Tema 5. Difracción de rayos X Espectro electromagnético y Rayos X
Los rayos X son radiaciones electromagnéticas de la misma naturaleza que la luz pero de longitud de onda mucho más corta. La unidad de medida en la región de los rayos X es el angstrom (Å), igual a 10 -10m y los rayos X usados en difracción tienen longitudes de onda en el rango 0.5-2.5Å mientras que la longitud de onda de la luz visible está en el orden de 6000Å (600nm). Son radiaciones penetrantes, producidas por el bombardeo de átomos metálicos con un haz de electrones de alta velocidad. Al aumentar el número atómico del metal bombardeado, la energía de los rayos X característicos aumenta. Los rayos X que más interesan en el campo de la cristalografía son aquellos que presentan una longitud longitud de onda alrededor alrededor de 1Å, que corresponde corresponde aproximadamente aproximadamente con las distancias interatómicas. Por ello, esta radiación es capaz de interaccionar con átomos y moléculas, proporcionando así información sobre los mismos. Estado cristalino
En muchos materiales sólidos, las grandes fuerzas de atracción o cohesión que existen entre las partículas que lo componen hacen que éstas se distribuyan regular y simétricamente en el espacio. Los sólidos que presentan este tipo de estructura ordenada (o cristalina) reciben el nombre de sólidos cristalinos o cristales. La cristalografía es la ciencia que se encarga de estudiar los cristales y su formación. La estructura cristalina es, por tanto, la forma en que se ordenan y empaquetan los átomos, moléculas o iones de manera ordenada, con patrones de repetición que se extienden en las tres dimensiones del espacio. En la estructura cristalina de los materiales inorgánicos, las unidades repetitivas son átomos (cristales atómicos, como el diamante) o iones (cristales iónicos, como el NaCl) enlazados entre sí, de modo que generalmente no se distinguen unidades aisladas y de ahí su estabilidad y dureza. En los cristales moleculares las unidades aisladas que forman el cristal son moléculas con uniones más débiles y son generalmente materiales más blandos e inestables, a diferencia de los cristales inorgánicos, donde las entidades que forman el retículo cristalino son átomos o iones. En el caso de macromoléculas como las proteínas, también existen unidades moleculares (como en otros materiales orgánicos), pero son mucho más grandes. Las fuerzas que unen estas macromoléculas son también similares a las de los cristales moleculares, pero su empaquetamiento empaquetamiento en los cristales deja muchos huecos que se rellenan con agua no ordenada y de ahí su extrema inestabilidad. Un cristal es, por tanto, una estructura sólida formada por agrupaciones ordenadas de átomos, iones o moléculas que se caracteriza por la repetición en las tres direcciones del espacio de una unidad estructural mínima, llamada "celda unidad". Esta celda unidad se define como la estructura geométrica tridimensional (paralelepípedo) cuya repetición genera el cristal y está formada, a su vez, por una unidad mínima que se denomina "unidad asimétrica". Las propiedades básicas del cristal van a depender por un lado de las dimensiones de la celda unidad (definidas por las distancias a, b, c y los ángulos α, � ⃗) y, por otro lado, β, γ, o bien por los vectores no coplanarios⃗ l ado, de su simetría. ,
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Los cristales se clasifican según sean las propiedades de simetría de la celda unidad. Los elementos de simetría son los puntos, ejes o planos alrededor de las cuales tienen lugar las operaciones de simetría (inversión, rotación, reflexión y traslación). Las restricciones que estos elementos de simetría ejercen sobre las longitudes y ángulos de la celdilla unidad permiten clasificar a los cristales en siete sistemas cristalinos (cúbico, tetragonal, ortorrómbico, hexagonal, trigonal, monoclínico y triclínico). Para determinar completamente la estructura cristalina elemental de un sólido, además de definir la forma geométrica de la red, es necesario establecer las posiciones de los átomos en la celda. Bravais mostró que catorce celdas unidad estándar (conocidas desde entonces como redes de Bravais) podían describir todas las estructuras reticulares posibles.
Desde un punto de vista geométrico, una red plana puede considerarse originada por la aplicación de una serie de traslaciones coplanares de la celda unidad. En una red cristalina pueden trazarse series o familias de planos paralelos y equidistantes entre sí, llamados planos cristalinos, construidas de forma que todos los puntos de la red (elementos de la celdilla unidad) caen en alguno de los planos de cada familia. La distancia "d" entre dos planos consecutivos de una misma familia se denomina distancia interplanar, o simplemente espaciado.
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https://www.youtube.com/watch?v=C1cYJthlBZY&feature=youtu.be La difracción de rayos X
Cuando un haz de rayos X incide sobre un material ocurren varios fenómenos:
El fundamento de la difracción de rayos X reside en el fenómeno conocido como dispersión “scattering”, que se produce cuando una radiación incide sobre la materia provocando su atenuación (es uno de los mecanismos responsables de la atenuación de los rayos X). Este fenómeno consiste en la desviación de los fotones del haz incidente de su dirección original de propagación al interaccionar con el material irradiado. Si esta desviación ocurre sin pérdida de energía (la λ de la radiación incidente no cambia en la radiación dispersada), la dispersión será "elástica". Por el contrario, cuando el haz es desviado con pérdida de energía, entonces la dispersión es "inelástica". La cristalografía de rayos X se basa en la dispersión elástica de la radiación causada por los cristales objeto de estudio, ya que es la responsable del fenómeno de difracción de rayos X. La difracción de rayos X es esencialmente un fenómeno de dispersión que provoca interferencias entre las ondas dispersadas. Las interferencias constructivas ocurren sólo en determinadas direcciones del espacio, en función de: • la distancia entre los elementos que se repiten en la estructura periódica.
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la longitud de onda de la radiación incidente y dispersada (que son iguales, al tratarse de una dispersión elástica).
Bragg descubrió que la geometría del proceso de difracción de rayos X es análoga a la reflexión de la luz por un espejo plano (para repasar el fenómeno de difracción, consultar el anexo I). En una estructura cristalina tridimensional, debido a su periodicidad, es posible construir familias de planos paralelos y equidistantes entre sí (llamados planos cristalinos), con idénticas disposiciones atómicas. La figura representa dos de estos planos de la red cristalina, donde "d" es la distancia entre ellos (distancia interplanar) y "θ" es el ángulo entre los rayos incidentes y el plano normal. El proceso de difracción se produce por la dispersión de los rayos X al interactuar con las nubes electrónicas que rodean los átomos del cristal. Esta interacción genera un patrón de difracción regular (al igual que la estructura atómica del cristal), resultado de la interferencia constructiva y destructiva de la radiación dispersada por todos los planos cristalinos. Los átomos dispersan la radiación incidente en todas direcciones pero sólo en algunas de ellas los rayos dispersados estarán completamente en fase y, por tanto, se reforzarán mutuamente (interferencia constructiva) para formar rayos difractados. La ley de Bragg impone que, para que se produzca una interferencia constructiva, la diferencia de camino óptico entre los rayos dispersados por dos planos cristalinos adyacentes sea múltiplo entero de la longitud de onda. Esta ley (que puede expresarse según la ecuación 2d sinθ = nλ) permite estudiar las direcciones en las que la difracción de rayos X sobre la superficie de un cristal produce interferencias constructivas, dado que permite predecir los ángulos en los que los rayos X son difractados por un material con estructura atómica periódica. Se dice que la interferencia es constructiva cuando la diferencia de fases entre dos ondas electromagnéticas es proporcional a un múltiplo entero de 2π. Cuando un cristal difracta rayos X, las ondas electromagnéticas dispersadas interfieren entre sí constructivamente (es decir, se refuerzan) sólo en algunas direcciones, anulándose en el resto.
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La amplitud dispersada por una celda unidad se obtiene sumando la amplitud dispersada por todos los átomos en la celda unidad, de nuevo la suma debe tener en cuenta la diferencia de fase entre todas las ondas dispersadas.
En un cristal hay distintas familias de planos, con distintos espaciados, y por lo tanto, existirán también distintas direcciones de difracción. El conjunto de espaciados de un cristal es característico para cada especie cristalina y esto nos permite decir que no existen dos sustancias cristalinas que tengan un diagrama de difracción idéntico. Se dice que el diagrama de difracción es como una huella dactilar de las sustancias cristalinas. En resumen, la difracción es esencialmente un fenómeno de dispersión en el que cooperan un gran número de átomos. Puesto que los átomos están dispuestos periódicamente en una red, los rayos dispersados tienen unas relaciones de fase definidas entre ellos; estas relaciones de fase son tales que en la mayoría de las direcciones se produce una interferencia destructiva pero en unas pocas direcciones se produce una interferencia constructiva y se forman rayos difractados. ¿Qué información nos proporciona la difracción de rayos X? a) La geometría de las direcciones de difracción está condicionada únicamente por el tamaño y la forma de la celda unidad del cristal, de modo que conociendo estas direcciones se puede deducir el sistema cristalino y las dimensiones de la celda . b) Las intensidades de los rayos difractados están íntimamente relacionadas con la naturaleza de los átomos y con sus posiciones en la red cristalina, de forma que su medida constituye un procedimiento para obtener información tridimensional acerca de la estructura interna del cristal . La intensidad de los picos de difracción depende de la interferencia de los rayos dispersados por los sitios de la base. Si la interferencia es constructiva entonces tendremos un pico de intensidad máxima, si al contrario es destructiva no observaremos ningún pico (intensidad cero). https://www.youtube.com/watch?v=XvkrgWKD6XI http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/index.html Cristalización
La cristalización es el proceso mediante el cual las moléculas se ordenan de un modo natural formando un retículo repetitivo que denominamos cristal. En este tema sólo mencionaremos brevemente algunas de las técnicas más extendidas que se usan para
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obtener cristales de proteínas. Para encontrar más detalles sobre estas técnicas se puede consultar el siguiente enlace: http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/archivos_07/brochureUNESCO.pdf . El experimento de cristalización comienza con una solución de proteína relativamente concentrada (entre 2 y 50 mg/ml) a la que se añade lentamente algún reactivo (precipitante) capaz de reducir la solubilidad de la proteína y generar una precipitación controlada de la misma. A continuación se fuerza un incremento paulatino de concentración controlando las condiciones, lo que normalmente origina diminutos núcleos cristalinos cuyo tamaño debe ir aumentando hasta obtener cristales de tamaño adecuado para los experimentos de difracción (entre 0.1 y 0.5 mm).
El diagrama de cristalización (sobre estas líneas) muestra genéricamente las diferentes zonas de un sistema proteína-precipitante en función de las concentraciones de ambos componentes. Las zona de color azul claro representa las condiciones en las que la proteína estaría solubilizada. En la zona de color marrón la proteína dejaría de ser soluble y aparecería como un precipitado. Ambas zonas están separadas por otras dos (de colores verde y azul oscuro) en donde existe una ligera sobresaturación, idónea para la nucleación (azul oscuro) y crecimiento cristalino (verde). El método más común para estos experimentos es el basado en la técnica de difusión de vapor, bien por el método de la gota colgante o por el de la de la gota sentada. Se colocan unos pocos microlitros (1- 2 μl) de la solución de proteína en el centro de un cubre-objetos de vidrio (gota colgante) o de un pedestal en el centro de un pocillo (gota sentada) y se le añaden otros tantos microlitros de la solución del precipitante (con pH equilibrado previamente mediante tampón) contenido en el pocillo. En el método de la gota colgante, el cubre-objetos que contiene a la gota de mezcla se invierte y con él se tapa el pocillo mencionado. En el de la gota sentada, simplemente se tapa el pocillo que contiene el precipitante rodeando el pedestal en que se encuentra la muestra. Este sistema cerrado evolucionará por equilibrio de vapor y, como la mezcla de proteína y precipitante en la gota está menos concentrada que la solución de precipitante en el pocillo, el agua de ésta se evaporará, uniéndose a la solución del pocillo. De este modo,
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la concentración de la proteína y del precipitante aumentarán lentamente en la gota (a la misma velocidad). Como resultado, la proteína precipita y, si las condiciones son las adecuadas, se formarán cristales, con lo cual la concentración de proteína irá decreciendo. Es importante tener en cuenta que, durante la fase de nucleación, cuantos menos núcleos se formen, menos cristales crecerán, pero éstos serán más grandes, por lo que interesa encontrar las condiciones experimentales para que se den estas circunstancias. Por ello, para maximizar la posibilidad de éxito de un intento de cristalización es necesario probar diferentes condiciones iniciales (diferentes concentraciones de proteína y precipitante, temperatura, pH, aditivos, etc.).
Existen otras muchas técnicas de cristalización que se usan para las proteínas, como la técnica de Batch, los botones de diálisis, técnicas basadas en la difusión en geles, etc. (http://www.lec.csic.es/). http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_07_1.html El difractómetro de Rayos X
Todo experimento de difracción de Rayos X requiere una fuente de rayos X, un soporte para la muestra y un detector para recoger los rayos X difractados. •
Fuente de radiación . Puede ser un tubo de rayos X si estamos trabajando con un
difractómetro convencional ("in house"), o bien los rayos X pueden generarse en un acelerador de partículas si estamos trabajando en un Sincrotrón. Las ventajas más importantes de la radiación sincrotrón es su amplio rango de longitudes de onda y su elevada intensidad.
Acelerador de partículas: Líneas tangenciales de emisión de radiación electromagnética producida por un anillo central con un haz de electrones.
Esquema de un tubo de rayos X
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Portamuestras. Consiste en un goniómetro rotacional, que es un sistema con una
mecánica muy precisa, que permite mediante giros colocar el cristal en cualquier orientación del espacio. •
Detector. Además de la clásica película fotográfica (en desuso en la actualidad),
existen cuatro tipos de detectores: los contadores proporcionales, los detectores de centelleo, los detectores semiconductores y los detectores PSD. http://www.uky.edu/~tzhai0/index_files/Page1203.htm https://www.youtube.com/watch?v=suVNYD1nCm4&feature=youtu.be http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/pushmovies/XAS.gif Resolución de estructuras
Los cristales pueden describirse mediante unidades que se repiten en las tres direcciones del espacio y dicho espacio, que contiene todos los planos cristalinos, se denomina espacio real o directo. Esas unidades repetitivas, llamadas celdillas elementales (o celdas unidad), sirven como sistema de referencia para describir la posición de los átomos. Debemos recordar que en las celdas unidad operan elementos de simetría que hacen que los átomos y moléculas se repitan en su interior y que esto determina el sistema cristalino al que pertenece un cristal. Este espacio real o directo es el mismo en donde vivimos nosotros y se describe por la función de densidad electrónica, definida en cada punto de coordenadas (xyz) de la celda. Cuando los rayos X interaccionan con los electrones de los átomos que componen los cristales dan lugar a un patrón de difracción denominado espacio recíproco, cuya simetría se relaciona geométricamente con la del espacio directo y en el que también se puede definir una celda de repetición (celda recíproca), en cuyos nudos está almacenada la información sobre la intensidad de la difracción. En resumen, un cristal presenta un espacio directo, con una celda unidad y unos ejes y ángulos directos. Además, presenta un espacio recíproco asociado geométricamente al espacio directo y que se caracteriza por tener su propia celda unidad (la celda recíproca, con sus ejes y ángulos recíprocos). El espacio recíproco, por tanto, está formado por una red de celdas recíprocas y la difracción de rayos X tiene lugar según este patrón reticular. Como consecuencia, el espectro de difracción que obtendremos nos dará una medida directa del espacio recíproco y, por consiguiente, una medida indirecta del espacio real, es decir, de la estructura del cristal. El espacio directo y el espacio recíproco se relacionan mediante la fórmula matemática de la transformada de Fourier, que permite calcular un espacio recíproco conociendo el espacio directo. Sin embargo, en un experimento de difracción de rayos X no podremos calcular directamente la estructura de la red cristalina (es decir, el espacio directo), ya que el experimento no puede proporcionar las fases relativas de los haces de difracción (necesarias para poder resolver la ecuación) y no existen técnicas experimentales para medirlas. Por ello, es necesario encontrar una solución al problema de las fases para poder resolver la estructura de un cristal mediante difracción de rayos X.
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http://www.xtal. iqfr.csic.es/Cristalografia/index.html
El problema de las fases
En difracción de rayos X nos encontramos con un importante problema práctico: la denominada pérdida de la fase. El experimento de difracción no proporciona una de las magnitudes fundamentales, las fases relativas de los haces de difracción, ya que no existen técnicas experimentales para medirlas. Perdemos por tanto la componente necesaria para calcular el mapa de densidad electrónica (mediante la transformada de Fourier) y así poder reconstruir la imagen. Para resolver la estructura cristalográfica de macromoléculas es necesario recuperar la mencionada fase. Para resolver el problema de la fase existen varios métodos: •
Reemplazamiento molecular (MR): se calcula la fase a partir de un modelo que se acepta como una buena aproximación. El modelo se extrae de otra molécula similar de estructura conocida, por ejemplo de una proteína relacionada con la proteína de estructura a resolver, o de la misma proteína en diferente forma cristalina, etc.
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Reemplazamiento isomorfo sencillo (SIR) o múltiple (MIR) (Single/Multiple Isomorphous Replacement): se introduce en la red cristalina algún átomo pesado con muchos más electrones y por ello producen intensidades de radiación dispersa mucho más grandes que los átomos “ligeros”. Para ello, partiendo de un cristal preformado de la macromolécula no modificada, se añaden reactivos capaces de difundir en el cristal y que contienen el átomo pesado. Los metales que se usan con mayor frecuencia son mercurio, uranio, plomo y oro. Es un método muy utilizado, especialmente en la resolución de estructuras de proteínas y ácidos nucleicos de los que no se tiene ninguna información previa.
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Difracción anómala múltiple (MAD) (Multi - wavelength Anomalous Diffraction): se basa en las pequeñas diferencias en la intensidad de la difracción causadas por el fenómeno de la "dispersión anómala". Este fenómeno ocurre cuando la frecuencia de los rayos X es similar a la frecuencia natural de oscilación de los electrones de un determinado átomo. En estas condiciones los electrones entran en resonancia con el campo electromagnético (oscilando en fase con este) y son capaces de absorber la
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energía de los rayos X. La dispersión producida por los electrones en este estado es diferente a la dispersión normal. Para resolver el problema de las fases mediante este método, se realizan dos (o más) experimentos de difracción, empleando rayos X con longitudes de onda diferentes para obtener espectros de difracción con y sin dispersión anómala. Analizando las diferencias entre los datos de difracción obtenidos es posible calcular la distribución de amplitudes y fases que generan los dispersores anómalos. Estas diferencias son normalmente pequeñas en cristales de materiales orgánicos, como las proteínas o ácidos nucleicos. El efecto es mucho más detectable cuando se usan metales u otros átomos pesados como dispersores anómalos. Los átomos pesados pueden estar presentes naturalmente en la molécula orgánica o ser incorporados a la molécula mediante técnicas químicas o biológicas. Estos métodos proporcionan (directa o indirectamente) un conocimiento aproximado de las fases de los haces de difracción. Combinando esta información con los módulos obtenidos a partir de las intensidades recogidas en el experimento de difracción, podemos generar un mapa de densidad electrónica que conducirá a la interpretación del modelo. Este paso de interpretación consiste en completar el mapa de densidad electrónica final (de alta resolución), asignando a la estructura obtenida la secuencia de aminoácidos. Para finalizar el proceso de modelización, es necesario realizar un paso de refinamiento de datos mediante comparación de amplitudes experimentales y teóricas, aplicando de nuevo la transformada de Fourier y repitiendo hasta obtener un mapa fiable.
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El siguiente esquema muestra un resumen del procedimiento para la determinación de la estructura tridimensional de una macromolécula mediante difracción de rayos X.
Para finalizar, hay que remarcar la importancia que esta técnica tiene para la resolución de estructuras de macromoléculas biológicas. De hecho, era el único método disponible hasta el desarrollo de las técnicas modernas de espectroscopía por resonancia magnética nuclear. Quizás el ejemplo más conocido sea la resolución de la estructura del ADN por James Watson y Francis Crick en el año 1953, gracias a los datos de difracción de rayos X obtenidos por Rosalind Franklin. https://www.youtube.com/watch?v=Bjk4MHCNzyM&feature=youtu.be https://www.youtube.com/watch?v=u7RrXAjuNRk&feature=youtu.be
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ANEXO I El fenómeno de la difracción de la luz
El fenómeno de difracción viene determinado por el principio de Huygens. Cuando una luz se hace pasar por una rendija ancha en comparación con la longitud de onda de la radiación, la onda se propaga casi inalterada. Si la rendija es del tamaño de la longitud de onda, se propaga en todas direcciones. La rendija se comporta como una nueva fuente a partir de la cual las ondas se irradian de manera que el frente de ondas se curva al pasar entre los dos bordes de dicha rendija. Si a una cierta distancia se sitúan dos rendijas estrechas, según el principio de Huygens se convierten en dos nuevos focos (fuentes). Las ondas que se generan en ellos producen interferencias que pueden ser constructivas o destructivas. La difracción es, por tanto, una consecuencia de la interferencia. Si se ilumina con radiación monocromática dos rendijas estrechas (B y C) situadas a una cierta distancia y a continuación se coloca una pantalla (figura izquierda), se observan una serie de imágenes oscuras y luminosas perpendiculares en ella. Si se representan las intensidades de las bandas en función de la distancia a lo largo de la pantalla (figura derecha), se observa que disminuyen de forma gradual según aumenta la distancia respecto a la banda central (E). Esta banda central intensa es consecuencia de una interferencia constructiva de los rayos difractados por las dos rendijas.
Cuando las ondas salen de las rendijas, se transmiten perpendicularmente y forman un ángulo θ con la normal, lo que origina un desfase entre ellas. Cuando dos ondas interfieren diferenciándose entre ellas un número entero de λ se produce el reforzamiento (zonas iluminadas), pero si difieren un número impar de λ entonces se produce disminución o anulación (zonas oscuras). Si están defasadas una λ completa, se aparece la zona iluminada que corresponde a las bandas de 1 er orden (D), menos intensas que la central (E). La siguiente zona iluminada, correspondiente a las bandas de 2º orden, que aparecen a dos λ completas (y así sucesivamente). Si la radiación que incide es policromática, aparece la banda central igual que en caso anterior. También aparecen la imagen de 1 er orden, pero como cada longitud de onda de la radiación policromática tiene un ángulo λ diferente, aparece un espectro en lugar de una banda. En las imágenes de órdenes superiores ocurre lo mismo.
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