Pokok Bahasan II : PERLENGKAPAN DAN PERALATAN TEKNIS KULTUR JARINGAN Pendahuluan Teknik kultur jaringan (kultur in vitro) mensyaratkan kondisi steril baik ruang, peralatan, bahan maupun seluruh rangkaian kerjanya. Hal ini disebabkan karena pertumbuhan eksplan didalam kultur harus selalu dalam kondisi aseptis. Untuk itu semua tahapan pelaksanaan teknik kultur in vitro harus dilaksanakan didalam laboratorium dan harus ditunjang oleh organisasi serta perlengkapan laboratorium yang memadai serta tata cara kerja yang teliti dari si peneliti. Laboratorium tidak harus dibangun baru, ruang-ruang didalam laboratorium yang sudah ada dapat direnovasi untuk keperluan kultur jaringan, namun demikian pendirian laboratorium baru merupakan langkah yang terbaik. Laboratorium
sebaiknya
mempunyai
pembagian
ruangan
yang
diatur
sedemikian rupa sehingga tiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainnya, tetapi masih dapat saling berhubungan dan mudah dicapai. Dalam bab ini akan diuraikan skema umum laboratorium kultur jaringan, prinsip dan fungsi ruang serta peralatan yang ada didalamnya. Tujuan Instruksional Khusus: Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa akan dapat menjelaskan dan menggambarkan skema umum laboratorium kultur jaringan, prinsip, fungsi ruang serta peralatan yang ada didalamnya.
Subpokok bahasan : Laboratorium Kultur Jaringan
Pendahuluan Laboratorium yang baik untuk pekerjaan teknik kultur jaringan harus memenuhi kriteria aman, bersih, memiliki organisasi dan penataan ruang yang sesuai. Lokasi dari laboratorium itu sendiri sebaiknya jauh dari lingkungan pabrik atau bengkel yang sering menimbulkan polusi. Kondisi bagian dalam laboratorium mutlak harus bersih, mulai dari lantai, dinding, meja, alat-alat yang digunakan, maupun udara diruangan laboratorium tersebut. Harus diusahakan semaksimal mungkin bebas dari debu, karena debu adalah sumber kontaminan yang paling potensial. Yang tidak menguntungkan adalah bahwa negara kita terletak didaerah beriklim tropis, debu-debu begitu banyak mendominasi ruangan udara disekitar kita sehingga sulit untuk dihindari. Oleh karena itu sebagai upaya pembuatan laboratorium bebas debu, kita harus merancang laboratorium yang tertutup rapat tanpa ada ventilasi. Jendela-jendela dibuat permanen dari kaca (tidak bisa dibuka). Didalam ruangan diberi pengatur udara (AC) untuk mempertahankan suhunya konstan (25-28)°C, dan dipasang exhauster untuk
menyedot
debu
yang
ada
didalam
ruangan.
Lantai
laboratorium juga harus dibersihkan secara rutin dengan antiseptik, meja dan dinding juga harus dibersihkan dengan larutan antiseptik umumnya permukaan meja dan dinding dilapisi dengan porselin supaya kedap air dan mudah dibersihkan. Ruangan didalam laboratorium harus dijaga tetap bersih dan bebas dari debu, hewan kecil dan insek. Setiap orang yang akan masuk laboratorium harus melepas sepatunya dan menggantinya dengan alas kaki yang ada didalam laboratorium dan harus mengenakan jas praktikum. Kebersihan laboratorium secara umum sangat menentukan keberhasilan kerja kultur jaringan. Sarana dasar seperti aliran listrik, air yang cukup dan gas harus dipunyai. Materi subpokok bahasan Pelaksanaan kerja kultur jaringan tumbuhan memiliki tahapan-tahapan dan urutan kerja yang khusus. Oleh karena itu laboratorium harus diatur sedemikian rupa sehingga ada tingkatan sterilitas ruangan sesuai dengan tahapan kerja tadi, termasuk alur keluar-masuknya pekerja didalam laboratorium tersebut. Tahapantahapan kerja didalam laboratorium kultur jaringan dibagi
Subpokok bahasan : Laboratorium Kultur Jaringan
Pendahuluan Laboratorium yang baik untuk pekerjaan teknik kultur jaringan harus memenuhi kriteria aman, bersih, memiliki organisasi dan penataan ruang yang sesuai. Lokasi dari laboratorium itu sendiri sebaiknya jauh dari lingkungan pabrik atau bengkel yang sering menimbulkan polusi. Kondisi bagian dalam laboratorium mutlak harus bersih, mulai dari lantai, dinding, meja, alat-alat yang digunakan, maupun udara diruangan laboratorium tersebut. Harus diusahakan semaksimal mungkin bebas dari debu, karena debu adalah sumber kontaminan yang paling potensial. Yang tidak menguntungkan adalah bahwa negara kita terletak didaerah beriklim tropis, debu-debu begitu banyak mendominasi ruangan udara disekitar kita sehingga sulit untuk dihindari. Oleh karena itu sebagai upaya pembuatan laboratorium bebas debu, kita harus merancang laboratorium yang tertutup rapat tanpa ada ventilasi. Jendela-jendela dibuat permanen dari kaca (tidak bisa dibuka). Didalam ruangan diberi pengatur udara (AC) untuk mempertahankan suhunya konstan (25-28)°C, dan dipasang exhauster untuk
menyedot
debu
yang
ada
didalam
ruangan.
Lantai
laboratorium juga harus dibersihkan secara rutin dengan antiseptik, meja dan dinding juga harus dibersihkan dengan larutan antiseptik umumnya permukaan meja dan dinding dilapisi dengan porselin supaya kedap air dan mudah dibersihkan. Ruangan didalam laboratorium harus dijaga tetap bersih dan bebas dari debu, hewan kecil dan insek. Setiap orang yang akan masuk laboratorium harus melepas sepatunya dan menggantinya dengan alas kaki yang ada didalam laboratorium dan harus mengenakan jas praktikum. Kebersihan laboratorium secara umum sangat menentukan keberhasilan kerja kultur jaringan. Sarana dasar seperti aliran listrik, air yang cukup dan gas harus dipunyai. Materi subpokok bahasan Pelaksanaan kerja kultur jaringan tumbuhan memiliki tahapan-tahapan dan urutan kerja yang khusus. Oleh karena itu laboratorium harus diatur sedemikian rupa sehingga ada tingkatan sterilitas ruangan sesuai dengan tahapan kerja tadi, termasuk alur keluar-masuknya pekerja didalam laboratorium tersebut. Tahapantahapan kerja didalam laboratorium kultur jaringan dibagi
dalam 4 kelompok yaitu: 1. Persiapan. Merupakan tahap awal kerja kultur jaringan, dimulai dari penyiapan tanaman sebagai sumber eksplan yang ditanam di green house, kemudian menyiapkan alat-alat, botol-botol kultur dan pembuatan medium (meracik, merebus dan membaginya kedalam botol-botol sampai pada sterilisasi). 2. Inokulasi. Inokulasi meliputi sterilisasi, pengambilan/pengirisan bagian tanaman yang akan dijadikan sebagai eksplan, kemudian menanamnya didalam atau diatas medium buatan yang telah disediakan. Untuk inokulasi eksplan ini diperlukan kondisi yang absolut steril. 3. Pemeliharaan. Setelah diinokulasi, botol kultur diletakkan di rak-rak pemeliharaan di ruang inkubator untuk diikuti pertumbuhan dan perkembangannya sampai menjadi plantlet. Untuk pemeliharaan tersebut dibutuhkan ruang yang tidak perlu steril tetapi harus bersih, dengan pengatur suhu (2528)°C, dan pencahayaan dengan lampu TL (1000-3000) lux. 4. Aklimatisasi. Aklimatisasi merupakan proses penyesuaian/adaptasi plantlet dari kondisi heterotrof didalam botol kultur menjadi autotrof yang dapat ditanam pada kondisi alamiahnya ditanah. Proses aklimatisasi dilaksanakan didalam green house dengan memberikan perlakuan kelembaban, intensitas cahaya dan temperatur. Setelah melampauai masa aklimatisasi, tanaman dapat dibawa keluar dari green house untuk house untuk ditanam dilapangan.
Masing-masing tahapan pekerjaan tersebut harus terpisah satu dengan lainnya dan dengan menggunakan peralatan tersendiri. Berdasarkan adanya urutan tahapan kerja seperti tersebut diatas, maka dasar penataan ruang laboratorium adalah urutan kegiatan dan sterilitas ruangan. Oleh karena itu pembagian ruangan laboratorium yang baik meliputi
1. Ruang persiapan. 2. Ruang transfer (inokulasi) atau ruang steril. 3. Ruang kultur (inkubator dan ruang plantlet) 4. Ruang aklimatisasi
Ruang persiapan Ruangan ini dipergunakan sebagai tempat untuk mempersiapkan eksplan, medium dan alat-alat. Ruang persiapan biasanya dibagi menjadi berberapa ruangan kecil yang dipergunakan untuk menyimpan medium dan alat-alat yang sudali steril, untuk menyimpan alat-alat gelas, bahan-bahan kimia dan pembuatan medium (ruang timbang), dan ruangan untuk mencuci. Persiapan eksplan yang dilakukan meliputi pencucian, pemotongan/pembuangan bagian-bagian tanaman yang tidak dipergunakan serta perlakuan awal untuk mengurangi kontaminan yang ada dipermukaan tanaman. Persiapan medium meliputi penimbangan bahan kimia medium, pengenceran medium, penuangan kedalam wadah kultur dan sterilisasi. Sesuai dengan fungsinya, fasilitas yang dibutuhkan didalam ruangan ini adalah meja tempat meletakkan alat-alat pemanas, meja untuk alat-alat timbang, meja untuk bekerja dan tempat mencuci, semua meja adalah kongkrit (statis dari beton) dan beralas porselin.
Peralatan yang diletakkan didalam ruangan ini terdiri dari: 1. Oven 2. Magnetic stirrer dengan atau tanpa pemanas 3. Alat-alat gelas standard: labu takar berbagai ukuran pipet pasteur erlenmeyer berbagai ukuran gelas piala pengaduk gelas wadali kultur : botol, tabung reaksi, cawan petri 4. Lemari alat-alat gelas 5. Alat-alat untuk mencuci 6. Rak-rak pengering 7. Alat-alat diseksi: spatula, pisau, scalpel, pinset, glinting, cutter 8. Borrer berbagai ukuran
9. Blender 10. Bidistilling water 11. Agar dispenser 12. Kompor gas 13. Autoclave 14. Lampu bunsen dengan kaki tiga 15. Kereta (cart) untuk memindahkan alat-alat dan media keruang lain 16. Growth chamber, untuk praperlakuan dingin pada tanaman berbunga, khususnya yang akan dipergunakan untuk kultur mikrospora. Ruang timbang Ruangan ini dipergunakan untuk tempat menyimpan bahan-bahan kimia medium dan mempersiapkan medium kultur. Persiapan medium kultur meliputi penimbangan bahan kimia medium, pengenceran larutan stok, membagi-bagi dalam botol kultur dan sterilisasi. Ruang timbang berhubungan langsung dengan ruang persiapan. Fasilitas yang diperlukan dalam ruangan ini adalah meja kerja dan meja untuk alat-alat timbang beralas porselin. Peralatan yang diletakkan diruangan ini terdiri dari : 1. Timbangan analitik 2. Lemari es dan freezer untuk menyimpan larutan stok 3. Hot plate dengan magnetik stirrer 4. Bunsen dengan kaki tiga 5. pH meter 6. Lemari bahan kimia dana alat-alat (aluminum foil, kertas timbang, kertas saring dsb) 7. Hood tempat penimbangan bahan-bahan kimia yang karsinogenik 8. Blender / homogenizer
Ruang stok Ruang stok dipergunakan untuk menyimpan alat-alat steril dan medium yang sudah jadi (steril). Didalam pelaksanaan teknik kultur jaringan, sebelum penanaman eksplan maupun subkultur dilakukan, medium kultur harus sudah disiapkan minimum tiga hari sebelum diperlukan. Medium yang sudah jadi harus disimpan didalam ruangan yang dingin dan gelap. Fasilitas yang diperlukan
diruangan ini berupa meja kerja beralas porselin. Ruang stok harus berhubungan langsung 2 arah, satu arah dengan ruang persiapan (setelah media disterilisasi diruang persiapan, dapat langsung dibawa keruangan ini) dan arah yang lain dengan ruang transfer atau ruang steril, ruangan ini meskipun tidak harus steril tetapi kebersihannya harus tetap terjaga. Alat-alat yang terdapat diruangan ini meliputi: 1. Kereta dorong 2. Rak-rak untuk meletakkan medium steril 3. Oven untuk menyimpan alat-alat steril.
Ruang steril / transfer Ruang transfer merupakan ruangan dimana semua kegiatan aseptis dimulai. Kegiatan yang dilakukan meliputi : sterilisasi, isolasi bagian-bagian tanaman dan penanaman eksplan dalam medium. Kegiatan subkultur, sterilisasi medium dengan ultrafiltrasi juga dilakukan diruangan ini. Ruangan ini mutlak harus steril, sehingga sedapat mungkin bebas dari debu dan hewan kecil, dinding ruangan dilapis porselin atau bahan lain yang kedap air dan mudah dibersihkan. Ruangan ini juga dilengkapi dengan tempat cuci tangan sehingga memudahkan petugas yang akan memulai dengan pekerjaan aseptis, pengatur suhu (AC), lampu Ultra Violet dan lampu TL biasa. Ruang transfer harus terisolir sedemikian rupa tetapi masih dapat berhubungan dengan ruang stok, ruang inkubasi dan ruang mikroskop. Pintu penghubung harus selalu dalam keadaan tertutup.
Ruang transfer dilengkapi dengan alat-alat sebagai berikut: 1. Laminar air flow cabinet, peralatan utama untuk melakukan pekerjaan aseptis 2. Dissecting microscope 3. Cart yang selalu disemprot dengan alkohol 70% 4. Alat-alat diseksi: scalpel, pinset, spatula, gunting, jarum 5. Millipore filter 6. Syrink 7. Hand sprayer untuk alcohol 8. Tempat alcohol 9. Bunsen burner/lampu alkohol/bacticinerator 10. Meja beralas kaca/formica dengan laci untuk menyimpan alat-alat steril,
kapas dan alcohol 11. Entkas 12. Timbangan kecil 13. Electrofusion chamber 14. Vacumpump 15. Centrifuge, untuk proses isolasi protoplas
Ruang inkubasi/kultur Ruang kultur merupakan ruang besar dengar kemungkinan perluasan bila diperlukan. Kebersihannya harus diperhatikan dan sedapat mungkn dihindari
terlalu
banyak
keluar
masuknya
orang-orang
yang
tidak
berkepentingan. Ruangan ini dipergunakan untuk memelihara eksplan yang telah ditanam pada medium secara aseptis. Kultur yang telah lumbuh dan memperbanyak diri, secara teratur harus disubkultur. Tergantung dari jenis eksplan dan tipe kultur, subkultur dilakukan setiap 3-6 minggu sekali, hal ini berarti tiap bulan ada pelipatan jumlah kultur. Botol-botol kultur diatur dengan menempatkannya pada rak-rak terbuka yang bertingkat (3-4 tingkat) dengan lampu fluorescent, jarak tiap tingkat 40-50 cm. Jarak antara rak harus diatur sedemikian rupa sehingga memudahkan lalulintas pemeriksa kultur. Didalam ruang kultur, lingkungan fisik diatur sedemikian rupa sehingga mendukung pertumbuhan yang optimal, untuk itu perlu ada pengaturan terhadap suhu dan cahaya. Unsur-unsur dan cahaya yang perlu diperhatikan adalah kualitas, lama penyinaran dan intensitas cahaya. Kualitas cahaya Cahaya putih merupakan cahaya yang baik untuk pertumbuhan kultur. Lampu fluorescent (neon/TL) biasa digunakan sebagai sumber cahaya dalam ruang kultur. Keseimbangan spektrum lampu fluorescent sangat baik dan efisien dalam penggunaan energi bila dibandingkan dengan lampu pijar. Bentuk lampu memungkinkan penyebaran cahaya yang baik, dengan panas yang dikeluarkan relatip rendah, bila transformer dapat diletakkan diluar ruang kultur. Pada
lampu
pijar
hampir
90%
merupakan
energi
panas
sehingga
mempengaruhi temperatur temperatur ruangan. Pada ruang kultur juga dapat diberikan campuran lampu pijar dan fluorescent secara bersamaan.
Intensitas cahaya Intensitas cahaya yang baik dari lampu fluorescent adalah antara 100400 foot candel (1000-4000 lux). Intensitas cahaya diatur dengan menempatkan sejumlah lampu dengan kekuatan tertentu pada jarak antara 40-50 cm dari tabung kultur pada luas area tertentu. Lama penyinaran Seberapa lama cahaya harus diberikan pada eksplan sehingga berpengaruh positip terhadap pertumbuhannya, sangat tergantung dari jenis tanaman dan respon yang diinginkan. Untuk proses morfogenesis, umumya diperlukan pencahayaan terus menerus, sebaliknya untuk induksi kalus umumnya tidak memerlukan pencahayaan. Sedangkan untuk pertumbuhan plantlet, yang segera akan dilakukan aklimatisasi, umumnya memerlukan periode penyinaran selama 14-16 jam. Panjang penyinaran diatur dengan alat automatic timer switch atau timer. Temperatur Temperatur didalam ruang kultur yang baik adalah pada suhu normal yaitu antara 25-28° C. Pengaturan suhu dilakukan dengan menggunakan AC, karena ruang kultur merupakan ruang tertutup yang sedikit sekali mempunyai aliran udara bebas. Beberapa perlakuan khusus kadang-kadang memerlukan suhu rendah (18-20°C), sehingga diperlukan adanya growth chamber yang dapat diatur suhu dan pencahayaannya. Alat-alat yang diperlukan didalam ruang kultur adalah: 1. Rak-rak kultur 3-4 tingkat dengan lampu fluorescent, jarak tiap tingkat 40-50 cm. 2. Timer untuk mengatur lama penyinaran 3. AC untuk mengontrol suhu ruangan 4. Binocular microscope dan loupe/kaca pembesar 5. Tangga aluminium untuk melihat kultur di rak yang tinggi 6. Shaker, untuk inkubasi kultur dengan medium cair
Ruang mikroskop Ruangan ini dipergunakan untuk pengamatan dan analisa selama kultur berjalan, reaksi suatu kultur dalam media perlakuan sering diikuti sejak awal inisiasi. Untuk membedakan morfologi eksplan atau struktur internal pada kultur mikrospora, sel dan protoplas yang terjadi pada awal perkembangannya, diperlukan bantuan mikroskop. Untuk keperluan tersebut dipergunakan binocular mikroskop (stereoscope), inverted microscope, fluorescent microscope, yang dilengkapi dengan peralatan untuk fotografi. Penelitianpenelitian yang lebih canggih seperti fusi protoplas, micro-injection DNA atau organel kedalam sel atau protoplas, memerlukan mikroskop dengan mikromanipulator. Ruangan ini harus senantiasa kering/tidak lembab dan bersih, untuk pengoperasian fluorescent microscope, diperlukan ruangan yang gelap total. Meja kongkrit (dari beton) untuk tempat meletakkan mikroskop diperlukan didalam ruangan ini. Alat-alat yang terdapat didalam ruangan ini adalah: 1. Inverted microscope 2. Stereoscope 3. Student microscope 4. Fluorescent microscope 5. Micro-manipulator 6. Alat-alat fotografi 7. Alat-alat untuk pengamatan sitologis, misalnya gelas preparat dan penutup, jarum, microtome dsb.
Gambar 2.1. Skema umum laboratorium Kultur Jaringan
R1. Ruang Persiapan
R4. Ruang Steril/transfer
R7. Ruang Administrasi
R2. Ruang Timbang
R5. Ruang Mikroskop
R8. Ruang cuci
R3. Ruang Stok
R6. Ruang Inkubator
Latihan soal-soal. 1. Jelaskan persyaratan umum laboratorium yang dapat dipergunakan untuk melaksanakan pekerjaan kultur jaringan! 2. Apa yang menjadi dasar pembagian ruang-ruang didalam laboratorium? 3. Jika kita ingin merenovasi laboratorium yang sudah ada, bagaimana saudara merancang ruang-ruang didalam laboratorium agar dapat mengurangi masalah kontaminasi! 4. Jelaskan mengapa ruang transfer harus terisolir dari ruang-ruang yang lain!, sebutkan peralatan apa saja yang harus ada didalam ruangan ini!. 5. Gambarkan skema umum laboratorium kultur jaringan!
Perunjuk jawaban latihan soal-soal 1. Ingat tahapan pekerjaan didalam kultur jaringan! 2. Ingat alur pekerjaan kultur jaringan! 3. Ingat fungsi setiap ruang! 4. Ingat prinsip pekerjaan aseptis dan peralatan yang digunakan! 5. Ingat alur kerja dan tahapan pekerjaan didalam kultur jaringan!
Ringkasan Didalam kultur jaringan, pertumbuhan eksplan harus dalam lingkungan aseptik dan terkendali. Implikasi dari keadaan ini adalah bahwa setiap tahapan dalam pelaksanaannya harus dilakukan didalam laboratorium. Laboratorium kultur jaringan dirancang sedemikian rupa mengikuti alur pekerjaan aseptis, sehingga setiap kegiatan dilakukan didalam ruangan secara terpisah, namun masih dapat saling berhubungan satu sama lain. Setiap ruangan dirancang sesuai dengan kebutuhan dan peralatan yang ada disetiap ruangan juga disesuaikan dengan kegiatan yang dilakukan. Tes Formatif 2 1. Laboratorium Kultur jaringan dirancang sesuai dengan alur kegiatan aseptis, lokasi Laboratorium sebaiknya ditempat yang: a. Aman b. Sejuk c. Dekat pabrik
d. Pinggir jalan raya 2. Alur pekerjaaan didalam kultur jaringan meliputi persiapan eksplan, inokulasi, pemeliharaan dan aklimatisasi, pekerjaan utama yang absolut steril dilaksanakan di ruang: a. Persiapan b. Inkubator c. Transfer d. stok 3. Peralatan utama yang terdapat didalam ruang steril adalah: a. Laminar air Flow cabinet b. Bidistiling water c. Oven d. Autoclave 4. Ruang transfer harus mutlak steril, untuk itu sterilisasi ruangan tersebut dilakukan dengan menggunakan: a. Laminar Air Flow cabinet b. Lampu Ultra violet c. Autoclave d. AC 5. Medium kultur jaringan dibuat dengan meracik setiap komponen yang tertera didalam resep, preparasi media dapat dilakukan di ruang yang tersebut dibawah ini, kecuali: a. Ruang timbang b. Ruang persiapan c. Ruang stok d. Ruang steril
Kunci jawaban Tes Formatif 2 1. a dan b, 2. c, 3. a, 4. b, 5. C
FASILITAS DAN BAHAN DI LABORATORIUM KULTUR JARINGAN
1. Organisasi Dalam Laboratorium Kultur Jaringan Di setiap laboratorium dimana teknik kultur jaringan digunakan harus mempunyai sejumlah fasilitas yang mencakup al.: - Ruang pencucian - Ruang persiapan media, sterilisasi dan penyimpanan - Ruang transfer aseptik - Ruang kultur atau inkubator yang lingkungannya terkontrol - Ruang pengamatan dan koleksi data Diagram laboratorium kultur jaringan dapat dilihat pada gambar B-2.1. a. Ruang Pencucian Ruang pencucian harus mempunyai bak cuci, meja kerja yang terbuat dari bahan yang tahan terhadap asam dan basa, rak pengering dan mempunyai saluran untuk air demineralisasi atau destilasi, ruang untuk tempat oven pengering, alat/mesin pencuci dan pengering, serta rak atau lemari penyimpanan alat. b. Ruang Persiapan Media Di dalam ruang persiapan media harus tersedia tempat untuk penyimpanan bahan-bahan kimia, gelas kultur dan penutupnya, dan peralatan gelas yang diperlukan untuk pembuatan media. Meja yang kokoh atau ”bench” untuk penyimpanan ”hot plate magnetic stirrer”, pH meter, timbangan, dan dispenser harus tersedia. Peralatan lain yang biasanya ada di ruang persiapan dan pembuatan media antara lain alat vaccum, distiling unit, bunsen, refrigerator (kulkas) dan freezer untuk penyimpanan larutan stok dan bahan kimia, mikrowave, kompor gas, oven dan autoclave untuk sterilisasi mdia, peralatan gelas dan peralatan lain. Didalam pembuatan media kultur, bahan bahan kimia yang digunakan harus yang bertaraf analitik dan penimbangannya harus baik dan benar. Agar lebih akurat, dalam pembuatan media harus dilakukan tahap demi tahap dan bahan bahan yang digunakan harus di ”checklist”. Air yang digunakan dalam pembuatan media harus berkualitas tinggi yang mempunyai tingkat kemurnian yang tinggi. Air ledeng atau sumur tidak digunakan untuk pembuatan media karena mengandung kation-kation (amonium, kalsium, besi, magnesium natrium, dll.), anion-anion (bikarbonat, klorida, flourida, fosfat, dll.), mikroorganisme (algae, jamur, bakteri), gas-gas (oksigen, CO2, nitrogen) dan bahan-bahan lain (minyak, bahan organik dll.). Air yang digunakan dalam kultur jaringan harus mempunyai standar type II (minimum) yaitu bebas pirogen, gas, dan bahan organik dan mempunyai konduktivitas elektrik kurang dari 1.0 µmho/cm. gambar Metoda yang paling umum untuk pemurnian air standar type II adalah dengan deionosasi yang diikuti dengan satu atau dua destilasi gelas. Deionisasi menghilangkan dari bahan yang bersifat ionik dan proses destilasi menghilangkan molekul-molekul organik, mikroorganisme dan pirogen. Metode-metode lain yang dapat digunakan untuk mendapatkan air murni type II adalah (1) penyaringan dengan cara absorpsi, dengan menggunakan karbon aktif untuk menghilangkan kontaminan organik dan bebas klorine; (2) penyaringan dengan membran, yang menghilangkan bahan-bahan partikulat dan kontaminasi oleh bakteri; dan
(3) reverse osmosis, yang menghilangkan sekitar 99% bakteri, bahan organik dan bahan partikulat. c. Ruang Transfer Teknik kultur jaringan dapat berlangsung dengan sukses apabila dilakukan dibawah kondisi laboratorium yang sangat bersih. Oleh karena itu pemindahan atau transfer biakan dikerjakan dalam ruang transfer steril atau laminar air flow. Laminar air flow yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman adalah tipe horizontal dan dirancang dengan mempunyai ruangan yang bebas dari partikel debu yang halus dan dilengkapi dengan sinar ultra violet (UV) serta unit penyaring udara. Penyaring udara harus mempunyai filter udara dengan efisiensi tinggi atau ”highefficiency particulate air (HEPA filter). HEPA filter harus mempunyai pori sekitar 0.3 µm dengan efisiensi kerja berkisar 99.97 – 99.99%. Semua permukaan ruang kerja dalam laminar harus dirancang dan mempunyai konstruksi sedemikian rupa sehingga debu dan mikroorganisme tidak dapat berakumulasi dan permukaan tempat kerja dapat mudah dibersihkan dan diidisinfeksi. d. Ruang Kultur Semua jenis kultur harus disimpan dalam tempat yang terkontrol baik temperatur, sirkulasi udara, kelmbaban maupun kualitas dan lamanya cahaya. Faktor-faktor lingkungan tersebut akan mempengaruhi proses pertumbuhan dan diferensiasi biakan baik secara langsung maupun tidak langsung. Kultur protoplas, suspensi sel dan kultur anther adalah yang paling sensitif terhadap kondisi lingkungan. Suhu ruang kultur untuk pertumbuhan umumnya berkisar antara 15o – 30oC, dengan fluktuasi kurang dari ±0.5oC; akan tetapi kisaran suhu yang lebih besar mungkin diperlukan untuk tujuan percobaan. Ruang kultur harus mempunyai pencahayaan hingga 10.000 lux. Suhu dan cahaya harus dapat diprogram selama 24 jam. Ventilasi udara harus baik dengan kelembaban berkisar 20-98%. 2. Peralatan dan Bahan Dasar Dalam Laboratorium Kultur Jaringan Peralatan yang diperlukan dari suatu laboratorium umumnya adalah sbb.: 1. Hot plate/magnetic stirrer atau kompor 2. Peralatan gelas (gelas ukur, erlenmeyer) atau stainless steel untuk memanaskan dan melarutkan media 3. Alat sterilisasi dengan tekanan uap (autoclave) 4. pH meter 5. Timbangan (analitical dan bench top loading) 6. Gelas ukur gradual 7. Botol kultur dengan penutupnya 8. Dispenser 9. Alat diseksi (spatula, scalpel (pinset), forcep, gunting) 10. Refrigerator 11. Distiling unit atau water deionizer 12. Oven 13. Microwave 14. Mikroskop 15. Pipet ukur 16. Shaker
17. Laminar air flow 18. Disinfectant 19. Bahan kimia yang diperlukan untuk pembuatan media (Lampiran) 20. Dll. Peralatan gelas yang digunakan di lab kultur jaringan umumnya terbuat dari Pyrex. Erlenmeyer dari berbagai ukuran (50, 125, 250, 500, 1000 atau 2000 ml) digunakan untuk wadah kultur dan pembuatan media. Tabung gelas, cawan petri, botol jam atau bekas selai juga sering digunakan sebagai botol kultur. Peralatan gelas tesebut harus tahan panas selama proses sterilisasi dengan oven atau autoclave. Peralatan gelas lain yang biasanya digunakan adalah gelas piala, gelas ukur, pipet dan labu ukur. 3. Prosedur Dasar Laboratorium Umumnya penggunaan operasional di lab perbanyakan tanaman dengan kultur jaringan dapat dipelajari dengan mudah. Hal yang paling perlu diperhatikan adalah akurasi, kebersihan dan keamanan saat bekerja dengan teknik kultur jaringan. Penimbangan Pada saat pembuatan media, semua bahan yang ditimbang harus dilakukan dengan hati-hati meskipun untuk pembuatan media dalam skala komersial. Setiap penggunaan timbangan atau alat-alat lain harus memperhatikan instruksi dari pabrikannya. Jenis timbangan yang sering digunakan di lab antara lain top-loading balance dan analytical balance yang memungkinkan akurasi penimbangan hingga skala milligram. Beberapa persyaratan yang harus diperhatikan agar diperoleh penimbangan yang akurat adalah (i) timbangan harus ditempatkan pada tempat yang keras, stabil, permukaannya rata yang bebas getaran dan kebocoran, (ii) daerah sekitar penimbangan harus terjaga kebersihannya, (iii) yang terpenting lagi, penimbangan jangan sampai pernah overload, (iv) penimbangan disarankan menggunakan wadah atau alas yang ringan atau kertas daripada menempatkan bahan yang ditimbang secara langsung di atas piring timbangan. Pengukuran cairan/larutan Peralatan gelas yang mempunyai ukuran seperti gelas piala, erlenmeyer dan pipet diperlukan untuk pembuatan media. Gelas ukur kapasitas 10, 25, 100 dan 1000 ml banyak digunakan untuk mengukur volume, tetapi pengukuran yang lebih akurat diperlukan labu ukur dan pipet. Pengukuran larutan dengan menggunakan pipet dan labu ukur hanya akan akurat apabila bagian dasar dari cekungan antara air dan udara berada tepat pada tanda pengukuran. Penggunaan pipet harus dibantu dengan alat penghisap larutan (pipetor). Jangan pernah menggunakan mulut untuk memipet. Jenis-jenis pipetor yang umum digunakan antara lain (i) tipe bola penghisap yang dilengkapi dengan beberapa katup pengontrol, (ii) pipet penghisap yang dioperasikan menggunakan roda kecil pada bagian atas alat penghisap, (iii) alat penghisap dengan bantuan pompa udara secara elektrik. Cairan dihisap kedalam pipet dengan menekan tombol bagian atas dan melepaskan cairan dengan menekan tombol bagian bawah, (iv) pipet mikro, biasanya untuk pengambilan larutan dengan volume yang sangat kecil (mikro liter). Membersihkan peralatan gelas Metoda konvensional pencucian peralatan gelas dilakukan dengan merendam gelas dalam larutan asam kromat yang diikuti pembilasan dengan air kran dan air destilasi. Karena asam kromat dapat menyebabkan korosif, maka cara ini banyak ditinggalkan kecuali untuk peralatan gelas yang terkontaminasi tinggi. Pencucian yang lebih aman adalah dengan air panas (>70oC) + sabun, diikuti dengan pembilasan dengan air panas dan air destilasi.
Peralatan gelas yang telah dicuci, dikeringkan dalam oven pada suhu 150oC dibungkus dengan aluminium foil, kemudian disimpan dalam lemari tertutup. Sterilisasi Bagian yang sangat penting dalam teknik in vitro adalah sterilisasi bahan tanaman dan media dan menjaga kondisi aseptik yang telah dicapai. Bakteri dan jamur adalah dua kontaminan yang paling banyak dijumpai dalam kultur. Spora jamur sangat ringan dan ada disekeliling lingkungan. Apabila spora jamur kontak dengan media kultur dan kondisinya optimal untuk perkecambahan jamur, maka akan terjadi kontaminasi. a. Sterilisasi Ruang Kultur dan Transfer Sterilisasi ruang kultur yang paling baik adalah dilakukan dengan penggunaan sinar ultraviolet (UV). Waktu sterilisasi bervariasi tergantung dari ukuran ruang transfer itu sendiri dan harus dilakukan apabila tidak ada kegiatan dalam ruang tersebut. Radiasi UV sangat berbahaya bagi mata dan kulit. Ruang transfer dapat juga disterilisasi dengan mencuci/mengepel 1-2 kali setiap bulan dengan bahan anti jamur (fungisida) komersial. Ruang kerja dalam laminar flow biasanya sudah dilengkapi dengan lampu UV, sehingga sterilisasinya dilakukan dengan UV dan diikuti dengan membasuh/melap permukaan tempat bekerja dalam laminar dengan alkohol 95% sebelum mulai bekerja. Ruang kultur harus dibersihkan dengan sabun kemudian dilap dengan Na-hypoklorit 2% (merek komersial seperti Sunclin, Bayclin atau pembersih lantai lain yang mengandung disinfektan) atau alkohol 95%. Lantai ruangan dan dinding harus dibesihkan seminggu sekali dengan bahan yang sama. b. Sterilisasi Peralatan Gelas dan Peralatan Lain. Peralatan yang terbuat dari metal, gelas, aluminium foil, dll., dapat disterilsasi dengan cara pengeringan dalam oven pada suhu 130o-170oC selama 2-4 jam. Semua peralatan tersebut harus dibungkus sebelum di oven, tetapi jangan menggunakan kertas karena akan akan terdekomposisi pada suhu 170oC. Sterilisasi dengan menggunakan autoclave tidak dsarankan untuk bahan yang erbuat dari metal karena akan menyebabkan karat. Untuk peralatan diseksi yang akan digunakan pada ruang transfer atau laminar, setelah disterilisasi dalam oven harus direndam dahulu dalam alkohol 96% kemudian dibakar di atas lampu bunsen. Teknik ini disebut sterilisasi pembakaran (flame sterilization). Teknik ini harus dilakukan dengan ekstra hati-hati karena alkohol sangat mudah terbakar. Autoclave adalah metoda sterilisasi dengan menggunakan tekanan uap air. Bahan-bahan atau alat yang dapat disterilisasi dengan cara autoclave ini antara lain kapas penutup tabung, saringan dari nylon, pakaian lab, tutup plastik, peralatan gelas, pipet, air, dan media kultur. Hampir semua mikroba dapat mati bila diautoclave pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15-20 menit. c. Sterilisasi Media Ada dua metoda untuk sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu dengan autoclave dan filter membran. Media kultur, air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan menggunakan wadah yang ditutup dengan kapas, aluminium foil atau plastik. Akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil (heat-labile) harus menggunakan filter. Umumnya media diautoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121oC. Untuk volume larutan per wadah yang sedikit (< 100 ml), waktu yang dibutuhkan adalah 15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit. Tekanan jangan melebhi dari 20 psi
karena dapat mengakibatkan dekomposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolabile. Beberapa senyawa yang tergolong dalam kelompok protein, vitamin, asam amino, ekstrak tanama, hormon dan karbohidrat ada yang bersifat thermolabile yang mungkin akan mengakibatkan dekomposisi bila disterilisasi dengan autoclave, sehingga harus disterilisasi dengan filter. Filter Millipore yang mempunyai porositas ± 0.2 mikron (µm) merupakan salah satu filter yang banyak digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat thermolabile. Peralatan gelas yang akan menampung media yang disterilisasi dengan filter harus sudah disterilisasi dahulu dengan autoclave. Media yang sebagian mengandung komponen thermolabile, dapat dibuat dengan cara: (i) larutan yang mengandung komponen heat-stable disterilisasi dengan autoclave, kemudian didinginkan sampai suhu 50o-60oC pada kondisi steril (biasanya dalam laminar), (ii) pada bagian lain dalam kondisi yang steril, larutan yang mengandung komponen besifat thermolabile disterilisasi dengan filter, (iii) kedua larutan yang sudah disterilisasi dengan metoda yang berbeda tersebut digabungkan dalam kondisi aseptik. d d. Sterilisasi Bahan Tanaman
Mendapatkan bahan tanaman yang steril merupakan hal yang sulit. Meskipun bermacam tindakan pencegahan sudah dilakukan, 95% kultur akan mengalami kontaminasi apabila eksplan tidak didisinfeksi. Organ atau jaringan tanaman harus disterilisasi dengan larutan disinfektan, karena sebagai bahan biologis tidak dapat dilakukan dengan cara pemanasan yang ekstrim.
Tidak ada metoda yang baku untuk sterilisasi eksplan, sehingga waktu perendaman dalam larutan disinfektan merupakan kisaran karena tergantung pada jenis bahan dan tanaman yang akan disterilisasi. Larutan yang digunakan harus yang aman bagi jaringan/eksplan tetapi bersifat dapat membunuh kontaminan baik bakteri maupun jamur. Untuk tanaman berkayu, umbi dll. biasanya sebelum disterilisasi dengan larutan disinfektan harus dibersihkan dahulu dengan sabun dan dibilas dengan air mengalir, tetapi tidak untuk tanaman jenis herbaceous. Semua permukaan eksplan yang disteriliasi harus terendam dalam sterilan, dan setelahnya harus dibilas dengan akuades steril sekurang-kurangnya tiga kali. Menentukan pH larutan pH larutan diukur berdasarkan konsentrasi ion hidrogen dalam larutan. Skala pH mulai dari 0 (sangat asam) hingga 14 (sangat basa) dan skala 7 adalah titik netral. pH dari media kultur umumnya diatur 5.7 ± 0.1 sebelum diautoclave. pH dapat memengaruhi kelarutan ion-ion di dalam media, kemampuan agar untuk menjadi gel dan selanjutnya mempengaruhi pertumbuhan sel-sel. Oleh karena itu akurasi pH media menjadi faktor yang penting untk diperhatikan. Umumnya pengukuran pH media menggunakan pH meter.
KOMPOSISI MEDIA KULTUR JARINGAN TANAMAN
a. Zat Pengatur Tumbuh Zat pengatur tumbuh adalah persenyawaan organik selain dari nutrient yang dalam jumlah yang sedikit ( 1mM) dapat merangsang, menghambat, atau mengubah pola pertumbuhan dan perkembangan tanaman ( Moore, 1979 dalam Gunawan, 1992). Zat pengatur tumbuh (ZPT) dalam kultur jaringan diperlukan untuk mengendalikan dan mengatur pertumbuhan kultur tanaman. Zat ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan, dan organ. Jenis dan konsentrasi ZPT tergantung pada tujuan dan tahap pengkulturan. Secara umum, zat pengatur tumbuh yang digunakan dalam kultur jaringan ada tiga kelompok besar, yaitu auksin, sitokinin, dan giberelin. Auksin digunakan secara luas dalam kultur jaringan untuk merangsang pertumbuhan kalus, akar, suspensi sel dan organ (Gunawan, 1992; 49) Contoh hormon kelompok auksin adalah 2,4 Dikloro Fenoksiasetat ( 2,4-D), Indol Acetid Acid (IAA), Naftalen Acetid Acid (NAA), atau Indol Buterik Asetat (IBA). Golongan sitokinin berperan untuk menstimulus pembelahan sel dan merangsang pertumbuhan tunas pucuk .Menurut Gunawan, 1992; 52 golongan ini sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis. Sitokinin yang biasa digunakan dalam kultur jaringan adalah kinetin, ziatin, benzilaminopurin (BAP). Dan giberelin untuk diferensiasi atau perbanyakan fungsi sel, terutama pembentukan kalus. Hormon kelompok giberelin adalah GA3, GA2, dan GA1. Penggunaan hormon tersebut harus tepat dalam perhitungan dosis pemakaian, karena jika terlalu banyak maupun terlalu sedikit dari dosis yang diperlukan justru akan menghambat bahkan mematikan tanaman kultur. Karena interaksi antar hormon dalam suatu media sangat berpengaruh dalam diferensiasi sel. b. Unsur Hara Makro dan Mikro dalam Media Kultur Jaringan Kebutuhan nutrisi mineral untuk tanaman yang dikulturkan secara in-vitro pada dasarnya sama dengan kebutuhan hara tanaman yang ditumbuhakn di tanah. Unsur-unsur hara yang dibutuhkan tanaman di lapangan merupakan kebutuhan pokok yang harus tersedia dalam media kultur jaringan. Antara lain adalah unsur hara makro dan unsur hara mikro. Unsur-unsue hara tersebut diberikan dalam bentuk garam-garam mineral. Komposisi media dan perkembangannya didasarkan pada pendekatan masing-masing peneliti ( Gunawan, 1992; 44). Unsur hara makro adalah hara yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah yang banyak. Hara makro tersebut meliputi, Nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Kalsium (Ca), Sulfur (S), Magnesium (Mg), dan Besi (Fe). Kegunaan unsur hara makro tersebut dalam kultur jaringan menurut Qosim, 2006;3 dalam Sukarasa, 2007; 21adalah sebagai berikut : Nitrogen (N) diberikan dalam bentuk NH4NO3, NH2PO4, NH2SO4. Berfungsi untuk membentuk protein, lemak, dan berbagai senyawa organik lain, morfogenesis (pertumbuhan akar dan tunas), pertumbuhan dan pembentukan embrio, pembentukan embrio zigotik dan pertumbuhan vegetatif. Fosfor (P), diberikan dalam bentuk KH2PO. Berfugsi untuk metabolisme energi, sebagai stabilitor membran sel, pengaturan metabolisme tanaman, pengaturan produksi pati/ amilum, pembentukan karbohidrat, sangat penting dalam transfer energi, protein, dan sintesis asam amino serta konstribusi terhadap struktur dan asam nukleat.
Kalium (K), diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2. Berfungsi untuk pemanjangan sel tanaman, memperkuat tubuh tanaman, memperlancar metabolisme dan penyerapan makanan, ion kalsium ditransfer secara cepat menyebrangi membran sel dan mengatur pH dan tekanan osmotik di antara sel. Kalsium (Ca), diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O. Berfungsi untuK merangsang bulu-bulu akar, penggandaan atau perbanyakan sel dan akar, pembentukan tabung polen, dinding dan membran sel lebih kuat, tahan terhadap serangan patogen, mengeraskan batang, memproduksi cadangan makanan. Sulfur (S). Berfungsi dalam berbagai reaksi-reaksi reduksi oksidasi. Magnesium (Mg), diberikan dalam bentuk MgSO4.7H2. Berfungsi untuk meningkatkan kandungan fosfat, pembentukan protein. Besi (Fe), diberikan dalam bentuk Fe2(SO4)3;FeSO4.7H2. Berfungsi untuk membantu asilmilasi nitrogen. Unsur hara mikro adalah hara yang dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Unsur hara mikro ini merupakan komponen sel tanaman yang penting dalam proses metabolisme dan proses fisioligi lainnya (Gunawan, 1992; 46). Unsur hara mikro tersebut diantaranya adalah : 1. Klor (Cl), diberikan dalam bentu KI 2. Mangan (Mn), diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O 3. Tembaga (Cu), diberikan dalam bentuk CuSO4.5H2O 4. Kobal (CO), diberikan dalam bentuk CoCl2.6H2O 5. Molibdenun (Mo), diberikan dalam bentuk NaMoO4.2H2O 6. Seng (Zn), diberikan dalam bentuk ZnSO4.4H2O 7. Boron (B), diberikan dalam benruk H3BO3 c. Vitamin dan Bahan Organik Lain Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur jaringan tanaman adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin), pyridoxine (vitamin B6). Thiamine merupakan vitamin yang esensial dalam kultur jaringan tanaman karena thiamine mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan sel. Vitamin C, seperti asam sitrat dan asam askorbat, kadang-kadang digunakan sebagai antioksidan untuk mencegah atau mengurangi pencoklatan atau penghitaman eksplan. Mio-Inositol atau meso-insitol merupakan heksitol (gula alkohol berkarbon 6) sering digunakan sebagai salah satu komponen media yang penting, karena terbukti merangsang pertumbuhan jaringan yang dikulturkan (Yusnita, 2004;58). d. Asam-asam amino Dalam media kultur jaringan, asam amino merupakan sumber nitrogen organik. Namun sumber N organik ini jarang ditambahkan dalam media kultur jaringan, karena sumber sumber nitrogen utamanya sudah tersedia dari NO3- dan NH4+. Asam amino yang sering digunakan adalah glisin, lysin dan threonine. Penambahan glisin dalam media dengan konsentrasi tertentu dapat melengkapi vitamin sebagai sumber bahan organik (Yusnita, 2004; 59) e. Sumber Energi : Karbohidrat Gula digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena umumnya bagian tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai laju fotosintesis yang rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan membutuhkan karbohidart yang cukup sebagai sumber energi. Menurut Gautheret dalam Gunawan, 1992; 56 mendapatkan sukrosa adalah sumber karbohidrat penghasil energi yang terbaik melebihi glukosa, maltosa, rafinosa. Namun jika tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat tersebut dapat digantikan dengan gula pasir. Gula pasir cukup
memenuhi syarat untuk mendukung pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber energi, gula juga berfungsi sebagai tekanan osmotik media (Gunaman; 1992; 56) f. Bahan Pemadat Media Eksplan yang dikulturkan harus selalu bersinggungan atau terkena dengan medianya, tetapi tidak tenggelam sehingga aerasinya baik. Media kultur dapat berbentuk cair maupun padat. Jika media tersbut berbentuk cair, kultur harus selalu digoyangkan. Karena jika tidak digoyang dengan mengunakan shaker, eksplan akan tenggelam seluruhnya, sehingga kondisi anaerobik dapat menyebabkan kematian. Namun jika medianya padat, diperlukan bahan pemadat media (Yusnita, 2004; 60). Bahan pemadat media yang paling banyak digunakan adalah agar-agar. Agar adalah campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Dalam analisa unsur, diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K, dan Na (Debergh, 1982 dalam Gunawan, 1992; 57). Keuntungan dari pemakaian agar-agar adalah : 1. Agar-agar membeku pada suhu 45° C dan mencair pada suhu 100° sehingga dalam kisaran suhu kultur, agar-agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil. 2. Tidak dicerna oleh enzym tanaman 3. Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaa penyusun media. Umumnya agar dapat membentuk gel pada suhu 40 - 45°C dengan titik cair 80 - 100°C. Kekerasan media pada umumnya meningkat secara linier pada pertambahan konsentrasi agaragar. Kekerasan dipengaruhi oleh (Gunawan, 1992; 57) : 1. Jenis agar-agar yang dipakai. Merek agar-agar yang berbeda, memberikan kekerasan yang sedikit berbeda pada berat yang sama. 2. pH media. Selain agar-agar, bahan pemadat media yang semakin banyak disukai adalah Gelrite TM (buatan Kelco). Gelrite adalah gellam gum, suatu hetero-polisakarida yang dihasilkan bakteri Pseudomonas elodea, terdiri dari molekul-molekul K-glukuronat, rhamnosa, dan selobiosa. Sebagai bahan pemadat media gelrite memiliki sifat-sifat yang menguntungkan sebagai berikut : 1. Gelnya lebih jernih 2. Untuk memadatkan media dibutuhkan lebih sedikit daripada agar, sekitar 1,5 -3 g/l. 3. Lebih murni dan konsisten dalam kualitas 4. Untuk mencapai kekerasan gel tertentu, pemakaian gelrite lebih rendah dari agar-agar, pada umumnya 2gr/l media. Namun kekerasan gel dari gelrite sangat dipengaruhi oleh kehadiran garam-garam seperti NaCl, KCl, MgCl2.6H2O dan CaCl2. Garam NaCl dan KCl menurunkan kekerasan gel, tetapi MgCl2 dan CaCl2 meningkatkan kekerasan gel (Gunawan, 1992; 57 ) Salah satu kelemahan Gelrite adalah cenderung menaikkan kelembaban nisbi (RH) dalam kultur, sehingga sering menyebabkan terjadinya verifikasi. Gelrite jarang digunakan untuk produksi planlet secara komersial terutama di Indonesia karena harganya mahal (Yusnita, 2003; 62). g. Akuades Kultur yang kurang berhasil, kadang-kadang disebabkan oleh pemakaian air yang kurang murni (Wetherel, 1976; 54). Tidak boleh sembarang air dapat digunakan untuk membuat media kultur. Contohnya air sumur atau air ledeng, dalam air tersebut mengandung banyak kontaminan, bahan inorganik, organik, atau mikroorganisme. Air yang digunakan untuk membuat media harus benar-benar berkualitas tinggi, karena air maliputi lebih adari 95% komponen media. Terhambatnya pertumbuhan tanaman yang dikulturkan dapat disebabkan oleh rendahnya kualitas air yang digunakan. Untuk menghindari hal tersebut, maka sebaiknya digunakan air yang telah dimurnikan atau yang sering kita sebut air destilata (akuades) atau air destilata ganda
(akuabides). Dengan alasan ini, sebaiknya sebuah laboratorium kultur jaringan layaknya mempunyai alat penyulingan air (water destilator ) atau setidaknya alat pembuat air bebas ion (deionizer). Cara kerja destilator dalam menghasilkan air destilata adalah dengan cara mengubah air menjadi uap air, kemudian mengkondensasikan uap air tersebut. Maka, jadilah air destilata yang tidak lagi berisi mineral atau senyawa organik (Yusnita, 2004; 57). h. pH Media Keasaman (pH) adalah nilai yang menyatakan derajat keasaman atau kebasaan larutan dalam air. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0 – 6,0 (Daisy, 1994; 68). Faktor pH dalam media juga perlu mendapat perhatian khusus. pH tesebut harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan beberapa fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor : 1. Kelarutan dari garam-garam penyusun media 2. Pengambilan ( uptake ) dari zat pengatur tumbuh dan garam – garam lain 3. Efisiensi pembekuan agar-agar. Menurut Gamborg dan Shyluk, 1981 dalam Gunawan, 1992; 58, sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,5 – 5,8. Pengaturan pH, biasa dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCL pada waktu semua komponen sudah dicampurkan (Gunawan, 1992; 58). Pustaka Gunawan, L.W. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Hendaryono, D.P.S dan A. Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Jogyakarta. Wetherell, D.F. 1982. Pengantar Propagasi Tanaman Secara In Vitro. Avery Publishing Group INC. Wayne, New Jersey. Yusnita. 2004. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien. Agromedia Pustaka. Jakarta
Macam dan Jenis Media Kultur Jaringan Tumbuhan Tohir Artikel 0
Kultur tanaman padi.Kepik Hitam Menjadi Hama Tanaman Padi Yang Menjengkelkan Macam dan Jenis Media Kultur Jaringan Tumbuhan – Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, macam-macam media kultur jaringan telah ditemukan sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama media tumbuh untuk eksplan ini biasanya sesuai dengan nama penemunya. Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hampir sama, hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk tiap-tiap persenyawaan.
Media yang digunakan biasanya berupa garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu diperlukan juga bahan tambahan seperti agar-agar, gula, arang aktif, bahan organik dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenis maupun jumlahnya. Medium yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Medium yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf agar tidak terjadi kontaminasi dari bakteri maupun cendawan. Komposisi media yang digunakan dalam kultur jaringan dapat berbeda jenis dan konsentrasinya. Perbedaan komposisi media dapat mengakibatkan perbedaan pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang ditumbuhkan secara invitro. Formulasi media kultur jaringan pertama kali dibuat berdasarkan komposisi larutan yang digunakan untuk hidroponik, khususnya komposisi unsur-unsur makronya. Unsur-unsur hara diberikan dalam bentuk garam-garam anorganik. Koposisis media dan perkembangan formulasinya didasarkan pada jenis jaringan, organ dan tanaman yang digunakan serta pendekatan dari masing-masing peneliti. Beberapa jenis sensitif terhadap konsentrasi senyawa makro tinggi atau membutuhkan zat pengatur tertentu untuk pertumbuhannya. Pada periode tahun 1930an, formulasi media terutama ditujukan untuk menumbuhkan akar, tuber dan kambium. Media untuk penumbuhan akar yang dikembangkan oleh White 1934, pertama White menggunakan media yang berisi garam anorganik, yeast ekstrak dan sucrose, tetapi kemudian yeast ekstrak digantikan dengan 3 macam vitamin B, yaitu pyridoxine, thiamine dan nicotinic acid. (Pertama) Media Knop Dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan
penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA (Dodds and Roberts). (Kedua) Media White Dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang. (Ketiga) Media Knudson dan media Vacin and Went Media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm. Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Pertumbuhan sel dari jaringan suatu organ dibandingkan dengan jaringan tumor tanaman Venca rosea (Catharanthus roseus), menunjukkan bahwa penambahan ammonium ke dalam media White yang sudah dimodifikasi, mempunyai pertumbuhan yang lebih baik. Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan H2PO4- yang diperoleh, hampir sama dengan yang dikembangkan oleh Miller. (Keempat) Media Murashige & Skoog (media MS) Merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media : Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 19 88) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther.
Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan 1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra. Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan, maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983). Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap. (Kelima) Media Gamborg B5 (media B5) Pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang diberikan setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM, sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et al, 1968). (Keenam) Media Schenk & Hildebrant (media SH) Merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil. Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume. (Ketujuh) Media WPM (Woody Plant Medium) Yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon. (Kedelapan) Media N6 Media N6 mempunyai ciri perbandingan NH₄⁺ dan NO₃⁻ yang jauh perbandinganya. Amonium yang diberikan dalam bentuk (NH₄)SO₄ hanya sebanyak 363 mg/l, sedangkan KNO₃ 2830 mg/l.
Pada umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan. Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar pada umumnya diambil dari nama penemunya atau peneliti yang menggunakan pertama kali dalam kultur khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting artinya. Berikut beberapa media dasar yang banyak digunakan : Media dasar Murhasige dan skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hampir semua jenis kultur, terutama pada tanaman herbaceous. Media dasar B5 untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume lain. Media dasar White (1934) yang sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat. Media dasar Vacin dan Went yang biasa digunakan untuk kultur jaringan anggrek. Media dasar Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan dalam kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel. Media dasar schenk dan Hildebrandt (1972) atau media SH yang cocok untuk kultur jaringan tanaman-tanaman monokotil. Medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant Medium (WPM) Media N6 untuk serealia terutama padi.
Regenerasi Tanaman secara In Vitro dan Faktor-Faktor Yang Mempenaruhi 20/09/2012 Saptowo J Pardal 0 Comments eksplan, in vitro, kultur jaringan
Kultur jaringan atau dikenal dengan kultur in vitro merupakan teknik memisahkan bagian dari tanaman seperti tunas terminal, tunas aksilar, daun, batang atau embrio serta menumbuhkannya di dalam media buatan dalam kondisi aseptik sehingga membentuk tanaman lengkap. Hal ini didasari oleh adanya daya totipotensi sel. Terbentuknya tanaman lengkap dari eksplan potongan bagian tanaman dipengaruhi oleh banyak faktor antara lain: kondisi fisiologi eksplan, genotipe eksplan, media dasar, zat pengatur tumbuh serta lingkungan kultur seperti pencahayaan maupun kelembaban dan suhu ruangan. Eksplan dari jaringan muda dengan titik tumbuh mempunyai peluang membentuk tanaman lengkap lebih besar dibandingkan dari jaringan tua, karena jaringan muda bersifat meristematis dan aktif membelah, pada lingkungan tumbuh yang cocok akan terjadi proliferasi dan organogenesis. Tanaman herba pada umumnya lebih mudah diregenerasikan dibandingkan tanaman berkayu atau tanaman tahunan seperti pada tanaman cengkeh, pala, melinjo dll. Namun demikian pada tanaman berkayu tertentu seperti jati, cendana dan sukun tidak sulit diperbanyak secara in vitro , hal ini menunjukkan bahwa faktor genetik juga menentukan kemampuan regenerasi tunas. Media dasar yang biasa digunakan dalam kultur in vitro antara lain B5 (Gamborg), MS (Murashige dan Skoog), Vacin and Went, N6 dll, masing-masing media dasar mengandung unsur hara makro dan mikro serta kandungan vitamin berbeda, sehingga masing-masing tanaman memberikan respon berbeda namun demikian sebagian besar tanaman memberikan respon yang optimal apabila dibiakkan pada media dasar MS. Zat pengatur tumbuh yang kita kenal merupakan ekspresi dari gen, produk yang dihasilkan oleh tanaman, di dalam sel/jaringan disebut dengan zat pengatur tumbuh (ZPT) endogen. ZPT sintetis seperti Benzyl Adenin, thidiazuron, IBA dll, dibuat untuk memacu
pertumbuhan tanaman baik pada tanaman budidaya maupun tanaman yang diinduksi dalam kultur in vitro. Di dalam kultur in vitro untuk memacu proliferasi sel atau kumpulan sel agar terjadi dediferensiasi dan organogenesis menggunakan ZPT dalam konsentrasi sangat rendah. Tidak semua sel di dalam jaringan tanaman memberikan respon terhadap ZPT yang diberikan, suatu sel hanya memberikan respon pada stadia tertentu dalam siklus pertumbuhan tanaman. Dengan demikian selain genotipe tanaman, kondisi fisiologi eksplan seperti kemampuan meristematis, juga stadia pertumbuhan dari sel atau jaringan juga sangat menentukan keberhasilan regenerasi tunas. Hal ini terkait dengan metabolisme sel, ketersediaan zpt endogen serta aktifitas gen-gen yang mengendalikan proses pertumbuhan dan perkembangan. Bagian tanaman yang aktif memproduksi ZPT endogen antara lain di bagian meristem batang, akar atau jaringan muda. Zat pengatur tumbuh tanaman berperan penting dalam mengontrol proses-proses biologi dalam jaringan tanaman (Gaba, 2005). Perannya antara lain mengatur kecepatan pertumbuhan dari masing-masing jaringan dan mengintegrasikan bagian-bagian tersebut guna menghasilkan bentuk yang kita kenal sebagai tanaman. Aktivitas zat pengatur tumbuh di dalam pertumbuhan tergantung dari jenis, struktur kimia, konsentrasi, genotipe tanaman serta fase fisiologi tanaman. Dalam proses pembentukan organ seperti tunas atau akar ada interaksi antara zat pengatur tumbuh eksogen yang ditambahkan ke dalam media dengan zat pengatur tumbuh endogen yang diproduksi oleh jaringan tanaman (Gunawan, 1987). Penambahan auksin atau sitokinin ke dalam media kultur dapat meningkatkan konsentrasi zat pengatur tumbuh endogen di dalam sel, sehingga menjadi “faktor pemicu” dalam proses tumbuh dan perkembangan jaringan. Penggunaan zat pengatur tumbuh di dalam kultur jaringan tergantung pada tujuan atau arah pertumbuhan tanaman yang diinginkan. Zat pengatur tumbuh BA (Benzyl Adenin) paling banyak digunakan untuk memacu penggandaan tunas karena mempunyai aktivitas yang kuat dibanding kinetin (Zaer dan Mapes, l982). BA mempunyai struktur dasar yang sama dengan kinetin tetapi lebih efektif karena BA mempunyai gugus benzil (George dan Sherington, l984). Flick et al., 1993 menyatakan bahwa pada umumnya tanaman memiliki respon yang lebih baik terhadap BA dibandingkan terhadap kinetin dan 2-iP sehingga BA lebih efektif untuk produksi tunas in vitro . Zat pengatur tumbuh 2-iP merupakan sitokinin yang mempunyai daya aktivitas lebih lemah dibanding sitokinin lainnya sehingga jarang digunakan. Sebagai contoh, pada kultur tanaman nilam penggunaan 2-iP menghasilkan tunas yang lemah dan kurus (Seswita et al., 1996). Pembentukan tunas dapat dipacu dengan memanipulasi dosis auksin dan sitokinin eksogen. Kombinasi antara sitokinin dengan auksin dapat memacu morfogenesis dalam pembentukan tunas (Flick et al., 1993). Zat pengatur tumbuh 2,4-D berperan sebagai inisiasi kalus, dengan adanya BA maka pembentukan tunas adventif menjadi lebih aktif (Flick et al., 1993). Penambahan jenis zat pengatur tumbuh yang berbeda dari golongan yang sama seperti kinetin, zeatin dan 2-iP ke dalam media yang sudah mengandung Benzyl adenin (BA) kadang dibutuhkan untuk memacu morfogenesis agar lebih optimal (Gaba, 2005). Di samping sitokinin BA atau kinetin, penggunaan thidiazuron (TDZ) dapat pula meningkatkan kemampuan multiplikasi tunas. Thidiazuron merupakan senyawa organik yang banyak digunakan dalam
perbanyakan in vitro karena aktivitasnya menyerupai sitokinin (Singha and Bathia, l988).Thidiazuron berpotensi memacu frekuensi regenerasi pada kacang tanah ( Arachis hipogaea) secara in vitro , dan memacu pembentukan tunas adventif pada beberapa jenis tumbuhan (Huetterman dan Prece, 1993) karena dapat menginduksi proses pembelahan sel secara cepat pada kumpulan sel meristem sehingga terbentuk primordia tunas (George dan Sherington, 1994). Kombinasi BA dengan thidiazuron untuk meningkatkan kemampuan proliferasi tunas antara lain pada tanaman Pyrus communis (Singha dan Bhatia, 1988), tunas apel (Van Niew Kerk et al., 1986), Sukun (Supriati et al., 2005). Thidiazuron dalam konsentrasi rendah 1µM lebih efektif dalam pembentukan tunas adventif (Sankhla et al., 1996). Tidak semua tanaman memberikan respon proliferasi tunas yang optimal dengan adanya thidiazuron, contohnya pada tanaman belimbing Dewi tidak diperoleh adanya peningkatan jumlah tunas. Thidiazuron yang ditambahkan cenderung meningkatkan tinggi tunas dan jumlah daun. Komposisi media terbaik untuk multiplikasi tunas pada belimbing Dewi adalah media MS + zeatin 2 mg/l + IAA 0,5 mg/l (Supriati et al., 2006). Contoh lain tanaman yang memberikan respon lebih baik bila ditumbuhkan pada media dengan penambahan tidiazuron antara lain pada tanaman Kencur (Lestari dan Hutami, 2005), thidiazuron 0,1 mg/l yang ditambahkan pada media MS + BA 1, 3 dan 5 mg/l, mampu meningkatkan kemampuan multiplikasi tunas, demikian pula pada tanaman pisang. Penggunaan sitokinin dan auksin dalam satu media dapat memacu proliferasi tunas karena ada pengaruh sinergisme antara zat pengatur tumbuh tersebut (Thorpe, 1987; Davies, 1995). Contohnya pada tanaman obat langka Pulasari ( Alyxia stellata ) kombinasi BA dan NAA menghasilkan tunas lebih banyak (Lestari dan Mariska 1994), tanaman krisan menggunakan kombinasi BA 1 mg/l + GA mg/l diperoleh faktor multiplikasi tunas tertinggi (Karim et al., 2003), dan tanaman Tangguh menggunakan kinetin 3 mg/l + IAA 10 mg/l (Lestari et al., 1999). Pembentukan tunas dari kalus padi indica dipengaruhi oleh faktor genetik, sehingga formulasi media untuk masing-masing varietas tidak sama. Alam et al ., (1998) menggunakan media MS + kinetin 2 mg/l + NAA 0,1 mg/l untuk padi indica kultivar Vaidehi. Purnamaningsih (2003) menggunakan media MS + BA 5 mg/l + IAA 0,8 mg/l untuk pembentukan tunas dari kalus padi var Rojolele (Javanica), pada padi var Bengawan Solo dan Cisadane menggunakan media MS +BA 3 mg/l + IAA 0,1 m/l + zeatin 0,1 mg/l. Lestari dan Yunita (2008) mendapatkan formulasi media untuk regenerasi kalus padi varietas Fatmawati yaitu MS + BA 2 mg/l + IAA 0,8 mg/l + zeatin 0,2 mg/l. Pada tanaman Pule Pandak (Rauwolvia serpentina ), pembentukan tunas dari eksplan kalus dapat diperoleh menggunakan media MS + BA 1 mg/l + zeatin 0,5 mg/l + maltosa 3 % (Yunita dan Lestari, 2008). Pembentukan embrio somatik Tahapan dalam proses embriogenesis somatik meliputi tahap induksi kalus embriogenik, pendewasaan, perkecambahan, pembentukan kotiledon dan bibit somatik. Konsentrasi zat pengatur tumbuh yang dibutuhkan tergantung pada tahap dalam perkembangan pembentukan embrio somatik. Pada tiap tahapan membutuhkan kombinasi auksin dan sitokinin yang berbeda. Pada tanaman Cendana menggunakan media MS + 3,44 µM IBA + 0,44 µM BA (Alam et al., 1998) pada tanaman Pepaya untuk induksi kalus embriogenik adalah media MS + 2,4-D 20 mg/l dan untuk memproduksi embrio somatik dan bibit somatik 3
adalah media MS + BA 0,4 mg/l + kinetin 0,1 mg/l (Hutami et al., 2001). Pada tahap pembentukan embrio fase Globular dan Hati sering digunakan zat pengatur tumbuh sitokinin seperti benzyladenin (BA) atau yang mempunyai peran fisiologis yang sama yaitu thidiazuron (Husni et al., l997) atau 2,4-D dan NAA apabila embrio somatik melalui fase kalus. Pada tahap pendewasaan, konsentrasi sitokinin diturunkan dan untuk tahap perkecambahan sering ditambahkan Giberelin (GA ) (Mariska et al., 2001). Pembentukan embrio somatik pada tanaman Cendana dari eksplan embrio somatik dewasa menggunakan media MS + BA 1 mg/l, sedangkan dari eksplan embrio somatik muda menggunakan media MS + BA 2 mg/l. Perkecambahan embrio somatik membentuk tunas menggunakan media MS ½ + GA 5 mg/l (Sukmadjaja, 2005). Induksi Kalus Zat pengatur tumbuh untuk induksi kalus antara lain: 2.4-D, pikloram, dicamba, NAA dll. Hormon 2.4-D paling banyak digunakan karena aktivitasnya paling kuat. Kalus yang dapat diregenerasikan biasanya mempunyai struktur remah atau friabel, bentuknya seperti bulatan –bulatan berwarna putih atau kekuningan agak mengkilat. Kalus dengan struktur tersebut sering disebut dengan kalus embrionik (embriogenik). Kalus yang lembek banyak mengandung air, warna putih pucat atau kecoklatan biasanya agak sulit diregenerasikan. Kalus ini tergolong jenis non embrionik. Induksi Tunas Adventif Tunas yang dihasilkan bukan berasal dari titik tumbuh aksilar atau terminal tetapi berasal dari jaringan tanaman seperti daun, petiole, tangkai bunga dll atau melalui tahap pembentukan kalus disebut dengan tunas adventif . Kemampuan kalus beregenerasi membentuk tunas selain dipengaruhi oleh zat pengatur tumbuh dan media tumbuh, dipengaruhi pula oleh ukuran atau umur kalus. Kalus yang baru terbentuk dengan ukuran berkisar antara 25 mm dan umur kurang dari 4 minggu, mempunyai peluang lebih besar untuk diregenerasikan menjadi tunas dibandingkan yang sudah disubkultur beberapa kali. Kalus yang masih muda, daya mersitematis, kandungan zat pengatur tumbuh dan asam amino seperti prolin atau senyawa lain seperti spermin atau spermidin masih tinggi. Berikut contoh beberapa tanaman serta komposisi media untuk induksi kalus dan tunas Tabel 1. Komposisi media untuk induksi kalus dan tunas 3
3
Media induksi kalus Eksplan
Tanaman
Media induksi tunas
Daun dewa (Gynura procumbens)
2,4-D 0,1 mg/l + BA 0,1 mg/l + kinetin 2 mg/l
MS tanpa ZPT
Embrio sigotik
Padi
2,4-D 3 mg/l + Casein hidrolisat 3 g/l
BA 3 mg/l + IAA 0,1 mg/l
Kalus
Solanum
Kalus
Padi indica
2,4-D 3 mg/l CH 3 g/l
MS + kinetin 2 mg/l + NAA 0,1
Kalus
Padi Rojo Lele,
2,4-D 3 mg/l CH 3 g/l
MS + BA 5 mg/l + IAA 0,8 mg/l
Daun
zeatin 2 mg/l + IAA 0,1 mg/l.
