécula amarilla de la derecha) en el cromosoma correspondiente. Estas células alteradas permiten producir ratones con mutaciones genéticas específicas. La aparición de una cola curvada y problemas de equilibrio y audición en uno de los ratones (arriba) llevó al descubrimiento de que el gen afectado, el int-2, participa en el desarrollo de la cola y el oído interno.
TEMAS 3
pistas sobre el papel que ésta desem- mamíferos: la posibilidad de ver cómo peña en las células: actividad enzimá- intervienen los genes en los procesos tica, componente estructural o molé- biológicos. Los métodos clásicos de la cula transmisora de señales. Pero la disciplina, muy fructíferos a la hora secuencia no basta, por sí misma, para de abordar esos procesos en organisrevelar las tareas realizadas por la pro- mos elementales, no acababan de teína durante la vida del animal. La adaptarse al estudio de seres de la sustitución génica dirigida sí puede complejidad de los mamíferos. proporcionar esa información y ampliar Para saber cómo replican su ADN nuestro conocimiento sobre las funcio- bacterias y levaduras, unicelulares, nes de los genes y sus proteínas. basta con exponer mil millones o más La sustitución génica nos ofrece una a un agente químico lesivo para el nueva manera de hacer genética de ADN (un mutáge mut áge no) . Elig iendo ien do la
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
dosis adecuada del mutágeno, aseguraremos que cada individuo porte una mutación en uno o varios genes. A partir de esta población de bacterias o levaduras que han experimentado mutagénesis, identificaremos individuos incapaces de replicar su ADN. En tamaña población resulta probable hallar individuos distintos con mutaciones en cada uno de los genes necesarios para la replicación del ADN. (En la replicación del genoma bacteriano o de levaduras participan un
121
Sustitución dirigida de genes en cultivos celulares 1.
Se alteran las copias de un gen (barra de la izquierda) en el tubo de ensayo y se prepara un vector director (barra alargada). El gen mostrado se ha inactivado por inserción del gen neor (verde) en la región que cifra la proteína (azul). El gen neor servirá de marcador para indicar que el ADN vector se ha instalado en un cromosoma. En un extremo del vector se ha introducido un segundo marcador: el gen tk de herpes (rojo).
centenar largo de genes.) Una vez identificados los genes, podemos determinar su papel específico en la replicación: qué genes controlan la decisión de copiar el ADN y cuáles la precisión y tasa de duplicación. Planteamientos similares se han aplicado a los organismos pluricelulares. Los dos favoritos de los genetistas son Caenorhabditis elegans, un gusano, y Drosophila melanogaster, la mosca del vinagre. No obstante, incluso en estas formas sencillas de organismos pluricelulares, la identificación de todos los genes implicados en un proceso biológico es dificilísima. Varios factores explican se mejante dificultad. Uno es el tamaño del genoma. El de la bacteria Escherichia coli contiene sólo 3000 genes, mientras que el de D. melanogast er tiene al menos 20.000 y el de ratón, 10 veces esa cifra. Cuanto mayor es el número de genes tanto mayor es la complejidad, porque aquéllos forman redes interactivas más intrincadas. Averiguar el efecto de cualquiera de esos genes en una red tan enrevesada constituye una tarea hercúlea. Además, el mayor tamaño de los organismos pluricelulares pone límites prácticos al número de individuos que puede abarcarse en un experimento de mutagénesis. No cuesta demasiado buscar tipos específicos de mutantes entre más de mil millones de bacterias o levaduras sometidas a mutagénesis. Pero detectarlos aunque sólo sea en 100.000 moscas constituiría un experimento de una magnitud
122
2.
Vector y sus dos marcadores se introducen en células ( gris) aisladas de un embrión de ratón.
inabordable. A modo de comparación, en los ratones se alcanzaría el límite práctico de detección de una mutación dada en torno a los mil animales.
A
l ser en su mayoría diploides los organismos pluricelulares, las dificultades logísticas para identificar y estudiar los genes se redoblan; ser diploides significa que sus células poseen dos copias de los genes, una heredada de la madre y otra del padre. A efectos de supervivencia, importa mucho tener dos copias de la mayoría de los genes. Normalmente, si una copia sufre una mutación perjudicial, la otra la compensa, y así no se producen graves consecuencias. Esta redundancia significa también que una mutación provocará defectos fisiológicos o anatómicos en el organismo sólo si las dos copias del gen están dañadas. Se logra este tipo de individuos cruzando parentales que tengan cada uno la mutación en una copia del gen. Aproximadamente una cuarta parte de la descendencia de esos cruzamientos será portadora de las dos copias defectuosas del gen. Pese a las dificultades, la identificación de mutaciones seleccionadas en animales vivos sigue siendo el mejor medio para empezar a aclarar y ordenar las etapas de todo proceso biológico. Además, si queremos entender procesos que sólo ocurren en los organismos complejos, como el desencadenamiento de la respuesta inmunitaria, habrá que realizar en éstos los análisis.
Esa es la razón por la que los genetistas interesados en el desarrollo, las funciones neuronales, la respuesta inmunitaria, la fisiología y las enfermedades de los mamíferos hayan empezado a trabajar con el ratón. Desde un punto de vista genético, este animal es un mamífero ideal. Pequeño y prolífico, constituye, además, un excelente referente para la mayoría de los procesos biológicos humanos. Con todo, las manipulaciones genéticas que pueden llevarse a cabo en los ratones son, comparadas con las operaciones permitidas en los organismos simples, muy limitadas. Para identificar ratones que han experimentado mutagénesis y son portadores de defectos en los genes que intervienen en determinados procesos, tendrían que controlarse de 10.000 a 100.000 individuos, a un costo prohibitivo. Por ello, los estudiosos se han venido ciñendo a los animales mutantes que surgían de modo espontáneo en sus colonias. Fruto de la tenacidad de los genetistas, se dispone hoy de una nutrida colección de ratones mutantes. Pero ni siquiera ese grupo de ratones mutantes se halla libre de inconvenientes: no representan una muestra aleatoria de las posibles mutaciones del genoma del ratón, sino que contiene un número desproporcionado de mutaciones que se traducen en anomalías fisiológicas o de comportamiento fácilmente perceptibles. Así, abundan las mutaciones que afectan al color del pelaje, mientras que hay pocas que influyan en las primeras etapas del desarrollo
TEMAS 3
3.
Se produce recombinación homóloga (arriba): el vector se alinea con el gen normal (el objetivo), ubicado en un cromosoma; a continuación, las regiones idénticas alineadas del vector (junto con cualquier ADN que haya intercalado entre ellas) ocupan el lugar del gen original y se produce la exc lusión del marcador situado en el extremo (rojo). En muchas células, sin embargo, se produce inserción aleatoria de todo el vector (también el marcador extra) en algún cromosoma (centro) y en otras la integración fracasa (abajo).
(pues suelen determinar la muerte inesperada del embrión). Por no hablar de lo costoso que resulta aislar los genes responsables de los defectos manifiestos en los ratones mutantes; tarea ésta que exige a menudo años de esfuerzo concertado. Podemos deducir muchas de las etapas involucradas en los fenómenos biológicos sin descubrir los genes implicados; pero sin aislarlos no hay progreso molecular: no se puede determinar la naturaleza de las proteínas cifradas por los genes mutados, ni identificar las células en las que dichos genes son activos. La sustitución génica dirigida permite superar tales dificultades al dejar en nuestras manos qué gen que-
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
4.
Para aislar las células portadoras de una mutación dirigida, se cultivan todas en un medio que contenga ciertas drogas: un análogo de la neomicina (G418) y el ganciclovir. El G418 es letal para las células, a menos que lleven un gen neoY funcional; elimina, pues, las células en las que no se haya integrado el vector ADN ( gris). El ganciclovir mata las células que tienen un gen tk; es decir, elimina las células portado ras de un vector integrado al azar. Las únicas células que sobreviven y proliferan son las que portan la inserción dirigida (verde).
remos alterar. Tam- los genes bajo el control de un conmubién permite ejercer el tador, elemento que permitirá coneccontrol sobre el tipo de tar y desconectar un gen durante el modificaciones intro- desarrollo embrionario o posnatal del ducidas en el gen, de ratón. Supongamos, por ejemplo, un suerte tal que la muta- gen, hipotético, responsable de la forción puede diseñarse a mación y el funcionamiento de una medida para abordar serie de neuronas. La anulación del cuestiones específicas gen determinaría la ausencia de esas sobre la función del neuronas durante la formación del gen. Los criterios para cerebro e impediría valorar la activiseleccionar el gen a dad génica en el adul to. Si el gen estumutar pueden basarse viera bajo el control de un conmutaen el conocimiento dor, éste podría dejarse conectado obtenido de la investi- durante el desarrollo, y las neuronas gación en ratones y se formarían normalmente. En el otras especies. Ahora adulto, el conmutador se desconectaresulta bastante fácil ría; podríamos evaluar entonces la aislar una serie de genes que son acti- función del gen sobre las neuronas. vos durante la formación del corazón del ratón; la sustitución de genes pern los últimos 15 años la técnica de mitiría, por tanto, determinar el papel la sustitución génica dirigida ha de cada uno de esos genes en el de- avanzado mucho. Cuando yo empecé, sarrollo cardíaco. Por vía alternativa, a finales de los años setenta, utilizaba podemos averiguar si existe en el agujas de cristal muy pequeñas para ratón una serie de genes cuya función inyectar ADN directamente en el en D. melanogaster consiste en guiar núcleo de las células de mamífero. Las el desarrollo neuronal y si cumplen agujas se controlaban mediante una función similar. micromanipuladores hidráulicos y las De entrada se pretende anular el dirigíamos hacia el núcleo con la ayuda gen a estudiar, para conocer las conse- de microscopios de alta resolución. El cuencias que arrastra la ausencia del procedimiento resultó de una gran efiproducto que dicho gen determina. cacia. Una de cada tres o cinco células Probablemente serán complejas y recibía ADN funcional y comenzaba a afectarán a múltiples vías metabóli- dividirse y a transmitirse establemente cas. Puede comprenderse aún mejor a las células hijas. la función del gen introduciendo mutaCuando investigué el sino de esas ciones definidas, más sutiles, que inci- moléculas de ADN en el interior celudan sólo en una de sus múltiples fun- lar, un sorprendente fenómeno llamó ciones. Muy pronto, podrán ponerse mi atención. Aunque las moléculas de
E
123
Sustitución génica dirigida en ratones 1.
Se aíslan células madre embrionarias (ME) (verde, a la izquierda) de una estirpe de ratón de color marrón y se introduce una mutación dirigida en un cromosoma (inserto). Las células ME se colocan a continuación en embriones jóvenes. El color del pelaje de las futuras crías sirve de guía para comprobar si las células ME han sobrevivido en el embrión. En general se introducen las células ME en embriones que, sin ellas, originarían ratones totalmente negros. Estos embriones se obtienen a partir de una estirpe de color negro (abajo) , carentes del gen agoutí, que produce pelo marrón, aunque esté presente en una sola copia.
ADN recién introducidas se insertaban al azar en uno de los cromo somas de la célula receptora, a veces se introducía más de una molécula en el mismo sitio y todas tenían la misma orientación. Igual que en los idiomas existe una dirección de lectura (de izquierda a derecha en español), así también en las moléculas de ADN. Según parecía, antes de que las células llevaran a cabo la inserción aleatoria, había algún mecanismo nuclear en virtud del cual las moléculas de ADN introducidas se engarzaban en la misma orientación. Demostramos que las células utilizaban un proceso de recombinación homóloga para conseguir tales engarces. La recombinación homóloga se produce sólo entre moléculas de ADN que tienen la misma secuencia de nucleótidos: se alinean una al lado de la otra, ambas sufren cortes y se juntan por los extremos cortados. Los empalmes se realizan con tal precisión, que no se altera la secuencia nucleotídica del sitio donde se producen dichos engarces. Esta inesperada observación revelaba que todas las células de ratón, y
124
2.
Los embriones que contienen las ME se dejan crecer a término en “madres de alquiler”. Se examina el pelo de los recién nacidos. La presencia de parches marrones sobre una fondo negro manifiesta que las células ME han sobrevivido y proliferado en el animal. (Se llaman quimeras porque contienen células procedentes de dos estirpes de ratón.) Un color totalmente negro significaría que las células ME han perecido.
Pese a la denegación, decidí aprovechar los fondos que recibía de otro proyecto. Era una empresa arriesgada. Si fracasaba, no dispondría de datos suficientes para solicitar la renovación de la subvención. La fortuna vino en mi ayuda. En 1984, cuando volvimos a solicitar fondos para proseguir la investigación, teníamos pruebas de la viabilidad de la sustitución génica en las células. Los expertos que habían rechazado la primera propuesta demostraron ahora su buen sentido del humor. El informe de valoración del nuevo proyecto empezaba con la siguiente frase: “Nos alegramos de que no siguiese nuestros consejos.” ¿Cómo se efectúa la sustitución génica dirigida en las células? Se empieza por clonar el gen que nos interesa y propagarlo en bacterias, para así lograr una fuente pura de ntusiasmado ante esta perspecti- ADN que contiene el gen. A continua va, en 1980 solicité una subven- ción, en un tubo de ensayo, se cambia ción para investigar la viabilidad de la la secuencia de nucleótidos del gen en técnica de sustitución génica dirigida. función de los fines del experimento. Pero el comité de expertos que revisó Al gen alterado se le denomina vector el proyecto lo rechazó. En su opinión, director (“targeting vector”). Se introduce el vector en células la probabilidad siquiera de que la secuencia de ADN recién introducida vivas. Dentro del núcleo celular, forma encontrase su secuencia homóloga en complejo con las proteínas que constilos 1000 volúmenes del manual de ins- tuyen la maquinaria celular de recombinación homóloga. Ayudado por esas trucciones genéticas parecía mínima. presumiblemente todas las de mamífero, poseían la maquinaria necesaria para llevar a cabo la recombinación homóloga. En aquellas fechas no había razones para sospechar que contaran con ella las células somáticas, que no están implicadas en la reproducción sexual. Comprobamos la eficacia sobresaliente del mecanismo, pues logramos microinyectar más de 100 moléculas de ADN de idéntica secuencia, que las células engarzaron en la misma orientación. Inmediatamente comprendí que, si aprovechábamos esta maquinaria para provocar la recombinación homóloga entre una molécula recién introducida de ADN de nuestra elección y la misma secuencia del cromosoma de una célula, podríamos reescribir a voluntad su manual de instrucciones.
E
TEMAS 3
3.
Se cruzan ratones quiméricos macho con hembras negras (no agoutí ). Se analiza la descendencia en busca de indicadores de la mutación dirigida (inserto verde) en el gen deseado. Los ratones negros se apartan; si los animales han nacido a partir de esperma procedente de células ME -y con probabilidad de portar la mutación- serían marrones. El examen directo de los genes de los ratones marrones revela cuál de esos animales ( recuadro) ha heredado la mutación dirigida.
4.
proteínas, el vector busca su secuencia homóloga (el objetivo) por todo el genoma. Si la encuentra, se alinea binación homóloga, los segmentos junto a ella y la sustituye. inalterados del gen clonado, junto con Por desgracia, esta sustitución diri- el gen neo r intercalado entre ellos, gida ocurre sólo en una pequeña frac- sustituyen a la secuencia diana preción de las células tratadas. Lo habi- sente en el cromosoma. Pero el gen tk, tual es que el vector se inserte al a zar situado fuera de la zona de secuencias en lugares no homólogos o que ni alineadas, no se integra en el cromosiquiera se integre. Debemos, pues, soma y es degradado por la célula. Por ser capaces de identificar las células el contrario, cuando las células inseren las que la sustitución ha resultado tan aleatoriamente el vector director, satisfactoria. Aproximadamente una lo engarzan todo, incluido el gen tk, en de cada millón de células tratadas el ADN. Si no hay integración, se piertiene la sustitución deseada. den el vector y sus marcadores. Para simplificar la búsqueda de esas células, utilizamos dos “marcadores o necesitamos examinar directaseleccionables”, que se introducen en mente el ADN para identificar el vector director desde el principio. La cuál de esas posibilidades ha ocurrido. inclusión de un marcador seleccionable Nos basta con cultivar las células en “positivo” promueve la supervivencia y un medio que contenga dos drogas: un el crecimiento de las células que han análogo de la neomicina llamado G418 incorporado el vector, ya sea donde se y el antiherpético ganciclovir. El G418 pretendía o en una localización aleato- mata a las células que carecen del gen ria dentro del genoma. La inclusión del neo r protector en sus cromosomas, marcador seleccionable “negativo” esto es, las que no han integrado el ayuda a eliminar la mayoría de las ADN vector. Pero permite sobrevivir células que han incorporado el vector y crecer a las células portadoras de las en una localización aleatoria. inserciones, ya sean aleatorias o diriEl marcador positivo, normalmente gidas. A su vez el ganciclovir mata un gen de resistencia a neomicina todas las células que tienen el gen tk (neor), se coloca de tal forma que quede herpético, es decir, las que albergan flanqueado por secuencias de ADN una inserción aleatoria. Al final, las también presentes en el gen diana únicas células supervivientes vienen homólogo que se desea reemplazar. El a ser las portadoras de la inserción marcador negativo, por lo general el dirigida (las que poseen el gen “selecgen de la quinasa de timidina (tk) de cionable positivo” neor y carecen del un virus herpes, se fija a un extremo gen “seleccionable negativo” tk). del vector. Cuando se produce recomEn 1984 habíamos demostrado ya
N
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
Se cruzan machos y hembras portadores de la mutación para obtener ratones cuyas células presenten la mutación en las dos copias del gen (inserto), careciendo por tanto del gen funcional. La identificación final de esos animales (recuadro) se realiza por análisis directo de su ADN. Por último, se comprueba si tienen algún defecto físico o de comportamiento.
que era posible sustituir genes específicos en células de ratón cultivadas. Estábamos preparados para ampliar la técnica al genoma de ratones vivos. Nos servimos de células especiales desarrolladas en 1981 por Matthews H. Kaufman y Martin J. Evans. Se trata de las células madre embrionarias (ME), es decir, células pluripotentes obtenidas de las primeras fases de un embrión de ratón, que pueden cultivarse indefinidamente en placas de Petri y están capacitadas para originar cualquier línea de células. En resumen, mediante el procedimiento antes descrito, produjimos células ME con una mutación dirigida en una de las dos copias del gen elegido. Luego introdujimos las células ME en embriones muy jóvenes de ratón y los dejamos desarrollarse a término. Algunos de los ratones resultantes, cuando maduraron, produjeron esperma derivado de las células ME. Cru zando estos ratones con otros normales, conseguimos descendientes heterocigotos para la mutación, esto es, ratones que la portan en todas las células en una de las dos copias del gen. En casi todos los casos, esos heterocigotos estarán sanos, porque la segunda copia del gen, intacta, seguirá funcionando correctamente. Pero el cruzamiento de estos heterocigotos con hermanos o hermanas portadores de la misma mutación produce homocigotos: animales con la mutación diri-
125
As í pues , cu an do ve mo s cría s marrones, sabemos que los genes transportados por las células ME han ido a parar a esos descendientes, y ya podemos iniciar los cruzamientos entre hermanos heterocigotos para producir ratones con dos copias defectuosas del gen objetivo. Antes, sin embargo, debemos saber qué crías marrones son las portadoras de una copia del gen mutado. Esto lo consemente durante este tiempo, transmi- guimos buscando la mutación por exatiendo copias completas de todos sus men directo de su ADN. Cuando se genes a sus células hijas; éstas se mez- cruzan hermanos heterocigotos, uno clan con las del embrión y contribuyen de cada cuatro descendientes tendrá a la formación de la mayoría de los las dos copias defectuosas del gen. tejidos del ratón. Por consiguiente, los Identificamos los homocigotos tamrecién nacidos son quimeras: ratones bién por análisis directo de su ADN, compuestos por células derivadas de esta vez buscando dos copias de la las ME extrañas y de las células del mutación. Luego, se examinan los aniembrión original. Las quimeras son males para comprobar la existencia de fáciles de identificar por los amplios anomalías anatómicas, fisiológicas o parches de color marrón que presen- de comportamiento que puedan dar tan en un pelaje negro. Si los animales pistas sobre la función del gen alteno portaran células derivadas de las rado. Todo el procedimiento, desde la ME, serían completamente negros clonación de un gen hasta la producporque carecerían de genes agoutí ción de ratones con una mutación dirifuncionales. gida en ese gen, viene a durar alrede Ahora bien, con sólo mirar las qui- dor de un año. meras no podemos determinar si las Laboratorios de todo el mundo aplicélulas ME dieron origen a células can ahora la técnica de la sustitución germinales, instrumento por el que se génica dirigida en ratones para estutransmite la mutación a las genera- diar una amplia variedad de probleciones futuras. Y esto lo averiguamos mas biológicos. Desde 1989 se han sólo al pasar a la etapa siguiente: la producido más de 250 estirpes portade producción de ratones heterocigo- doras de defectos genéticos seleccionatos portadores de una copia de la dos. Unos pocos ejemplos de los desmutación en todas sus células. Para cubrimientos obtenidos permitirán generar esos animales, cruzamos ilustrar el tipo de información que ratones quiméricos machos con hem- estos animales pueden suministrar. bras negras, defectivas para el gen En mi propio laboratorio hemos agoutí . Los descendientes serán estado explorando las funciones de los marrones si el esperma que fecundó el genes homeóticos, o genes Hox. Estos óvulo procede de las células ME (ya genes son una suerte de conmutadores que todo ese esperma lleva el gen maestros encargados de que las difeagoutí ). Si el esperma deriva de las rentes partes del organismo, como las células del blastocisto original (sin extremidades, los órganos y las partes genes agoutí funcionales), los descen- de la cabeza, se formen en lo s lugares dientes serán negros. adecuados y adopten su morfología
2. RATON RECIEN NACIDO ( arriba, izquierda) con una mutación dirigida en las dos copias del gen HoxA-3 . Su cuerpo está más curvado que el de un ratón normal (segundo por la izquierda). Muestras de tejidos de ratones mutantes (izquierda) y normales (derecha) revelan que los mutantes también carecen de timo y tienen una glándula tiroidea exageradamente empequeñecida. Estos y otros defectos indican que el gen HoxA-3 es necesario para el desarrollo de los tejidos y los órganos que se originan a partir de una estrecha banda de células presentes en los embriones jóvenes (banda coloreada en el dibujo).
gida en las dos copias del gen. Estos animales exhibirán anomalías que revelarán las funciones normales del gen sustituido en todos sus tejidos. Empezamos inyectando nuestras células ME modificadas en embriones en estado de blastocisto, que aún no se han implantado en el útero materno. Como dependíamos del color del pelaje para saber si el procedimiento marchaba de acuerdo con el plan, elegimos blastocistos que en un desarrollo normal se transformarían en crías de color diferente del encontrado en las producidas por la estirpe de ratón de la que obtuvimos las células ME. Las células madre se aislaron de un ratón marrón que portaba dos copias del gen agoutí . Este gen, aun cuando esté presente en una sola copia, produce colorido marrón debido a la presencia, en cada uno de los pelos, de una banda de pigmento amarillo sobre la pigmentación negra normal (la producción de los pigmentos propiamente dichos está controlada por otros genes). Por tanto, seleccionamos blastocistos que, de no ser tratados, se convertirían en ratones negros (los ratones son de color negro cuando el gen agoutí heredado de ambos padres es defectuoso). Esperamos, por fin, a que el embrión, que contenía las células ME modificadas, llegara a término en una “madre de alquiler”.
S 126
i todo va bien, las células ME alteradas se reproducen repetida-
TEMAS 3
correcta. Los estudios sobre los genes homeóticos de Drosophila han suministrado valiosa información sobre sus actividades. Sin embargo, quedan por resolver muchas cuestiones. Por ejemplo, D. melanogaster tiene sólo ocho genes Hox, mientras que el ratón y el hombre tienen 38 cada uno. Probablemente, la expansión de la familia Hox desempeñó un papel crucial en la progresión evolutiva de invertebrados a vertebrados, aportando la maquinaria adicional necesaria para formar un cuerpo más complejo. ¿Qué función precisa cumplen esos 38 genes?
A
ntes de que dispusiésemos de la técnica de sustitución génica dirigida, no había forma de responder a esa pregunta, ya que nadie había encontrado ratones o seres humanos con mutaciones en ninguno de los 38 genes Hox. Mis colegas y yo mismo estamos embarcados ahora en un proyecto cuyo objetivo es establecer la función de cada uno de esos genes. Más tarde intentaremos identificar cómo establecen una red interactiva para dirigir la formación de nuestro cuerpo. Dentro de ese programa, hemos descubierto que la alteración dirigida del gen HoxA-3 origina múltiples defectos. Los ratones que portan dos copias mutadas del gen mueren al nacer por disfunción cardiovascular debida al desarrollo incompleto del corazón y los principales vasos sanguíneos que arrancan del mismo. Esos ratones nacen también con aberraciones en otros muchos tejidos, entre ellos el timo y el paratiroides (que faltan), la glándula tiroidea, el hueso y los cartílagos de la parte inferior de la cabeza, el tejido conectivo, el músculo y el cartílago de la faringe. Esas anomalías, aunque dispares, comparten un rasgo común: todos los tejidos afectados descienden de células que estaban agrupadas en un principio en una estrecha región de la parte superior del embrión en desarrollo. Los rudimentos del corazón, por ejemplo, se alojan en esa región antes de alcanzar su ubicación más retrasada en el tórax. Parece, por tanto, que la función del gen HoxA-3 consiste en controlar la construcción de muchos de los tejidos y órganos que se originan en esa estrecha región. Inesperadamente comprobamos que el desorden producido por la desactivación del gen Hox A-3 del ratón semejaba el observado en el síndrome de Di George, una enfermedad hereditaria humana. El análisis cromosómico de los pacientes con ese sín-
CONSTRUCCIÓN DE UN SER VIVO
drome muestra que el gen HoxA-3 humano no es el culpable; las víctimas presentan daños genéticos en un cromosoma distinto del que alberga dicho gen. Ahora sabemos, sin embargo, que el gen responsable del síndrome actúa dificultando la activación del HoxA-3 o los episodios desencadenados por ese gen. Además, contamos ya con un modelo de la enfermedad en el ratón que acabará proporcionando pistas para su tratamiento. Este imprevisto beneficio resalta el valor de la investigación básica: los descubrimientos nacidos de la curiosidad suelen llevar a aplicaciones muy prácticas. Los inmunólogos se han beneficiado también de la técnica de sustitución génica. La están aplicando para acotar la responsabilidad de cada uno de los más de 50 genes que influyen en el desarrollo y el funcionamiento de las dos clases principales de células defensoras del organismo: linfocitos B y linfocitos T . Los oncólogos acuden también a ella. Con frecuencia se confirma que uno o más tipos de tumores comparten mutaciones en un gen concreto, cuyo papel normal, sin embargo, se desconoce. Su descubrimiento mediante el empleo de nuestra técnica de anulación puede ayudar a revelar cómo contribuye la forma mutante del gen al desarrollo de la neoplasia. El gen supresor tumoral p53 ofrece un ejemplo que hace al caso. Se entiende por genes supresores de tumores aquellos cuya inactivación contribuye al desarrollo del cáncer. Es posible que hasta en el 80 por ciento de todos los cánceres humanos el gen p53 esté mutado, pero hasta hace muy poco se desconocía su función normal. El análisis de ratones homocigotos para una mutación dirigida en p53 indicó que probablemente este gen actúe a modo de cancerbero que impida la división de las células sanas hasta no haber reparado cualquier daño que haya podido sufrir su ADN. Daños infligidos a menudo a las células como consecuencia de las frecuentes agresiones ambientales a las que están sometidas. La pérdida de los genes p53 funcionales elimina esa salvaguarda, lo que facilita la transmisión del gen lesionado a las células hijas, donde participa en el desarrollo cancerígeno. No sólo el cáncer. Más de 5000 enfermedades humanas se han atribuido a defectos genéticos. La identificación de los genes y las mutaciones responsables de esas enfermedades permitirá conseguir las mismas mutaciones en ratones. Los modelos en
ratones harán posible, a su vez, la identificación detallada de los procesos que median entre el funcionamiento anómalo de un gen y la manifestación de la enfermedad. Con un mejor conocimiento de la patología molecular de la enfermedad diseñaremos terapias más eficaces. Entre los modelos que se están creando ahora destacan los ratones con diferentes tipos de mutaciones en el gen de la fibrosis quística. Cuanto más ahondamos en la genética de las enfermedades, mayor es nuestro deseo de aplicar la terapia génica para corregir los defectos. De momento, las técnicas utilizadas en dicha terapia se basan en la inserción aleatoria de genes sanos en los cromosomas para compensar las versiones dañadas. Mas los genes así insertados no suelen funcionar con la eficacia de los que ocupan su lugar correcto en el cromosoma. En principio, la sustitución génica dirigida puede ofrecer una solución a ese problema. Sin embargo, antes de que la técnica pueda utilizarse para corregir un gen defectuoso en el tejido de un paciente, habrán de obtenerse cultivos de células capaces de participar en la formación de esos tejidos en el adulto. Dichas células, que, como las ME de nuestros estudios, se denominan células madre, están presentes en médula ósea, hígado, pulmones, piel, intestinos y otros tejidos. Pero la investigación sobre cómo aislar y cultivar esas células está todavía en mantillas.
A
ntes de ello, la sustitución génica encontrará un uso común en el estudio de la neurobiología de los mamíferos. Ya se han preparado ratones con mutaciones dirigidas que alteran su capacidad de aprendizaje. La identificación de nuevos genes neuronales acelerará el desarrollo de esta línea de trabajo.
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA THE NEW MOUSE GENETICS: ALTERING THE GENOME BY GENE TARGETING. M. R. Capecchi en Trends in Genetics, vol. 5, número 3, páginas 70-76; marzo de 1989. ALTERING THE GENOME BY HOMOLOGOUS RECOMBINATION. M. R. Capecchi en Science, vol. 244, págs. 1288-1292; 16 de junio de 1989. REGIONALLY RESTRICTED DEVELOPMENTAL DEFECTS RESULTING FROM TARGETING DISTRUPTION OF THE MOUSE HOMEOBOX GENE HOX -1,5. Chisaka y M. R. Capecchi en Nature, volumen 350, n.o 6318, páginas 473-479; 11 de abril de 1991.
127
