LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI
Acara II (Teknik (Teknik Aseptik)
Oleh Winda !i Ast"ti NIM# $$%&$%$'%$' Pr*ra+ ,t"di Pendidikan Bil*i
LABORATORIUM LABORATORIUM KULT KU LTUR UR -ARINGAN -ARI NGAN TUMBU.AN TUMBU.A N -URU,AN BUIA/A PERTANIAN 0AKULTA, PERTANIAN UNI1ER,ITA, -EMBER &%$2
BAB $# PENA.ULUAN $#$ Latar Belakan* Belakan* Pada ada dasar asarny nyaa
bahwa ahwa bany banyak ak kita kita keta ketahu huii bahw bahwaa dala dalam m seti setiap ap
labo labora rato tori rium um terd terdap apat at bany banyak ak seka sekali li kont kontam amin inas asii yang ang terj terjad adi. i.
Hal Hal ini ini
dika dikare rena naka kan n mikr mikroo oorg rgan anism ismee ada ada dima dimanana-ma mana na.. Namu Namun n kita kita tida tidak k pern pernah ah menyadari keberadaannya. Bakteri dapat ditemukan pada tangan kita yang tidak tampak jika dilihat dengan mata telanjang. Jamur yang berasal dari saluran udara AC dengan pintu yang terbuka. Ineksi dari kedua nya dapat menyerang media atau atau serum serum yang yang steril. steril. !arena !arena itu labora laborator torium ium yang yang sangat sangat sering sering diguna digunakan kan untuk untuk berbag berbagai ai peneli penelitian tian dan prakti praktikum kum yang yang dianta diantaran ranya ya prakti praktikum kum kultur kultur jaringan perlu adanya upaya untuk men"apai men"apai keberhasilan. #alam keberhasilan praktikum kultur in $itro membutuhkan membutuhkan tidak adanya kontaminasi mikroba yang terjadi dengan adanya upaya untuk selalu steril selama pelaksanaanya. %paya untuk steril tidak hanya diperuntukkan hanya mediumnya yang ang ster steril il namu namun n juga juga ruan ruang g kerj kerja& a& eksp ekspla lan n yang ang digu diguna naka kan n dan dan juga juga praktikan. 'leh karena itu& untuk menjamin semuanya steril sebelum memulai suat suatu u prak prakti tiku kum m maka maka dilak dilakuk ukan an suat suatu u tekn teknik ik asept aseptik ik.. Pros Prosed edur ur kont kontro roll pada teknik ini adalah kualitas yang akan memastikan bahwa dalam praktikum tersebut tersebut memang memang dilakukan dilakukan dengan dengan aseptik& aseptik& teknik teknik yang mengutamak mengutamakan an tidak adanya kontaminasi. (ehing (ehingga ga sebagia sebagian n besar besar prakti praktikum kum kultur kultur jaringa jaringan n selalu selalu dilaku dilakukan kan deng dengan an
meng menggu guna naka kan n
alat alat
steri sterili lisas sasii
deng dengan an
bant bantua uan n
Auto" uto"la la$e $e
untu untuk k
mensterilkan mensterilkan alat dan bahan serta medium yang telah dibuat dibuat beserta )aminar )aminar Air *low +)A*, yang selalu digunakan untuk menjaga kesterilan ruang kerja dalam proses menanam. Praktikum kultur jaringan yang bera"arakan teknik asepti" ini dilaksanakan yang salah satunya guna mengetahui beberapa proses sterilisasi yaitu sterilisasi ruang kerja dengan prinsip kerja )aminar Air *low +)A*,& sterilisasi alat dan media dengan prinsip kerja Auto"la$e yang sering dipergunakan dalam setiap praktikum dan sterilisasi bahan tanam yang akan digunakan sebagai eksplan sebelum ditanam pada medium. 'leh karena itu dilakukan pengamatan dengan
parameter berapa jumlah kontaminan yang terjadi dan jenis kontaminan yang disebabkan kemungkinan oleh bakteri ataupun jamur. $#& T"3"an . empelajari "ara melakukan teknik aseptik yang baik dan benar /. engetahui alat yang digunakan dalam teknik aseptik pada !ultur jaringan& misalnya )aminar Air *low +)A*, dan Auto"la$e 0. engetahui jenis dan penyebab terjadinya kontaminasi pada media kultur
BAB &# TIN-AUAN PU,TAKA
(eiring
perkembangan
teknologi
yang
disertai
dengan
semakin
berkembangnya usaha di bidang pertanian maka kebutuhan akan bibit semakin meningkat. Hal ini dapat dilakukan dengan perbanyakan kon$ensional yang sangat sulit untuk memenuhi kebutuhan bibit yang sangat banyak dengan waktu yang dibutuhkan relati$e lebih sedikit atau "epat. 'leh karena itu& teknologi kultur jaringan yang telah marak untuk saat ini dapat digunakan sebagai teknologi pilhan
yang sangat menjanjikan untuk pemenuhan kebutuhan bibit tanaman yang akan dieksploitasi se"ara besar-besaran +ariska& /112,. Namun ada beberapa aktor tertentu yang harus diperhatikan& yaitu penyimpangan geneti" yang dapat terjadi karena metode in$itro yang salah satunya sangat berpengaruh pada lingkungannya. 'leh karena itu teknik asepti" sangat diperlukan dalam hal menentukan keberhasilannya +ariska& /112,. 3eknik perbanyakan mikro yang menjadi salah satu bentuk aplikasi dari teknik kultur jaringan bertujuan untuk memperbanyak tanaman yang telah dibuktikan berhasil untuk dilakukan perbanyakan. %ntuk memanaatkan se"ara optimal teknik ini yaitu diperlukan adanya penguasaan kondisi yang tepat untuk pertumbuhan dan perkembangan se"ara in vitro. (angat diperlukan proses sterilisasi yang tepat untuk mematikan mikroorganisme yang terdapat pada eksplan sehingga tidak mengganggu pertumbuhan tanaman. !eberhasilan sterilisasi dipengaruhi oleh bahan tanam +eksplan,& seperti tanaman herbal atau berkayu& dan kondisi lingkungan +)ili& /10,. Penggunaan media kultur dengan komponen-komponen yang tepat dapat merangsang usaha untuk perbanyakan dan juga tumbuhnya tunas. edia menjadi aktor yang paling utama dalam perbanyakan dengan teknik kultur jaringan. !eberhasilan dari teknik ini sangat bergantung dengan jenis media yang digunakan. Hal ini dikarenakan pengaruh media tumbuh pada kultur sangat besar adanya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkan +3uhuteru& /1/,. Beberapa kelebihan yang diberikan dalam teknik kultur jaringan dibandingkan dengan "ara kon$ensional yaitu diperoleh perbanyakan tanaman yang tidak tergantung pada musim karena lingkungan tumbuh in vitro terkendali. Bahan tanaman yang digunakan juga sangat sedikit sehingga tidak merusak pohon induk. 3anaman yang dihasilkan bebas dari penyakit meskipun dari induk yang mengandung pathogen internal. (elain itu dalam teknik ini tidak membutuhkan tempat yang sangat luas untuk menghasilkan tanaman dalam jumlah yang banyak. Hasil yang berupa eksplan +bahan tanaman yang ditanam se"ara kultur jaringan, sudah berhasil dibiakkan dalam botol maka untuk selanjutnya bibit dapat diproduksi se"ara besar-besaran +#eden& /110,.
Namun biasanya masalah lain atau kendala teknis yang sering mun"ul adalah tanaman hasil kultur jaringan sering berbeda dengan tanaman induknya atau mengalami mutasi. utasi dapat disebabkan metode perbanyakan& jenis dan konsentrasi 4at pengatur tumbuh yang digunakan& penggunaan kumpulan sel somatik yang memang berbeda se"ara genetis pada tanaman induknya& rekuensi pemindahan biakan pada media baru& dan tipe jaringan yang digunakan +ayta& /112,. Hal ini dapat terjadi karena penggunaan metode perbanyakan yang sering tidak sesuai& seperti rekuensi subkultur yang terlalu tinggi& perbanyakan melalui organogenesis yang tidak langsung +melalui ase kalus, atau konsentrasi 4at pengatur tumbuh yang digunakan terlalu tinggi. (elain itu aklimatisasi yang berupa adaptasi tanaman hasil kultur jaringan pada lingkungan yang baru diluar botol se"ara in vivo sering mengalami kegagalan. (terilisasi bahan tanam yang digunakan dan kontaminasi yang terjadi pada biakan karena lingkungan yang kurang memadai +ariska et al.& 22/ dalam buku yang dikarang oleh #eden& /110,. !arena se"ara umum& produksi bibit melalui metode kultur jaringan memerlukan beberapa tahap& yaitu penyediaan bahan tanaman +eksplan, dari induk terpilih& proses sterilisasi eksplan yang akan ditanam pada media yang akan d inisiasi& penanaman pada media untuk penggandaan atau multiplikasi tunas& penanaman pada media untuk perakaran atau pembentukan planlet& dan aklimatisasi +urashige& 2567 8eorge dan (herrington& 296 dalam :a4id& /11,. Pada salah satu metode perbanyakan tanaman yang umumnya tidak dilakukan tahap multiplikasi tunas dan perakaran tetapi diganti menjadi tahap induksi tunas dan elongasi& sedangkan tahap perakaran dilakukan pada saat aklimatisasi. etode ini "ukup sederhana dan mirip dengan "ara perbanyakan dengan stek se"ara kon$ensional. 'leh karena itu& metode perbanyakan ini sering disebut se"ara stek mikro. !euntungan penggunaan metode ini adalah tanaman yang dihasilkan stabil se"ara geneti" +Nur Ajijah& /11,. Persiapan Bahan 3anaman menjadi salah satu kun"i keberhasilan untuk mendapatkan bahan tanaman yang responsi dan dapat diperbanyak se"ara kultur in vitro adalah bahan tanaman yang masih muda. %ntuk tanaman kehutanan atau tanaman tahunan lainnya daya tumbuh bahan yang akan ditanam sangat
diperhatikan +ariska dan Purnamaningsih& /11 dalam #eden& /110,. #aya tumbuh tunas muda akan hilang se"ara isik apabila jarak antara ujung tunas dan akar semakin jauh karena pertumbuhan +8eorge dan (herrington& 296 dalam Nugraha& /10,. Pada tanaman tahunan dewasa& tunas muda yang memiliki daya tumbuh tinggi +ju$enil, sering mun"ul pada bagian tanaman yang dekat dengan tanah atau sering disebut tunas air. 3unas ju$enil dari tanaman berkayu tahunan dewasa yang akan digunakan sebagai bahan tanaman untuk kultur jaringan& juga dapat diperoleh dengan "ara melakukan pemangkasan berat. 3unas yang mun"ul setelah pemangkasan dapat digunakan sebagai bahan tanaman. (elain itu& ase ju$enil kadang-kadang dapat juga diinduksi dengan "ara melakukan penyemprotan tanaman dewasa dengan 8A0 atau "ampuran antara auksin dan 8A0 +8eorge dan (herrington& 296 dalam #eden& /110,. %ntuk memudahkan proses sterilisasi bahan tanaman& sangat dianjurkan bahwa tanaman induk berada atau ditanam di kamar ka"a. !eberadaan tanaman induk di kamar ka"a memudahkan perlakuan penyemprotan dengan ungisida dan bakterisida se"ara periodik sehingga dapat mengurangi tingkat kontaminasi bahan tanaman yang akan disterilisasi. (terilisasi bahan tanaman dan inisiasi kultur dilakukan se"ara aseptik. (terilisasi bahan tanaman +eksplan, merupakan langkah awal yang "ukup penting dan dapat menentukan keberhasilan penanaman se"ara in vitro. ;ksplan yang akan ditanam pada media tumbuh harus bebas dari mikroorganisme kontaminan. 3ahap sterilisasi sering menjadi kendala utama keberhasilan perbanyakan tanaman se"ara in vitro. 3erlebih iklim tropis seperti Indonesia yang memungkinkan kontaminan seperti "endawan dan bakteri terus tumbuh sepanjang tahun. %ntuk tanaman tertentu& sterilisasi sulit dilakukan karena kontaminan berada pada bagian internal dari jaringan tanaman +Patoni& /1/,. (terilisasi eksplan biasanya dilakukan dengan merendam bahan tanaman dalam larutan kimia sistemik pada konsentrasi dan waktu perendaman tertentu& baik dengan menggunakan satu ma"am maupun dengan ma"am-ma"am sterilan. Bahan-bahan yang biasanya digunakan untuk sterilisasi antara lain alkohol& natrium hipoklorit +Na'Cl,& kalsium hipoklorit atau kaporit +Ca'Cl,& sublimat
+HgCl/,& dan hidrogen peroksida +H/'/, +ariska& /110,. Jenis bahan& konsentrasi& dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi bahan tanaman yang disajikan pada tabel .
+(umber< ariska& /110, Cara lain yang digunakan dalam sterilisasi eksplan atau bahan tanam yang pertama eksplan di"u"i dengan deterjen atau bahan pen"u"i lain& selanjutnya direndam dalam bahan-bahan sterilan baik yang bersiat sistemik atau desinektan. Bahan-bahan yang biasa digunakan untuk sterilisasi antara lain "loro=& kaporit atau sublimat. 3unas yang akan digunakan sebagai eksplan di"u"i dengan deterjen sampai benar-benar bersih. (etelah itu& tunas diambil dari rimpang dan direndam berturut-turut dalam benlate +1&>?, selama > menit& alkohol +51?, selama > menit& "loro= +/1?, selama /1 menit& dan HgCl/ +1&/?, selama > menit. Akhirnya eksplan dibilas dengan a@uades steril +0-> kali, sampai larutan bahan kimia hilang. #engan perlakuan tersebut& 91-21? eksplan yang disterilkan tidak terkontaminasi setelah dikulturkan +ariska& /110,. Apabila kontaminan tetap ada maka konsentrasi dan lamanya perendaman sterilan dapat ditingkatkan. Bahan yang digunakan serta metode sterilisasi biasanya berbeda untuk setiap bahan tanaman& sehingga bahan dan "ara tersebut belum tentu berhasil apabila diaplikasikan pada bahan yang berbeda serta waktu yang berlainan. (ehingga bahan tanam tertentu memiliki "ara yang berbeda antara satu sama lain +ayta& /112,. 'leh karena itu baik media maupun eksplan yang akan digunakan harus selalu dalam keadaan steril. (ehingga pada tahap persiapan& sebelum digunakan semua peralatan yang akan digunakan di"u"i dengan menggunakan deterjen dan larutan pemutih atau Bay"lin& membilasnya sampai bersih dan kemudian
disterilisasi menggunakan o$en atau auto"la$e. Bahan atau alat yang lain adalah tutup botol plastik& peralatan gelas& peralatan diseksi& pipet& air murni& dan media kultur untuk mendapatkan perlakuan sesuai dengan jenis alatnya. (emua peralatan diseksi dibungkus dengan menggunakan kertas "oklat atau kertas merang dan juga !oran sebelum diautokla$. Aluminium oil tidak direkomendasikan untuk membungkusnya
dikarena
uapnya
tidak
dapat
menembus
pembungkus.
(ebelumnya kondisi autokla$ diatur pada temperatur yang digunakan untuk sterilisasi dengan autokla dengan suhu / oC serta tekanan >-5&> psi selama >/1 menit. Peralatan yang terbuat dari logam& wadah-wadah gelas& dan lainlain& disterilsasi dengan pemanasan dalam o$en pada suhu 0151 oC selama /6 jam +3uhuteru& /1/,. (etelah dio$en& alat-alat ini bisa langsung digunakan atau disimpan dalam lemari. )aminar Air *low adalah alat yang ditemukan pada tahun 2>1 yang dikolaborasikan struktur yang dilengkapi dengan ruangan udara dengan udara yang steril. Ada dua ma"am dari jenis ini yaitu hori4ontal dan $erti"al )aminar Air *low steril system yang terkadang membutuhkan biaya yang sangat mahal dalam proses perawatannya. Pengembangan alat ini diharapkan memanipulasi dan mempertahankan suatu ruangan dalam keadaan yang selalu steril. Alat ini telah disempurnakan dengan adanya aliran udara steril melalui sebuah prefilter dan alat yang dialirkan melalui sebuah ilter H;PA + High Efficiency Particulate Air , untuk menggerakkan aliran udara yang steril di dalam ruang kerja di laboratorium. )aminar dilengkapi dengan adanya lampu % +Ultra Violet , yang digunakan untuk memastikan bahwa tidak adanya kontaminan di setiap sisi ruangan +(tignor& /112,. Hal ini sangat diperuntukan untuk kegiatan praktikum dan pembuatan stok biologi yang harus dalam kondisi yang steril. Cara kerja laminar air low sebagai HACD + Heating, Ventilation, Air-Conditioning, and Refrigeration, sebelum digunakan terlebih dahulu disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 51 ? pada dinding dan alasnya serta meratakannya menggunakan tissue atau kertas yang steril. !emudian mendiamkannya selama kurang lebih 01 menit. )ampu ultra$iolet yang berada di dalam laminar air low dinyalakan selama 1&>- jam untuk membunuh kontaminan yang berada di dalamnya +(tignor& /112,.
*aktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet mati. !ontaminasi yang terjadi disebabkan oleh "endawan atau ungi +jamur, dan bakteri. #ari kedua aktor penyebab kontaminasi& jamur atau "endawan yang menjadi penyebab paling dominan karena media yang telah terkontaminasi "endawan sangat sulit untuk dibersihkan atau disterilkan kembali. !ontaminasi pada media perlakuan sebelum proses penanaman tidak dapat digunakan untuk menanam. (ehingga sebelumnya harus diganti dengan pembuatan media yang baru untuk selanjutnya dapat dilakukan proses penanaman +3uhuteru& /1/,. edia tanam dapat digunakan setelah diinkubasi selama 6-5 hari dan memastikan bahwa media yang digunakan terbebas dari kontaminasi& namun kontaminasi pada planlet mulai terlihat pada umur satu (P dengan rekuensi E -> botol planlet. !ontaminasi yang disebabkan se"ara langsung oleh "endawan dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi media yang berkontak langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan maka "endawan tersebut akan menutupi seluruh permukaan media. Hal ini berbeda dengan kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri yang terjadi langsung pada eksplan yang ditandai dengan mun"ulnya lendir berwarna putih keruh disekeliling planlet. Hal ini dapat disebabkan dari kurang bersihnya botol& peralatan pada saat pembuatan media& suhu ruang kultur yang sering berganti atau tidak tetap pada saat botol disimpan di rak kultur dan adanya bakteri yang terbawa dari sumber tanam atau bahan tanam +3uhuteru& /1/,. 'leh karena itu hal yang perlu mendapatkan diperhatian dalam teknik asepti" se"ara in $itro yaitu dalam beberapa tahapan antara lain pemilihan eksplan& proses sterilisasi bahan tanam atau eksplan yang telah dipilih& keadaan selama proses kultur yang terdiri dari suhu atau temperatur& kelembaban relati$e serta waktu yang diperlukan untuk proses pertumbuhan dan perkembangannya selama proses kultur in $itro.
!ondisi pertama yang membawa keberhasilan
dalam proses kultur adalah aseptik. 3eknik untuk mempertahankan asepti" disebut teknik asepti" yang berarti bebas dari semua jenis mikroorganisme atau kondisi yang steril dan layak untuk melakukan proses kultur in $itro. %ntuk menjaga lingkungan yang aseptik maka harus semua komponen kultur baik alat dan bahan
serta media dan juga eksplan yang akan digunakan harus dalam keadaan yang steril sehingga harus dilakukan proses sterilisasi untuk semua komponen dalam kultur jaringan. Hal penting yang lain yaitu menjaga udara& permukaan lantai bebas dan bersih dari debu. (ehingga semua pengerjaan dari praktikum kultur harus dilakukan dalam )aminar Air *low Cabinet yang steril +Chawla dalam Anoop& /112,. %ntuk itu pada dasarnya teknik aseptik yang dilakukan dalam kultur jaringan sangat perlu digunakan untuk dapat mendukung kondisi yang dibutukan eksplan yang ditanam dalam media mengalami proses pertumbuhan dan perkembangan. 3eknik asepti" dapat terlaksana dengan baik apabila juga disertai dilakukannya proses sterilisasi terutama pada eksplan yang harus bebas dari kontaminan sebelum dilakukan proses penkulturan. Berbagai proses sterilisasi yang disertai dengan agen sterilisasi digunakan untuk men"egah adanya kontaminasi pada jaringan dalam eksplan. Agen sterilisasi "ontohnya yaitu Cloro= atau bay"lin ditujukan karena bay"lin memiliki kandungan yang dapat membersihkan eksplan dari berbagai ma"am kontaminan baik berupa jamur& $irus& bakteri& maupun kontaminan yang lain +Hariyadi& /11,. Hal ini dikarenakan kedua bahan tersebut merupakan ra"un untuk tanaman oleh karena itu dalam penggunaanya diperlukan dosis atau ukuran yang sesuai agar tidak melukai ataupun mematikan jaringan dalam eksplan.
BAB # METOE PRAKTIKUM
#$ Wakt" dan Te+pat Praktikum !ultur Jaringan 3umbuhan dengan a"ara 3eknik Aseptik dilaksanakan pada hari inggu& ei /16 pukul /.11 sFd selesai bertempat di )aboratorium !ultur Jaringan 3umbuhan Jurusan Budidaya Pertanian& *akultas Pertanian& %ni$ersitas Jember. #& Alat dan Bahan 0./. Alat . /. 0. 6. >. G. 5. 9. 2.
)aminar Air *low +)A*, Botol semprot Pinset Pisau (eal +segel, !ertas label Alat tulis Bunsen Petri dish
0././ Bahan . edium padat kultur jaringan yang telah dibuat pada praktikum sebelumnya /. PestisidaF *ungisida 0. A@uades 6. Alkohol 51?
# Prsed"r Ker3a ,terilisasi Peralatan
.
en"u"i dengan detergen dan membilasnya sampai bersih dengan menggunakan a@uades& kemudian meniriskannya hingga kering
/.
ensterilkan dengan auto"la$e dan menyimpannya dalam o$en untuk menjaga peralatan agar tidak kontaminasi
0.
(etelah proses sterilisasi& dapat menggunakan semua peralatan dengan menekan kontaminasi
,terilisasi Media . enggunakan media tanam yang steril /. ensterilkan menggunakan auto"la$e untuk menghindari kontaminasi 0. emasukkan media yang telah jadi ke dalam botol kultur dan menutupnya dengan aluminium oil 6. elakukan sterilisasi pada temperature /oC dengan tekanan 5&> Psi selama /1-01 menit ,terilisasi Bahan Tana+ (Men4es"aikan den*an praktik"+ k"lt"r r*an) . en"u"i bersih bahan tanam dengan menggunakan air mengalir /. engojog bahan tanam dengan menggunakan pestisida atau ungisida 0. erendam bahan tanam dengan bahan kimia tertentu atau antisepti" di )aminar Air *low +)A*, 6. embilas bahan tanam dengan menggunakan air steril dan kemudian menanamnya
#2 Para+eter Pen*a+atan engamati kontaminasi media pada hari ke-5 dan ke-6 berdasarkan parameter< . Jenis mikroorganisme dan "iri-"iri yang menyebabkan kontaminasi /. Prosentase keberhasilan dari teknik aeptik yang di lakukan
3abel . Jumlah kultur yang terkontaminasi dan jenis kontaminan Bahan 3anam 3embakau
at Pengatur 3umbuh
Hari ke-5
Hari ke-6 !
!
( 1
1
-
j
NAA 1&/> ppm dan BAP ppm NAA ppm dan BAP 1&/> ppm BAP 1&> ppm /&6 # 1&> ppm !eterangan <
Jumlah kontaminasi
!
Jenis kontaminasi
J&B
Jamur& Bakteri
dst
dst
BAB 2# .A,IL AN PEMBA.A,AN
2#$ .asil Pen*a+atan Ta5el $# -"+lah k"lt"r 4an* terknta+inasi dan 3enis knta+inan pada hari ke67 dan ke6$2 Bahan Tana+ Te+5aka" 8at Pen*at"r T"+5"h
.ari ke67
.ari ke6$2
9
K
%
6
%
6
%
6
BAP %;' pp+
%
6
&;2 %;' pp+
%
6
M, : % NAA %;&' pp+ dan BAP $ pp+ NAA $ pp+ dan BAP %;&' pp+
Keteran*an < 9
: -"+lah knta+inasi
K
: -enis knta+inasi
-; B
: -a+"r; Bakteri
9
K
2#& Pe+5ahasan Pada praktikum kultur jaringan dengan a"ara teknik ase ptik yang bertujuan untuk mengetahui pelaksanaan teknik septik yang baik dan benar dalam kultur jaringan serta mengetahui alat yang serig digunakan dalam setiap teknik asepti". 3ujuan yang terakhir yaitu mengetahui jenis kontaminan yang terjadi karena beberapa a"tor. (ebelum memulai praktikum ini maka praktikan harus mempersiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan. Alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu& )aminar Air *low +)A*,& Botol semprot yang berisi alkohol 51?& Pinset& Pisau& (eal wrap +segel,& !ertas label& Alat tulis& Bunsen dan Petri dish. (edangkan bahan yang harus disediakan yaitu medium padat kultur jaringan yang telah dibuat pada praktikum sebelumnya& PestisidaF *ungisida& A@uades serta Alkohol 51?. (etelah alat dan bahan sudah lengkap tersedia& maka praktikan dapat memulai praktikum a"ara teknik aseptik dengan prosedur yang sudah terdapat dalam modul. Prosedur kerja dalam praktikum ini dibagi menjadi 0 prosedur yaitu prosedur kerja dalam sterilisasi peralatan& prosedur kerja dalam sterilisasi media& dan yang terakhir prosedur kerja sterilisasi bahan tanam yanga akan digunakan. Prosedur kerja yang pertama yaitu proses sterilisasi peralatan yang dimulai dengan men"u"i dengan detergen dan membilasnya sampai bersih dengan menggunakan a@uades& kemudian meniriskannya hingga kering. ensterilkan dengan auto"la$e dan menyimpannya dalam o$en untuk menjaga peralatan agar tidak kontaminasi. (etelah proses sterilisasi& dapat menggunakan semua peralatan dengan menekan kontaminasi. Prosedur kerja kedua yaitu proses sterilisasi media yang diawali dengan menggunakan media tanam yang steril. ensterilkan menggunakan auto"la$e untuk menghindari kontaminasi. emasukkan media yang telah jadi ke dalam botol kultur dan menutupnya dengan aluminium oil. (etelah selesai semuanya lalu melakukan sterilisasi pada temperature /oC dengan tekanan 5&> Psi selama /1-01 menit. Prosedur kerja yang terakhir yaitu proses sterilisasi bahan tanam atau eksplan yang akan digunakan dengan men"u"i bersih bahan tanam dengan
menggunakan air mengalir. Hal yang perlu diperhatikan adalah pada saat pembilasan air yang digunakan harus dengan air yang mengalir agar semua kontaminan dapat di singkirkan dan agar eksplan tidak mudah terkontaminasi dengan air bekas bilasan yang telah digunakan apabila menggunakan air yang tidak mengalir.
engojog bahan tanam dengan menggunakan pestisida atau
ungisida. erendam bahan tanam dengan bahan kimia tertentu atau antisepti" di )aminar Air *low +)A*, dan yang terakhir membilas bahan tanam dengan menggunakan air steril dan kemudian menanamnya. (etelah praktikum selesai dilakukan maka dilakukanlah pengamatan pada hari ke-5 dan hari ke-6. Namun yang dapat diperoleh hanya pada hari ke-5. Parameter yang digunakan untuk mengamatinya adalah mengetahui jumlah dan jenis kontaminan yang terjadi pada media dan berapa prosentase keberhasilan teknik aseptik yang telah dilakukan. Berdasarkan tabel hasil pengamatan dapat diperoleh bahwasanya pada hari ke-5 dengan bahan tanam tembakau& media yang telah ditanami dengan perlakuan (1 menunjukkan bahwa tidak ada kontaminan yang terjadi dalam media tanamnya. Pada perlakuan ( dengan P3 NAA 1&/>ppm dan BAP ppm diperoleh hasil bahwa tidak ada akti$itas kontaminasi yang terjadi& sehingga tidak adanya kontaminan dalam media tanamnya. Pada perlakuan selanjutnya dengan menggunakan media ( yang di tambahi dengan P3 NAA ppm dan BAP 1&/>ppm menunjukkan hal yang sama bahwa tidak adanya akti$itas kontaminan yang dibuktikan dengan tidak adanya kontaminasi yang terjadi. Pada perlakuan ke-6 dengan media ( menggunakan P3 BAP 1&>ppm menunjukkan tidak adanya kontaminasi baik dari jamur ataupun bakteri. Perlakuan yang terakhir dengan media ( yang ditambahi dengan /&6 # 1&> ppm tidak terjadi adanya kontaminan yang disebabkan oleh akti$itas jamur ataupun bakteri. (ehingga dapat disimpulkan berdasarkan hasil pengamatan hari ke-5 dapat diketahui prosentase keberhasilan teknik asepti" yang telah dilakukan men"apai 11?. Hal ini dibuktikan dengan tidak adanya kontaminan baik yang berasal dari jamur ataupun bakteri.
*aktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet mati. !ontaminasi yang terjadi disebabkan oleh "endawan atau ungi +jamur, dan bakteri. #ari kedua aktor penyebab kontaminasi& jamur atau "endawan yang menjadi penyebab paling dominan karena media yang telah terkontaminasi "endawan sangat sulit untuk dibersihkan atau disterilkan kembali. !ontaminasi pada media perlakuan sebelum proses penanaman tidak dapat digunakan untuk menanam. (ehingga sebelumnya harus diganti dengan pembuatan media yang baru untuk selanjutnya dapat dilakukan proses penanaman +3uhuteru& /1/,. edia tanam dapat digunakan setelah diinkubasi selama 6-5 hari dan memastikan bahwa media yang digunakan terbebas dari kontaminasi& namun kontaminasi pada planlet mulai terlihat pada umur satu (P dengan rekuensi E -> botol planlet. !ontaminasi yang disebabkan se"ara langsung oleh "endawan dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi media yang berkontak langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan maka "endawan tersebut akan menutupi seluruh permukaan media. Hal ini berbeda dengan kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri yang terjadi langsung pada eksplan yang ditandai dengan mun"ulnya lendir berwarna putih keruh disekeliling planlet +3uhuteru& /1/,. *aktor penyebab kontaminasi yang terjadi berasal dari kurang bersihnya botol& peralatan pada saat pembuatan media& suhu ruang kultur yang sering berganti atau tidak tetap pada saat botol disimpan di rak kultur dan adanya bakteri yang terbawa dari sumber tanam atau bahan tanam oleh karena itu harus dilakukan proses sterilisasi bahan tanam sebelum dilakukan proses penanaman dan juga kontaminasi sangat ditentukan oleh sterilitas ruangan yang sebab itu sangat perlu dilakukannya proses sterilisasi ruangan sebelum digunakan untuk menanam eksplan dalam medium. Proses sterilisasi ruangan yang termasuk dalam teknik aseptik menggunakan )aminar Air *low +)A*, untuk menjaga sterilitas ruangan. Prinsip kerja alat ini dapat dikolaborasikan dengan struktur yang dilengkapi dengan ruangan udara dengan udara yang steril. Ada dua ma"am dari jenis ini yaitu hori4ontal dan $erti"al )aminar Air *low steril system yang
terkadang membutuhkan biaya yang sangat mahal dalam proses perawatannya. Pengembangan alat ini diharapkan memanipulasi dan mempertahankan suatu ruangan dalam keadaan yang selalu steril. Alat ini telah disempurnakan dengan adanya aliran udara steril melalui sebuah prefilter dan alat yang dialirkan melalui sebuah ilter H;PA + High Efficiency Particulate Air , untuk menggerakkan aliran udara yang steril di dalam ruang kerja di laboratorium. )aminar dilengkapi dengan adanya lampu % +Ultra Violet , yang digunakan untuk memastikan bahwa tidak adanya kontaminan di setiap sisi ruangan +(tignor& /112,. Hal ini sangat diperuntukan untuk kegiatan praktikum dan pembuatan stok biologi yang harus dalam kondisi yang steril. Cara kerja laminar air low sebagai HACD + Heating, Ventilation, Air-Conditioning, and Refrigeration, sebelum digunakan terlebih dahulu disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 51 ? pada dinding dan alasnya serta meratakannya menggunakan tissue atau kertas yang steril. !emudian mendiamkannya selama kurang lebih 01 menit. )ampu ultra$iolet yang berada di dalam laminar air low dinyalakan selama 1&>- jam untuk membunuh kontaminan yang berada di dalamnya +(tignor& /112,. Proses sterilisasi media dan peralatan dengan menggunakan alat sterilisasi auto"la$e yang mempunyai prinsip sebelum digunakan atau dinyalakan bahan atau alat yang lain adalah tutup botol plastik& peralatan gelas& peralatan diseksi& pipet& air murni& dan media kultur mendapatkan perlakuan sesuai dengan jenis alatnya. (emua peralatan diseksi dibungkus dengan menggunakan kertas "oklat atau kertas merang dan juga !oran sebelum diautokla$. Aluminium oil tidak direkomendasikan untuk membungkusnya dikarena uapnya tidak dapat menembus pembungkus. Cara kerja yang harus dipatuhi dalam menggunakan auto"la$e mengkondisikan autokla$ diatur pada temperatur yang digunakan untuk sterilisasi dengan autokla dengan suhu /oC serta tekanan >-5&> psi selama >/1 menit. Peralatan yang terbuat dari logam& wadah-wadah gelas& dan lain-lain& disterilsasi dengan pemanasan dalam o$en pada suhu 0151 oC selama /6 jam. 'leh karena itu hal yang perlu mendapatkan diperhatian dalam teknik asepti" se"ara in vitro yaitu dalam beberapa tahapan antara lain pemilihan eksplan& proses sterilisasi bahan tanam atau eksplan yang telah dipilih& keadaan selama
proses kultur yang terdiri dari suhu atau temperatur& kelembaban relati$e serta waktu yang diperlukan untuk proses pertumbuhan dan perkembangannya selama proses kultur in vitro. !ondisi pertama yang membawa keberhasilan dalam proses kultur adalah aseptik. 3eknik untuk mempertahankan asepti" disebut teknik asepti" yang berarti bebas dari semua jenis mikroorganisme atau kondisi yang steril dan layak untuk melakukan proses kultur in vitro. %ntuk menjaga lingkungan yang aseptik maka harus semua komponen kultur baik alat dan bahan serta media dan juga eksplan yang akan digunakan harus dalam keadaan yang steril sehingga harus dilakukan proses sterilisasi untuk semua komponen dalam kultur jaringan. Hal penting yang lain yaitu menjaga udara& permukaan lantai bebas dan bersih dari debu. (ehingga semua pengerjaan dari praktikum kultur harus dilakukan dalam )aminar Air *low Cabinet yang steril +Chawla dalam Anoop& /112,. %ntuk itu pada dasarnya teknik aseptik yang dilakukan dalam kultur jaringan sangat perlu digunakan untuk dapat mendukung kondisi yang dibutukan eksplan yang ditanam dalam media mengalami proses pertumbuhan dan perkembangan. 3eknik asepti" dapat terlaksana dengan baik apabila juga disertai dilakukannya proses sterilisasi terutama pada eksplan yang harus bebas dari kontaminan sebelum dilakukan proses penkulturan. Berbagai proses sterilisasi yang disertai dengan bahan sterilisasi digunakan untuk men"egah adanya kontaminasi pada jaringan dalam eksplan. Bahan sterilisasi "ontohnya yaitu Cloro= atau bay"lin ditujukan karena bay"lin memiliki kandungan yang dapat membersihkan eksplan dari berbagai ma"am kontaminan baik berupa jamur& $irus& bakteri& maupun kontaminan yang lain +Hariyadi& /11,. Hal ini dikarenakan kedua bahan tersebut merupakan ra"un untuk tanaman oleh karena itu dalam penggunaanya diperlukan dosis atau ukuran yang sesuai agar tidak melukai ataupun mematikan jaringan dalam eksplan +:a4id& /11,. Pentingnya teknik aseptik dalam kultur jaringan tepatnya pada saat penanaman eksplan harus selalu dalam keadaan yang steril& maka harus dilakukan sterilisasi. (etiap bahan yang akan kita gunakan harus dalam kondisi yang steril. 3ermasuk juga praktikan yang hendak menanam eksplan pada media tanam harus
steril dimulai dari penggunaan jas lab& sarung tangan dan masker. (elain itu sebelum praktikan memulai melakukan penanaman eksplan di dalam )aminar air *low Cabinet& harus menyemprotkan al"ohol ke tangan walaupun sudah memakai sarung tangan lateks. Begitu juga dengan peralatan yang akan digunakan sebelum memasuki )aminar Air *low Cabinet seperti pinset dan s"alpel& harus direndam dengan al"ohol yang disediakan dalam beaker glass ke"il apabila alat tersebut tidak digunakan. Namun apabila akan digunakan kembali harus di panaskan terlebih dahulu di atas nyala api Bunsen. Proses sterilisasi yang merupakan langkah penting dalam teknik aseptik dilakukan dengan tujuan agar semua proses penanaman yang dilakukan dengan alat dan bahan yang steril karena penanaman eksplan ini sangat mudah terjadi kontaminan yang dapat mempengaruhi keberhasilam penanaman eksplan. 'leh karena itu teknik aseptik sangat penting untuk dilakukan untuk memperoleh keberhasilan pada proses penanaman dalam kultur jaringan.
BAB '# KE,IMPULAN AN ,ARAN
'#$ Kesi+p"lan . 3eknik aseptik dalam kultur jaringan dilakukan pada saat sebelum& pada waktu penanaman eksplan dan sesusadah penanaman harus selalu dalam keadaan yang steril& maka harus selalu dilakukan sterilisasi. (etiap bahan yang akan kita gunakan harus dalam kondisi yang steril. 3ermasuk juga praktikan yang hendak menanam eksplan pada media tanam harus steril dimulai dari penggunaan jas lab& sarung tangan dan masker. (elain itu sebelum praktikan memulai melakukan penanaman eksplan di dalam )aminar air *low Cabinet& harus menyemprotkan al"ohol ke tangan walaupun sudah memakai sarung tangan lateks. Begitu juga dengan peralatan yang akan digunakan sebelum memasuki )aminar Air *low Cabinet seperti pinset dan s"alpel& harus direndam dengan al"ohol yang disediakan dalam beaker glass ke"il apabila alat tersebut tidak digunakan. Namun apabila akan digunakan kembali harus di panaskan terlebih dahulu di atas nyala api Bunsen. (terilisasi setelah penanaman dengan membersihkansemua alat dan bahan yang digunakan untuk tidak berada dalam )A* pada saat setelah proses penanaman. /. Proses sterilisasi yang merupakan langkah penting dalam teknik aseptik dilakukan dengan tujuan agar semua aspek yang terdiri dari peralatan dan bahan serta media& praktikan dan eksplan atau bahan tanama yang akan digunakan dan juga lingkungan kerja pada saat proses kultur jaringan mempunyai alat tertentu yang digunakan untuk melakukan proses sterilisasi pada semua aspek. Proses sterilisasi peralatan& dan media dilakukan dengan menggunakan auto"la$e dengan suhu / oC dan tekanan 5&> Psi. Proses sterilisasi lingkungan kerja beserta praktikan dengan selalu berada dalam )aminar Air *low Cabinet dengan dilengkapi lampu % untuk mempertahankan sterilitas ruangan selama proses penanaman.
Proses sterilisasi bahan tanam dngan menggunakan bahan sterilisasi seperti Cloro= atau bay"lin ditujukan karena bay"lin memiliki kandungan yang dapat membersihkan eksplan dari berbagai ma"am kontaminan baik berupa jamur& $irus& bakteri 0. *aktor utama yang menjadi kendala dalam kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat menyebabkan media perlakuan rusak dan planlet mati. !ontaminasi yang terjadi disebabkan oleh "endawan atau ungi +jamur, dan bakteri. #ari kedua aktor penyebab kontaminasi& jamur atau "endawan yang menjadi penyebab paling dominan karena media yang telah terkontaminasi "endawan sangat sulit untuk dibersihkan atau disterilkan kembali. !ontaminasi yang disebabkan se"ara langsung oleh "endawan dapat terlihat pada awalnya terletak di permukaan atau tepi media yang berkontak langsung dengan dinding botol. Apabila dibiarkan maka "endawan tersebut akan menutupi seluruh permukaan media. Hal ini berbeda dengan kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri yang terjadi langsung pada eksplan yang ditandai dengan mun"ulnya lendir berwarna putih keruh disekeliling planlet. *aktor penyebab kontaminasi yang terjadi berasal dari kurang bersihnya botol& peralatan pada saat pembuatan media& suhu ruang kultur yang sering berganti atau tidak tetap pada saat botol disimpan di rak kultur dan adanya bakteri yang terbawa dari sumber tanam atau bahan tanam yang digunakan.
'#& ,aran #alam hal menaikkan keberhasilan pada praktikum ini& adapun beberapa saran yang pastinya perlu untuk diperhatikan& yaitu . (angat memperhatikan kesterilan alat dan bahan dan memastikan semuanya dalam keadaan steril. /. (elalu memakai jas praktikum saat praktikum maupun pada saat pengamatan baik pada praktikan maupun asisten laboratorium untuk menghindari adanya kontaminasi.
A0TAR PU,TAKA
Anoop& Badoni and J. (. Chauhan. /112. In itro (terili4ation Proto"ol or i"ropropagation o (olanum tuberosum. Academia Arena& /1127 +>,<>-9K. I((N >>0-22/L. #eden& (ukmadjaja dan ariska& Ika. /110. Perbanyaan !ibit "ati melalui #ultur "aringan I(BN 252-2>G/5-9-0. Bogor< Balai Penelitian Bioteknologi dan (umberdaya 8enetik Pertanian. Hariyadi& Purwiyatno. /11. $terili%a%i UH& dan Pengema%an A%epti . Jakarta< Ikatan #okter Indonesia )ili Herawati (iregar& )uthi A. (iregar& )ollie A. P. Putri. /10. P;N8AD%H M- B;NI) AIN' P%DINA #AN M- A(A A(;3A3 NA*3A);NA 3;DHA#AP P;D3%B%HAN A!AD !oe%enbergia flava (;CADA IN-I3D'. "urnal 'nline Agroeotenologi ol.& No.0& Juni /10 ariska& Ika. /112.Perkembangan Penelitian !ultur In itro pada 3anaman Industri& Pangan& dan Hortikultura. !uletin Agro!io ()*+(-( ') >& N'. / ariska& Ika dan #eden (. /110. Perbanyaan !ibit Abaa melalui #ultur "aringan I(BN 252-2>G/5-2-. Bogor< Balai Penelitian Bioteknologi dan (umberdaya 8enetik Pertanian. ayta No$ali4a Isda dan Iran (ulianyah. /112. IN#%!(I !A)%( Centella a%iatica ;)A)%I AP)I!A(I A%!(IN #AN (I3'!ININ +3he Dole o Au=in and Cytikinin in Callus Indu"tion o Indian Pennywort +Centella a%iatica,. "erami olume / No. 0& (eptember - #esember /112 I((N 252-1//9 . :a4id& Aris Bastianudin. /11. P;N8AD%H (3I%)AN A(A A(;3A3 3;DHA#AP ;*I(I;N(I P;N8I!A3AN %DANI% #A)A BI'D;;#IA(I )IN8!%N8AN ;N88%NA!AN !acillu% sp. dan P%eudomona% sp. Pro%iding PP/ - P0/P&1 *2 Pu%te A%elerator dan Pro%e% !ahan 3 !A&A1 I((N 1/G 0/9.
Nur Ajijah& Ireng #arwati& :udiwanti& #an Doostika. /11. P;N8AD%H (%H% IN!%BA(I 3;DHA#AP P;D3%B%HAN #AN P;D!;BAN8AN ;BDI' ('A3I! P%D'C;N8 + Pimpinella pruat4an olk.,. "urnal 5ittri G+/,& Juni /11 Hlm. >G G0 I((N 19>0-9//. Nugraha Pratama #hanal& )ahmuddin )ubis& )isnawita. /10. I(')A(I JA%D 'ncoba%idium theobromae P.H.B 3A)B'3 !;AN; P;N:;BAB P;N:A!I3 A(C%)AD (3D;A! #I;BAC! PA#A 3ANAAN !A!A' #I )AB'DA3'DI%. "urnal 'nline Agroeotenologi I((N No. /005- G>25 ol./& No.< /99-/20 #esember /10. Patoni A. 8aar dan (usi Heryani. /1/. P;N8;BAN8AN PD'(;( P;N8')AHAN IN%AN NIDA AD;N #;N8AN 3;!NI! %)3DA*I)3DA(I #AN #;'#'DI(A(I +3he #e$elopment o Aren (ap #rink Pro"essing 3e"hnology by %sing %ltrailtration and #eodori4ation 3e"hni@ues,. "UR1A5 HA$/5 PE1E5/&/A1 /10U$&R/ olume />& No. & April /1/. (tignor& Caroline Haglund. /112. 5aminar-flo6 5i7uid-to-air Heat E8changer%-Energy-effeciency 0i%play Cabinet Application%. (weden< )und %ni$ersity. 3uhuteru& . ). Hehanussa& (.H.3. Daharjo. /1/. P;D3%B%HAN #AN P;D!;BAN8AN AN88D;! 0endrobium ano%mum PA#A ;#IA !%)3%D IN I3D' #;N8AN B;B;DAPA !'N(;N3DA(I AID !;)APA. Agrologia& ol. & No. & April /1/& Hal. -/. I((N /01-5/95.
