APROVECHAMIENTO DE SUERO LÁCTEO COMO FUENTE PARA LA PRODUCCIÓN DE UN BIOPOLÍMERO BASADO EN ÁCIDO POLILÁCTICO
Trabajo Especial de Grado presentado ante la Ilustre Universidad de Carabobo, para optar al tí tulo tulo de Ingeniero Quí mico mico
Tutor Académico:
Autor:
Prof. MSc. Jhonny Medina
Rosales Bonilla, Anny Rosmar C.I: 19.479.072
Valencia, 27 de Junio de 2017
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AGRADECIMIENTOS A Dios y a mi abuela Julia Bonilla Que desde el cielo observaron cada etapa realizada para la culminación de este proyecto y me dieron la fuerza necesaria para seguir adelante, por iluminarme en el camino y dotarme de fe para entender que toda meta propuesta puede ser alcanzada con trabajo constante. Abuelita hermosa, desde el cielo ya puedes reafirmar que soy tu nieta ingeniero.
A mis Padres, hermanos y familia en general Mis padres ante todo por sus consejos y apoyo incondicional, porque sin ustedes no hubiese sido posible alcanzar esta meta, siempre les estaré en deuda. d euda. Este logro también es de ustedes. A mis hermanos por el apoyo brindado día a día en el transcurso de cada año de la carrera universitaria. Tías y primos por siempre estar al pendiente.
A mi tutor académico y a las personas que influyeron en el desarrollo de la tesis Prof. Jhonny Medina por sus consejos, paciencia y direccionamientos. También agradezco la recepción y el apoyo recibido por todo el personal del Centro de Investigaciones Químicas en especial los técnicos Carlos Osal y Jhonny González; a Herminia Arvelo técnico del Laboratorio de Química General y al profesor Vicenzo por su disponibilidad en el Laboratorio de Biotecnología de Facyt.
A mis amigos y personas especiales. Ledyamil García y Alfredo Arnao dos angelitos en mi vida y un gran ejemplo a seguir, me enseñaron que la verdadera amistad existe aún en la distancia; ustedes junto a José García, Daniel Villena, Luis Olarte, Rolando Araujo, José Noriega y Samuel Marseille, pertenecen al grupo de personas especiales que de forma desinteresada siguieron al pendiente del avance de este proyecto, siempre ofreciendo su apoyo. apo yo. Fueron de gran motivación. A mis amigos y compañeros de la etapa universitaria en especial a Cristian Karmelo Domingo Siverio Fouco y Carlos Rebolledo por su amistad incondicional y haber hecho de este tiempo de estudio un trayecto de vivencias agradables.
A to todos us usttedes, gra gr aci as. iii
DEDICATORIA A Dios. Ante todas las cosas, porque sin ÉL nada es posible. He llegado a este punto de mi vida gracias a él, por darme la vida, los padres que tengo y permitirme ser la persona que soy hoy en día.
A mis Padres. Naileth Bonilla y Aníbal Rosales, sin duda alguna merecen esta dedicatoria por su amor, paciencia, confianza y apoyo. Los mejores padres del mundo, por enseñarme desde pequeña valores y principios; y por sobre todas las cosas, a luchar y nunca darse por vencido en las metas propuestas. Y a todas aquellas personas que desinteresadamente me apoyaron en la vida y en mi carrera profesional.
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APROVECHAMIENTO DEL SUERO LÁCTEO COMO FUENTE PARA LA PRODUCCIÓN DE UN BIOPOLÍMERO BASADO EN ÁCIDO POLILÁCTICO Autor: Rosales Anny Tutor: Jhonny Medina Junio 2017 RESUMEN El lactosuero es un subproducto del proceso de fabricación de queso, el cual no es aprovechado adecuadamente en nuestro país. Este subproducto puede ser empleado como fuente natural para la obtención de Ácido Láctico (AL). Es por ello que, en este Trabajo Especial de Grado, se planteó como objetivo general, el aprovechamiento del suero lácteo como fuente de la producción de un biopolímero basado en Ácido Poli-Láctico (PLA). Para esto se llevó a cabo una serie de actividades que permitieron determinar las características fisicoquímicas de los sueros recolectados y de esta forma determinar cuál de ellos representaba la mejor opción a utilizar como sustrato. Además se eligió el mejor microorganismo a utilizar durante el proceso de fermentación del suero para la producción de AL. Se establecieron las condiciones para la policondensación en presencia de zinc del AL purificado y se llevó a cabo la caracterización del polímero obtenido. Las pruebas realizadas permitieron clasificar a los sueros recolectados como tipo ácido. La fermentación se realizó por carga durante 24 horas utilizando la bacteria
Lactobacillus casei a una temperatura de (37±1) °C. El rendimiento obtenido en la producción de AL fue de 51%. La purificación del ácido se realizó mediante el método de separación líquido-líquido con 1 butanol. La concentración del AL purificado fue del 20,21%p/v. El proceso de policondensación se logró en 8 horas. Se obtuvo un polímero con punto de fusión de 173°C, densidad 1,3 g/mL y dureza de 62 Shore A. El producto obtenido también fue caracterizado por espectroscopia infrarroja donde se observaron bandas características del ácido poliláctico y se realizó un estudio de degradabilidad por hidrólisis, apreciándose una pérdida de peso del 4,13% en las muestras analizadas después de 15 días. Los resultados obtenidos demostraron que el lactosuero representa un sustrato para la producción de PLA y que el polímero obtenido es degradable.
Palabras claves: suero lácteo, ácido poliláctico, fermentación, Lactobacillus casei. v
USE WHEY AS A SOURCE FOR PRODUCING A BIOPOLYMER BASED ON POLYLACTIC ACID Author: Rosales Anny Tutor: Jhonny Medina June 2017 ABSTRACT The whey is a by-product of chess making process, which is not adequately exploited in Venezuela. This by-product can be used as a natural source for the production of lactic acid (LA). For this reason that in this research, the general objective was to use the whey as a source of the production of a biopolymer base on Poly-Lactic Acid (PLA). Then, a series of activities were carried out to determine the physicochemical characteristics of the collected whey and thus to determine which of them represented the best option to be used as a substrate. In addition, the best microorganism to be used during the fermentation process of the whey for the production of LA was chosen. The conditions for the polycondensation of the purified LA were established and the characterization of the obtained polymer was carried out. The tests made it possible to classify the whey collected as acid type whey. Fermentation was performed for 24 hours using the bacterium Lactobacillus casei at a temperature of (37±1) °C. The yield obtained in the production of LA was 51%. Purification of the acid was performed by the liquid-liquid separation method with 1 buthanol. The concentration of the purified lactic acid was 20,21 %p/v. The polycondensation process was achieved in 8 hours. It was obtained a polymer having a melting point of 173°C, density 1,3g/mL and a hardness of 62 Shore A. The product obtained was also characterized by infrared spectroscopy where observed bands of polylactic acid and degradability study was carried out by hydrolysis, reaching a loss of weight of 4,13% in the analyzed samples after 15 days. The results obtained showed that the whey represents a suitable substrate for the production of PLA and that the obtained polymer is degradable.
Keywords: polylactic acid, fermentation, Lactobacillus casei.
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ÍNDICE GENERAL Introducción……………………………………………………………………………………………..
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Capítulo I. Planteamiento del problema………………………………………………………………...
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1.1. Descripción del problema…………………………………………………………………………..
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1.2. Formulación del problema………………………………………………………………………….
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1.2.1. Situación actual………………………………………………………………………………..
3
1.2.2. Situación deseada ……………………………………………………………………………...
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1.3. Objetivos……………………………………………………………………………………………
4
1.3.1. Objetivo General……………………………………………………………………………….
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1.3.2. Objetivos Específicos…………………………………………………………………………..
4
1.4. Justificación………………………………………………………………………………………..
4
Capítulo II. Marco referencial…………………………………………………………………………..
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2.1. Antecedentes……………………………………………………………........................................
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2.2. Bases teóricas………………………………………………………………………………………
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2.2.1. Definición y t ipos de lactosuero………………………………………………………………..
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2.2.2. Lactosa………………………………………………………………………………………….
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2.2.3. Ácido láctico …………………………………………………………………………………...
9
2.2.4. Microorganismos productores de ácido láctico………………………………………...............
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2.2.5. Fermentación……………………………………………………………...................................
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2.2.6. Separación y purificación del ácido láctico…………………………………………………….
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2.2.7. Polímeros……………………………………………………………………………………….
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2.2.8. Propiedades de los polímeros…………………………………………………………………..
16
2.2.9. Ácido Poliláctico (PLA )……………………………………………………………………….
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2.2.10. Degradación……………………………………………………………………………………. 20 Capítulo III. Marco metodológico………………………………………………………………………
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3.1. Tipo de investigación……………………………………………………………………................
22
3.2. Fases metodológicas……………………………………………………………………………….
22
3.2.1. Actividades iníciales…………………………………………………………………..............
22
3.2.2. Determinación de características fisicoquímicas del suero lácteo……………………………..
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3.2.3. Aplicación del proceso de purificación del ácido obtenido……………………………………
22
3.2.4. Síntesis del PLA…….……...…………………………………………………………………..
22
3.2.5. Evaluación del polímero sintetizado…………………………………………………..............
22
3.2.6. Actividades finales……………………………………………………………………………..
22
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3.3. Operacionalización de los objetivos…………….…………………………………………...……..
22
3.3.1. Determinar las características fisi coquímicas del suero lácteo………………………………...
22
3.3.2. Realizar la fermentación láctica con el microorganismo más adecuado……………………….
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3.3.3. Emplear la alternativa más conveniente para el proceso de purificación del ácido láctico obtenido de la fermentación del suero lácteo…………………………………………………………...
30
3.3.4. Sintetizar el polímero con el ácido láctico obtenido en el proceso de purificación…….......
34
3.3.5. Evaluar propiedades del polímero obtenido y su capacidad de degradación………………….
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Capítulo IV. Resultados y discusión……………………………………………………………………
40
4.1. Determinar las características fisicoquímicas del suero lácteo…………………………………… .
40
4.2. Realizar la fermentación láctica con el microorganismo más adecuado…………………………..
42
4.3. Emplear la alternativa más conveniente para el proceso de purificación del ácido láctico obtenido de la fermentación del suero lácteo…………………………………………………………............
45
4.4. Sintetizar el polímero con el ácido láctico obtenido en el proceso de purificación………………..
50
4.5. Evaluar propiedades del polímero obtenido y su capacidad de degradación ………………………
51
Conclusiones…………………………………………………………………………………...............
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Recomendaciones………………………………………………………………....................... ..............
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Referencias bibliográfica………………………………………………………………………………..
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Apéndice A. Datos recolectados………………………………………………………………………... 61 Apéndice B. Cálculos típicos…………………………………………………………………………...
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Anexo I. Información para la selección del microorganismo fermentador……………………………..
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Anexo II. Información bibliográfica…………………………………………………………………….
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Anexo III. Métodos de purificación…………………………………………………………………….
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ÍNDICE DE TABLAS Tabla 2.1 Composición promedio del lactosuero dulce y ácido………………………………………...
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Tabla 2.2 Propiedades fisicoquímicas del ácido láctico………………………………………………...
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Tabla 2.3 Propiedades del ácido poliláctico y plasticos convencionales……………………………….
17
Tabla 3.1 Escala de valoración para criterios de selección ……………………………………………..
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Tabla 4.1 Características fisicoquímicas de los sueros y cambios producidos a causa del pretratamiento utilizado ……………………………………………………………………………………
40
Tabla 4.2 Matriz de Moody para la selección de la bacteria a utilizar en la fermentación láctica……..
42
Tabla 4.3 Características del medio de cultivo inoculado con la bacteria Lb. casei y cambios producidos a causa de la fermentación …………………………………………………………………
44
Tabla 4.4 Parámetros de la solución fermentada antes y después del proceso de purificación ………...
45
Tabla 4.5 Información sobre el proceso de polimerización…………………………………………….
50
Tabla 4.6 Caracterización del polímero obtenido ………………………………………………………. 51 Tabla 4.7 Variación ocurrida en el proceso de degradación …………………………………………...
52
Tabla A.1 Datos requeridos para la caracterización del suero proveniente de la quesera familiar ……..
61
Tabla A.2 Datos requeridos para la caracterización del suero proveniente de la empresa LACSA ……
61
Tabla A.3 Datos requeridos para la caracterización del suero pre-tratado proveniente de la quesera familiar ………………………………………………………………………………………………….
62
Tabla A.4 Datos requeridos para la caracterización del suero pre-tratado proveniente de la empresa LACSA …………………………………………………………………………………………………
62
Tabla A.5 Datos requeridos para la determinación de parámetros de seguimiento de la fermentación del suero proveniente de la quesera familiar …………………………………………………...……….
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Tabla A.6 Datos requeridos para la determinación de parámetros de seguimiento de la fermentación del suero proveniente de la empresa LACSA…………………………………...……………………… 63 Tabla A.7 Datos tomados después de la fermentación de prueba del suero proveniente de la quesera familiar…………………………………………………………………………………………………..
63
Tabla A.8 Datos tomados después de la fermentación de prueba del suero proveniente de la empresa LACSA………………………………………………………………………………………………….
64
Tabla A.9 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra antes de la adición de carbonato………………………………………………………………………………………………...
64
Tabla A.10 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado mediante el método de lactato……………………………………………………………………………………………………
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64
Tabla A.11 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado de la fase acuosa, obtenida por el método de extracción líquido-líquido………………….. .………..……………………………… 64 Tabla A.12 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado de la fase orgánica, obtenida por el método de extracción líquido-líquido……………………….…………………………. 64 Tabla A.13 Parámetros necesarios para determinar la densidad del ácido purificado………... ..............
65
Tabla A.14 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra diluida de ácido purificado ……...
65
Tabla A.15 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra diluida de ácido pre-concentrado.. 65 Tabla A.16 Parámetros necesarios para el cálculo de la densidad del polímero sintetizado…………… 65 Tabla A.17 Punto de fusión del polímero sintetizado, calculado mediante el Método de Thiele ………
65
Tabla A.18 Acidez iónica de las soluciones antes y después del proceso de degradación……………...
66
Tabla A.19 Peso de las mu estras antes y después del proceso de degradación…………………………
66
Tabla A.20 Valores de Dureza del polímero sintetizado……………………………………………….. 66 Tabla I.1 Información relevante respecto al uso de bacterias u hongos en el proceso fermentativo …… 82 Tabla II.1Productividad de ácido láctico en diferentes condiciones de fermentación tipo lote ……..….
83
Tabla II.2 Información teórica del ácido láctico y ácido poliláctico…………………………………… 83
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ÍNDICE DE FIGURAS Figura 2.1 Molécula de l actosa……….………………………………………………….......................
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Figura 2.2 Estructuras del ácido L-láctico y ácido D- láctico……………………..…………………….
9
Figura 2.3 Molécula de ácido láctico vista desde diferentes perspectivas……………………………...
10
Figura 2.4 Métodos de síntesis para la obtención de PLA……………………………………………...
18
Figura 3.1 Montaje para el proceso de desnatado ……………………………………………………… 23 Figura 3.2 Autoclave y suero con proteínas precipitadas ………………………………………………. 23 Figura 3.3 Suero antes y después del pre-tratamiento ………………………………………………….. 24 Figura 3.4 Equipo utilizado para la determinación de °Brix …………………………………………… 24 Figura 3.5 Coloración del suero antes y después de la titulación ………………………………………. 25 Figura 3.6 Equipo utilizado para la determinación de pH ……………………………………………… 25 Figura 3.7 Muestra calcinada del suero ………………………………………………….......................
26
Figura 3.8 Coloración del suero después de la segunda valoración ……………………………………. 26 Figura 3.9 Solución a esterilizar ………………………………………………………………………... 29 Figura 3.10 Proceso fermentativo con agitación y control de temperatura …………………………….. 29 Figura 3.11 Montaje para el proceso de destilación simple ……………………………………………. 30 Figura 3.12 Montaje para el control de temperatura de calentamiento ………………………………… 31 Figura 3.13 Mezcla suero fermentado con 1-Butanol………………………………………………….. 31 Figura 3.14 Montaje utilizado para evaluar el punto de ebullición de la solución ……………………..
32
Figura 3.15 Disposición de muestra en el refractómetro... ……………………………………………... 33 Figura 3.16 Recipiente para determinar la densidad (picnómetro) …………………………………….. 33 Figura 3.17 Mezcla de ácido y agua -Prueba de miscibilidad ………………………………………….. 34 Figura 3.18 Equipo para obtención de infrarrojos (espectrómetro) …………………………………… 34 Figura 3.19 Montaje usado en la síntesis del ácido poliláctico ………………………………………… 35 Figura 3.20 Probeta con agua y polímero obtenido …………………………………………………….. 36 Figura 3.21 Montaje utilizado para la evaluación del punto de fusión del polímero ……………...……
37
Figura 3.22 Polímero expuesto a la llama……………………………………………………………..
37
Figura 3.23 Equipo para la medición de dureza (durómetro) …………………………………………..
38
Figura 3.24 Exposición de la muestra polimérica al agua de chorro …………………………………… 38 Figura 4.1 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido después del proceso de purificación mediante el método 1- Obtención de lactato (arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial (abajo)…………………………………………………………………………………………………...
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Figura 4.2 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido de la fase acuosa- Método 2: Separación líquido-líquido (arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial (abajo) …………………….. 48 Figura 4.3 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido de la fase orgánica- Método 2: Separación líquido-líquido (arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial (abajo) …………………….
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Figura 4.4 Polímero obtenido en solución ……………………………………………………………… 50 Figura 4.5 Espectro infrarrojo del polímero sintetizado ………………………………………………. 52
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INTRODUCCIÓN El lactosuero es una sustancia de residuo obtenida de la fabricación de queso, después de la precipitación de la caseína en la leche. Por ello esta sustancia se ha constituido en el principal residuo de la industria láctea. Parte de él, es usado para alimentación animal y el resto tratado como un desecho, el cual resulta altamente contaminante debido a su gran demanda biológica y química de oxígeno. Es de resaltar que, este desecho contiene lactosa, azúcar presente en la leche y sustrato que puede utilizarse para el crecimiento de microorganismos capaces de producir ácido láctico (AL). La importancia de la bioconversión del suero lácteo en AL radica en la posibilidad que ofrece el ácido para producir su polímero correspondiente (ácido poliláctico, mejor conocido por sus siglas en inglés como PLA), un polímero biodegradable y gran competidor frente a otros plásticos de origen petroquímico por su amplio rango de propiedades, desde el estado amorfo hasta el estado cristalino. En este trabajo se utilizó el suero lácteo para producir un polímero basado en PLA. Para ello se realizó la caracterización de los sueros utilizados como sustrato para el proceso fermentativo, que busca la obtención de AL. El ácido es purificado mediante el método de separación líquido-líquido con 1-butanol y luego polimerizado mediante policondensación directa utilizando zinc metálico como catalizador. La información contenida en este trabajo sería un valioso aporte para investigaciones posteriores, cuyo interés sea el de disminuir el grado de contaminación ambiental generado por el vertimiento del lactosuero en los suelos y por el uso de plásticos de origen petroquímico. El documento consta de cuatro capítulos, los cuales están estructurados de la siguiente manera: en el capítulo I se presenta el planteamiento del problema, los objetivos planteados y la justificación. El segundo contiene los antecedentes y las bases teóricas necesarias para el desarrollo de la investigación. Por otro lado el tercero señala el tipo de investigación y abarca la metodología necesaria para el cumplimiento de los objetivos planteados; y el último capítulo contiene los resultados obtenidos en la investigación. Además con conclusiones y recomendaciones producto de la investigación, las referencias bibliográficas utilizadas y apéndices con datos experimentales y cálculos típicos.
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CAPÍTULO I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA En esta sección se presenta el problema en estudio, especificándose su propósito, situación actual y deseada, así como el objetivo general y los específicos de la investigación. Por último, se exponen las razones que justifican la investigación y se establecen las limitaciones existentes. 1.1. DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA El alto grado de avance de los niveles de contaminación ambiental debido a desechos en la industria láctea ha incitado la búsqueda de alternativas eficientes y económicas para el aprovechamiento de estos subproductos de desecho nocivos al ambiente (Urribarrí et al ., 2004). El suero de leche es el subproducto más abundante de la industria láctea. Es una sustancia de residuo obtenida en la fabricación de queso. Sus características por si solas no representan una aceptación en el mercado y no se puede comercializar como suero líquido, ya que posee bajo porcentaje de fuentes aprovechables para la alimentación humana como lactosa (3,3-6,0%) y proteínas (0,32-0,70%). La mayor parte del lactosuero se convierte en un efluente con alto grado de contaminación cuando se vierte en el agua, debido a su gran demanda biológica y química de oxígeno (Urribarrí et al ., 2004). La conversión biológica representa un papel importante en el manejo de subproductos industriales provenientes de procesos alimentarios, ya que estos subproductos contienen sustratos aprovechables para la generación de productos con valor agregado. Uno de los principales sustratos que se puede obtener es el ácido láctico (AL), el cual se puede producir a partir de la fermentación del suero lácteo por bacterias lácticas. El proceso puede ser realizado utilizando el proceso de fermentaciones tipo lote (Ríos, 2011). El AL (ácido 2-hidroxi-propanoico) es un ácido orgánico de alto valor, debido a sus diversas aplicaciones en la industria de alimentos, farmacéutica, química, entre otras. Por lo tanto, la producción biotecnológica del AL ha adquirido gran importancia industrial con respecto a la síntesis química, debido a que usa materias primas renovables y es amigable con el ambiente. Además ofrece varias ventajas como el bajo costo de los sustratos, bajas temperaturas de producción y bajo consumo de energía (García et al ., 2010). En este trabajo especial de grado se realizó un estudio de la factibilidad en el aprovechamiento del ácido láctico en la síntesis de un polímero degradable basado en ácido poliláctico (PLA). Este tipo de polímero es apropiado para sustituir a los plásticos convencionales debido al bajo impacto ambiental que producen por su biodegradabilidad. El PLA es un biopolímero termoplástico utilizado para la producción de hilo para sutura, implantes, cápsulas para la liberación lenta de fármacos, prótesis, producción de envases y 2
empaques para alimentos y producción de películas para la protección de cultivos en estados primarios. Este biopolímero ha despertado el interés de investigadores, productores y procesadores, ya que fuera de su degradabilidad, se ha encontrado que puede ser un gran competidor frente a otros plásticos de origen petroquímico por su amplio rango inusual de propiedades, desde el estado amorfo hasta el estado cristalino (Serna et al ., 2003). En Venezuela, aún no se cuenta con centros para la producción de plásticos a base de PLA, con lo que esta investigación generaría un gran aporte para la iniciativa de una nueva alternativa en el mercado de materiales que reduzca el impacto ambiental generado por los desechos lácteos de la industria quesera; y a su vez sirva como fuente para la preservación del ambiente aprovechando la biodegradabilidad del PLA.
1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA El lactosuero es el principal subproducto de la industria quesera. Este se descarta como efluente, con lo cual se crea un problema ambiental grave debido a su elevada demanda bioquímica de oxígeno. Otra forma de contaminación actual es la disposición final de plásticos no degradables. En este trabajo se propone utilizar el suero lácteo para la obtención de PLA, mediante la policondensación de AL. Este polímero biodegradable, es un potencial sustituto de los plásticos derivados de la industria petroquímica y de menor costo.
1.2.1. Situación actual Debido al alto grado de contaminación producido por el suero lácteo en la fabricación de queso, es necesario reducir su impacto ambiental buscando alternativas para su utilización, como es el caso de la síntesis de un biopolímero basado en PLA, el cual se caracteriza por ser biodegradable y presentar bajo costo energético en su fabricación. En Venezuela, pequeños productores utilizan el suero lácteo como complemento para la alimentación de animales de granja, mientras la mayoría de las plantas de leche, no tienen sistemas de tratamiento adecuado para un mejor aprovechamiento; por ello nace la iniciativa de estudiar el aprovechamiento de este desecho.
1.2.2. Situación deseada Se dispone de una alternativa para el aprovechamiento del suero lácteo, la cual se basa en la producción de un polímero degradable a base de PLA, el cual generará menor impacto ambiental en relación a los plásticos más comunes en el mercado. El alcance de esta investigación, permite contar con un material nuevo en el mercado venezolano que amplía el rango de productos de bajo impacto ambiental. 3
1.3. OBJETIVOS 1.3.1. Objetivo General Aprovechar el suero lácteo para su utilización como fuente de producción de un biopolímero basado en ácido poliláctico.
1.3.2. Objetivos Específicos 1. Determinar las características fisicoquímicas del suero lácteo. 2. Realizar la fermentación láctica con el microorganismo más adecuado. 3. Emplear la alternativa más conveniente para el proceso de purificación del ácido láctico obtenido de la fermentación del suero lácteo. 4. Sintetizar el polímero con el ácido láctico obtenido en el proceso de purificación. 5. Evaluar las propiedades del polímero obtenido y su capacidad de degradación.
1.4. JUSTIFICACIÓN Tomando en cuenta el impacto ambiental generado por la producción de suero lácteo, se plantea desarrollar a través de documentación bibliográfica y estudios experimentales este proyecto, con la finalidad de obtener un polímero degradable a partir de este lactosuero, con el fin de contribuir con la disminución de la contaminación causada por el mismo y buscar una forma de aprovechar este desecho, creando un nuevo material en el mercado nacional. En esta investigación se busca obtener ácido láctico del lactosuero mediante fermentación láctea. Este ácido al ser polimerizado forma el PLA, que es el polímero de interés, el cual se consideraría comercializarlo, contribuyendo así al desarrollo económico de la región, mejorando la calidad de vida de los ecosistemas que están siendo afectados por la contaminación de otros polímeros sintéticos y del mismo suero lácteo. Su elaboración no generaría costos mayores a los invertidos en la fabricación de los plásticos comunes en el mercado, ya que se requeriría menor cantidad de energía para su procesamiento y la materia prima no tiene valor comercial alguno, lo que proporciona una ventaja para el desarrollo de este proyecto. Esta alternativa propone un avance en la investigación, debido a que permite ampliar el conocimiento científico, favoreciendo el aprovechamiento de estos residuos para obtener un producto de gran utilidad, aportando también información para la documentación de nuevas tecnologías para la obtención de biopolímeros.
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CAPÍTULO II. MARCO REFERENCIAL En este capítulo, se presentará la información bibliográfica que hace referencia a las investigaciones previas realizadas y se exponen las bases teóricas que sustentan y facilitan la comprensión del estudio. 2.1. ANTECEDENTES Medina, et al ., (2014), elaboraron un trabajo sobre la obtención de ácido láctico por medio de la
fermentación del mosto del fruto de cují ( Prosopis juliflora), y posteriormente realizaron una policondensación con zinc metálico para transformarlo a ácido poliláctico (PLA). El objetivo principal de esta investigación fue la obtención de ácido láctico por fermentación del mosto del fruto de cují y su posterior poli-condensación con zinc metálico a poli (ácido láctico) (PLA). Se determinaron condiciones óptimas de temperatura, pH y °Brix para el crecimiento óptimo de la bacteria Lactobacillus bulgaricus y se concluyó, que el mosto de cují representa un buen sustrato para la producción del PLA por su alto contenido de azúcares fermentables. La principal diferencia de este trabajo con el actual es la materia prima a utilizar, por esta razón la metodología empleada y las condiciones de operación no son necesariamente las mismas. También se diferencian en que el objetivo final del trabajo de referencia, es la obtención del poli (ácido láctico) sin determinar sus propiedades, mientras que en el actual, es de gran interés estudiar las características físicas y mecánicas, así como también su degradabilidad. Nava, P. & Y. Núñez. (2013), trabajaron en la evaluación de un biopolímero obtenido a partir de la
pectina extraída de desechos de cáscara de frutos de parchita (P assiflora edulin) y naranja (Citrus
sinensis). El aporte de interés en este trabajo es que el mismo buscó evaluar polímeros degradables. Para obtener la pectina, se realizó una hidrólisis ácida al albedo de la naranja y la cáscara de la parchita con HCl. Al plástico obtenido, se le realizaron análisis fisicoquímicos de densidad, punto de fusión, prueba la llama, ensayos mecánicos e infrarrojo; al igual que un estudio de biodegrabilidad en suelo y con especies de hongos, con el fin de determinar si este poseía características biodegradables. Los métodos de análisis sirven de referencia para la evaluación de propiedades del polímero obtenido. La diferencia más resaltante en el trabajo de referencia es básicamente la materia prima a utilizar para la obtención del polímero, ya que el anterior utiliza la cáscara de frutos de parchita y naranja, mientras que en el actual se partirá del lactosuero para obtener ácido láctico y polimerizarlo a ácido poliláctico. De igual forma la metodología empleada para la obtención del polímero no corresponde a las realizadas en este trabajo. 5
Jiménez, et al ., (2012), realizaron la síntesis y caracterización de poli (ácido L – láctico) por
policondensación directa, obtenido del fermento de desechos agroindustriales de banano ( Musa
acuminata aaa variedad Cavendish cultivar Gran naine) en Costa Rica. Este trabajo describe la síntesis del poli (ácido L – láctico) por policondensación directa del ácido láctico en tres etapas: en primer lugar una concentración del 14 % al 77 %, una segunda etapa de oligomerización a 150 °C utilizando una presión inicial de 850 mbar, empleando gradiente de vacío de 850 mbar a 25 mbar en 6 horas; y una etapa final de polimerización a 170 °C, empleando octoato de estaño (II) como catalizador a 25 mbar constantes. A pesar de aplicar el mismo método de polimerización, este se realiza bajo diferentes condiciones de operación, es decir, diferentes temperaturas, presiones, tiempos de síntesis y catalizador. Además, el ácido láctico utilizado para el proceso de síntesis del ácido poliláctico, proviene de los desechos agroindustriales de banano y no del suero lácteo. Ríos, A. (2011), realizó la caracterización del proceso de obtención y separación de ácido láctico a
partir de la fermentación de suero lácteo utilizando la tecnología de membranas. En este trabajo se estudiaron las mejores condiciones de crecimiento para Lactobacillus casei, microorganismo necesario para la fermentación del lactosuero. Las fermentaciones para la producción de ácido láctico se realizaron en un proceso tipo lote a diferentes pH y se determinó que las mejores condiciones para el crecimiento de
Lactobacillus casei fueron 50 g/L de sustrato con 1% inóculo. La fermentación realizada a pH 6, logró la mayor productividad. En este trabajo se probaron dos membranas de nano filtración para la separación de ácido láctico. Los resultados de este trabajo sugieren que el suero lácteo es un buen sustrato para, el crecimiento de la bacteria Lactobacillus casei y la producción de ácido láctico. Además, el trabajo también sugiere que la tecnología de nano filtración puede ser usada para concentrar y purificar el ácido láctico. El trabajo realizado se relaciona con el presente estudio ya que ambos buscan obtener ácido láctico a partir del suero lácteo, sin embargo este estudio empleó separación mediante el uso de membranas, mientras que en la investigación actual, se empleó separación por lactato y separación líquido- líquido con 1-butanol. Además, el trabajo anterior solo tiene el interés de caracterizar el proceso de obtención del ácido láctico, mientras que el actual va más allá, buscándole una utilidad al ácido obtenido. Ojeda, J. (2011), desarrolló un trabajo basado en estudios de parámetros fisicoquímicos en los diversos
productos lácteos. Se llevó a cabo la medición de sólidos totales, mediante dos métodos gravimétricos: análisis por estufa (método normalizado) y análisis por microondas (método rápido). También se 6
realizaron ensayos químicos de acidez titulable, viscosidad, °Brix e índice de homogeneidad, los cuales son de utilidad para determinar las características fisicoquímicas del suero lácteo. El estudio de referencia se realizó en una empresa de productos lácteos, específicamente en el Departamento de Aseguramiento de la Calidad; y se fundamentó en el estudio de las propiedades fisicoquímicas de productos lácteos; a diferencia de la presente investigación, que se desarrolló en el Centro de Investigaciones Químicas (CIQ) de la Facultad de Ingeniería de la Universidad de Carabobo, y tuvo como interés estudiar las características fisicoquímicas del lactosuero, el cual es considerado un desecho en la industria láctea. Gil, et al ., (2008), realizaron una bioproducción de ácido láctico a partir de residuos de cáscara de
naranja (Citrus sinensis). Esta investigación propone un proceso para la obtención de ácido láctico a partir de la bio-transformación de cáscara y bagazo de naranja en fase sólida con Rhizopus oryzae. Se evaluó la viabilidad técnica de utilizar operaciones de intercambio iónico como pasos intermedios para la reducción de impurezas. Asimismo, se evaluaron y compararon dos procesos: (a) Esterificación del ácido láctico con 1-butanol y (b) Cristalización evaporativa de sales de sulfato de calcio, como posibles rutas de separación secundaria y concentración. El trabajo de referencia tenía como objetivo principal obtener ácido láctico a partir de residuos de la cáscara de naranja y no presentan una utilidad final para el producto obtenido; mientras que en el trabajo actual, la producción de ácido láctico se realiza utilizando el suero lácteo como materia prima y el ácido obtenido se utiliza para obtener ácido poliláctico. Urribarrí, et al ., (2004), realizaron la obtención de ácido láctico a partir de suero de leche, utilizando
Lactobacillus helveticus en cultivo continuo. Se estudió el cultivo continuo de la bacteria Lactobacillus helveticus en un suero de leche desproteinizado, estudiando las condiciones más adecuadas como pH y temperatura para el crecimiento del microorganismo. Se caracterizó el suero de leche, determinando su contenido de lactosa, nitrógeno, proteínas, fósforo y pH. Su estudio reveló y sugirió el uso potencial del lactosuero como sustrato para bacterias homolácticas. La diferencia más resaltante de este trabajo de investigación es el uso de la bacteria, ya que en el actual trabajo no se escoge la bacteria de forma arbitraria si no que se realiza un estudio para escoger la más apropiada. Este trabajo solo se basa en la obtención del ácido láctico mientras que la actual busca una utilidad del mismo como posible materia para la producción del ácido poliláctico. 7
2.2. BASES TEÓRICAS 2.2.1. Definición y tipos de lactosuero El lactosuero es un líquido claro de color amarillo verdoso, subproducto del procesamiento de leche, obtenido después de la precipitación de la caseína en la elaboración de quesos. Con una producción mundial de 82 millones de Toneladas métricas, se ha constituido en el principal residuo de la industria láctea, donde una parte de éste es usado para alimentación animal y el resto se vierte directamente a las aguas sin un tratamiento previo, generando un problema de contaminación ambiental debido a la materia orgánica constituida por 4,8% de lactosa, 0,75% de proteínas y 6,2% de materia seca (García et al ., 2013). Según las propiedades fisicoquímicas, un lactosuero puede ser clasificado como ácido o dulce. En el primer grupo, se encuentran aquellos que provienen de la fabricación de quesos frescos de pasta blanda, obtenidos a partir de leche de vaca y/o de cabra. En ellos, la lactosa se ha transformado en ácido láctico, siendo ricos en calcio y fósforo. En cambio un lactosuero dulce proviene de la fabricación de quesos de pasta cocida y prensada (vaca) y quesos de ovejas. Es pobre en ácido láctico, calcio y fósforo (Callejas et
al ., 2012). Otra forma de clasificarlo es mediante el método aplicado para la precipitación de la caseína, para separar el coágulo de la leche en la elaboración de queso. El suero dulce, está basado en la coagulación por la renina a pH 6,5; mientras el suero ácido resulta del proceso de fermentación o adición de ácidos orgánicos o minerales para coagular la caseína (Parra, 2009). En la tabla 2.1 se muestra la composición promedio de los distintos tipos de suero.
Tabla 2.1 Composición promedio del lactosuero dulce y ácido Componente
Lactosuero dulce
Lactosuero ácido
Sólidos totales (g/L) Lactosa (g/L) Proteínas (g/L) Calcio (g/L) Lactato (g/L) Ácido Láctico (g/kg) pH (Adim) Cenizas (%p/p)
63-70 46-52 6-10 0,4-0,6 2 0,0-0,3 >5,5 4-6
63-70 44-46 6-8 1,2-1,6 6,4 7-8 <4,8 6-8
Fuente: (Parra, 2009) y (Callejas et al ., 2012)
2.2.2. Lactosa Es el azúcar que se encuentra en la leche, siendo específicamente un disacárido compuesto por 2 moléculas de galactosa y glucosa (monosacáridos) y son fuente principal de energía en la dieta del ser humano, presente en el suero en un 4.99% aproximadamente. La figura 2.1 muestra la forma molecular de la lactosa. 8
Figura 2.1 Molécula de Lactosa Fuente: (Álvarez, 2013)
Ciertos microorganismos, bacterias y levaduras son capaces de fermentar la lactosa produciendo ácido láctico como se muestra en la siguiente reacción: C12H22O11 + H2O
2C6H12O6
4CH3-CHOH-COOH
Muchas veces estas fermentaciones son producidas por bacilos anaerobios, apreciándose un olor desagradable y abundante formación de gas (Álvarez, 2013).
2.2.3. Ácido láctico El ácido láctico (ácido 2-hidroxipropanoico) es un compuesto incoloro de fórmula CH 3CHOHCOOH. Es una de las moléculas ópticamente activas más pequeñas de la naturaleza y se encuentra bajo dos formas: la dextrógira D(-) y levógira L(+), frecuentemente denominadas ácido D-láctico y ácido L-láctico, (Suárez, 2007). En la figura 2.2 se pueden observar los isómeros del ácido láctico.
Figura 2.2 Estructuras del ácido L-láctico y ácido D-láctico Fuente: (Medina et al ., 2014)
El ácido láctico tiene un carbono asimétrico, ver figuras 2.2 y 2.3, lo cual da lugar a actividad óptica. A diferencia del isómero D(-), la configuración L(+) es metabolizada por el organismo humano. Tanto las dos formas ópticamente activas, como la forma racémica, se encuentran en estado líquido, siendo incoloros y solubles en agua. En estado puro son sólidos altamente higroscópicos de punto de fusión bajo, 9
el cual es difícil de determinar debido a la extrema dificultad de producir el ácido de forma anhidra; es por esta razón que se manejan rangos de 18-33°C.
Figura 2.3 Molécula de ácido láctico vista desde diferentes perspectivas Fuente: (Arrellano, 2013)
El punto de ebullición del producto anhidro está entre 125-140°C. Ambas formas isoméricas del ácido láctico, así como la mezcla racémica, pueden ser polimerizadas y se pueden producir polímeros con diferentes propiedades dependiendo de la composición (Arrellano, 2013). Las propiedades fisicoquímicas del ácido láctico se muestran en la tabla 2.2.
Tabla 2.2 Propiedades fisicoquímicas del ácido láctico Fórmula Peso molecular Índice de refracción Punto de fusión Punto de ebullición Gravedad específica Calor de combustión Viscosidad Densidad Constante dieléctrica
C3H6O3 90,08 1,4414 L(+) y D(-): 52,8 a 54°C DL (según composición): 16,8 a 33°C 122-140°C 1206 3616 cal/g 40,33 mNsm-2 1,21 a 1,249 g/mL 22 ɛ
Fuente: (Serna y Rodríguez, 2005)
Procesos de producción El ácido láctico puede ser producido por síntesis química o biotecnológica. La producción química, está basada en la reacción de acetaldehído con ácido cianhídrico lo cual produce un lactonitrilo que puede ser hidrolizado a ácido láctico. Otro tipo de reacción se basa en la reacción a alta presión de acetaldehído con monóxido de carbono y agua en presencia de ácido sulfúrico como catalizador. Este proceso es costoso debido a que el petróleo es la base de la materia prima. Los problemas de alto costo de esta materia, así 10
como la dependencia de otras industrias para su obtención, además de la impureza del producto, hacen de los procesos basados en fermentaciones la mejor opción para producir ácido láctico (Arrellano, 2013). La producción biotecnológica se realiza por fermentación y se puede producir a partir de diferentes sustratos y microorganismos. La obtención de ácido láctico con enzimas o microorganismos vivos pueden producir la mezcla racémica o los isómeros L(+) o D(-), dependiendo del microorganismo involucrado en el proceso y las condiciones operacionales de la fermentación (Rios,2011).
Aplicaciones del ácido láctico Actualmente, la demanda mundial de ácido láctico está en aumento, debido a sus múltiples aplicaciones. Esto se debe en gran medida por la propiedad única de tener presente en su estructura un grupo carboxílico y uno hidroxilo, lo cual hace posible su participación en una amplia variedad de reacciones químicas como esterificación, condensación, polimerización, reducción y sustitución (Arrellano, 2013). Existen cuatro grandes áreas en las que es usado actualmente:
Alimentaria
Es clasificado como GRAS (Generalmente Reconocido Como Seguro) para su uso como aditivo alimentario, por lo cual es ampliamente usado en casi todos los segmentos de la industria alimenticia, debido a su gran cantidad de funciones, como saborizante, regulador del pH, mejorador de la calidad microbiana y fortificante mineral. Este es un compuesto que también es usado comercialmente en las industrias de las aves de corral y de las carnes, ya que aumenta su tiempo de almacenamiento y sabor; y también controla patógenos. Debido a su sabor ácido, también es usado como acidulante en ensaladas, productos de panadería, bebidas, en confiterías, no solo como saborizante, sino también como controlador del pH durante el procesamiento. Las ventajas de usar este compuesto en la industria incluyen su bajo costo, fácil manejo y la capacidad de producir dulces incoloros (Suárez, 2007).
Cosmética
Este es un ácido que agrega ingredientes naturales para aplicaciones cosméticas. Aunque inicialmente fue usado como humectante y regulador del pH, posee múltiples propiedades, entre ellas la actividad antimicrobiana, rejuvenecedora e hidratante de la piel. El efecto humectante está directamente relacionado con la capacidad de retención de agua del lactato y el rejuvenecimiento de la piel es producido por la supresión de la formación de tironasa. Ya que son ingredientes naturales del cuerpo humano, tanto el 11
ácido como sus sales, tienen perfecta acogida en las nuevas tendencias hacia formulaciones naturales y seguras, con efectos que los hacen muy atractivos como ingredientes activos en los cosméticos (Suárez, 2007).
Farmacéutica
Es usado en la industria farmacéutica como electrolito en soluciones intravenosas que sirven para aumentar los fluidos del cuerpo. Además, se emplea en una amplia variedad de productos minerales, como tabletas, prótesis, suturas quirúrgicas y sistemas controlados de entrega de droga (Suárez, 2007).
Química
Algunos ejemplos de productos derivados del ácido láctico que han tenido una gran demanda en los últimos años, son: termoplásticos biodegradables (ácido poliláctico), solventes verdes (etil, propil, butil) y químicos oxigenados como el glicol de propileno (Ríos, 2011). Adicionalmente, este puede tener conversiones hacia químicos potencialmente útiles, como el óxido de propileno (vía hidrogenación), ácido propanoico (vía reducción), ácido acrílico (vía deshidratación), acetaldehído (vía descarboxilación), y diláctido (vía auto esterificación) (Suárez, 2007).
2.2.4. Microorganismos productores de ácido láctico La producción biotecnológica está basada en la fermentación de sustratos ricos en carbohidratos por bacterias u hongos. Esta depende del tipo de microorganismo utilizado, la inmovilización o recirculación del microorganismo, el pH, la temperatura, la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno, el modo de fermentación empleado y la formación de subproductos. Las bacterias ácido lácticas (BAL) son cocos y bacilos Gram positivos, anaerobios facultativos, no esporulados, inmóviles y catalasa negativo, pertenecientes a los géneros Lactobacillus (Lb),
Carnobacterium (Cb), Leuconostoc (Leu), Pediococcus (Pd), Streptococcus (Str), Tetragenococcus (Teg), Lactococcus (Lc), Vagococcus (Vc), Enterococcus (Ent), Aerococcus (Ac) y Weissella (W). La mayoría de las especies pertenecientes a estos géneros tienen alta tolerancia a pH por debajo de 5. Esta tolerancia ácida les da ventajas competitivas sobre otras bacterias (Serna y Rodríguez, 2005). Acorde a los productos finales de la fermentación de los hidratos de carbono, las BAL se dividen en homofermentativas y heterofermentativas. En el metabolismo homofermentativo, se produce predominantemente ácido láctico y las bacterias utilizan las hexosas siguiendo la vía de Embden12
Meyerhof. Las bacterias que tiene este tipo de metabolismo son Lb. delbruekii, Lb. helveticus, Lb.
amylovorus; Pd. acidilactici, Pd. pentosaceus, Pd. damnosus; Str. salivarius, Lc. lactis, entre otros. La fermentación heteroláctica produce a partir de glucosa, cantidades equimolares de otros productos de fermentación como ácido acético, etanol y dióxido de carbono. Las bacterias que tienen este tipo de metabolismo son: Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. bifidus y todas las especies del género Leuconostoc. Los hongos utilizados en la producción de ácido láctico son mohos y levaduras pertenecientes a los géneros Rhizopus, Zymomonas, Saccharomyces y Kluiveromyces. La dificultad que presenta la producción de ácido láctico con mohos es su forma física, ya que el gran tamaño de los micelios o sus agregados puede provocar un aumento en la viscosidad del medio de fermentación, lo que causa un alto incremento en la demanda de oxígeno y resistencia a la transferencia de masa en el proceso fermentativo, lo que a su vez aumenta los tiempos de fermentación y los subproductos formados especialmente etanol, y disminuye los rendimientos de conversión (Serna y Rodríguez, 2005).
2.2.5. Fermentación Las fermentaciones se llevan a cabo en un dispositivo llamado biorreactor, también denominado comúnmente fermentador, por medio del cual se proporciona un medio ambiente controlado que permite la obtención de productos de interés a partir de la transformación microbiológica o enzimática de un sustrato. Las fermentaciones a nivel laboratorio son usualmente realizadas en matraces erlenmeyer o cajas de petri, esto debido a que son convenientes cuando se trabaja con volúmenes pequeños (Ríos, 2011).
Tipos de fermentación
Proceso tipo lote
La fermentación en lote es el modo de operación más simple y se considera como un sistema cerrado. Es usado frecuentemente en el laboratorio. Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el microorganismo (Ríos, 2011).
Proceso semi-continuo
Un proceso semicontinuo es un cultivo en lote alimentado continuamente con sustrato, sin la remoción del caldo de fermentación. Esta estrategia de alimentación permite que el microorganismo crezca a una velocidad de crecimiento específica deseada, minimizando la formación de subproductos (Ríos, 2011).
13
Proceso continuo
En la fermentación continua se establece un sistema abierto. La solución nutritiva estéril se añade continuamente al bióreactor y una cantidad equivalente de caldo de fermentación con los nutrientes y los microorganismos, es retirada de forma continua (Ríos, 2011).
Parámetros de relevancia durante la fermentación para la producción de ácido láctico
Medio de cultivo
Es una mezcla de suplementos y nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento y la multiplicación de los microorganismos, tales como bacterias, hongos y parásitos. De acuerdo a su estado físico pueden ser sólidos, semisólidos y líquidos (Nava y Núñez, 2013).
Modo de fermentación
El ácido láctico es comúnmente producido en fermentaciones tipo lote, pero existen numerosos ejemplos de cultivo continuo y semicontinuo. Cuando se compara los modos de fermentación por lote y continuo, el primero resulta en mayores concentraciones de ácido láctico y mejores rendimientos en la mayoría de estudios; esto es debido a que todo el sustrato es usado. Por otro lado, el modo continuo resulta en mayores productividades (Suárez, 2007).
pH
La concentración de iones hidrógeno es un parámetro importante que tiene un fuerte efecto en la producción de ácidos orgánicos formados durante los procesos de fermentación, debido a que cuando se acumulan en gran cantidad en el caldo de fermentación inhiben el crecimiento del microorganismo. Para controlar el pH durante la fermentación se hace el uso de agentes neutralizantes. El carbonato de calcio ha sido ampliamente usado en investigaciones a nivel matraz, así como también el carbonato de sodio y el hidróxido de sodio (Ríos, 2011).
Temperatura
El efecto de la temperatura en la producción de ácido láctico ha sido estudiado en pocos reportes (Suárez, 2007). Generalmente este parámetro se selecciona en función del microorganismo a utilizar y su temperatura óptima de producción. En el caso de las BAL la temperatura óptima de crecimiento varía entre géneros y está en un rango de 20°C a 45°C (Serna y Rodríguez, 2005). 14
2.2.6. Separación y purificación del ácido láctico El proceso de producción del ácido láctico vía fermentativa requiere el uso de un proceso de separación económico y eficiente para recuperar el ácido láctico y aislarlo de varias impurezas en el caldo de fermentación (Suárez, 2007). Los métodos de recobrado del ácido láctico deben tener en cuenta: la separación de las sales de ácido láctico de los microorganismos que la producen y la separación de las impurezas del medio de fermentación, entre los que se encuentran: azúcares que no se consumieron totalmente, proteínas y varios tipos de sales orgánicas (Núñez et al ., 2009). Los estudios de separación y purificación del ácido láctico han tenido un marcado interés, debido a que por sus propiedades fisicoquímicas se hace difícil la destilación y cristalización del mismo, lo cual hace de esta etapa del proceso una de las más complejas y costosas (Sánchez et al., 2007). En la mayoría de los procesos, el ácido láctico es recuperado bajo la forma de lactato de calcio por la adición de carbonato de calcio al medio de fermentación y su posterior acidificación con ácido sulfúrico. Los tratamientos posteriores, van a depender de la pureza deseada e incluyen: esterificación, purificación con resinas de intercambio iónico y extracción con solventes. También se han usado procesos de membrana como ultrafiltración, nanofiltración, microfiltración, ósmosis inversa y electrodiálisis. La electrodiálisis puede utilizarse simultáneamente a la fermentación, empleando un sistema de recirculación, método que permite remover el ácido a medida que se produce, eliminando la necesidad de agregar agentes neutralizantes. Recientemente se ha evaluado la utilización de Diálisis Donan como pretratamiento del caldo de fermentación y electrólisis con membrana bipolar para la extracción del lactato. Otra técnica estudiada es la fermentación extractiva, que permite la remoción continua del ácido láctico favoreciendo el rendimiento de la reacción. Recientemente se ha estudiado un proceso que permite la esterificación del ácido láctico y la posterior hidrólisis del lactato en una torre de destilación reactiva consiguiéndose mayores purezas en la composición del ácido láctico final (Tejeda et al ., 2007). La esterificación es el único proceso de separación que separa el ácido láctico de otros ácidos orgánicos. El ácido láctico de alta pureza puede ser preparado mediante la formación de un éster al reaccionar el ácido láctico con alcohol. Posteriormente, la purificaron del éster se da mediante una hidrólisis ácida, por destilación o extracción y luego se realiza su conversión en ácido láctico (Suárez, 2007). 15
2.2.7. Polímeros Son macromoléculas (generalmente orgánicas) formadas por la unión de cientos de miles de moléculas más pequeñas, llamadas monómeros, que forman enormes cadenas de formas más diversas (Nava y Núñez, 2013).
Biopolímeros Son macromoléculas presentes en los seres vivos y se considera que son materiales poliméricos o macromoleculares sintetizados por los seres vivos. Existen también los llamados biopolímeros derivados, que agrupan a los biopolímeros sintetizados artificialmente pero a partir de sustancias naturales. Estos materiales también son denominados bioplásticos, aunque es esta categoría también se incluyan todo los biopolímeros de origen natural (Nava y Núñez, 2013).
Polimerización La reacción por la cual se sintetiza un polímero a partir de sus monómeros se denomina polimerización. Según el mecanismo por el cual se produce la reacción de polimerización para dar lugar al polímero, ésta se clasifica como "polimerización por pasos" o como "polimerización en cadena". En cualquier caso, el tamaño de la cadena dependerá de parámetros como la temperatura o el tiempo de reacción, teniendo cada cadena un tamaño distinto y, por tanto, una masa molecular distinta. Por esta razón se habla de masa promedio del polímero (Nava y Núñez, 2013).
2.2.8. Propiedades de los Polímeros Los polímeros tiene gran cantidad de usos y su aplicación depende de las propiedades que estos presenten. Las propiedades para cada polímero son variables y dependen de muchos factores, dentro de los cuales se encuentra la estructura química. Las propiedades técnicas se refieren a la aplicabilidad que presentan los mismos en un determinado proceso o en su uso final. Dentro de estas características se encuentran la resistencia al ataque de sustancia químicas, resistencia eléctrica y su comportamiento frente al calor. En cambio, las propiedades mecánicas se relacionan con el comportamiento del polímero frente a distintos procesos mecánicos. Entre estas propiedades se encuentra la resistencia, que se relaciona con la firmeza de los polímeros frente a la presión ejercida sobre ellos sin sufrir cambios en su estructura. La dureza, que es la capacidad de oposición a romperse y la elongación que es la capacidad de un polímero de estirase sin romperse cuando se ejerce una presión externa (Romero, 2014). 16
2.2.9. Ácido Poliláctico (PLA) El PLA es un polímero termoplástico rígido que puede ser semicristalino o totalmente amorfo, dependiendo de la pureza estereoquímica de la cadena polimérica. La peculiaridad de este polímero es que en muchos aspectos parece tereftalato de polietileno (PET), que es también un poliéster, pero tiene un comportamiento muy similar al polipropileno (PP), que es una poliolefina. De hecho, puede ser el polímero con más amplio intervalo de aplicaciones debido a su habilidad para cristalizar mediante estiramiento, o térmicamente, copolimerizar o procesar mediante la mayoría de las técnicas de procesado. Además, tiene excelentes propiedades organolépticas y es excelente para aplicaciones en contacto con alimentos y de embalaje (Mazarro, 2009).
Propiedades del PLA El PLA tiene propiedades mecánicas en el mismo rango de los polímeros petroquímicos, a excepción de una baja elongación. Esta propiedad puede mejorarse durante la polimerización (por copolimerización) o por modificaciones después de la polimerización con la adición de plastificantes. El ácido poliláctico puede ser duro como el acrílico o blando como el polietileno, rígido como el poliestireno (PS) o flexible como un elastómero. Puede formularse para obtener una variedad de resistencias. Las resinas de PLA pueden someterse a esterilización con rayos gama y son estables cuando se exponen a los rayos ultravioleta. Otras propiedades de interés del ácido poliláctico son, la suavidad y resistencia al rayado y al desgaste. La tabla 2.3 muestra algunas propiedades del PLA en comparación con otros plásticos convencionales (Tejeda et al ., 2007).
Tabla 2.3 Propiedades del ácido poliláctico y plásticos convencionales Polímero
Fuerza Tensión (MPa)
Módulo de Tensión (GPa)
Temperatura Máxima de F usión (° C)
Polietileno de baja densidad (PEBD) Polietileno de alta densidad (PEAD) PET
6,2-17,2
0,14-0,19
65
20,0-37,2
-
121
68,9
2,8-4,1
204
PS
41,3-51,7
3,1
78
PP
33-37,9
1,1-1,5
121
PLA L(+)
40-60
3-4
50-60
Fuente: (Tejeda et al ., 2007)
17
Este polímero puede hidrolizarse fácilmente a ácido láctico, mediante la adición de agua, para luego ser nuevamente polimerizado. Esta sería una ventaja para el reciclaje y la biodegradación de los productos de ácido poliláctico (Tejeda et al ., 2007). El ácido poli (L-láctico), o su homólogo poli (L, L-lactida), conocido como PLLA, es semi-cristalino y tiene un punto de fusión de 170 – 183ºC y una temperatura de transición vítrea (Tg) de 55 a 65ºC. Mientras que el ácido poli (D, L-láctico) o poli (D, L-lactida), conocido como PDLLA es amorfo y tiene una Tg de 59ºC, aunque estas temperaturas pueden variar con el peso molecular. Debido a la cristalinidad del PLLA, éste presenta unas mejores propiedades mecánicas que el PDLLA. Su densidad es de 1,25 a 1,29 g.cm-3. La solubilidad del PLA depende del peso molecular, el grado de cristalinidad y la presencia de otros monómeros. Normalmente, el PDLLA es soluble en un mayor número de disolventes orgánicos que el PLLA, pero ambos son insolubles en alcoholes, como el metanol y el etanol, e hidrocarburos no sustituidos como el hexano, el heptano, entre otros (Mazarro, 2009).
Polimerización del PLA Existen cuatro métodos para la producción del PLA: la policondensación directa del ácido láctico, la condensación azeotrópica, la polimerización en estado sólido y la polimerización por apertura de anillo. Aunque se puede obtener un polímero de alto peso molecular mediante los tres últimos métodos, la polimerización por apertura de anillo es la más comúnmente estudiada, debido a la posibilidad de controlar la estereoquímica del producto. En la figura 2.4 se puede observar de forma resumida los métodos de síntesis para la obtención de PLA (Mazarro, 2009).
Figura 2.4 Métodos de síntesis para la obtención de PLA Fuente: (Mazarro, 2009) 18
Policondensación directa del ácido láctico
En la polimerización por condensación, la reacción toma lugar entre dos moléculas polifuncionales para producir una gran molécula polifuncional con posible eliminación de pequeñas moléculas, como el agua. La policondensación de ácido láctico se realiza, por lo general, en masa por destilación del agua de condensación, con o sin catalizador, mientras el vacío y la temperatura aumentan de forma progresiva. Aunque los poliésteres de alto peso molecular y buenas propiedades mecánicas son difíciles de obtener, las propiedades de los oligómeros de ácido láctico pueden ser controladas por el uso de diferentes catalizadores y agentes de funcionalización, o por la variación de las condiciones de polimerización. La mayor desventaja de esta técnica de síntesis es que no produce PLA de alto peso molecular, debido a su complicación en la eliminación de impurezas y agua. Otras desventajas de esta técnica son, la necesidad de grandes reactores, evaporación, recuperación de disolventes y el aumento de racemización (Castro y Vera, 2012).
Condensación azeotrópica
La deshidratación azeotrópica es un método utilizado para obtener la longitud de cadena alta sin el uso de extensores de cadena y sus inconvenientes asociados. Un procedimiento general consiste en reducir la presión de destilación del ácido láctico por 2-3 horas a 130°C, para eliminar la mayor parte del agua. El catalizador y éter difenil son luego agregados y un tubo lleno de tamices moleculares se inserta en el recipiente de reacción. El disolvente se recircula al recipiente a través de los tamices moleculares durante 30-40 horas a 130 °C. Por último, el PLA es purificado (Castro y Vera, 2012).
Polimerización por apertura de anillo
Este tipo de polimerización es la más atractiva ya que se puede controlar la química del proceso para obtener las propiedades deseadas del polímero, lo que permite ampliar el campo de aplicación del mismo. Algunas de las ventajas que presenta son: el empleo de condiciones de reacción moderadas, bajos tiempos de reacción, obtención de altos pesos moleculares, control de la longitud de cadena y la baja existencia de reacciones laterales. La polimerización por apertura de anillo utiliza como monómero el dímero cíclico del ácido láctico, conocido como lactida (“lactide” en inglés). La lactida es obtenida por craqueo térmico de PLA de bajo
peso molecular a alta temperatura y baja presión en presencia de un catalizador. La lactida es un dímero cíclico de seis átomos (Mazarro, 2009). 19
Aplicaciones del PLA Por ser biodegradable y reabsorbible, el PLA encuentra múltiples aplicaciones en medicina y en industrias como la alimentaria, la textil, de cosméticos y otras. La mayor aplicación del PLA está en la industria biomédica, ya que éste es un termoplástico biodegradable y no es tóxico cuando se degrada. El PLA y sus copolímeros se han utilizado en el sistema de administración de drogas, en la encapsulación y entrega de proteínas, el desarrollo de las microesferas, hidrogeles, suturas, tornillos ortopédicos, entre otros. En la fijación de fracturas, se utilizan dispositivos metálicos para alinear los fragmentos de huesos. Al ser retirados estos dispositivos, pueden dejar el hueso sujeto a fracturas. Sin embargo, en el caso de los dispositivos basados en PLA, la degradación reduce el área donde hay actividad, lo que ayuda a la curación gradual del hueso. Después de la degradación completa, el dispositivo se absorbe de manera completa y una segunda cirugía no es necesaria. Sin embargo, este dispositivo de PLA tiene más bajo módulo de elasticidad que el dispositivo metálico, pero esta propiedad puede ser mejorada utilizando en el momento de la fabricación fibras de refuerzo de alto módulo. Puesto que las propiedades mecánicas del PLA de alto peso molecular son comparables a otros termoplásticos como el poliestireno (PS) y el polietilentereftalato (PET), este tiene grandes oportunidades para reemplazar estos polímeros para numerosas aplicaciones, como son el embalaje de productos alimenticios, botellas plásticas y para artículos que requieran gran transparencia. En el sector de las fibras, el PLA puede reemplazar al Nylon y estas prendas se sienten más cómodas, ya que sus propiedades les dan un toque sedoso, además de ser menos inflamables que otros tipos de telas. El PLA también encuentra aplicaciones en películas agrícolas, bolsas de basura degradables, bandejas termo-formadas de frutas y verduras, platos y vasos desechables, juguetes, cubiertos, capas de nano-compuestos de silicato, muebles y artículos para el hogar (Castro y Vera, 2012).
2.2.10. Degradación Los materiales poliméricos considerados degradables deben contener grupos en la cadena principal que se puedan romper fácilmente por la acción de agentes externos de naturaleza física o química, consiguiendo así, el mantenimiento de las propiedades durante el periodo de utilización del biopolímero y posterior cambio de estructura química para descomponerse en componentes compatibles con el medio ambiente. Como consecuencia de la degradación, en un biopolímero pueden ocurrir cambios físicos o químicos. Los cambios físicos pueden consistir en la decoloración, pérdida del brillo superficial, formación de grietas, superficie pegajosa, erosión superficial y pérdida de propiedades como la resistencia a la tracción y el 20
alargamiento. Los cambios químicos consisten en la rotura de cadenas, cambios en grupos sustituyentes laterales y aparición de reacciones de entrecruzamiento entre otros. Por otra parte, es importante recalcar que cuanto más bajo sea el peso molecular de un biopolímero, la degradación será más rápida; y para el caso los polímeros con mayor peso molecular, la combinación de grupos funcionales fotosensibles e hidrolizables hace más efectiva la degradación medioambiental. La biodegradación parcial consiste en la alteración en la estructura química del material y la pérdida de propiedades específicas, al contrario que en la biodegradación total, donde el material es degradado totalmente por la acción de microorganismos con la producción de CO 2 (bajo condiciones aeróbicas) y metano (bajo condiciones anaeróbicas), agua, sales minerales y biomasa (Nava y Núñez, 2013).
Degradación del PLA El principal mecanismo de degradación del PLA es la hidrólisis, debido a la presencia de grupos éster en la cadena polimérica. De este modo, en una primera etapa se produce la ruptura de las cadenas al azar, que conlleva una reducción del peso molecular y, después, los microorganismos metabolizan el ácido láctico y los oligómeros que han sido producidos en la etapa anterior para formar agua y dióxido de carbono. La degradación térmica o pirólisis también ha sido descrita en otros estudios, aunque no está muy claro cuál es el mecanismo seguido en este caso, se ha observado una disminución considerable del peso molecular a temperaturas superiores a 190ºC. Entre las posibles causas de degradación se encuentran: la depolimerización, la oxidación térmica que genera una ruptura al azar de las cadenas de polímero y las reacciones de trans-estericación inter- e intramoleculares que generan monómero y oligómeros de bajo peso molecular. Aunque existen numerosos factores que pueden afectar a la degradación del polímero, como son la presencia de trazas de impurezas, monómeros o agua, al parecer, tanto la depolimerización como las reacciones de trans-esterificación pueden estar catalizadas por la presencia de catalizador remanente del proceso de polimerización (Mazarro, 2009).
21
CAPÍTULO III. MARCO METODOLÓGICO En este capítulo se delimita el tipo de trabajo científico y de investigación en que se basa el estudio, y se presenta la metodología utilizada para llevar a cabo el logro de los objetivos planteados. 3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN Este trabajo se fundamentó en una investigación mixta, en la cual se emplearon aspectos de la investigación documental para establecer un procedimiento sistemático del desarrollo de la síntesis de interés y por otro lado, se utilizó una investigación experimental donde se realizaron los estudios necesarios para evaluar el comportamiento de los fenómenos en estudio y comprobar la información bibliográfica encontrada sobre el tema, (Muñoz, 2011).
3.2. FASES METODOLÓGICAS Se planteó para el desarrollo sistemático de la investigación, las siguientes fases o etapas acordes con los objetivos específicos planteados:
3.2.1. Actividades iníciales , se llevó a cabo la búsqueda de información bibliográfica necesaria para el desarrollo de los objetivos planteados.
3.2.2. Determinación de algunas de las características fisicoquímicas que posee el suero lácteo utilizado como materia prima para la investigación, realizando después una fermentación láctica con el microorganismo seleccionado.
3.2.3. Aplicación del proceso de purificación más adecuado para la separación del ácido láctico obtenido en el proceso de fermentación láctea.
3.2.4. Síntesis del ácido poliláctico (PLA), mediante la policondensación del ácido láctico obtenido en la etapa de purificación.
3.2.5 Evaluación de algunas propiedades del polímero sintetizado. 3.2.6. Actividades finales , una vez de cumplidas todas las actividades planteadas, se procedió a la redacción de este trabajo de investigación.
3.3. OPERACIONALIZACIÓN DE LOS OBJETIVOS 3.3.1 Determinar las características fisicoquímicas del suero lácteo Para la determinación de las características fisicoquímicas del suero lácteo, se recolectaron en Puerto Cumarebo (Municipio Zamora del Estado Falcón) dos muestras de suero, aplicando un muestreo de tipo aleatorio simple al azar, según lo indicado en la Norma COVENIN 1769-81 (Frutas: tomas de muestra). La muestra A1 fue recolectada en una empresa de propiedad familiar, en la cual preparan queso de manera 22
artesanal; mientras que la muestra A2, se recolectó en la empresa LACSA C.A, donde preparan queso de manera semi-industrial. Las muestras fueron trasladadas en cuñetes plásticos al Laboratorio de Polímeros y Derivados Petroquímicos del Centro de Investigaciones Químicas de la Facultad de Ingeniería de la Universidad de Carabobo, en donde fueron sometidas a diferentes ensayos para su caracterización, sin tratamientos y con tratamiento previos.
Pre-tratamiento del suero El pre-tratamiento realizado al suero consistió en el desnatado y la desproteinización, siguiendo la metodología planteada por (Urribarrí et al ., 2004). Para el desnatado, se realizó el calentamiento del suero a temperaturas entre 70 y 100°C durante 30 minutos, utilizando el montaje experimental que se muestra en la figura 3.1. Luego se retiró la solución de la fuente de calor y se dejó reposar hasta temperatura ambiente para finalmente filtrar y retirar los sólidos formados.
Figura 3.1 Montaje para el proceso de desnatado
Para la desproteinización del suero, se aplicó un tratamiento térmico en la autoclave, mostrada en la figura 3.2, a 115°C y 10 psig durante 20 minutos. Luego se dejó reposar a temperatura ambiente, se centrifugó, se decantó y se filtró el sobrenadante.
Figura 3.2 Autoclave y suero con proteínas precipitadas 23
Finalizado el pre-tratamiento de los sueros se observó la diferencia en los mismos (ver figura 3.3) y se procedió a realizar la caracterización tanto del suero tratado como el no tratado. Las pruebas realizadas fueron: °Brix, Contenido de ácido láctico, Acidez iónica, contenido de cenizas y cantidad de proteínas. El efecto del pre-tratamiento se evaluó comparando las características del suero antes y después del procedimiento aplicado.
Figura 3.3 Suero antes y después del pre-tratamiento
Determinación del contenido de azúcar (°Brix) La determinación del contenido de azúcar se fundamentó en el procedimiento establecido en la Norma NTE INEN 0273 (Determinación de la densidad en grados Brix). Para ello, se utilizó el Brixómetro mostrado en la figura 3.4, modelo TI-RBX0032(A) marca Trans. Para esto, se limpió el prisma del equipo con agua destilada y se dejó secar. Luego se colocaron dos gotas de suero en el prisma, se cerró el equipo, se visualizó la medida y se registró el valor observando.
Figura 3.4 Equipo utilizado para la determinación de °Brix
Determinación del contenido de ácido láctico Para la determinación del contenido de ácido láctico en el suero lácteo, se utilizó el procedimiento descrito en la Norma COVENIN 658:1997 (Leche y sus derivados, Determinación de acidez titulable). Se 24
emplearon 10 mL de suero para titularlo con hidróxido de sodio 0,1M, utilizando fenolftaleína como indicador, hasta que se observó el cambio de coloración mostrado en la Figura 3.5.
Figura 3.5 Coloración del suero antes y después de la titulación
Determinación de pH Para la determinación del pH, se utilizó un pHmetro marca ORION modelo 410A (ver figura 3.6), empleando el procedimiento descrito en la Norma COVENIN 1315:79 (Alimentos. Determinación del pHAcidez iónica). Para esto, se sumergió el electrodo del equipo, previamente calibrado con soluciones buffer de pH 4 y 7, en un vaso de precipitado que contenía el suero a analizar. Los valores reportados por el equipo fueron tabulados una vez que los mismos no variaron en más de 0,01 unidades.
Figura 3.6 Equipo utilizado para la determinación de pH
Determinación del contenido de cenizas La determinación del contenido de cenizas se realizó siguiendo el procedimiento descrito en la Norma COVENIN 368:1997 (Leche y sus derivados, Determinación de cenizas). Para esto, se pesó un vidrio de reloj limpio y seco, se le añadió 1mL de suero y se volvió a pesar. Posteriormente, el vidrio de reloj se colocó en la estufa a 180 °C hasta que la muestra se calcinó por completo (ver figura 3.7). Finalmente, el 25
vidrio de reloj se enfrió en el desecador y se procedió a pesar nuevamente. Con los datos obtenidos y la norma mencionada, se calculó el porcentaje de cenizas.
Figura 3.7 Muestra calcinada del suero
Determinación de la cantidad de proteínas El contenido de proteínas fue determinado mediante el método Sorensen-Walker, descrito por (Periago et
al ., 2010) y cuya metodología se explica a continuación:
Se agregaron 10 mL de suero lácteo en un matraz erlenmeyer.
Se añadió 20 mL de agua destilada y se adicionaron unas gotas de fenolftaleína.
Luego se neutralizó la acidez titulable natural del suero con una solución de hidróxido de sodio 0,1M hasta la aparición de un color rosado.
Se añadieron 3 mL de formol.
Se realizó una segunda valoración con hidróxido de sodio, hasta que se observó que la solución se tornó rosado, como se muestra en la figura 3.8. En este caso, se tomó nota del volumen de base gastado.
Figura 3.8 Coloración del suero después de la segunda valoración 26
La cantidad de hidróxido de sodio 0,1M gastado en la segunda valoración, se multiplicó por 2,24 y el resultado se expresó como porcentaje de proteínas.
Culminado el proceso de caracterización de los sueros, se procedió al análisis de los resultados reportados, para seleccionar el suero que representaba la mejor alternativa a utilizar como sustrato en el proceso fermentativo para la producción de ácido láctico.
3.3.2 Realizar la fermentación láctica con el microorganismo más adecuado Para realizar la fermentación láctica, se realizó la selección del microorganismo más adecuado para el proceso fermentativo mediante la elaboración de una matriz de selección de Moody. Además, una vez conocido el microorganismo a utilizar, se realizó la evaluación de las mejores condiciones para realizar el proceso.
Creación de la matriz de selección de Moody para el microorganismo más adecuado. Para la creación de la matriz de selección de Moddy, fue necesario realizar una investigación sobre las diferentes formas de producir ácido láctico mediante vía biotecnológica. El resumen de dicha información se encuentra contenido en el Anexo I, tabla I.1, mientras que la matriz elaborada se realizó siguiendo los siguientes pasos:
Se definieron los criterios de evaluación: (1) El costo de la bacteria, (2) El tiempo de fermentación, (3)
La cantidad de parámetros a controlar, (4) La necesidad de suplementos, (5) La producción de biomasa y (6) La formación de sub-productos.
Se asignó un valor de importancia a cada criterio de evaluación, según su peso con respecto a ejecución
y eficacia del proceso, mediante la utilización de una escala del 0-100, siendo el mayor valor reportado el más importante a considerar durante la selección del microorganismo.
Se definieron los posibles microorganismos capaces de producir AL a partir de la fermentación del
suero lácteo, siendo estos: (1) Lactobacillus bulgaricus, (2) Lactobacillus casei y (3) Lactobacillus
helveticus.
Se construyó la matriz de selección Moody, siguiendo el formato mostrado a continuación
Cr iteri iteri o
I mportancia rtancia (I)
B acte acterr i as prop pr opuest uestas as P
P: puntuación
I: importancia del criterio
27
PxI
P
PxI
P
PxI
Se definió la escala de valoración de cada criterio, basándose en el método cualitativo por puntos,
usando la siguiente información:
Tabla 3.1 Escala de valoración para criterios de selección Puntuación 1
3
5
Criterio Costo de la bacteria
Mayor a 10mil bs
De 5 a 10mil bs
Menor a 2mil bs
Tiempo de fermentación fermentación
Mayor a 24 horas
De 12 a 24 horas
Menor a 12 horas
Cantidad de parámetros
Más de 5
405
3 o menos
Necesidad de
Más de 15 o menos pero
De 15 a 10 pero de uso
Menos de 10 y de uso
suplementos
poco comunes
común
común
Producción de biomasa
Mucha
Intermedia
Poca
Formación de sub-
2 o más sub-productos
1 solo sub-producto
No forma sub-productos
a controlar
productos Fuente: (García et al .,., 2013)
Se asignó una puntuación del 1 al 5 a cada alternativa (bacteria) con cada criterio, siendo 5 la mejor
opción, según la escala de valoración mostrada anteriormente.
Luego se realizó la multiplicación del puntaje asignado a cada alternativa según el criterio de
evaluación (P) por su valor de importancia (I) y se procedió a realizar la suma de dichos valores para cada alternativa propuesta. La selección del microorganismo se realizó mediante el análisis de los resultados arrojados en la matriz de selección de Moody elaborada. La alternativa escogida fue aquella en la cual se obtuvo el mayor puntaje total.
Preparación del medio de cultivo para la fermentación Se tomaron 4 recipientes de plástico de 2L de capacidad, limpios y secos, y a cada uno se le agregó:
1L de suero desnatado y desproteinizado, proveniente de la quesera de propiedad familiar.
30 gramos de carbonato de calcio (CaCO 3).
1 gramo de extracto de levadura.
0,5 gramos de fosfato mono-potásico (KH 2PO4).
0,5 gramos de fosfato di-potásico (K 2HPO4).
0,2 gramos de sulfato de magnesio (MgSO4) y
0,03 gramos de sulfato de manganeso (MnSO 4). 28
Luego se procedió a tapar los recipientes y se agitaron de forma vigorosa hasta obtener una mezcla homogénea. Las soluciones preparadas se transfirieron a matraces de 250 mL de capacidad y se taparon, tal y como se muestra en la figura 3.9, luego se colocaron en una autoclave y se esterilizaron a 115°C y 10 psig durante 20 minutos. Luego se sacaron los matraces y se dejaron reposar para ser utilizados en el aislamiento de la bacteria seleccionada para la producción de ácido láctico por vía fermentativa.
Figura 3.9 Solución a esterilizar
Fermentación El medio de cultivo preparado fue llevado al Laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencia y Tecnología (FACYT), para la inoculación la bacteria Lactobacillus casei, la cual fue extraída por un personal especializado, especializado, a partir del yogurt comercial Alpina Alpina - presentación natural. Después de inocular las bacterias en el medio de cultivo, los matraces fueron tapados con algodón y gasa. Se tomó una de las soluciones para la evaluación de pH, contenido de ácido láctico y °Brix, siguiendo las metodologías descritas en el apartado 3.3.1.
Figura 3.10 Proceso fermentativo con agitación y control de temperatura 29
El resto de las soluciones se colocaron en un equipo de agitación con control de temperatura, como el mostrado en la figura 3.10, para efectuar el proceso de fermentación durante 24 h a 37 °C y 150 rpm. Culminado el proceso de fermentación, se tomó un matraz como muestra representativa y se procedió a evaluar nuevamente el: pH, contenido de ácido láctico y °Brix, siguiendo las metodologías descritas en el apartado 3.3.1.
3.3.3
Emplear la alternativa más conveniente para el proceso de purificación del ácido láctico
obtenido de la fermentación del suero lácteo El suero lácteo de la fermentación fue filtrado, y el líquido obtenido se destiló, utilizando el montaje mostrado en la figura 3.11, hasta el 50% de su volumen inicial. Luego se dejó enfriar a temperatura ambiente, y se centrifugó para retirar posibles impurezas y compuestos insolubles. El líquido obtenido fue purificado mediante la utilización de dos métodos: obtención de lactato y separación líquido-líquido.
Figura 3.11 Montaje para el proceso de destilación simple
La selección de la alternativa más conveniente para la purificación del ácido láctico, obtenido de la fermentación del suero lácteo, se realizó mediante el análisis de las soluciones obtenidas después de la aplicación de los procesos de purificación utilizados. Los métodos de obtención de lactato y el método de separación líquido-líquido, se describen a continuación:
Método 1: obtención de lactato
(1) Se tomaron 100 mL del sobrenadante obtenido de la centrifugación y se le agregó 0,5042g de carbonato de calcio para la formación del lactato de calcio. (2) Se evaporó la solución, utilizando el montaje que se muestra en la figura 3.12, a temperaturas entre 4060°C por 1 hora con agitación continua. (3) Luego se agregó 0,5 mL ácido sulfúrico. (4) Se filtró para remover el precipitado formado. 30
(5) Se tomaron 50 mL para la caracterización del ácido purificado.
Figura 3.12 Montaje para el control de temperatura de calentamiento
Método 2: Separación líquido-líquido
(1) Se tomaron 200 mL del sobrenadante del centrifugado y se le agregó 1mL de ácido sulfúrico. (2) A la solución resultante se le agregó igual volumen de 1-butanol. (3) Se mezcló por agitación magnética durante 30 minutos y luego se dejó en reposo por 1 día. (4) La solución fue decantada y se retiró el precipitado formado. (5) Se agitó nuevamente la solución durante 10 minutos y se centrifugó. (6) El sobrenadante obtenido se filtró y se pasó a embudos de separación, como el que se muestra en la figura 3.13, dejándose en reposo hasta observar la separación de las fases.
Figura 3.13 Mezcla suero fermentado con 1-butanol
(7) Luego se procedió a la separación e identificación de las fases. (8) Se agregó agua y ácido sulfúrico a la fase superior para hidrolizarla. 31
(9) Tanto la fase inferior, como la solución hidrolizada fueron destiladas hasta obtener un residuo de aproximadamente 50% del volumen inicial. Los destilados y residuos obtenidos, fueron almacenados para estudios y tratamientos posteriores. (10) Por último se tomaron 50mL de los residuos obtenidos en las destilaciones previas, para la caracterización del ácido purificado. El ácido purificado se caracterizó mediante la determinación del pH y la concentración %p/v de la solución, siguiendo las metodologías descritas en el apartado 3.3.1. Otras pruebas realizadas, se describen a continuación:
Punto de ebullición
El punto de ebullición del ácido purificado se determinó siguiendo la metodología planteada por la Norma ASTM D 1120-72 “Boiling Temperature”. P ara esto, se tomó un vaso de precipitado de 100 mL y se colocaron 20 mL del ácido láctico purificado. La muestra se sometió a calentamiento y al observar la aparición de pequeñas burbujas en la superficie del líquido se tomó nota de la temperatura observada en el termómetro. El montaje utilizado se muestra en la figura 3.14.
Figura 3.14 Montaje utilizado para evaluar el punto de ebullición de la solución
Índice de refracción
La determinación del índice de refracción se realizó siguiendo el procedimiento descrito en la Norma COVENIN 2450-87 (Determinación del índice de refracción y dispersión refractiva). Para esto, se utilizó el refractómetro Bausch y Lomb tipo Abbe modelo 3L, el cual fue calibrado con agua destilada. Luego se tomó una pequeña muestra del ácido purificado y se colocó en el equipo, tal como se observa en la figura 3.15. 32
Figura 3.15 Disposición de muestra en el refractómetro
Densidad
La determinación de la densidad se realizó siguiendo la metodología descrita por Velásquez, 2007; la cual se fundamentó en el método del picnómetro. Para esto, se utilizó un picnómetro de 25 mL (Ver figura 3.16). Se midió la masa del picnómetro vacío, limpio y seco. Posteriormente, se llenó el picnómetro completamente con el ácido láctico purificado y se midió la masa del picnómetro lleno. Mediante la utilización de la fórmula adecuada y los datos recolectados, se procedió a calcular la densidad del producto (ver Apéndice B, ecuación B.11).
Figura 3.16 Recipiente para determinar la densidad (picnómetro)
Miscibilidad en agua
La miscibilidad en agua se determinó siguiendo la metodología descrita por Lozano et al ., 2013; mediante la aplicación del método básico para medir solubilidad. En un tubo de ensayo, se agregó agua destilada (hasta 25% de la capacidad del recipiente) y luego se fue agregando ácido láctico purificado. Tras cada adición, se agitó la solución y se tomó nota del comportamiento observado durante el proceso de mezcla.
33
En la figura 3.17 se observa el tubo de ensayo conteniendo agua destilada y ácido láctico en igual proporción.
Figura 3.17 Mezcla de ácido y agua -Prueba de miscibilidad
Estudio por espectroscopia infrarrojo
La espectroscopia de infrarrojo se realizó en el equipo FT-IR Spectrometer modelo SPECTRUM 1000, (ver figura 3.18), acoplado a un dispositivo informático para el análisis de los espectros a través del programa Spectrum v2.00. Los espectros se llevaron a cabo con una resolución de 1 cm -1 en el rango de 400 - 4000 cm-1.Para la evaluación de las muestras, estas se colocaron en el equipo, previamente calibrado, para la visualización del espectro.
Figura 3.18 Equipo para obtención de infrarrojos (espectrómetro)
3.3.4 Sintetizar el polímero con el ácido láctico obtenido en el proceso de purificación La síntesis del polímero con el ácido láctico obtenido en el proceso de purificación se realizó mediante un proceso de policondensación en tres etapas: pre-concentración, oligomerización o deshidratación y polimerización. Para esto, se realizó el montaje que se muestra en la figura 3.19 constituido de una manta 34
de calentamiento, un balón de 1 L con 3 bocas de fondo redondo, un embudo de adición, un termómetro y un condensador; además de los conectores necesarios al sistema de destilación y un kitasato conectado a una bomba de vacío. La metodología utilizada se detalla a continuación:
Figura 3.19 Montaje usado en la síntesis del ácido poliláctico
Pre-concentración
Se evaporó 1/3 de solución de ácido láctico purificado a una temperatura comprendida entre 40 °C y 60 °C. Luego se diluyó 2 mL de dicha solución pre-concentrada con 20 mL de agua destilada. Posteriormente, se tomaron 2 mL de la muestra diluida y se tituló con hidróxido de sodio 0,1 M y fenolftaleína como indicador. Para conocer la concentración %p/v se utilizó la metodología descrita en el apartado 3.3.1 para el contenido de ácido láctico y se utilizaron las ecuaciones B.12 y B.13, mostradas en el apéndice B.
Oligomerización
Se agregaron 200 mL de AL concentrado en el balón de 1 L y se adaptó al sistema de destilación al vacío. Luego se procedió a calentar la solución hasta que la misma alcanzó 100 °C. Posteriormente, se aplicó vacío hasta 635 mmHg por 45 minutos.
Polimerización
En la etapa final de la síntesis se agregó el catalizador manteniendo la temperatura de operación y bajando la presión hasta 508 mmHg. La reacción se mantuvo en esas condiciones durante 1 hora y 30 minutos aproximadamente. Transcurrido ese tiempo, se apagaron y se desconectaron los equipos, de forma inmediata se transfirió el producto a moldes elaborados para su secado y los mismos se colocaron en un desecador.
35
3.3.5 Evaluar propiedades del polímero obtenido y su capacidad de degradación Las pruebas realizadas para la caracterización del polímero obtenido fueron: densidad, punto de fusión y determinación de la presencia de zinc. Además de espectroscopia infrarrojo y degradación por hidrólisis.
Determinación de la densidad
Para la determinación de la densidad del polímero obtenido, se utilizó la metodología descrita por Torrelavega, s.f; siguiendo el método de la probeta. Se tomó una pequeña muestra del plástico obtenido del proceso de polimerización y se pesó en una balanza analítica. Luego, en un cilindro de 25 mL, se agregó un volumen conocido de agua, se introdujo la muestra de plástico previamente pesada y se esperó que la misma llegara al fondo de la probeta, tal y como se observa en la figura 3.20. Después, se tomó nota del volumen final y finalmente, mediante la utilización de la fórmula B.14 (ver apéndice B), se calculó la densidad del producto de síntesis.
Figura 3.20 Probeta con agua y polímero obtenido
Determinación del punto de fusión
Para la determinación del punto de fusión se utilizó el método de Thiele descrito por Sánchez, 2012. Para ello se cortó una muestra del polímero obtenido, en pequeños trozos, para introducirlos en un tubo capilar. Luego se montó el equipo, utilizando un beaker lleno con parafina líquida, la cual se calentó junto con un termómetro y la muestra contenida en el tubo capilar. Al observar la fusión del polímero, se anotó la temperatura señalada en el termómetro. El montaje utilizado se muestra en la figura 3.21, que se presenta a continuación:
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Figura 3.21 Montaje utilizado para la evaluación del punto de fusión del polímero
Determinación de presencia de Zinc
La prueba se basó en el ensayo a la llama, siguiendo la metodología descrita por Hurtado, 2014. Para esto, se utilizó una espátula, previamente limpiada con ácido clorhídrico, y se colocó en ella una pequeña cantidad del polímero obtenido. Luego la muestra se calentó con un mechero y se procedió a observar la coloración de la llama (ver figura 3.22).
Figura 3.22 Polímero expuesto a la llama
Evaluación de la dureza
La prueba se realizó siguiendo la metodología indicada por la Norma ASTM D2240-15, utilizando el Durómetro tipo A, modelo 360 L, que se visualiza en la figura 3.23. La muestra se colocó sobre una base paralela al equipo. Luego se dejó caer el dial del equipo sobre la muestra. El equipo reportó el valor de interés de forma directa y esta prueba se realizó por triplicado.
37
Figura 3.23 Equipo para la medición de dureza (durómetro)
Estudio por espectroscopia infrarrojo
El equipo y dispositivo informático utilizado para esta prueba son los mismos descritos en el apartado 3.3.3, para el estudio de espectroscopia infrarrojo del ácido purificado. Para la evaluación de la muestra polimérica, fue necesario diluir una cantidad del polímero en cloroformo, para formar películas delgadas que pudieran ser colocadas en el equipo.
Estudio de degradabilidad
Para los ensayos de degradación hidrolítica, se siguió la Norma Internacional ASTM F1635-04a. Para ello, se tomaron 3 muestras del polímero obtenido, fueron pesadas antes de ser sumergidas cada una en 3 soluciones diferentes. La primera fue en una solución buffer de pH=4, la segunda en una solución buffer de pH=10 y la última en agua de chorro. Las soluciones Buffer fueron tapadas con papel de aluminio, mientras que la tercera se dejó abierta al ambiente (ver figura 3.24). Estas condiciones se mantuvieron por un periodo de 30 días.
Figura 3.24 Exposición de la muestra polimérica al agua de chorro 38
El pH de las soluciones se midió antes de la adición de las muestras, según la metodología descrita en el apartado 3.3.1. Transcurridos los 30 días de degradación, se retiraron las muestras de las soluciones que la contenían y se colocaron en la estufa a 30°C durante 2horas para secarlas. Luego se procedió a aplicar nuevamente la metodología indicada en el apartado 3.3.1 para determinar el pH final de las soluciones y también se realizó la pesada de las muestras.
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CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En este capítulo se presenta detalladamente el análisis de los resultados obtenidos del trabajo de investigación. 4.1. DETERMINAR LAS CARACTERÍSTICAS FISICOQUÍMICAS DEL SUERO LÁCTEO Tabla 4.1 Características fisicoquímicas de los sueros y cambios producidos a causa del pretratamiento utilizado Parámetro Acidez iónica (pH±0,01)Adim Contenido de azúcar (°Brix±0,1)°Brix Contenido de cenizas (C±0,02)%p/p Contenido de ácido láctico (CAL±0,05)gAL/Lsuero Cantidad de proteínas (P±0,1)%
Suero antes del tratamiento
Suero después del tratamiento
Diferencia obtenida por el tratamiento
Suero A.1
Suero A.2
Suero A.1
Suero A.2
Suero A.1
Suero A.2
4,53
4,31
4,37
3,91
- 0,16
- 0,40
8,3
4,9
8,4
5,0
+ 0,1
+ 0,1
5,76
3,59
5,63
3,52
- 0,13
- 0,07
11,99
12,93
12,18
13,89
+ 0,19
+ 0,96
15,0
15,3
12,5
14,6
- 2,5
- 0,7
Suero A.1: suero proveniente de la quesera de propiedad familiar, suero A.2: Suero proveniente de la empresa LACSA, C.A.
En la tabla 4.1 se presentan las características de los sueros utilizados en la investigación. Los parámetros analizados fueron obtenidos tanto de los sueros sin tratar como de los sueros luego del tratamiento realizado. En este sentido, se encontró que la acidez iónica de los sueros presenta un valor de pH por debajo de 5, y se observa que después del tratamiento de desnatado y desproteinizado, estos valores bajan en 0,16 unidades para el suero proveniente de la quesera de propiedad familiar y en 0,40 unidades para el suero proveniente de la empresa LACSA. Los valores de acidez iónica, encontrados en los sueros evaluados, se encuentran dentro del rango establecido por Callejas et al ., (2012) como valor promedio en sueros de tipo ácidos, en donde se indica que todo lactosuero que posea un pH<5 clasifica como suero ácido. La disminución del pH después del tratamiento concuerda con el comportamiento reportado por Urribarrí et al ., (2004), debido a que hubo eliminación de agua y aumentó la concentración de ácido. En cuanto al contenido de azúcar, se observa en la tabla 4.1 que el suero proveniente de la quesera familiar tiene mayor contenido de azúcares fermentables, en comparación con el suero proveniente de la empresa LACSA, tanto en los sueros sin tratar como en los sueros luego del tratamiento realizado. También se 40
observa que los sueros después de ser tratados, presentan un leve aumento en el contenido de azúcar. Los valores reportados para este parámetro, según la información reportada por García et al ., (2013), indican que los sueros en estudio son un buen sustrato para la fermentación con microorganismos, ya que los mismos consumen los azucares presentes en la solución. El cambio observado en el contenido de azúcar de las soluciones, una vez efectuado el pre-tratamiento, se debe a que parte del agua presente en los sueros se evaporó a causa de los tratamientos térmicos aplicados, concentrando así las soluciones, tal y como lo explican García et al ., (2013). Por su parte, el contenido de cenizas es mayor en el suero proveniente de la quesera familiar en comparación con el contenido de cenizas presentes en el suero de la empresa LACSA. El tratamiento aplicado permitió el cambio de este parámetro de 5,79 a 5,63 %p/p para el suero proveniente de la quesera de propiedad familiar y de 3,59 a 3,52 %p/p en el suero proveniente de la empresa LACSA, apreciándose de esta forma que el tratamiento resultó más efectivo para el suero proveniente de la propiedad familiar por presentar una disminución de 0,13 unidades, mientras que el otro suero solo se logró disminuir 0,07 unidades. Los valores reportados para este parámetro se encuentran dentro del rango establecido por Parra (2009) para un suero ácido y la disminución de este parámetro concuerda con lo esperado y reportado por Urribarrí et al ., (2004). En relación al contenido de ácido láctico (AL), se encontró que el suero proveniente de la empresa LACSA tiene más ácido presente en la solución en comparación con el suero de la quesera de propiedad familiar. Después de la aplicación del tratamiento, se aprecia un aumento de 0,19 y 0,96 unidades para este parámetro, observándose el mayor cambio (0,96 unidades) en el suero proveniente de la empresa LACSA. Siguiendo la definición propuesta por Álvarez (2013), los sueros evaluados se clasifican en los sueros de tipo ácido, por presentar un contenido de AL mayor a 2 gramos por cada litro de solución. El aumento de este parámetro, a causa del tratamiento aplicado concuerda con el comportamiento reportado por García et al ., (2013), y es debido a la evaporación de parte del agua presente en la solución por causa de los tratamientos térmicos aplicados. En tanto, que para la cantidad de proteínas, se encontró que el suero proveniente de la empresa LACSA presentó un valor más alto en comparación con el suero de la quesera de propiedad familiar y que después del tratamiento aplicado se mantuvo este comportamiento. En la tabla 4.1 también se observa que el cambio más significativo obtenido por el tratamiento, se presenta en el suero de la quesera de propiedad familiar en este parámetro. La cantidad de proteínas, encontrada en los sueros evaluados fue superior a la reportada por Álvarez, (2013); Callejas et al ., 2012; Parra, (2009), los cuales indican este valor en un 41
rango de (6 – 12) % respectivamente, por ello resultó necesario la aplicación de un proceso de desproteinización el cual resultó efectivo, por disminuir la cantidad de proteínas presentes en la solución, como lo indicó Urribarrí et al ., (2004). En virtud a los resultados analizados anteriormente, se establece que los sueros del presente estudio son de tipo ácido y que el tratamiento aplicado resultó efectivo para disminuir las impurezas presentes en ellos, como son las cenizas y proteínas. Además, se determinó que el suero tratado, proveniente de la quesera de propiedad familiar, fue la mejor opción a utilizar como sustrato, para la aplicación de un proceso fermentativo mediante el uso de microorganismos, por poseer un mayor contenido de azúcares fermentables y menor cantidad de proteínas (consideradas impurezas del proceso) en comparación al suero proveniente de la empresa LACSA.
4.2. REALIZAR LA FERMENTACIÓN LÁCTICA CON EL MICROORGANISMO MÁS ADECUADO Tabla 4.2 Matriz de Moody para la selección de la bacteria a utilizar en la fermentación láctica Cr iteri o
I mportancia (I)
Bacterias propuestas Lactobacillus helveticus P PxI
Lactobacillus bulgaricus P PxI
Lactobacillus casei P PxI
Costo
40
1
40
5
200
5
200
Tiempo de fermentación
20
5
100
1
20
3
60
Cantidad de parámetros a controlar
20
3
60
5
100
5
100
Necesidad de suplementos
10
3
30
5
50
5
50
Producción de biomasa
5
1
5
3
10
3
15
Formación de sub-productos
5
1
5
3
10
3
15
Total
100
-
240
-
390
-
440
P: Puntuación
I: importancia del criterio
En la tabla 4.2 se muestran los criterios utilizados para la selección del microorganismo más adecuado para llevar a cabo la fermentación del suero lácteo. El costo de la bacteria está relacionado directamente con la facilidad de adquisición de la misma, por ello es el parámetro de mayor importancia para la selección de la bacteria, ya que de no poder adquirir la bacteria no se podría realizar la fermentación del suero. 42
El tiempo de fermentación, se considera el tiempo óptimo necesario para que la bacteria logre producir la mayor cantidad de ácido láctico; y la cantidad de parámetros a controlar, es un criterio a considerar por la limitante de los equipos que se disponen para el estudio. Estos criterios tienen cada uno, un 20 % de importancia al momento de realizar la selección de la bacteria, por la ventaja que representaría realizar un proceso en el menor tiempo posible sin gran cantidad de aplicación de controles. La necesidad de suplementos, involucra la cantidad, variedad y tipos de suplementos necesarios para que se dé una fermentación efectiva, tienen un 10 % de importancia ya que, si bien es posible la fermentación sin su uso, como lo demuestran García et al ., (2013) y Ríos (2011), los mismos también recomiendan su uso para mejorar la eficiencia del proceso. En cuanto a la producción de biomasa y formación de sub-productos, se consideran por el interés de realizar un proceso que genere la menor cantidad posible de biomasa y subproductos, sin embargo, poseen menor valor de importancia ya que los mismos a pesar de variar por la utilización de diferentes bacterias en la mayoría de los casos se producen y no hay forma de evitarlo, como lo señalan García et al ., (2013). Los microorganismos analizados fueron bacterias del género Lactobacillus, tales como: Lactobacillus
helveticus, Lactobacillus bulgaricus y Lactobacillus casei. En la tabla 4.2 se observa que la bacteria Lactobacillus helveticus presentó el menor de los valores totales reportados en la matriz de selección de Moddy. Esto se debe a que fue la bacteria más costosa, que requiere mayor cantidad de suplementos y produce mayor cantidad de biomasa y formación de sub productos, en comparación a las otras opciones. En cuanto a la bacteria Lactobacillus bulgaricus se observa que esta presentó un valor medio entre los totales reportados por las otras bacterias a considerar; por tanto, se considera que su uso es mejor alternativa frente al uso de la bacteria Lactobacillus helveticus pero no lo es frente a la bacteria
Lactobacillus casei por necesitar mayores tiempos de fermentación. En la tabla 4.2 se puede apreciar que la bacteria Lactobacillus casei tiene la mayor puntuación reportada en la matriz de selección de Moody. Esto se debe a que, en comparación a las otras dos alternativas propuestas, es una bacteria de bajo costo, con poca cantidad de parámetros a controlar y requerimientos de suplementos de uso común en las laboratorios. 43
En virtud de los criterios analizados anteriormente, se estableció que el microorganismo que presenta las mejores condiciones para ser empleado en la fermentación de los sueros lácteos, fue la bacteria
Lactobacillus casei. Tabla 4.3 Características del medio de cultivo inoculado con la bacteria Lb. casei y cambios producidos a causa de la fermentación Parámetro
Antes de la fermentación
Después de la Cambios fermentación producidos
Acidez iónica (pH±0,01)Adim Contenido de azúcar (°Brix±0,1)°Brix Contenido de ácido láctico (C AL±0,05)gAL/Lsuero
6,00 10,0 1,38
5,24 8,4 7,73
0,76 1,6 6,35
En la tabla 4.3 se muestran las características del medio de cultivo inoculado con la bacteria Lb. casei. Las características del medio fueron determinadas antes y después del proceso fermentativo, con el fin de visualizar los cambios producidos por el mismo. En este sentido, se encontró que la acidez iónica de la solución se encontraba inicialmente en un valor de pH igual a 6 y disminuyó en 0,76 unidades, producto del proceso fermentativo, obteniéndose un valor final de pH igual a 5,24. El pH inicial del medio se debe a la adición de carbonato de calcio, álcalis que neutraliza el ácido láctico presente en la solución mediante la formación de lactato, según lo indican Núñez et al ., (2009), y la disminución de este parámetro por la fermentación, concuerda con el comportamiento reportado por García et al ., (2013) cuando existe producción de ácido en el proceso. En cuanto al contenido de azúcar, se observó una disminución de 10,0 a 8,4°Brix por el proceso fermentativo, que se interpreta como una disminución de 1,6 unidades en este parámetro. El contenido de azúcares fermentables presente en la solución se debe a la lactosa y el extracto de levadura que contiene dicha solución, (Álvarez, 2013; Ojeda, 2011), mientras que la disminución de este parámetro durante el proceso de fermentación concuerda con el cambio reportado por Sánchez et al ., (2012), donde justifica que la bacteria colabora con la producción de ácido láctico, mediante el consumo de azucares fermentables presentes en la solución. Por su parte, el contenido de ácido láctico aumentó de 1,38 a 7,73 gramos por cada litro de suero, lo cual representa una producción del ácido de interés de 6,35 gramos por cada litro de solución. Si se compara la cantidad de ácido láctico producido en el presente trabajo, con los valores reportados por Ríos (2011), que realizó una fermentación bajo las mismas condiciones (ver tabla II.1, anexo II), se tiene que el porcentaje de rendimiento del proceso de producción de ácido láctico en este trabajo fue del 51%. 44
La cantidad de ácido obtenido, producto de la fermentación, fue mayor que la reportada por García et al ., (2013) utilizando la misma bacteria pero con diferentes suplementos, y a la obtenida por Sánchez et al ., (2007) y García et al ., (2013), utilizando Lb. bulgaricus y Lb. helveticus con el sustrato sin suplementar (ver tabla II.1, anexo II). En virtud del análisis de resultados de este apartado, se obtuvo que la mejor alternativa para la fermentación del suero lácteo es la bacteria Lb. casei, por ser una bacteria de bajo costo y que no requiere de grandes controles operacionales para que trabaje eficientemente en la producción de ácido láctico. Además se comprueba que el suero seleccionado para el proceso de fermentación, en conjunto con suplementos tales como: carbonato de calcio, extracto de levadura, fosfato mono-potásico, fosfato di potásico, sulfato de magnesio y sulfato de manganeso, forma un medio de cultivo adecuado para la producción de ácido láctico mediante una fermentación tipo lote de 24horas a 37°C y 150 rpm.
4.3. EMPLEAR LA ALTERNATIVA MÁS CONVENIENTE PARA EL PROCESO DE PURIFICACIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO OBTENIDO DE LA FERMENTACIÓN DEL SUERO LÁCTEO Tabla 4.4 Parámetros de la solución fermentada antes y después del proceso de purificación Parámetros Miscibilidad en agua Acidez iónica (pH±0,01)Adim Índice de refracción (Nd±0,0005)Adim Densidad
Solución fermentada Solución purificada (Sin purifi car) Método 1 Método 2 Miscible 5,24
Miscible 4,20
Fase Acuosa Miscible 3,79
Fase Orgánica Miscible 3,45
1,3580
1,3850
1,4460
1,4445
1,1342
1,1580
1,1916
1,2017
100
118
118
118
6,95
7,53
18,53
21,90
(ρ±0,0001)g/mL
Punto de ebullición (Te±1)°C Concentración (CAL±0,03)%p/v
Método 1: Obtención de lactato Método 2: Separación líquido-líquido con 1-butanol
Presión ambiente: (712,60 ± 0,05) mmHg Temperatura ambiente: (31,0± 0,5) °C
En la tabla 4.4 se presentan los parámetros evaluados en las soluciones de suero lácteo fermentado, antes y después de la aplicación de distintos procesos de purificación. Los métodos para purificar dicha solución fueron mediante la obtención de lactatos y mediante un proceso de separación líquido-líquido con 1 butanol. En este sentido, se encontró que la aplicación de los distintos métodos de purificación evaluados 45
permitió la obtención de un ácido miscible en agua. El resultado obtenido concuerda con lo esperado y reportado por Munilla y Blanco (2005), en donde se indica que el ácido láctico es miscible en agua. En cuanto a la acidez iónica, se observa que inicialmente la solución tiene un pH de 5,24 y que después de la aplicación de los distintos métodos de purificación, el valor de este parámetro disminuye. También se evidencia que el menor valor reportado para este parámetro se encontró al aplicar el método 2, en la solución de ácido láctico obtenida de la fase orgánica. La disminución del pH en la solución concuerda con los cambios reportados por Gil et al ., (2008) como indicativo de un proceso de purificación efectivo. La disminución de pH se da en mayor proporción en el método 2, ya que la adición de 1-butanol a la solución permitió la precipitación de los azucares remanentes que no se consumieron durante el proceso fermentativo permitiendo así una mayor purificación de la solución, de esta forma lo indican Gil et al ., (2008). Por su parte, también en la tabla 4.4, se observa que el índice de refracción de la solución evaluada es inicialmente de 1,3580 y que luego de la aplicación de los procesos de purificación su valor aumentó a 1,3850 en el método 1, mientras que el aumento en el método 2 fue mayor, reportando valores de 1,4460 para la solución obtenida de la fase acuosa y 1,4445 para la fase orgánica. El cambio observado en este parámetro concuerda con lo esperado, debido a la concentración del ácido en la solución. Al comparar los valores obtenidos después de la purificación, con el índice de refracción del ácido láctico comercial (ver tabla II.2, Anexo II) se tiene que la solución purificada con el índice de refracción más cercano al valor teórico es la solución obtenida de la fase orgánica del método de purificación 2. En relación a la densidad, se tiene que este valor aumentó después de la aplicación de ambos métodos de purificación, y que el menor cambio observado se presentó en la solución que se purificó mediante la aplicación del método 1, el cual reportó un valor de 1,1580 g/mL. Si se compara el valor de la densidad teórica del ácido láctico (ver tabla II.2, Anexo II) con las densidades reportadas en la tabla 4.4, se tiene que la solución purificada que reporta el valor más cercano al teórico, fue la solución de ácido obtenida de la fase orgánica de la aplicación del método 2. Los cambios observados concuerdan con los reportados por Gil et al ., (2008), debido a la capacidad del 1-butanol en precipitar los azucares que no se consumieron en la fermentación (comportamiento que no ocurre mediante la aplicación del método 1), y a su vez formar un éster para luego recuperar el ácido de la fase orgánica mediante un proceso de hidrólisis (Ver anexo III, método 2).
46
Con respecto al punto de ebullición de la solución, se observa que el mismo aumentó, en todos los casos, de 100 a 118°C. Estos valores son indicativos de que la solución fermentada (sin purificar) está compuesta mayormente por agua, cuyo punto de ebullición es de 98,17°C a las condiciones de presión presentes en el laboratorio al momento de realizar la evaluación de esta propiedad, mientras que el valor de las soluciones purificadas se asemeja más al valor teórico del ácido láctico (Ver tabla II.2, Anexo II), por tanto, es evidencia de que el proceso de purificación resultó efectivo, tal y como lo indica Arellano, (2013). Por último, en la tabla 4.4 se observa que la concentración de ácido láctico en la solución sin purificar fue de 6,95 %p/v y que luego de la aplicación del método 1, este valor aumentó a 7,53 %p/v, mientras que en el método ,2 este parámetro reportó 18,53 %p/v para la solución obtenida de la fase acuosa y 21,90 %p/v de la fase orgánica. Los resultados concuerdan con el comportamiento reportado por Arellano, (2013) y Gil et al ., (2008) debido a la eliminación de parte del agua presente en las soluciones por destilación y en el caso del método 2, por la eliminación de impurezas como parte del azúcar remanente en la solución. Ahora bien, además de la caracterización de las soluciones purificadas mediante la determinación de los parámetros mostrados en la tabla 4.4, se realizó un análisis de los espectros infrarrojos emitidos por cada solución final obtenida de los procesos de purificación evaluados, los cuales se presentan a continuación:
Figura 4.1 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido después del proceso de purificación mediante el método 1Obtención de lactato (arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial (abajo). 47
En la figura anterior (arriba), se observan bandas en 1649 y 1719 cm -1 correspondientes a estiramientos C=O, 2956 cm-1 del estiramiento OH proveniente del alcohol y 3398 cm -1 del estiramiento OH debido al ácido carboxílico. Dichas bandas señalan la existencia de ácido láctico en la solución; sin embargo, la longitud de los picos difiere respecto a las longitudes de ondas visualizadas en el ácido láctico comercial (abajo). Dicha variación se debe principalmente a que el producto obtenido no posee la misma pureza del ácido comercial.
Figura 4.2 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido de la fase acuosa- Método 2: Separación líquido-líquido (arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial (abajo).
En la figuras 4.2 (arriba), se observan bandas en 1645 y 1720 cm -1 correspondientes a estiramientos C=O, 2939 cm-1 del estiramiento OH proveniente del alcohol y 3438 cm -1 del estiramiento OH debido al ácido carboxílico. Si se compara el espectro obtenido con el espectro del ácido láctico comercial (abajo), se tiene que el comportamiento del mismo es muy similar, a pesar de que las bandas se encuentren un poco a la izquierda con respecto a sus valores.
48
Figura 4.3 Espectro infrarrojo del ácido láctico obtenido de la fase orgánica - Método 2: Separación líquido-líquido (arriba) vs espectro infrarrojo del ácido láctico comercial (abajo).
Por otro lado, en la figura 4.3 (arriba), se observan bandas en 1649 y 1721 cm -1correspondientes a estiramientos C=O, 2938 cm -1del estiramiento OH proveniente del alcohol y 3301 cm -1del estiramiento OH debido al ácido carboxílico. Estas bandas son similares a las obtenidas por el análisis del ácido láctico comercial (abajo), donde destacan bandas en 1709 y 1753 cm -1estiramientos C=O, 2990 cm -1 estiramiento OH proveniente del alcohol y 3370 cm -1estiramiento OH debido al ácido carboxílico. En virtud de los resultados analizados anteriormente, se estableció que los métodos de purificación evaluados resultaron efectivos para aumentar la concentración del ácido láctico presente en la solución, además de mejorar las propiedades fisicoquímicas del mismo. Sin embargo, el método que dio los mejores resultados para la purificación del ácido láctico obtenido por medio de la fermentación del suero lácteo, fue el método 2 (separación líquido-líquido con 1-butanol), ya que éste permitió la precipitación de parte de los azúcares remanentes en la solución logrando así una mayor purificación y mayor acercamiento a las propiedades características del ácido láctico, en comparación con el método 1 (obtención de lactato). También se estableció que la muestra obtenida de la fase orgánica del método 2, fue la que presentó los valores más parecidos a las propiedades teóricas del ácido láctico, por lo tanto, se realizó la purificación
49
del resto de la solución fermentada con el método de separación líquido-líquido con 1-butanol y se extrajo el ácido de la fase orgánica.
4.4. SINTETIZAR EL POLÍMERO CON EL ÁCIDO LÁCTICO OBTENIDO EN EL PROCESO DE PURIFICACIÓN Tabla 4.5 Información sobre el proceso de polimerización Proceso
Parámetro a evaluar
Condición
Valor/Observación
Pre-concentración
Concentración de la solución (% p/v ± 0,03) % Volumen de la Solución (V±1) mL Aspecto de la solución final
Antes del proceso Después del proceso Inicial Final -
21,90 25,00 200 120 Presentó una capa en la superficie del líquido
Oligomerización Polimerización
En la tabla 4.5 se presenta información sobre el proceso de policondensación aplicado al ácido láctico purificado. En dicha tabla se puede evidenciar que la concentración de la solución era inicialmente de 21,90 %p/v y que una vez culminado el proceso de pre-concentración este valor aumento hasta 25 %p/v. Este aumento en la concentración, concuerda con el comportamiento reportado por Jiménez et al ., (2012), los cuales indicaron que la concentración de la solución aumentaba debido a la eliminación, por evaporación, de parte del agua presente en la solución; por tanto se consideró evidencia de un proceso de pre-concentración efectivo. En cuanto al proceso de oligomerización, se observa que comenzó con 200 mL y culminó en 120 mL de solución. La disminución del volumen de la solución concuerda con lo reportado por Jiménez et al ., (2012), ya que dicho proceso permitió la deshidratación de la solución y la misma se da mediante la eliminación de agua por destilación.
Figura 4.4 Polímero obtenido en solución 50
Por último, también en la tabla 4.5, se reporta que al final del proceso de polimerización, se observó la formación de una capa en la superficie de la mezcla de reacción, tal y como se muestra en la figura 4.4. La formación de dicha capa se considera una evidencia de producción del polímero PLA, tal como lo reportan Medina et al ., (2014) y Estupiñan et al ., (2007). En virtud de los resultados analizados, se estableció que el método de policondensación, utilizando como catalizador zinc metálico, efectuado en tres etapas (pre-concentración, oligomerización y polimerización) resultó efectivo para aumentar la concentración inicial del ácido a polimerizar y obtener un polímero como capa en la superficie del líquido.
4.5. EVALUAR PROPIEDADES DEL POLÍMERO OBTENIDO Y SU CAPACIDAD DE DEGRADACIÓN Tabla 4.6 Caracterización del polímero obtenido Densidad promedio (ρ±0,2) g/mL
1,3
Punto de fusión medio (Pf±1) ° C Dureza Shore A ( D±1) Adim Prueba de ensayo a la llama
173 62 Negativo para la presencia de Zinc
En la tabla 4.6 se muestran las características del producto obtenido al culminar el proceso de policondensación del ácido láctico. En este sentido, se encontró que el polímero posee una densidad de 1,3g/ml. Dicho valor se encuentra dentro del rango establecido por Mazarro (2009) para el PLA, ver tabla II.2, anexo II. En cuanto al punto de fusión del material obtenido, la prueba realizada indicó que fue de 173°C, valor que se encuentra dentro del rango establecido por Mazarro (2009), el cual indica que para este parámetro el PLA posee un valor entre 170 y 183 °C. Con respecto a la dureza del material, el polímero presentó un valor de 62 Shore A. Este valor difiere del valor reportado por Figueira (2008), en donde se menciona una dureza de 83 Shore A para el PLA, pero el valor reportado resulta igualmente aceptable como lo mencionan Aponte y Villazón (2001), pues el valor indica que el material evaluado presenta resistencia a ser rayado o penetrado por otro cuerpo sólido. El hecho de que el material de referencia indique un valor de dureza mayor al reportado en este estudio, solo indica que el material de referencia tiene mayor resistencia al rayado y a la penetración en comparación con el material en estudio. 51
Finalmente, en la tabla 4.6 se muestra que la prueba de ensayo de la llama indicó que el polímero obtenido no contiene trazas de Zinc. Este resultado difiere de lo reportado por Estupiñan et al ., (2007) donde se demostró la presencia de zinc en la matriz principal del polímero obtenido, mediante un estudio de microscopía electrónica de barrido y energía dispersiva de rayos X. Sin embargo, en este trabajo se considera el resultado obtenido como satisfactorio, ya que el zinc utilizado en la polimerización tenía como único objetivo el de funcionar como catalizador, y por tanto no debía estar presente en el producto final.
Figura 4.5 Espectro infrarrojo del polímero sintetizado
En la figura 4.5 se muestra el espectro del material obtenido por la polimerización del ácido láctico. El pico que se presenta en 1.744,38 cm-1 indica la presencia del grupo C=O. Otro pico en 2.990,35 cm -1 es debido al grupo C-H y entre 1.000 y 1.200 cm -1 se encuentra otro pico sobresaliente que indica la presencia de un enlace C-C en el polímero. El comportamiento del espectro obtenido indica una absorción característica del PLA y se asemeja al resultado obtenido por Medina et al ., (2014), quienes sintetizaron el ácido poliláctico mediante policondensación del ácido láctico obtenido de la fermentación del fruto de cují.
Tabla 4.7 Variación ocurrida en el proceso de degradación Parámetro de estudio pH (pH±0,01)Adim
Peso (P±0,0001)g
Buffer 1: solución de pH=4
Buffer 1
Buffer 2
Agua de Chorro
Valor inicial
4,03
10,07
7,31
Valor final
4,00
10,06
7,21
%Variación
0,74
0,10
1,37
Valor inicial
0,2758
0,2744
0,2588
Valor final
0,2602
0,2650
0,2502
%Variación
5,6563
3,4256
3,3230
Buffer 2: solución de pH=10
52
pH: acidez iónica.
En la tabla 4.7 se muestran los parámetros evaluados para determinar la eficiencia del proceso de degradación hidrolítica. En dicha tabla se evidencia que el pH en todas las soluciones disminuyó después del proceso de degradación, siendo la solución de agua de chorro la que presentó mayor porcentaje de variación en comparación con las soluciones buffer. El hecho de que el pH en las soluciones buffer no cambiaran significativamente, es un comportamiento esperado y justificado por Figueira (2008), debido a la naturaleza de dichas soluciones. En cambio, la variación del pH en el agua corriente del 1,37% concuerda con lo reportado por Zuluaga (2013), que indica la concentración de grupos carboxilos por efecto de la degradación. En cuanto al peso de las muestras también se evidenció que el mismo descendió en todos los casos evaluados, pero la mayor variación de este parámetro se observó en la muestra que fue sumergida en la solución buffer 1 (de pH 4). La disminución del peso concuerda con el comportamiento reportado por Mazarro (2009), y resulta indicativo de que se ha producido degradación, debido a la ruptura de las cadenas poliméricas. En virtud de los resultados analizados, se estableció que el polímero sintetizado mediante la policondensación del ácido láctico purificado obtenido de la fermentación del suero lácteo, posee características propias del ácido poliláctico, tales como: una densidad de 1,3g/mL, punto de fusión de 173°C y, resistencia al rayado y a la penetración. Además, la evaluación del polímero demostró que el mismo no contiene trazas de zinc metálico y que es degradable en soluciones acuosas.
53
CONCLUSIONES 1. Los sueros evaluados en el presente estudio fueron de tipo ácido. 2. Los procesos de desnatado y desproteinización resultaron efectivos como pre-tratamiento para la disminución del contenido de cenizas y proteínas presente en los sueros. 3. El suero tratado proveniente de la quesera de propiedad familiar fue la mejor opción a utilizar como sustrato, para la aplicación de un proceso fermentativo mediante el uso de microorganismos. 4. La mejor alternativa para la fermentación del suero lácteo fue la bacteria Lb. casei. 5. El suero lácteo pre-tratado y suplementado con carbonato de calcio, extracto de levadura, fosfato mono-potásico, fosfato di-potásico, sulfato de magnesio y sulfato de manganeso, forma un medio de cultivo adecuado para la producción de ácido láctico mediante una fermentación tipo lote de 24 horas a 37 °C y 150 rpm. 6. Los métodos de purificación de obtención de lactato y separación líquido-líquido con 1-butanol, resultaron efectivos para aumentar la concentración del ácido obtenido en la fermentación láctica; además sirven para que las propiedades fisicoquímicas de dicho ácido se asemejen a las propiedades teóricas del ácido láctico. 7. El método que dio mejores resultados para la purificación del ácido láctico obtenido por medio de la fermentación del suero lácteo, fue el método de separación líquido-líquido con 1-butanol. 8. El método de separación líquido-líquido con 1-butanol permitió la precipitación de parte de los azúcares remanentes en la solución. 9. La policondensación del ácido láctico, obtenido de la fermentación del suero lácteo, utilizando como catalizador zinc metálico, resultó efectiva para obtener un polímero con las características propias del PLA. 10. El polímero obtenido mediante la fermentación del suero lácteo fue degradable mediante procesos de hidrólisis. 54
RECOMENDACIONES 1. Realizar procesos de destilación al vacío durante el proceso de purificación para evitar degradación y concentración de azúcares remanentes en la solución. 2. Evaluar otros métodos de purificación del ácido, por ejemplo: mediante el uso de membranas de intercambio iónico. 3. Estudiar el efecto del tiempo y condiciones de operación en el proceso de polimerización sobre el producto final obtenido.
55
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA Álvarez, M. (2013). Caracterización fisicoquímica de los diferentes tipos de lactosueros producidos en la
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60
APÉNDICE A. DATOS RECOLECTADOS Tabla A.1 Datos requeridos para la caracterización del suero proveniente de la quesera familiar. Prueba
Valor experimental
Muestra/ Condición
Valor 1
Valor 2
Valor 3
Contenido de azúcar
°Brix (°Brix±0,1) °Brix
Alícuota
8,3
8,3
8,3
Acidez titulable
Volumen de NaOH gastados (V NaOH±0,05 )mL
10 mL de suero
12,80
14,45
12,70
Acidez iónica
pH (pH±0,01) Adim
50 mL de suero
4,52
5,54
4,52
Contenido de cenizas
Peso de cápsula vacía (M1±0,0001) g
1 mL de suero colocado en la estufa por 30 minutos a 180 °C
24,5103
50,6995
26,0730
25,5598
51,7200
27,1498
24,5720
50,7584
26,1335
6,35
7,10
6,70
Peso de cápsula con suero (M2±0,0001) g
Cantidad de proteínas
Peso de cápsula con muestra incinerada (M3±0,0001) g Volumen de NaOH gastados* (V NaOH±0,05) mL
10 mL de suero
*: volumen de NaOH gastados en segunda titulación.
Tabla A.2 Datos requeridos para la caracterización del suero proveniente de la empresa LACSA. Prueba
Valor experimental
Muestra/ Condición
Valor 1
Valor 2
Valor 3
Contenido de azúcar
°Brix (°Brix±0,1) °Brix
Alícuota
4,9
4,9
4,9
Acidez titulable
Volumen de NaOH gastados (V NaOH±0,05) mL
10 mL de suero
14,50
14,30
14,30
Acidez iónica
pH (pH±0,01)Adim
50 mL de suero
4,32
4,30
4,30
Contenido de cenizas
Peso de cápsula vacía (M1±0,0001) g
1 mL de suero colocado en la estufa por 30 minutos a 180 °C
24,5103
50,6995
26,0730
25,5255
51,7599
27,0802
24,5462
50,7378
26,1095
6,90
6,80
6,75
Peso de cápsula con suero (M2±0,0001) g
Cantidad de proteínas
Peso de cápsula con muestra incinerada (M3±0,0001) g Volumen de NaOH gastados* (V NaOH±0,05) mL
10mL de suero
*: volumen de NaOH gastados en segunda titulación.
61
Tabla A.3 Datos requeridos para la caracterización del suero pre-tratado proveniente de la quesera familiar. Prueba
Valor experimental
Muestra/ Condición
Valor 1
Valor 2
Valor 3
Contenido de azúcar
°Brix (°Brix±0,1) °Brix
Alícuota
8,4
8,4
8,4
Acidez titulable
Volumen de NaOH gastados (V NaOH±0,05) mL
10 mL de suero
13,50
13,60
13,50
Acidez iónica
pH (pH±0,01) Adim
50 mL de suero
4,37
4,38
4,37
Contenido de cenizas
Peso de cápsula vacía (M1±0,0001) g
1 mL de suero colocado en la estufa por 30 minutos a 180 °C
24,5103
50,6995
26,0730
25,5724
51,7334
27,1175
24,5701
50,7572
26,1323
5,40
5,75
5,60
Peso de cápsula con suero (M2±0,0001) g
Cantidad de proteínas
Peso de cápsula con muestra incinerada (M3±0,0001) g Volumen de NaOH gastados* (V NaOH±0,05) mL
10 mL de suero
*: volumen de NaOH gastados en segunda titulación.
Tabla A.4 Datos requeridos para la caracterización del suero pre-tratado proveniente de la empresa LACSA. Prueba
Valor experimental
Muestra/ Condición
Valor 1
Valor 2
Valor 3
Contenido de azúcar
°Brix (°Brix±0,1) °Brix
Alícuota
5,0
5,0
5,0
Acidez titulable
Volumen de NaOH gastados (V NaOH±0,05) mL
10 mL de suero
15,60
15,30
15,40
Acidez iónica
pH (pH±0,01)Adim
50 mL de suero
3,91
3,92
3,91
Contenido de cenizas
Peso de cápsula vacía (M1±0,0001) g
1 mL de suero colocado en la estufa por 30 minutos a 180 °C
24,5103
50,6995
26,0730
25,5501
51,6639
27,1002
24,5471
50,7337
26,1087
6,40
6,70
6,50
Peso de cápsula con suero (M2±0,0001) g
Cantidad de proteínas
Peso de cápsula con muestra incinerada (M3±0,0001) g Volumen de NaOH gastados* (V NaOH±0,05) mL
10 mL de suero
*: volumen de NaOH gastados en segunda titulación.
62
Tabla A.5 Datos requeridos para la determinación de parámetros de seguimiento de la fermentación del suero proveniente de la quesera familiar. Condición Puro Con bacteria Con bacteria y pH inicial=6 Con bacteria + suplementos Con bacteria + suplementos y pH inicial=6
Acidez iónica (pH±0,01)Adim Volumen de NaOH gastados (V NaOH ±0,05)mL *
Contenido de azúcar (°Brix±0,1)°Brix
Valor 1 4,46 4,85 6,16
Valor 2 4,46 4,87 6,15
Valor 3 4,46 4,89 6,14
Valor 1 12,80 12,80 0,40
Valor 2 14,45 12,80 0,80
Valor 3 12,70 12,70 0,60
Valor 1 8,4 8,4 8,4
Valor 2 Valor 3 8,4 8,4 8,4 8,4 8,4 8,4
4,89
4,87
4,90
12,75
12,75
12,70
10,0
10,0
10,0
6,00
6,01
6,00
1,40
1,60
1,60
10,0
10,0
10,0
*: valor requerido para determinar contenido de ácido láctico.
Tabla A.6 Datos requeridos para la determinación de parámetros de seguimiento de la fermentación del suero proveniente de la empresa LACSA. Condición
Acidez iónica (pH±0,01)Adim
Valor 1 4,16 Puro 4,59 Con bacteria Con bacteria y 6,00
pH inicial=6 Con bacteria + 4,65 suplementos Con bacteria + 6,01 suplementos y pH inicial=6
Volumen de NaOH gastados Contenido de (V NaOH ±0,05)mL * (°Brix±0,1)°Brix
azúcar
Valor 2 4,16 4,63 6,03
Valor 3 4,16 4,61 6,00
Valor 1 14,30 13,90 1,05
Valor 2 14,30 13,30 1,10
Valor 3 14,10 13,60 1,10
Valor 1 5,0 5,0 5,0
Valor 2 Valor 3 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
4,65
4,65
13,75
16,30
13,70
6,5
6,5
6,5
6,00
6,00
2,10
2,00
2,05
6,5
6,5
6,5
*: valor requerido para determinar contenido de ácido láctico.
Tabla A.7 Datos tomados después de la fermentación de prueba del suero pr oveniente de la quesera familiar. Condición Puro Con bacteria Con bacteria y pH inicial=6 Con bacteria + suplementos Con bacteria + suplementos y pH inicial=6
Acidez iónica (pH±0,01)Adim Volumen de NaOH gastados (V NaOH ±0,05)mL *
Contenido de azúcar (°Brix±0,1)°Brix
Valor 1 4,37 4,51 6,00
Valor 2 4,37 4,50 5,99
Valor 3 4,37 4,52 6,01
Valor 1 14,50 14,60 1,40
Valor 2 15,00 15,20 1,30
Valor 3 15,00 14,85 1,30
Valor 1 7,6 7,6 8,0
Valor 2 Valor 3 7,6 7,6 7,6 7,6 8,0 8,0
4,73
4,71
4,71
14,10
14,00
14,20
9,0
9,0
9,0
5,24
5,24
5,23
8,50
8,65
8,60
8,4
8,4
8,4
*: valor requerido para determinar contenido de ácido láctico.
63
Tabla A.8 Datos tomados después de la fermentación de prueba del suero pr oveniente de la empresa LACSA. Condición
Acidez iónica (pH ±0,01)Adim
Valor 1 3,91 Puro 4,17 Con bacteria Con bacteria y 5,93
pH inicial=6 Con bacteria + 4,49 suplementos Con bacteria + 5,58 suplementos y pH inicial=6
Volumen de NaOH gastados Contenido de (V NaOH ±0,05)mL * (°Brix±0,1)°Brix
azúcar
Valor 2 3,91 4,18 5,95
Valor 3 Valor 1 3,91 15,60 4,17 15,30 5,94 2,90
Valor 2 15,30 15,30 2,80
Valor 3 15,40 15,40 2,80
Valor 1 5,0 4,5 5,0
Valor 2 5,0 4,5 5,0
Valor 3 5,0 4,5 5,0
4,49
4,49
15,20
15,25
15,40
6,0
6,0
6,0
5,58
5,57
7,30
7,20
7,30
6,0
6,0
6,0
*: valor requerido para determinar contenido de ácido láctico.
Tabla A.9 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra antes de la adición de carbonato. Pr ueba
Valor E xperimental
Muestra/ Condición
Valor 1
Valor 2
Valor 3
Acidez titulable
Volumen de NaOH gastados (V NaOH±0,05) mL
(10 ± 1) mL
9,80
9,85
10,00
Tabla A.10 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado medianteel Método de lactato. Prueba
Valor experimental
Muestra/ Condición
Valor 1
Valor 2
Valor 3
Acidez iónica Índice de Refracción
pH (pH±0,01) Adim Nd (Nd±0,0005) Adim
50 mL de suero Alícuota
4,20 1,3850
4,21 1,3850
4,20 1,3850
Tabla A.11 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado de la fase acuosa, obtenida por el método de extracción líquido-líquido Prueba
Valor experimental
Muestra/ Condición
Valor 1
Valor 2
Valor 3
Acidez iónica
pH (pH±0,01)Adim Nd (Nd±0,0005)Adim
50 mL de suero
3,77
3,80
3,81
Alícuota
1,4460
1,4460
1,4460
Índice de refracción
Tabla A.12 Datos requeridos para la caracterización del ácido purificado de la fase orgánica, obtenida por el método de extracción líquido-líquido. Prueba
Valor experimental
Muestra/ Condición
Valor 1
Valor 2
Valor 3
Acidez iónica
pH (pH±0,01)Adim Nd (Nd±0,0005)Adim
50 mL de suero
3,47
3,44
3,43
Alícuota
1,4445
1,4445
1,4445
Índice de refracción
64
Tabla A.13 Parámetros necesarios para determinar la densidad del ácido antes y después de purificar. Masa picnómetro lleno (m2±0,0001)g Valor 1 51,8452 52,5072 53,3465 53,5998
Solución inicial cido de lactato1 Ácido fase acuosa 2 Ácido fase orgánica 2
Valor 2 51,9457 52,5080 53,3454 53,6003
Valor 3 51,9479 52,5086 53,3498 53,6005
Masa del picnómetro vacío (m1±0,0001) g: 23,5568 Volumen picnómetro: 25mL 1 2 y : se refieren al método de purificación aplicado; obtención de lactato y separación líquido-líquido respectivamente.
Tabla A.14 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra diluida de ácido purificado. Volumen de NaOH utilizado (V NaOH ±0,05)mL Valor 1 1,50 3,80 4,40
Ácido de lactato1 Ácido fase acuosa 2 cido fase orgánica 2
Valor 2 1,60 3,65 4,35
Valor 3 1,45 3,75 4,50
Volumen de ácido purificado: (2,0 ± 0,5) mL Volumen de muestra diluida: (20,0 ± 0,5) mL Volumen alícuota valorada: (2,0 ± 0,5) mL
Tabla A.15 Volumen de base gastado en la titulación de la muestra diluida de ácido pre-concentrado Volumen de NaOH utilizado (V NaOH ±0,05) mL Valor 1 5,00
Valor 2 5,30
Valor 3 5,20
Volumen de ácido purificado: (2,0 ± 0,5) mL Volumen de muestra diluida: (22,0 ± 0,5) mL Volumen alícuota valorada: (2,0 ± 0,5) mL
Tabla A.16 Parámetros necesarios para el cálculo de la densidad del polímero sintetizado. Muestra
Peso de la muestra (m±0,0001) g
Volumen de agua (V 1±0,2) mL
Volumen de agua + muestra (V 2 ±0,2) mL
1
2,5278
10,0
12,0
2
2,5276
10,0
12,0
3
2,5280
10,0
12,0
Tabla A.17 Punto de fusión del polímero sintetizado, calculado mediante el Método de Thiele. Muestra
Punto de fusión experi mental (Pf±1) °C
1
170
2
175
3
175 65
Tabla A.18 Acidez iónica de las soluciones antes y después del proceso de degradación. Solución Buffer 1 Agua de chorro Buffer 2
pH inicial (pHi ± 0,01)Adim
pH fi nal (pHf ± 0,01)Adim
Valor 1 4,02 7,32
Valor 2 4,04 7,30
Valor 3 4,02 7,30
Valor 1 4,01 7,20
Valor 2 4,00 7,24
Valor 3 4,00 7,18
10,07
10,09
10,07
10,07
10,05
10,05
Buffer 1: solución de pH=4. Buffer 2: solución de pH=10. pH: acidez iónica.
Tabla A.19 Peso de las muestras antes y después del proceso de de gradación. Solución Buffer 1 Agua chorro Buffer 2
Peso inicial (Pi ± 0,0001)Adim Valor 1 0,2758 de 0,2588 0,2740
Peso final (P f ± 0,0001)Adim
Valor 2 0,2756 0,2589
Valor 3 0,2760 0,2587
Valor 1 0,2602 0.2502
Valor 2 0,2602 0,2502
Valor 3 0,2602 0,2502
0,2742
0,2744
0,2650
0,2650
0,2650
Buffer 1: solución de pH=4. Buffer 2: solución de pH=10. pH: acidez iónica.
Tabla A.20 Valores de dureza del polímero sintetizado. Muestra
Dureza Shore A (D±1) Adim
1 2 3
65 60 62
66
APÉNDICE B. CÁLCULOS TÍPICOS Determinación del valor promedio del contenido de azúcar presente en el suero Mediante la ecuación B.1
∑:
(B.1)
(Walpole, 1999)
Donde: X: valor promedio del parámetro de interés. Xi: valor “i”. n: número de mediciones, (Adim). Sustituyendo los datos suministrados en la tabla A.1 (Apéndice A) para el cálculo de °Brix, se obtuvo que el contenido de azúcares presentes en el suero lácteo proveniente de la quesera familiar, antes del pretratamiento, resultando ser de:
Cálculo del error:
° 8,3 +8,33 +8,3 8,3 °
Aplicando el método de derivadas parciales, se obtuvo que:
∆ ∑= .∆
(B.2)
(Walpole, 1999) Donde:
∆:error asociado a la variable en estudio. Al sustituir, se obtiene:
∆° (0,31 + 0,31 + 0,31 ) 0,1
Por tanto, el valor del contenido de azúcar presente en el suero, se expresa de la siguiente manera:
° 8,3±0,1 °
Para determinar el valor de este parámetro, después de aplicar el pre-tratamiento, se aplican las mismas formulas, sustituyendo en esta ocasión la información contenida en la tabla A.3. De igual forma, se procedió con el suero proveniente de la empresa LACSA, cuya información de interés se encuentra en las tablas A.2 y A.4. 67
Determinación del contenido de ácido láctico presente en el suero Según la Norma COVENIN 658:1997, se establece que una de las formas de expresar los resultados es indicando que por cada 1mL de NaOH 0,1N gastados en el estudio se tienen 0,009 g de ácido láctico, en los 10 mL de muestra. Adaptando dicha relación para reportar los resultados en gramos de ácido láctico por cada litro de suero, se obtuvo que:
1.
(B.3)
(COVENIN 658:1997)
Donde: CAL: cantidad de ácido láctico contenido en 1 litro de suero, (g/L). F1: constante de valor 0,9 gAL/(Lsuero. mL NaOH) V NaOH: volumen de hidróxido de sodio 0,1M utilizados en la valoración del suero, (mL). Sustituyendo los datos suministrados en la tabla A.1 (Apéndice A), se obtuvo que la cantidad de ácido láctico presente en 1Litro de suero lácteo proveniente de la quesera familiar, antes del pre-tratamiento, es:
0,9 .12,80 11,52 .
De la misma forma, se procedió a calcular con el resto de los datos y se calculó un promedio, según la ecuación B.1, con la cual se obtuvo:
11,985
Calculando el error de la medición aplicando el método de derivadas parciales:
.∆ |1|.∆ 0,9.0,05 0,045 ≅ 0,05 ∆ Entonces, el contenido de ácido láctico presente en el suero, antes del pre-tratamiento, se expresa de la siguiente manera:
11,99±0,05 68
El cálculo de este parámetro para el mismo suero, después del pre-tratamiento, se calculó con los datos recolectados en la tabla A.3 y para el suero proveniente de la empresa LACSA antes y después del tratamiento, con información de las tablas A.2 y A.4 respectivamente .
Determinación del valor promedio de la acidez iónica contenida en el suero El valor fue reportado directamente por el equipo. La toma de datos se realizó por triplicado y se procedió a calcular un promedio, según la ecuación B.1. Para el suero proveniente de la quesera familiar, antes del pre-tratamiento, se obtuvo que:
Donde:
4,52+4,54+4,52 4,527 3
pH: acidez iónica, (Adim). Cálculo del error: se aplica la ecuación B.2 y se obtiene:
∆ (0,301 + 0,301 + 0,301 ) 0,01
Por tanto, el valor a reportar es:
4,53±0,01
La tabla A.3 muestra información para el mismo suero después de ser tratado y las tablas A.2 y A.4 para el suero proveniente de la empresa LACSA antes y después del tratamiento.
Determinación del contenido de cenizas presentes en el suero Se aplicó la siguiente ecuación
− − .100
(B.4)
(COVENIN 368:1997)
Donde: C: porcentaje de cenizas, (%p/p). M1: masa del vidrio de reloj vacío, (g). M2: masa del vidrio de reloj con 1mL de muestra, (g). M3: masa del vidrio de reloj con las cenizas, (g). Sustituyendo la información contenida en la tabla A.1, para el valor 1, se obtuvo: 69
572024,5103 .100 5,8789 %/ 24, 25,559824,5103 De la misma forma, se procedió a calcular el porcentaje de cenizas para el valor 2 y 3; luego se calculó un promedio, según la ecuación B.1, con la cual se obtuvo:
5,7564 %/
Aplicando el método de las derivadas parciales a la ecuación B.4, se obtuvo el error, el cual se expresa de la siguiente manera:
.∆1+ .∆2+ .∆3 0,02 0,019 ≅ 0,02 ∆ 1 2 3 21
Por tanto, el valor a reportar fue de:
5,76 ±0,02%/
De igual forma, se procedió para el cálculo de la información contenida en las tablas A.2, A.3 y A.4.
Determinación de la cantidad de proteínas presentes en el suero lácteo Mediante la siguiente ecuación
2,24.∗ (B.5) (Periago, 2012)
Donde: P: porcentaje de proteínas presentes en el suero, (%). V NaOH*: volumen de hidróxido de sodio 0,1M gastado en segunda valoración, (ml). Se sustituyen los datos reportados en la tabla A.1, apéndice A, obteniéndose:
2.24×6,35 14,224 %
Como el cálculo se realizó por triplicado, se aplicó la ecuación B.1 para obtener la media del valor, siendo esta:
15,0453 %
Cálculo del error: Aplicando el método de derivadas parciales
∗.∆∗ 2,24×0,05 0,112 ≅ 0,1 ∆ 70
Por tanto, la cantidad de proteínas presentes en el suero fueron:
15,0 ±0,1 %
Dicho valor es para el suero proveniente de la quesera familiar antes de tratamiento térmico aplicado; para conocer su valor después de dicho tratamiento, se utilizó la tabla A.3. Para el suero proveniente de la empresa LACSA, se utilizaron las tablas A.2 y A.4.
Cálculo de cambios producidos a causa del pre-tratamiento Mediante la siguiente ecuación
(B.6) (Navarro, 2005)
Donde: Vx: variación del parámetro “x”. Vf : valor final. Vi: valor inicial. Sustituyendo los datos reportados en las tablas 4.1 y 4.2, se logró visualizar los cambios producidos por el pre-tratamiento aplicado a los sueros. Ejemplo: para determinar el cambio de la cantidad de proteínas presentes en el suero de la quesera familiar, se obtuvo que:
|12,5%15,0%| 2,5%
pH de la solución antes y después de la fermentación El valor de este parámetro es reportado directamente por el equipo. La toma de datos se realizó por triplicado y se procedió a calcular un promedio según la ecuación B.1. Para el suero proveniente de la quesera familiar suplementado y con la bacteria, según información contenida en la tabla A.5 del apéndice A, se obtuvo que:
4,89+4,87+4,90 4,8867 3 Cálculo del error: Se aplica la ecuación B.2 y se obtiene:
∆ (0,301 + 0,301 + 0,301 ) 0,01 71
Por tanto, el valor a reportar es:
4,89±0,01
Las tablas A.5, A.6, A.7 y A.8 contienen información para el cálculo de este parámetro antes y después de la fermentación de prueba, según el tipo de suero utilizado.
Determinación del contenido de azúcar antes y después de la fermentación Mediante la ecuación B.1, sustituyendo los datos suministrados en las tablasA.5, A.6, A.7 y A.8 (Apéndice A) para el cálculo de °Brix, se obtuvo el contenido de azúcares presentes en las soluciones, según la condición de interés. Ejemplo: para conocer el contenido de azúcares presente en la solución fermentada compuesta inicialmente por el suero proveniente de la empresa LACSA, suplementos y bacteria, se obtuvo:
° 6,0 +6,30 +6,0 6,0 °
Cálculo del error: aplicando el método de derivadas parciales, se obtuvo:
∆° (0,31 + 0,31 + 0,31 ) 0,1
Por tanto, el contenido de azúcar presente en dicha solución, se expresa de la siguiente manera:
° 6,0±0,1 °
Determinación del contenido de ácido láctico antes y después de la fermentación Se aplica la misma metodología explicada en el cálculo de determinación del contenido de ácido láctico presente en el suero. Sustituyendo información de interés para el cálculo de este parámetro en la ecuación B.3, se obtuvo para el suero puro proveniente de la quesera familiar, después de la fermentación, una concentración de:
0,9 .14,50 13,05 . De la misma forma se procedió a calcular con el resto de los datos y se calculó un promedio, según la ecuación B.1, con la cual se obtuvo:
13,35 72
Reportando el valor con su error asociado, se obtuvo:
13,35±0,05
La información de interés para este cálculo se encuentra contenida en las tablas A.5, A.6, A.7 y A.8
Cálculo de cambios producidos a causa de la fermentación Se utilizó la ecuación B.6, donde se sustituyeron los datos reportados en las tablas 4.6 y 4.7 lográndose visualizar los cambios producidos en la fermentación. Ejemplo: para determinar la disminución de la acidez iónica debido a la producción de ácido en el suero proveniente de la quesera de propiedad familiar, se obtuvo:
|4,464,37| 0,09
De igual forma, se procedió para el cálculo de la producción de ácido láctico y disminución del contenido de azúcares.
Cantidad de carbonato de calcio a añadir para la formación del lactato A pesar de que el carbonato de calcio puede ser agregado a la solución en exceso, es recomendable la utilización de cantidades adecuadas para evitar derroche de reactivos. Por tanto, la cantidad a añadir de este compuesto es determinada por estequiometría, según el uso de la siguiente reacción:
Donde se indica que 2 moles de AL deben reaccionar con 1 mol de carbonato para producir el lactato; por tanto, para determinar la cantidad de carbonato a adicionar, se utilizó la siguiente ecuación:
. (B.7) . . . (Propio)
Donde: gCaCO3: Cantidad de carbonato de calcio, (g). C b: concentración de la base utilizada, mol/L. (Valor conocido M NaOH=0,1 mol/L) VA: Volumen alícuota de solución titulada, mL. (Valor reportado en tabla A.9) VSE: volumen de solución a tratar, (L). PMCaCO3: peso molecular del carbonato de calcio, g/mol. (Valor teórico= 100,087g/mol) 73
Sustituyendo los valores, se obtuvo que:
. . 1 3 . 100,087 0,1.10 2 1
Resolviendo y simplificando:
0,5..
(B.8)
Para la prueba de obtención del lactato, se utilizaron 0,1L de solución y el volumen de base gastada durante la titulación, se obtuvo al promediar los valores reportados en la tabla A.9 (según la ecuación B.1). Entonces, la cantidad de carbonato añadido en ese caso fue de:
.9,88 .0,1 0,494 0,5 .
La cantidad no es reportada en el trabajo, porque no es un valor necesario para la discusión de resultados, sin embargo, forma parte del proceso.
Cantidad de ácido sulfúrico a adicionar para la regeneración del AL Se determinó mediante la estequiometría, a partir de la siguiente ecuación química:
La cual indica que para la producción de 2 moles de AL es necesaria la adición de 1 mol de ácido sulfúrico; por tanto, para determinar la cantidad de H 2SO4 a añadir, se utilizó la siguiente ecuación:
.. . . .
(B.9)
Donde: VH2SO4: volumen de ácido sulfúrico, (mL). PMH2SO4: peso molecular del ácido sulfúrico, (g/mol). (Valor teórico= 98,079 g/mol) ρH2SO4: densidad del ácido sulfúrico, (g/mL). (Valor teórico= 1,84 g/ml)
Sustituyendo los valores se obtuvo que:
. . 1 . 98,079 . 1 0,1. 10 2 1 1,84 74
Resolviendo y simplificando:
0,2665..
(B.10)
De igual forma para la aplicación del método de obtención de lactato, se obtuvo que:
0,2665 1 .9,88 .0,1 0,26 ≈ 0,5
Nota: cuando el valor es muy pequeño, se aproxima al mínimo que pueda ser medible en el instrumento a utilizar.
Acidez iónica de la solución purificada El valor fue reportado directamente por el pHmetro. Se realizó la medición por triplicado, y mediante el uso de la ecuación B.1, se reportó el valor promedio. Tomando datos de la tabla A.10, se obtuvo que:
4,20+4,21+4,20 4,2033 3
Por tanto, el valor a reportar, considerando el error de medición, fue de:
4,20±0,01
De igual forma, se procedió al cálculo de la acidez de las soluciones resultantes del método de separación líquido-líquido con 1-butanol, utilizando la información contenida en las tablas A.11 y A.12.
Índice de refracción de la solución de ácido El valor fue reportado directamente por el equipo. Se realizó la medición por triplicado y mediante el uso de la ecuación B.1, se calculó el promedio. Tomando datos de la tabla A.10, se obtuvo que:
Donde:
1,3850+1,33850+1,3850 1,3850
Nd: índice de refracción de la solución, (Adim). Cálculo del error: se aplicó la ecuación B.2 relacionada al método de derivadas parciales, y al simplificar y sustituir los valores, se obtuvo que:
∆ (0,03005 + 0,03005 + 0,03005 ) 0,0005 75
Por tanto, el valor a reportar fue de:
1,3850±0,0005
Con información contenida en las tablas A.11 y A.12, se procede a realizar los cálculos necesarios para determinar este parámetro en el caso del la purificación con 1-Butanol.
Densidad del ácido láctico purificado Se calculó mediante la siguiente ecuación:
− (B.11) (Chang, 2010)
Donde: ρ: densidad de la solución a analizar, (g/mL).
m1: masa del picnómetro vacío, (g). m2: masa del picnómetro lleno, g. v: volumen del picnómetro, mL. El cálculo del valor promedio de m2 se realizó mediante la utilización de la ecuación B.1, y los datos reportados en la tabla A.13. Al sustituir el resto de los valores (también suministrados en la tabla antes referida) para el método 1, se obtuvo que:
5568 1,158044 / 52,507923, 25 Calculando el error, aplicando el método de propagación de errores, se obtuvo que:
∆ ∆1+∆2 0,0001+0,0001 0,0002 / Entones,
1,1580 ±0,0002/
Concentración del ácido diluido Se determinó mediante la siguiente ecuación:
× × (B.12) (Chang, 2010) 76
Donde: C: concentración molar, (mol/L). V: volumen, (mL). a: subíndice del ácido a ser evaluado. b: subíndice de la base utilizada en la titulación. Entonces, para determinar la concentración del ácido diluido y titulado con NaOH 0,1M obtenido del método 1 de purificación, se tomaron los datos suministrados en la tabla A.14 y se obtuvo que:
×1,50 0, 1 , 2 0,075 / Aplicando el método de derivadas parciales para la obtención del error, se obtuvo que:
0 , 1 ∆, × ∆ 2 ×0,05 0,0025 ≈ 0,003 Por tanto, la concentración del ácido diluido fue de:
, 0,075±0,003 /
De igual forma, se procedió al cálculo de la concentración diluida del ácido purificado, mediante el método de separación líquido-líquido.
Concentración del ácido purificado Una vez obtenida la concentración del ácido diluido, se procedió a aplicar nuevamente la ecuación B.12; esta vez considerando las muestras concentradas y diluidas respectivamente. Entonces para el método 1, se obtuvo que:
×22 0, 0 75 2 0,825 / Reportando el valor con error asociado:
0,825±0,003 /
Para reportar el valor en %p/v, es necesario la transformación de unidades, por lo que es utilizado el peso molecular del ácido y un factor de conversión, como se muestra a continuación: 77
Donde:
1 ].100 % [ ( ). . 1000
%p/v: concentración del ácido en unidades peso/volumen, (%). PMAL: peso molecular del ácido láctico, (g/mol). (Valor teórico: 90,08g/mol) Sustituyendo los valores conocidos y simplificando, se obtuvo que:
% 9,008×(B.13)
Entonces para el método 1, se obtuvo un error de:
% 9,008×0,825 7,4316 %
Aplicando el método de derivadas parciales, se obtuvo un error de:
∆% 9,008×∆ 9,008 ×0,003 0,027 ≅ 0,03
Por lo que el valor final se expresa de la siguiente manera:
% 7,43±0,03 %
Concentración del ácido diluido Se utilizó la ecuación B.12, tomando el primer dato contenido en la tabla A.15, donde al sustituir se obtuvo que:
×5,00 0, 1 , 2 0,25 / De igual forma, se procedió con el resto de los valores reportados, utilizándose el valor promedio, mediante la utilización de la ecuación B.1. Tomando en cuenta el error, se tiene:
, 0,258 ±0,003 / Concentración real del ácido pre-tratado Una vez obtenida la concentración del ácido diluido, se procedió a aplicar nuevamente la ecuación B.12; esta vez considerando las muestras concentradas y diluidas. 78
Entonces se obtuvo que:
×22 0, 2 58 2 2,838 / Reportando el valor con el error asociado:
2,838±0,003 / Para reportar el valor en %p/v, se utilizó la ecuación B.13 como sigue: % 9,008×2,838 25,5647 % Expresando el valor con su error se obtuvo que:
% 25,56±0,03 %
Densidad del polímero obtenido Se calcula mediante la siguiente ecuación
−(B.14)
Donde: ρ pol: densidad del polímero sintetizado, (g/mol).
m: masa de la muestra en estudio, (g). V1: Volumen de agua, (mL). V2: Volumen de agua más muestra, (mL). Si se toman los valores reportados en la tabla A.16 correspondientes a la muestra 1, se obtuvo que:
278 1,2639 / 12,2,0 510, 0
Realizando el cálculo del error asociado a la medida, mediante el método de derivadas parciales:
∆ 1 .∆ + .∆ + .∆ 0,2
Entonces el valor de la densidad a reportar fue de:
1,3±0,2 / 79
De igual forma, se procedió a calcular las muestras 2 y 3. El valor promedio de densidad fue calculado mediante los valores de densidad puntual obtenidos para cada muestra y la ecuación B.1.
Punto de fusión medio del polímero sintetizado Es calculado mediante el uso de la ecuación B.1 y los datos suministrados en la tabla A.17.
° 173,33 ° 170+175+175 3 El error es calculado mediante la ecuación B.2 ∆ (13 + 13 + 13) 1 ° Por tanto, el valor a reportar fue de:
173±1 °
Acidez iónica del medio de degradación El valor es reportado directamente por el pHmetro. Se realizó la medición por triplicado y mediante el uso de la ecuación B.1, se reportó el valor promedio. El pH inicial de la solución buffer 1, se calculó tomando los datos de la tabla A.18.
Cálculo del error:
4,02+4,04+4,02 4,0267 3
Se aplica la ecuación B.2, y se obtuvo que:
∆ (0,301 + 0,301 + 0,301 ) 0,01
Por tanto, el valor a reportar fue de:
4,03±0,01 De igual forma, se procedió a calcular el mismo parámetro al finalizar el ensayo.
Peso del polímero La medición se realizó por triplicado en una balanza analítica digital de apreciación 0,0001g y mediante el uso de la ecuación B.1 se reportó el valor promedio. 80
Ejemplo: el peso de la muestra polimérica sumergida en la solución buffer 1 antes del proceso de degradación fue de:
+ 3 + 0,2758+0,2756+0,2760 0,2758 3
Donde:
Pi: peso inicial de la muestra, (g). 1,2 y 3: valores
individuales medidos con el equipo.
Por ser la misma medición el valor a reportar debe poseer el mismo error del equipo, es decir ± 0,0001g. De igual forma se procedió para las distintas muestras, antes y después del proceso en estudio.
Cálculo del porcentaje de variación de los parámetros analizados en la degradación del polímero Se utiliza la siguiente ecuación:
% − ×100
Donde:
(B.14)
%V: porcentaje de variación del parámetro a evaluar. Vf: Valor final. Vi: Valor inicial. Sustituyendo la información contenida en la tabla 4.15, se procedió al cálculo de la variación de masa de la muestra contenida en la solución buffer 1, producto del proceso de degradación del polímero obtenido
2602 ×100 5,656% % 0,27580, 0,2758
Cálculo de la dureza promedio Se aplicó la ecuación B.1 y por ser un valor puntual, el error de medición es el mismo que reporta el equipo.
81
ANEXO I. INFORMACIÓN PARA LA SELECCIÓN DEL MICROORGANISMO FERMENTADOR Tabla I.1 Información relevante respecto al uso de bacterias u hongos en el proceso fermentativo C aracte aracterr í stica
B acte acterr i a
H ongo ongo
Viscosidad del medio Formación de burbujas Formación de subproductos Aprovechamiento de azúcares Demanda de oxigeno Requerimiento de fuentes de nitrógeno Proceso de separación del medio Variedad de géneros * Estudios relacionados**
Baja No Poca Alto No es necesario controlar Necesario
Alta Si, especialmente el etanol Disminuye según la viscosidad Alta Innecesario
Involucra varios estudios Alta Varios
Sencillo Ninguno
*: Se refiere a la cantidad de microorganismos antes utilizados y posiblemente útiles para el proceso fermentativo **: Se refiere a la cantidad de estudios encontrados en los cuales aplica el microorganismo microorganismo para fermentar suero lácteo -: No se tiene información. Fuente: (García et al .,., 2010; Munilla y Blanco, 2005; Ríos, 2011).
82
ANEXO II. INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA Tabla II.1 Productividad de ácido láctico en diferentes condiciones de fermentación tipo lote Sustrat Sustrato o
Mi croo croorga rg anismo nismo Suple Suplem mento ntos
Cond Condiciones iciones de ferme ferment nta ación ción
Ácido láctico (g/L)
F uente uente
Lactosuero diluido 36 g/L
Lb. helviticus y Lb. bulgaricus
Ninguno
37 °C 150 rpm
4,1 y 3,9
García et al .,., 2013
Lactosuero pasteurizado y Desproteinizado Suero desproteinizado
Lb. casei
Lactosa MnSO4
37°C; pH=6,5 21 h ;150 rpm
1,1
Lb. casei
E.L; KH2PO4; K 2HPO4; MgSO4 y MnSO4 Ninguno
37°C; 150 rpm 24 h
12,45
Ríos, 2011
43°C y 125rpm pH= 6,5 37°C y 150rpm 24 h
3
Sánchez at al .,., 2007 Trabajo actual
Lb. bulgaricus Lactosuero desnatado y desproteinizado
Lb. casei
E.L; KH2PO4; K 2HPO4; MgSO4 y MnSO4
6,35
Lb: Lactobacillus; E.L: Extracto de levadura
Tabla II.2 Información teórica del ácido láctico y ácido poliláctico P aráme arámetro
Á cido ci do lácti lácti co
Á cido ci do poli poliláct láctii co
Miscibilidad Miscibilidad en agua pH Índice de refracción (Adim) Densidad (g/mL) Punto de Ebullición (°C) Punto de Fusión (°C) Dureza Shore A (D±1) Adim
Miscible 2,8 1,4414 1,249 122 @740mmHg -
Entre 1,24 y 1,64 Entre 170 y 183 83
Fuente: (Serna y Rodríguez, 2005); (Mazarro, 2009); (Figueira, 2008).
83
ANEXO III. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Método 1: Formación de lactato El método se realiza con la adición de carbonato de calcio (CaCO 3). La formación del lactato se da por la reacción del carbonato con el ácido láctico presente en la solución, según se muestra a continuación:
También se produjo lactato de calcio durante la fermentación; ya que durante la misma, el ácido láctico inicialmente generado por las bacterias, reaccionó con el CaCO 3 añadido inicialmente para la regulación del pH de la solución. El calentamiento de la solución, permitió incrementar la solubilidad de la sal (lactato de calcio) y reducir la cantidad de agua presente. La regeneración del ácido se dio mediante la adición de ácido sulfúrico (H 2SO4), como lo indica la siguiente reacción:
Durante esta mezcla se dio la formación de un precipitado marrón grisáceo, el cual según la reacción anterior, vendría siendo el sulfato de calcio que resulta como producto secundario. Gil et al .,., 2008 reporta la producción de dicho precipitado al realizar la misma mezcla. Las cantidades de reactivos a añadir fueron determinadas por estequiometría, tal y como se puede observar en el apéndice A; sin embargo, resultó importante aclarar que, en el caso de agregar carbonato de calcio en exceso esto no fuera generado grandes cambios en los resultados, ya que como se indica en la siguiente estequiometría, el exceso reaccionaría con el H 2SO4 para la formación de más sales de sulfato, que pueden ser retiradas por filtración.
Método 2: Separación líquido-líquido Como la solución inicial podría contener sales de lactato, se agregó ácido sulfúrico para transformarlo en ácido láctico (ver fórmula en el método anterior). Al realizar la mezcla, se apreció que la solución liberaba 84
