2.1 Pengertian Biakan Murni Dalam Pertumbuhan dan perkembangan mikroba, diperlukan substrat yang disebut media. Sebelum dipergunakan media harus dalam keadaan steril. Susunan bahan, baik berbentuk bahan alami (seperti toge, kentang, daging, telur, wortel dan sebagainya) ataupun bahan buatan (berbentuk senyawa kimia baik organik ataupun ataupun anorganik) dipergunakan dipergunakan untuk untuk pertumbuhan dan dan perkembangan perkembangan mikroba, mikroba, dinamakan media (Monroetiboti, 2010). Medium adalah bahan yang biasa digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di atas atau di dalamnya. Langkah awal yang dilakukan sebelum menumbuhkan mikroorganisme adalah dengan memahami kebutuhan dasar lalu mencoba memformulasikan satu media yang memberikan hasil terbaik. Persyaratan nutrient mikroorganisme-mikroorganism mikroorganisme-mikroorganismee sangat beragam, namun sebagai makhluk hidup mempunyai kebutuhan dasar yang sama, yaitu meliputi air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuhan ( Hadioetomo, 1993). Dalam pemurnian mikroba dikenal dikenal istilah yaitu isolasi mikroba dan kultur murni. Isolasi mikroba adalah memindahkan mikroba dengan lingkungannya dengan mengisolasi mikroba bakteri yang diperlukan atau dengan kata lain mikroba yang tidak kita butuhkan segera di singkirkan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni (Trianda, 2011). Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal, artinya mikroba ditumbuhkembangkan ditumbuhkembangkan dari bakteri yang dihomogenkan dengan kata lain bakteri di isolasikan agar didapatkan bakteri murni yang dibutuhkan nantinya dalam kegiatan praktikum. Objek yang harus diperhatikan adalah bakteri (Surbakti, 2010). Di dalam mengisolasi mikroorganisme digunakan berbagai cara, antara lain dengan cara goresan (streak plate), cara taburan/tuang (pour plate) cara sebar (spread plate), cara pengenceran (dilution method), serta micromanipulator (teh micromanipulator method). Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian sedemikian rupa sehinga individu spesies individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya (Hadioetomo, 1993). Beberapa factor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba yaitu sebagai berikut : 1. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi. 2. Tempat hidup atau asal mikroba tersebut. 3. Medium untuk pertumbuhan yang sesuai. 4. Cara menginokulasi menginokulasi mikroba. 5. Cara inkubasi mikroba. 6. Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa kultur murni dan sesuai dengan yang dimaksud. 7. Cara memelihara memelihara agar mikroba yang telah diisolasi tetap merupakan kultur murni (Dwidjoseputro, (Dwidjoseputro, 1994).
Usaha mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan dan untuk menanam suatu spesies terdapat beberapa cara yaitu : 1. Penanaman dengan penggoresan : cara ini untuk mengasingkan kuman agar didapatkan biakan murni. 2. Biakan agar tabung : biasanya diperhunakan untuk menunjukkan adanya pertumbuhan murni mikro untuk aglutinasi gelas alas. 3. Biakan tusukan : biasanya diperhunakan untuk menunjukkan adanya pencairan gelatin dan mempertahankan biakan baru. 4. Biakan agar tuang : menunjukkan jumlah koloni mikroba hidup yang terdapat pada suspensi. 5. Biakan cairan : kegunaannya untuk menunjukkan biakan yang banyak dan cepat. Kerugiannya adalah tidak dapat membuat biakan murni dari bahan yang mengandung berbagai mikroorganisme (Dwidjoseputro, 1994).
Di alam bebas tidak ada mikroba yang hidup t ersendiri terlepas dari spesies yang lain seringkali mikroba patogen kedapatan secara bersama-sama dengan mikroba saprobe (saprobakteri). Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencernaan dari luar. Medium untuk membiakan mikroba haruslah steril sebelum digunakan pencermaran (kontaminasi) dari luar terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Teknik biakan murni untuk spesies dikenal dengan beberapa cara yaitu : A. Cara pengenceran Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Lister berhasil menerima murni Streptococcus lactis yang diisolasi dari susu yang sudah masam. Caranya adalah dengan mengencerkan suatu suspensi kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari pengenceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi, kalau perlu dari enceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. B. Cara penuangan Isolasi dengan menggunakan medium cair dengan cara pengenceran, seperti dijelaskan diatas prinsip melakukan pengeceran adalah menurunkan jumlah mikroorganisme sehingga suatu saat hanya ditemukan suatu sel dalam satu tabung. Demikian juga dengan cara penuangan. metode ini pertama kali dilakukan oelh Robert Koch (1843-1905). Caranya adalah dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel itu kemudian disebarkan dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. C. Cara penggoresan Cara ini lebih menggunakan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu tetapi memerlukan keterampilan yang diperoleh dari latihan penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Tetapi kelemahan cara ini adalah bakteri-bakteri anaerob tidak dapat tumbuh.
Ada beberapa teknik penggoresan, yakni : a. Goresan T 1. Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan petri. 2. Inokulasikan daerah 1 sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung. 3. Panaskan ose dan biarkan dingin kembali. 4. Gores ulang daerah 1 sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan didaerah 2 5. Pijarkan kembali ose dan biarkan dingin kembali. 6. Prosedur diatas diulangi untuk daerah 2. b. Goresan kuadran, teknik ini sama dengan goresan T hanya lempengan agar dibagi menjadi 4. c. Goresan radian. 1. Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan. 2. Pijarkan ose dan dinginkan kembali. 3. Putar lempengan agar 90°C dan buat goresan terputus diatas goresan sebelumnya. 4. Pijarkan ose. d. Cara sinambung. 1. Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar. 2. Jangan pijarkan ose, putar lempengan 180°C gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar. D. Cara penyebaran. Pengenceran sampel sama seperti pada cara-cara penuangan, dengan memipet sebanyak 0,1 ml cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir keatas permukaan agar. E. Cara pengucilan 1 sel. Cara ini dengan menggunakan suatu alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak bakteri, dengan tanpa ikutnya bakteri yang lain.alat semacam ini tidak mudah untuk menggunakannya. Alat itu berupa mikropipet yang ditempatkan pada suatu micromanipulator. F. Cara inokulasi pada hewan Metode ini didasarkan pada kenyataan bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh didalam tubuh seekor hewan. Misalnya, kita ambil bahan pemeriksaan berupa dahak (sputum) dari seseorang yang disangka memderita TBC, bila dahak disuntikkan kedalam tubuh tikus putih, maka sproba akan ikut serta, tetapi tidak dapat bertahan hidup. Sehingga kemudian hanya kita dapatkan kuman TBC saja. Biakan murni Pneumococcus dapat diperoleh dengan cara demikian juga (Schlegel, 1994).
Dua masalah akan dibicarakan pemilihan medium yang sesuai dan isolasi organism bakteri secara murni. Teknik yang digunakan dan tipe medium yang dipilih tergantung pada sifat penelitian. Pada umumnya tiga situasi dapat ditemukan. a) Menumbuhkan sel spesies tertentu, mikroorganisme yang teramati secara mikroskopik dan yang
tumbuh dalam lingkungan alami dapat terbentuk sangat sukar untuk t umbuh secara murni pada medium buatan, contohnya, bentuk parasit terbentuk tidak pernah dapat dibiakkan diluar inangnya. b) Pemeriksaan mikrobiologi bahan-bahan alami : bahan alami tertentu mengandung berbagai lingkungan mikro yang berbeda, masing-masing menyediakan tempat untuk spesies yang berbeda. Penanaman sebuah contoh bahan kelompok terseleksi memproduksi koloni-koloni tetapi menyebabkan banyak tipe lainnya terlupakan c) Isolasi tipe tertentu mikroorganisme. Sedikit contoh tanah, jika ditanam dengan tepat, akan menghasilkan tipe organism yang berbeda untuk tiap lingkungan mikro yang ada.
Medium cair digunakan untuk membiarkan adanya persaingan dan seleksi optimal meskipun ti pe yang diinginkan hanya beberapa sel saja diantara populasi yang jutaan. Keuntungan dapat diperoleh dari encrichment alami. Sebagai contoh pada pencarian kerosene oxiditers, tanah berminyak dipilih, karena sudah menjadi lingkungan enrichment untuk bentuk demikian. Isolasi mikroorganisme secara biakan murni. Untuk mempelajari sifat-sifat suatu organisme adalah penting untuk mempelajarinya dari biakan murni yang bebas dari semua tipe organisme lain. Untuk melakukan ini, sel tunggal harus diisolasi dari seluruh sel l ainnya dengan cara sedemikian rupa sehingga progeny yang terkumpul juga masih terpisah. Beberapa metode yang ada adalah : a) Penanaman pada agar (platting) : tidak seperti sel-sel dalam medium cair sel-sel dalam atau pada medium sel dibuat menetap oleh karenanya, jika cukup sedikit sel diletakkan dalam atau pada medium sel tiap sel akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah. Bahan gas ideal untuk kebanyakkan media mikrobiologi adalah agar, polisakarida asam yang diekstrak dari alga merah tertentu. b) Pengenceran : metode yang sedikit dapat dipercaya adalah pengenceran suspensi diencerkan seri dan contoh masing-masing pengenceran ditanam pada agar. Jika hanya sedikit contoh dari pengenceran tertentu menunjukkan pertumbuhan, diperkirakan bahwa beberapa biakan tadi dimulai dari sel tunggan.
Pada umumnya bakteri hanya mengenai satu macam pembiakan saja, yaitu pembiakan secara aseksual atau vegetatif. Pembiakan ini berlangsung cepat. Jika faktor-faktor luar menguntungkan. Pelaksanaan diri atau division. Pembelahan diri dapat dibagi atas 3 fase yaitu : a. Fase pertama, diantara sitoplasma terbelah oleh sekat yang tumbuh tegak lurus pada arah memanjang. b. Sekat tersebut diikuti oleh suatu dinding melintang ini tidak selalu merupakan penyekat yang sempurna, ditengah-tengah sering ketinggalan suatu lubang kecil, dimana protoplasma kedua sel baru masih tetap berhubung. Hubungan-hubungan protoplasma itu disebut plasmadesmida. c. Fase terakhir ialah berpisah, yaitu yang satu terlepas sama sekali daripada yang lain. Setelah dinding melintang menyekat secara sempurna. Bakteri yang semacam ini merupakan koloni yang merata, jika dipiara pada medium padat. Sebaliknya, bakteri-bakteri yang dindingnya l ebih kokoh itu
tetap bergandeng-gandengan setelah pembelahan bakteri macam ini merupakan koloni yang kasar permukaannya.
Isolasi bakteri merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Persyaratan utama bagi isolasi dan pembuatan biakan murni adalah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteri yang paling baik dan paling utama adalah dari inang. Sebagai contoh bakteri E. Coli yang dijumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi bahan sumbernya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya.
Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada medium yang terdiri dari bahan nutrien. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bergantung kepada banyak faktor seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung semua zat makanan yang diperlukan oleh organisme tersebut. Faktor lain seperti pH, suhu, dan pendinginan harus dikendalikan dengan baik. Selain untuk tujuan diatas medium juga memiliki fungsi lain, seperti tempat untuk mengisolasi, seleksi, evaluasi dan diferensiasi biakan yang didapatkan. Agar tiap-tiap medium memilki karakteristik yang sesuai dengan t ujuan sehingga seringkali digunakan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembang biakan mikroba.
Isolasi adalah cara untuk mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba l ain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkan dalam media padat, karena dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Waluyo, 2013).
Jika sel-sel tersebut tertangkap oleh media padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka setiap sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah, sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya. Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu karena terlalu kecil dan tidak tinggal tetap di tempatnya. Akan tetapi bila sel-sel tersebut dipisahkan dengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan dalam media padat dan dibiarkan membentuk koloni, maka sel-sel tersebut selanjutnya akan diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan petri yang terpisah.
Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu: 1. Isolasi pada agar cawan Prinsip pada metode isolasi pada agar cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan, yaitu: metode gores kuadran, dan metode agar cawan tuang. Pada metode gores kuadran, metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari satu sel. Metode agar tuang. Berbeda dengan metode gores kuadran, cawan tuang menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan (50°C), yang kemudian dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan/di dalam cawan. 2. Isolasi pada medium cair Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini j uga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar. 3. Isolasi sel tunggal Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan/medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali. Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis (Hasdianah, 2012).
Pembiakan murni
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat 1. Tabung reaksi 2. Lampu Bunsen 3. Cawan petri 4. Kawat ose 5. Incubator 6. Alat tulis 7. Medical sterilizer 8. Sprayer 9. Alat tulis 10. Korek api 11. Kamera hp
3.2.2 Bahan 1. Alkohol 2. tisu 3. Aquadest 4. Aluminium foil 5. Bakteri 6. Kertas label 7. Plate Count Agar (PCA) 3.3 Cara Kerja
3.3.1 Metode cawan gores pada cawan petri 1. Dicuci bersih tangan praktikan menggunakan sabun dan dibersihkan hingga kering. 2. Dibakar kawat ose dengan bunsen hingga pijar, lalu di angin-anginkan hingga cukup dingin. 3. Disterilkan dengan dipanaskan pada bunsen cawan petri yang berisi bakteri dibagian pinggirnya dengan diputar-putar. 4. Diambil sampel bakteri dengan menggunakan ujung kawat ose tadi. 5. Disterilksan dengan dipanaskan pada bunsen bunsen cawan petri yang berisi media PCA dibagian pinggirnya dengan diputar-putar. 6. Digoreskan kawat ose yang berisi bakteri pada cawan petri yang berisi media PCA secara perlahan sesuai dengan urutan penggoresan.
7. Digoreskan kawat ose yang berisi bakteri secara rapat pada goresan pertama (first streak) pada cawan petri yang berisi media PCA. 8. Digoreskan kawat ose yang berisi bakteri secara agak jarang pada goresan kedua (second streak) pada cawan petri yang berisi media PCA dan digoreskan menyambung dengan goresan pertama (first streak). 9. Digoreskan kawat ose yang berisi bakteri secara jarang pada goresan ketiga (third streak) pada cawan petri yang berisi media PCA dan digoreskan menyambung dengan goresan kedua (second streak). 10. Diinkubasi didalam inkubator selama 24 jam. 11. Diamati hasilnya.
3.3.2 Metode cawan gores pada tabung reaksi (Media PCA miring) 1. Dicuci bersih tangan praktikan menggunakan sabun dan dibersihkan hingga kering. 2. Dibakar kawat ose dengan bunsen hingga pijar, lalu di angin-anginkan hingga cukup dingin. 3. Disterilkan dengan dipanaskan pada bunsen cawan petri yang berisi bakteri dibagian pinggirnya dengan diputar-putar. 4. Diambil sampel bakteri dengan menggunakan ujung kawat ose tadi. 5. Dibuka penutup tabung reaksi lalu, dipaNAskan mulut tabung reaksi yang berisi media PCA dengan bunsen. 6. Digoreskan kawat ose yang berisi bakteri secara zig-zag pada media PCA yang ada dalam tabung reaksi. 7. Disterilkan dengan dipanaskan pada bunsen mulut tabung reaksi tadi, lalu ditutup dengan aluminium foil. 8. Diinkubasi didalam inkubator selama 24 jam. 9. Diamati hasilnya.
