TÉCNICA DEL SUDÁN III La técnica del sudán III es un método utilizado generalmente para demostrar la presencia de grasas mediante tinción de triglicéridos, aunque también tiñe otros lípidos. Pertenece al grupo de colorantes indiferentes, que son aquellos que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. Son insolubles en el agua y tiñen t iñen aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante.
FUNDAMENTO Los colorantes para grasas son más solubles en las propias grasas que en el medio en el que van disueltos. Así, al bañar la grasa con la solución del colorante, éste tiende a disolverse en la grasa que se va cargando del colorante. Por regla general estos colorantes siempre van en solución alcohólica o bien en una mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua.
TEJIDO CONTROL Y DIANA El tejido diana para esta técnica es el tejido adiposo y lípidos en general. El fijador ideal es el formol 10%, y el grosor óptimo de corte es de 4 a 6 micras.
REOS 1. Sudán III. 2. Escarlata. 3. Hematoxilina o carmín.
PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Desparafinar e hidratar. Lavar en agua destilada. Añadir sudán III + 40 gotas de rojo escarlata, de 1 a 24 horas. Lavar con agua corriente. Añadir hematoxilina o carmín (para el contraste), 5-10 minutos. Lavar en agua corriente, 5 minutos. Montar.
RESULTADOS Color inicial:
Grasa: rojo.
MÉTODO DE BIURET Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
PROTOCOLO A REALIZAR Añadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estándar y muestras problemas preparadas como se indica en la Tabla III. Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al blanco. El color es estable 1 hora.
- Representa la curva estándar. - Calcula el coeficiente de extinción. - Calcula las concentraciones de proteínas de las muestras M1 y M2.
RESULTADOS ESPERADOS El método de Biuret (poco sensible) permitirá cuantificar la cantidad de proteínas en la muestra M1 pero no en la M2. REACTIVO DE BIURET
Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O. Mientras se agita añadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de plástico.
PRUEBA DEL YODO La prueba del yodo es una reacción química usada para determinar la presencia o alteración de almidón u otros polisacáridos. Una solución de yodo - diyodo disuelto en una solución acuosa de yoduro de potasio - reacciona con almidón produciendo un color púrpura profundo. Este tipo de prueba puede realizarse con cualquier producto que contenga almidón como ser patatas, pan o determinados frutos. Esta reacción es el resultado de la formación de cadenas de poliyoduro a partir de la reacción del almidón con el yodo presente en la solución de un reactivo llamado Lugol. La amilosa, el componente del almidón de cadena lineal, forma hélices donde se juntan las moléculas de yodo, formando un color azul oscuro a negro. La amilopectina, el componente del almidón de cadena ramificada, forma hélices mucho más cortas, y las moléculas de yodo son incapaces de juntarse, obteniéndose un color entre naranja y amarillo. Al romperse o hidrolizarse el almidón en unidades más pequeñas de carbohidrato, el color azul-negro desaparece. En consecuencia, esta prueba puede determinar el final de una hidrólisis, cuando ya no hay cambio de color constituyendo una evidencia experimental ampliamente utilizada. La solución de yodo también reacciona con el glucógeno, aunque el color producido es más castaño y mucho menos intenso. Esta prueba se utiliza como indicador del grado de madurez de los frutos. El fruto cuando está inmaduro contiene altas cantidades de almidón, que son detectadas a través de la tinción con la prueba de almidón, apareciendo como grandes zonas en el fruto teñidas de azul. Mientras que cuando un fruto esta maduro, ese almidón se ha transformado en azúcares y por lo tanto no se tiñe en la prueba. En la industria, la hidrólisis del almidón es ampliamente utilizada para producir glucosa a partir del almidón presente en la pulpa del fruto de banano verde. El proceso consta de tres etapas:
1. Gelatinización: Consiste en calentar los gránulos de almidón en agua y separar la amilosa de la amilopectina. (Lixiviación).
2. Dextrinización: Luego de la gelatinización del almidón, se procede a obtener polisacáridos de bajo y alto peso molecular (maltodextrinas) aplicando una hidrolización parcial. Las dextrinas también pueden experimentar cambio de coloración cuando reaccionan con una solución de yoduro de potasio. La coloración obtenida va a depender del grado de hidrólisis de la molécula, (en este caso se trata de macromoléculas las cuales están conformadas por una cantidad importante de átomos en su estructura).
3. Sacarificación:
En esta etapa, se hidrolizan totalmente las mal todextrinas a glucosa, completándose el proceso.
En el procedimiento industrial anteriormente detallado, puede utilizase la prueba de yodo para realizar seguimiento de las reacciones de hidrólisis. Cuando el almidón se degrada totalmente a glucosa, ya no se obtiene la coloración azul oscura que caracteriza a la reacción entre el almidón y la solución de yodo-yodurada.
