SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS dan MICROPLATE READER A. SPEKTROFO SPEKTROFOTOM TOMETRI ETRI UV-V UV-VIS IS
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vi UV-Viss paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna uga untuk untuk sample tak berwarna. berwarna. Spektrofotometer Spektrofotometer UVVis !Ultra Violet-Visible" adalah salah satu dari sekian banyak instrumen yang ang bias biasaa digu diguna naka kan n dala dalam m meng mengan anal alis isaa
suat suatu u seny senyaw awaa kimi kimia. a.
Spek Spektr trof ofot otom omete eterr
kema kemamp mpua uanny nnyaa
umum umum
digu diguna naka kan n
karen karenaa
dalam dalam
menganalisa begitu banyak senyawa kimia serta kepraktisannya dalam hal preparasi sampel apabila dibandingkan dengan beberapa metode analisa. Spektrofot Spektrofotometri ometri UV#Vis UV#Vis melibatkan melibatkan energi energi elektronik elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spetrofotometer UV#Vis UV#Vis lebih banyak dpakai ntuk analisis kuantitatif dibanding kualitatif. kualitatif. Spektroskopi ultraviolet-visible atau spektrofotometri ultravioletvisible !UV-Vis atau UV # Vis" melibatkan spektroskopi dari foton dalam daerah UV-terlihat. $ni berarti menggunakan cahaya dalam terlihat dan berdekatan !dekat ultraviolet !UV" dan dekat dengan inframerah !%$&"" kisar kisaran an.. 'eny 'enyer erap apan an dalam dalam rent rentan ang g yang yang terli terliha hatt secara secara lang langsu sung ng mempengaruhi warna bahan kimia yang terlibat. Spektrofotometri UV#V$S meruu meruuk k pada pada spektro spektrofot fotome ometri tri absorb absorbsi si UV#V$S UV#V$S yang yang mana mana termasu termasuk k metode spektroskopi molekuler. Spektrofotometri UV#V$S bekera pada daera erah
spektrum rum
Spektrofotometri
ultraviolet UV
bekera
!UV" pada
dan
sin sinar
da e ra h
tampak
!V$ !V$S".
ℷ = 10− 380
nm.
Spektrofotometri visibel bekera pada daerah daerah
ℷ = 400 − 750 nm .
(arna sinar tampak berhubungan dengan panang gelombangnya. )ubungan antara warna dengan panang gelombang sinar tampak 'anang gelombang
(arna yang diserap
(arna komplementer
*++-* *-*+ *+-*0+ *0+-++ ++-2+ 2+-+ +-0 0-2+ 2+-4+
Ungu /iru /iru Kehiauan )iau Kebiruan )iau )iau Kekuningan Kuning 1range Merah
)iau Kekuningan Kuning 1range Merah Merah 3nggur Ungu /iru /iru Kehiauan )iau Kebiruan
1. Prinsip Kerja 'rinsip kera spektrofotometri UV-Vis adalah interaksi yang teradi
antara energy yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang berupa molekul. /esar energy yang diserap tertentu dan menyebabkan electron tereksitasi dari ground state ke keadaan tereksitasi yang memiliki energy lebih tinggi. Serapan tidak teradi seketika pada daerah ultraviolet-visible untuk semua struktur elektronik tetapi hanya pada system-sistem terkonugasi, struktur elektronik dengan adanya ikatan p dan non bonding electron. 'rinsip kera spektrofotometri berdasarkan hukum 5ambert /eer, bila cahaya monokromatik !$o" melalui suatu media !larutan", maka sebagian cahaya tersebut diserap !$a", sebagian dipantulkan !$r", dan sebagian lagi dipancarkan !$t". /erdasarkan teori tersebut, pinsip kera dari alat ini adalah suatau cahaya monokromatik akan melalui suatu media yang memiliki suatu konsentrasi tertentu, maka sakan membentuk spectrum cahaya, namun ketika melewati monokromator, cahaya yang keluar hanya akan terdapat satu cahaya yaitu yang sesuai dengan setting awal, misalnya warna hiau. Setelah keluar dari monokromator, cahaya
akan menembus sampel atau larutan yang kemudian menuu detector dimana cahaya yang di hasilkan dari sampel akan di ubah menadi listrik yang kemudian akan terbaca hasil pada read out !monitor". Spectrum cahaya yang dapat terlihat oleh mata terentang antara *++ nm sampai ++ nm. 'ada teknik spektrofotometri, cahaya dari sumber cahaya diuraikan menggunakan prisma sehingga di peroleh cahaya monokromatis yang diserap oleh 6at yang akan diperiksa. 7ahaya monokromatis merupakan cahaya satu warna dengan satu panang gelombang, sehingga cahaya yang diserap oleh larutan berwarna dapat diukur. 2. Instr!en Sumber Energi .
Monokro mator
Kuvet
Detektor
Pengolah Signal dan Readout
Sumber energi yang umum yaitu lampu hidrogen dan lampu deuterium yang memilki radiasi continum dengan panang gelombang 82+-+ nm. 5ampu 9enon uga dapat digunakan sebagai sumber energi pada daerah UV, namun tidak sestabil lampu hidrogen. Kuvet yang digunakan untuk daerah ultraviolet adalah berbahan kuarsa, sementara untuk daerah visibel bisa menggunakan kuvet berbahan kuarsa, gelas, atau plastik. :ua enis detektor yang digunakan untuk spektrometer UV#V$S adalah phototubes dan photomultiplier yang terdiri dari sebuah permukaan photosensitif yang dapat menyerap radiasi UV#V$S dan menghasilkan arus listrik yang sebanding dengan umlah foton yang sampai pada detektor.
". #a$ian dan Fn$si dari UV-VIS 1% S!&er Ca'a(a Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar
polikromatis dengan berbagai macam rentang panang gelombang. Untuk spektrofotometri ;
a. UV menggunakan lampu deuterium atau disebut uga heavi hydrogen !82+-4 nm" b. V$S menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram !lampu piar" menghasilkan spectrum kontiniu <+-<++ nm c. UV-V$S menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator d. $nfra merah, lampu pada panang gelombang $&. e. 5ampu =ungsten !(olfram" ; 5ampu ini digunakan untuk mengukur sampel pada daerah tampak. /entuk lampu ini mirip dengna bola lampu piar biasa. Memiliki panang gelombang antara +-<<++ nm. Spektrum radiasianya berupa garis lengkung. Umumnya memiliki waktu 8+++ am pemakaian. 2% M)n)*r)!at)r =erdiri atas ; a. 'risma, berfungsi mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya di dapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis. b. Kisi difraksi, berfungsi menghasilkan penyebaran dispersi sinar secara merata, dengan pendispersi yang sama, hasil dispersi akan lebih baik. Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh angkauan spektrum. c. 7elah optis, berfungsi untuk mengarahkan
sinar
monokromatis yang diharapkan dari sumber radiasi. 3pabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi akan dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh panang gelombang yang diharapkan. d. >ilter, berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panang gelombang yang dipilih. Monokromator
berfungsi
sebagai
penyeleksi
panang
gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar
polikromatis menadi cahaya monaokromatis. ?enis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa prisma dan filter optik. ?ika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. 3da banyak lensa warna dalam satu alat yang digunakan sesuai dengan enis pemeriksaan.
"% K)!parte!en sa!pe+ Kompartemen ini digunakan sebagai tempat diletakkannya kuvet.
Kuvet merupakan wadah yang digunakan untuk menaruh sampel yang akan dianalisis. Kuvet yang baik harus memenuhi beberapa syarat sebagai berikut ; a. 'ermukaannya harus seaar secara optis b. =idak berwarna sehingga semua cahaya dapat di transmisikan c. =idak ikut bereaksi terhadap bahan-bahan kimia d. =idak rapuh e. /entuknya sederhana
,% Dete*t)r :etektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel
dan mengubahnya menadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor ; a. Kepekaan yang tinggi b. 'erbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi c. &espon konstan pada berbagai panang gelombang. d. (aktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi. e. Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi % Read )t &ead out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya
isyarat listrik yang berasal dari detektor. ,. Pr)sedr Pe!a*aian A+at
a. 'utar tombol on-off !disebelah kira" kekanan. /iarkan 8 menit untuk memanaskan alat. 3tur tombol sampai menunuk angka nol pada petunuk @=. b. 'utar tombol pengatur panang gelombang !yang ada di sebelah atas alat" untuk memilah panang gelombang sesuai panang gelombang yang diinginkan. c. Masukkan kuvet yang berisi paling sedikit ml aAuadest kedalam tempat sampel !sebelum memasukkan kuvet, pastikan kuvet dalam keadaan kering dengan mengeringkannya dengan kertas tissue !tutup penutup sampel. d. 'utar tombol pengatur cahaya !tombol yang terletak disebelah kanan" sehingga @= menunuk angka 8++ atau 3 menunuk angka nol. e. 3ngkat kuvet yang berisi aAuadest dari tempat sampel dengan tutup. Banti isi kuvet dengan larutan lampu, baca serapannya. f. Banti larutan blanko dalam kuvet dengan larutan standar atau larutan ui, baca serapannya. . Tipe Instr!entasi dari Spe*tr))t)!etri UV-VIS a% Sin$+e #ea!
'ada
spektrofotometri
UV-Vis
tipe
single
beam
absorbsi
berdasarkan pada sinar tunggal dimana sampel akan ditentukan umlahnya pada satu panang gelombang atau fi9 wave lenght. )asil biasanya dibandingkan dengan blangko !biasanya pelarut".
Bambar 8 . Skema spektrofotometri tipe single beam
Keterangan gambar; 8" :ari celah mengeluarkan satu sinar monokromotis <" (adah atau kuvet yang dapat dilalui sinar hanya satu. " Setiap perubahan panang gelombang, alat harus dinolkan
&% D)&+e #ea!
'ada spektrofotometri UV-Vis tipe double beam absorbsi biasanya mempunyai variabel panang gelombang atau Cmulti wave lengthC. )asilnya bisa langsung dibandingkan dengan blangko.
Bambar < . Skema spektrofotometri tipe double beam.
Keterangan gambar; 8" :ari celah mengeluarkan dua sinar monokromotis. <" Sinar melaui < wadah atau kuvet yang sekaligus " 3lat hanya di auto 6ero satu kali dengan cara mengisi kedua kuvet dengan larutan blanko
'ersyaratan suatu sampel dapat dianalisa menggunakan Spektrofotometri UV Vis adalah ; 8. /ahan mempunyai gugus kromofor <. /ahan tidak mempunyai gugus kromofor tapi berwarna . /ahan tidak mempunyai gugus kromofor dan tidak berwarna, maka ditambahkan pereaksi warna !Vis" *. /ahan tidak mempunyai gugus kromofor dibuat turunannya yang mempunyai gugus kromofor !UV".
:asar dari metoda ini karena adanya perubahan sifat fisikokimia dari bahan yang diperiksa dengan alan mengamati sifat serapannya terhadap energi cahaya atau radiasi elektromagnetik. Spectrum UV-Vis merupakan hasil interaksi antara radiasi elektromagnetik !&DM" dengan molekul. &DM merupakan bentuk energi radiasi yang mempunyai sifat gelombang dan partikel !foton". Karena bersifat sebagai gelombang maka beberapa parameter perlu diketahui, misalnya panang gelombang !E", frekuensi !v", bilangan gelombang !v", dan serapan !3". &DM mempunyai vektor listrik dan vektor magnet yang bergetar dalam bidang-bidang yang tegak lurus satu sama lain dan masing-masing tegak lurus pada arah perambatan radiasi. /ila suatu cahaya monokromatis atau bukan monokromatis atuh pada medium homogen, maka sebagian dari cahaya ini akan dipantulkan, sebagian akan diabsorbsi dan sisanya akan diteruskan, sehingga dalam hal ini dapat dinyatakan sebagai berikut; $o F $r G $a G $t Keterangan; $o F $ntensitas 7ahaya yang :atang $r F $ntensitas 7ahaya yang :ipantulkan $a F $ntensitas 7ahaya yang :iserap $t F $ntensitas 7ahaya yang :iteruskan.
. Spe/tr! UV-Vis
Data-data yang dikeluarkan oleh UV atau VIS dapat berupa absorbansi atau transmitansi yang langsung dibaa pada spektro!otometer" #amun untuk UV$ VIS$ UV-VIS dan IR data yang dikeluarkan dapat berupa spektrum %ika telah dihubungkan dengan komputer" Spektrum yang dikeluarkan oleh UV$ VIS dan UV-VIS berupa pita yang lebar sedangkan pada pita yang dikeluarkan oleh IR berupa garis atau punak ta%am"
'ita melebar dari UV-V$S disebabkan karena energi yang dimiliki selain menyebabkan transisi elektronik teradi pula rotasi dan vibrasi elektron dalam molekul. Sedangkan pada $& hanya teradi vibrasi elektron maka spektrum yang dihasilkan berupa garis atau puncak taam. Selain pada $&, spektrum berupa garis dapat teradi pula pada spektroskopi %M& karena hanya teradi rotasi elektron. Spektrum yang dihasilkan dari setiap spektroskopi berbeda antara satu dengan yang lainnya. 'ara kimiawan spektrum UV, V$S maupun $& dapat dibedakan dengan mudah. Spektrum yang dihasilkan oleh UV, V$S dan UV-V$S tidak berbeda auh namun sangat sangat berbeda bila dibanding spektrum $&. Untuk membedakannya dapat dilihat pada gambar;
Bambar spektrum UV. %amun spektrum dari spektrofotometer V$S dan UV-V$S menyerupai spektrum UV
Ba mbar spektrum $&. 'ita tertinggi mengarah ke bawah sedangkan pada UV pita yang paling tinggi mengarah ke atas hal ini disebabkan spektrofotometer $& ditulis dalam bentung bilangan gelombang.
0. a+-'a+ (an$ ars Diper'ati*an da+a! Ana+isis Spe*tr))t)!etri UV-VIS a. 'ada tiap pemeriksaan angan lupa menutup tempat kuvet. b. =abung kuvet yang akan dibaca harus dalam keadaan bersih. c. /ila pada dinding tabung kuvet terdapat udara, hilangkan
dengan menentik-entikkan tabung dengan ari. d. ?angan sampai menumpahakan cairan yang diperiksa kedalam lubang tempat kuvet atau pada alat. e. 'astikan bahwa larutan yang akan diperiksa sudah tercampur dengan baik sebelum dilakukan pengukuran. f. 'engukuran selalu di kerakan dalam duplo. g. 'enetapan pada panang gelombang yang berbeda pada tiap panang gelombang alat harus di tera dengan aAuadest !3" harus menunuk angka nol atau 8++@=
3da beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri Uv-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri visibel karena
senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menadi senyawa yang berwarna. /erikut adalah tahapan-tahapan yang harus diperhatikan ; a. 'embentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis hal ini perlu dilakukan ika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah tersebut. 7ara yang digunakan adalah dengan merubah menadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu. 'ereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu; &eaksinya selektif dan sensitive • &eaksinya cepat, kuantitatif dan reprodusibel !aeg" • )asil reaksi stabil dalam angka waktu yang lama • b. (aktu operasional !operating time" 7ara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. =uuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. (aktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan. 'ada saat awal teradi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini meningkat smpai waktu tertentu hingga diperoleh absorbansi yang stabil. Semakin lama waktu pengukuran, maka ada kemungkinan senyawa yang berwarna tersebut menadi rusak atau terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya uga turun. Karena alasan inilah, maka untunk pengukuran senyawa berwarna !hasil suatu reaksi kimia" harus dilakukan pada saat waktu operasional.
c. 'emilihan panang gelombang 'anang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panang gelombang ynag mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih panang gelombang maksimal, dilakukan dengan
membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panang gelombang dari suatu larutan baku pada konsenterasi tertentu. Kadang-kadang diumpai keadaan yang mana pemakaian panang gelombang maksimal kurang baik. )al ini karena karena misalnya, selain 6at yang akan dianalisis, uga terdapat 6at lain yang mempunyai absorbansi pada panang gelombang tersebut. 3da beberapa variable yang dapat mempengaruhi absorbansi yaitu enis pelarut, p) larutan, suhu, konsentrasi dan 6at-6at pengganggu. d. 'embuatan kurva baku :ibuat seri larutan baku dari 6at yang akan dianilisis dengen berbagai konsenterasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi !y" dengan konsentrasi !H". bila hokum 5amber-/eer terpenuhi, maka kurva baku berupa garis lurus. e. 'embacaan absorbansi sampel atau cuplikan 3bsorban yang terbaca pada spektrofotometri hendaknya antara +,< sampai +, atau 8@ sampai 4+@ ika dibaca sebagai transmitansi. 3nuran ini berdasarkan anggapan bahwa kesalahan dalam pembacaan = adalah +,++ atau +,@ !kesalahan fotometri".
a!&ar A+at Spe*tr))t)!eter UV-Vis #. MICROPLATE READER Microplate &eader adalah suatu spektrofotometer khusus yang
disusun untuk membaca lempeng mikro !microplate". Microplate &eader menggunakan
prinsip
spektofotometri
yang
sama seperti
metode
konvensional, tetapi dapat menghasilkan peningkatan umlah sampel yang dapat dianalisis. 'erbedaan dengan Spektrofotometer konvensional yang memfasilitasi pembacaan pada berbagai panang gelombang, microplate reader memiliki filter atau kisi-kisi difraksi yang membatasi rentang panang gelombang yang digunakan D5$S3, umumnya antara *++-4+ nm. /eberapa microplate reader bekera dalam rentang ultraviolet dan melakukan analisis antara *+-4++ nm. Sistem optik yang dimanfaatkan oleh banyak produsen menggunakan serat optik untuk menyuplai cahaya untuk sumur lempeng mikro yang berisi sampel. /erkas cahaya yang melewati sampel memiliki diameter yang berkisar antara 8 sampai mm. Suatu sistem deteksi mendeteksi cahaya yang berasal dari sampel, menguatkan sinyal dan menentukan absorbansi sampel. Selanutnya, suatu sistem pembacaan mengubahnya menadi data yang memungkinkan interpretasi hasil penguian. Saat ini beberapa microplate reader menggunakan sistem berkas cahaya ganda.
Keterangan; 8. <. . *. . 2. 4. .
Sumber 7ahaya :iafragma 5ensa Kondensor >ilter >iber /undl 5ensa >okus Microplate :etektor
1. Cara Kerja A+at a. )ubungkan dengan arus listrik b. =ekan tombol 1% c. )ubungkan dengan printer d. (arm up selama I 8 menit e. 5etakkan microplate yang berisi sampel pada tempat yang telah
ada f. 'embacaan sampel pada microplate g. =unggu hasilnya secara langsung akan di print.
a!&ar A+at Mi/r)p+ate Reader
DAFTAR PUSTAKA
Bandar, $bnu BholibJ &ohman, 3bdul. <++4. Kimia Farmasi Analisis. ogyakarta; 'ustaka 'elaar. &usli, &aisani. Penetapan Kadar Boraks Pada Mie Basah yang Beredar Di Pasar Ciputat dengan Metode Spektrofotometri UVV!S Menggunakan Pereaksi Kurkumin. !Skripsi >M$'3 Kedokteran :an $lmu Kesehatan, ?akarta, <++0". Soewoto )afi6, dkk. <++8. Biokimia "ksperimen #a$oratorium Bagian Biokimia FKU! . ?akarta ; (idya Medika. Utomo, )arry. U%i Akti&itas Senya'a ()*"+,*(-kso.fenilkuina/olin, il+etenil0$en/ensulfonamida terhadap Siklooksigenase, *C-1,+. !Skripsi >M$'3 U$, :epok, <+8<". usbarina. <+8*. Analisis !nstrumen Kimia *Metode Spektroskopi+. 'ekanbaru; Kreasi Ddukasi.
