LAPORAN SISTEMATIKA MIKROBIA FILOGENETIK MOLEKULER
Nama : Ella Triana Aprilia
15030244028 15030244028
BIOLOGI 2015
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Klasifikasi bakteri secara filogenetik dapat dilakukan melalui analisis taksonomi molekular (Sembiring, 2010). Data yang digunakan adalah sekuens gen yang mengkode 16S rRNA (16S rDNA) pada masing-masing strain yang akan diklasifikasikan. Woese pada tahun 1980-an telah dapat menyimpulkan bahwa perbandingan filogenetik berdasarkan bagian conserved dari genom lebih stabil daripada klasifikasi berdasarkan pada sifat-sifat fenotipik (Woese, 1987). Oleh karena itu, penggunaan molekul rRNA disebarluaskan untuk pembuatan perbandingan filogenetik, dan gen 16S rRNA (1650 bp) adalah marker yang paling umum digunakan dalam bidang sistematika mikrobia (Prakash et al., 2007). Molekul 16S rRNA terdiri atas daerah variabel dan daerah conserved , dan primer universal untuk amplifikasi gen 16S rRNA biasanya dipilih dari daerah conserved sedangkan daerah variabel digunakan untuk taksonomi perbandingan. Langkah awal dalam klasifikasi filogenetik adalah mengisolasi dan memurnikan DNA kromosomal dari masing-masing strain. Gen 16S RNA selanjutnya diamplifikasi dengan teknik PCR ( polymerase chain reaction) dari masing-masing sampel DNA kromosomnya. Hasil amplifikasi tersebut dimurnikan untuk disekuensing (Prakash et al., 2007). Analisis filogenetika, kelompok outgroup sangat dibutuhkan dan menyebabkan polarisasi karakter atau ciri, yaitu karakter apomorfik dan plesiomorfik. Karakter apomorfik adalah karakter yang berubah dan diturunkan dan terdapat pada ingroup, sedangkan karakter plesiomorfik merupakan karakter primitive yang terdapat pada outgroup. Karakter sinapomorfik adalah karakter yang diturunkan dan terdapat pada kelompok monofiletik. Karakter morfologi telah lama digunakan dalam banyak penelitian filogenetika. Dengan pesatnya perkembangan teknik-teknik di dalam biologi molekuler penggunaan sekuen DNA dalam penelitian filogenetik telah meningkat pesat dan telah dilakukan pada semua tingkatan taksonomi, misalnya famili, marga, dan spesies. Filogenetik molekuler mengombinasikan teknik biologi molekuler dengan statistik untuk merekonstruksi hubungan filogenetika (Hillis et al., 1996). Menurut Prakash (2007) Klasifikasi filogenetik dilakukan melalui konstruksi phylogeny tree. Phylogeny tree yang diperoleh merupakan hasil klasifikasi yang menunjukkan hubungan filogenetik masing-masing strain bakteri yang diklasifikasikan. Terdapat 4 tahapan dalam mengkonstruksi phylogeny tree yang didasarkan atas data sekuens 16S rDNA, yaitu: a. Preparasi sekuens 16S rDNA
b. Aligment sekuens 16S rDNA c. Konstruksi phylogeny tree d. Konstruksi matriks similaritas dan perbedaan nukleotida 16S rRNA. 1.2. Rumusan Masalah Rumusan masalah pada praktikum ini adalah : Bagaimana tahapan analisis kekerabatan bakteri Escherichia dengan metode filogenetik molekuler? 1.3. Tujuan Tujuan dari rumusan masalah di atas adalah : Tujuan dari praktikum ini adalah mengetahui cara dan tahapan analisis kekerabatan bakteri Escherichia dengan metode filogenetik molekuler.
BAB II METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Praktikum Sistematika Mikrobia dengan judul “Filogenetik Molekuler ” Dilaksanakan pada hari Kamis, 2 November 2017 pukul 07:00 sampai selesai. Bertempat di Laboratorium C9 Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Surabaya. B. Bahan 1. Data sequence Strain mikroba yang digunakan merupakan genus Lactobacillus berjumlah 15 yang data sequence 16S rRNA-nya diperoleh dengan cara download dari data base Internasional melalui internet dengan alamat: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy. Data strain bakteri yang di uji ditunjukkan dalam Tabel 1 di bawah ini dan data selengkapnya mengenai sequence 16S rRNA dari masing-masing strain ditunjukkan dalam Lampiran 1. Tabel 1. Nama Strain Anggota Escherichia No
Nama Strain
1
Escherichia albertii Albert 19982
2
Escherichia fergusonii ATCC 35469
3
Escherichia coli NBRC 102203
4
Escherichia hermannii CIP 103176
5
Escherichia adecarboxylata LMG 2803
6
Escherichia blattae DSM 4481
2. Program Komputer (Software).
Untuk menganalisis data digunakan beberapa program komputer yaitu: PFE yang digunakan untuk mengatur data agar dapat dibaca oleh program algoritma. CLUSTALX yang digunakan untuk alignment data sequence 16S rRNA. Program PHYLIP yang digunakan untuk mengkonstruksi phylogeny tree. Program TREEVIEW untuk mengvisualisasikan phylogeny tree. PHYDIT untuk mengkonstruksi matriks similaritas dan perbedaan nukleotide 16S rRNA.
C. Cara Kerja 1. Koleksi data.
Data yang dikoleksi berupa sequence gen 16S rRNA 20 strain mikrobia terpilih. Data diperoleh dari data base Internasional dengan cara men-download melalui Internet dengan alamat: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy. Data sequence 16S rRNA yang dicari di download kemudian di save dalam suatu folder tersendiri. Folder disimpan di My document .
2. Preparasi sequence 16S rRNA
Data Sequence 16S rRNA yang telah diperoleh berupa file, dibuka dan di atur dengan program PFE agar dapat dibaca oleh program CLUSTALX dengan langkah-langkah sebagai beikut: a. Setelah mendapatkan data sequence 16S rRNA langkah selanjutnya adalah: b. Membuka program PFE Click File New atau Click pada icon pada sudut kiri bagian atas layer programmer’s file editor . c. Copy paste file sequence 16S rRNA dan letakkan pada file new yang telah dibuka dengan program PFE . d. Pada sudut kiri bagian atas sequence 16S rRNA yang ter-copy tersebut, dibuat fasta format dengan mengetik simbol > di depan sequence 16S rRNA dan diikuti dengan mengetikkan Acession Number dari sequence yang dipakai. e. Mengatur urutan sequence 16S rRNA supaya sejajar anatar satu sama lain. f. Save file dalam suatu folder tersendiri. 3. Alignment sequence 16S rRNA
Data sequence masing-masing strain yang sudah tersedia dalam fasta format di load ke dalam program CLUSTALX untuk di align dengan langkahlangkah sebagai berikut: a. Membuka ClustalX b. Click File, memilih Load sequence, memasukkan file sequence 16S rRNA yang diedit dalam PFE tadi dan Click Open. c. Click File, memilih Append sequence, memasukkan kembali file sequence 16S rRNA yang lain yang telah diedit dalam PFE dan Click open. Demikian seterusnya sampai seluruh genus sudah di-loading dalam direktori ClustalX . d. Click Aligment . Memilih out put options, kemudian memilih icon:
CLUSTAL format
GDE format
PHYLIP format
Kemudian Click close
e. Click Alignment . Memilih Do complete alignment f. Melihat Output Guide Tree File. Mengetikan C:\ClustalX \nama file yang disimpan.dnd , C:\ClustalX\gun4.dnd Melihat output alignment file Mengetikkan pada baris Clustal: C:\ClustalX\gun4.aln Phylip: C:\ClustalX\gun4.phy GDE: C:\ClustalX\gun4.gde g. Click align. Setelah align selesai ada instruksi: truncating sequences nama to 15 characters for phylip output . Click OK . Kemudian Close. h. Melihat di folder ClustalX ada tidaknya file yang disimpan. melihat file gun4.dnd, gun4.aln, gun4.phy dan gun4.gde dalam folder clustalX . 4. Konstruksi phylogeny tree
Seluruh sequence 16S rRNA dari masing-masing strain yang telah disatukan dalam satu file yang merupakan hasil alignment digunakan untuk mengkonstruksi phylogeny tree dengan menggunakan program PHYLIP dengan urutan langkah sebagai berikut: a. Membuka folder Phylip, mencari infile, kemudian delete file tersebut. Melakukan secara hati-hati agar file lain yang ada diprogram Phylip tidak ikut ter-delete. b. Membuka folder ClustalX . Click file gun3.phy, kemudian melakukan rename pada file gun3.phy menjadi infile. Drug (meletakkan file dengan cara menggeser) infile hasil rename untuk masuk dalam folder Phylip. c. Click Command Prompt C:\. Ini adalah program DOS yang dapat dicari dengan meng-explore all program mencari di accessories. d. Mengetikan setelah C;\Document and Settings\dengan cd\Phylip ( Enter ) e. Kemudian akan muncul C:\Phylip> f. Mengetikan dnadist pada C:\Phylip>, Contoh: C:\Phylip>dnadist ( Enter ) g. Muncul tulisan Are these setting correct ? h. Mengetikkan y ( Enter ) i. Akan muncul tulisan: Distance calculated for species Distance written to file j. k. l. m.
C:\Phylip>del infile C:\Phylip>ren outfile infile ( Enter ) C:\Phylip>neighbor ( Enter ) Akan muncul tulisan Are these setting correct ?
n. Mengetikkan y ( Enter ) o. Akan muncul tulisan: Output written on output Tree written on tree file p. C:\Phylip\exit
5. Visualisasi phylogeny tree
Untuk memvisualisasikan phylogeny tree digunakan TREEVIEW dengan urutan langkah sebagai berikut:
program
a. b. c. d. e.
Click TREEV32 Click File Open Look in PHYLIP Memilih files of type: All file (*.*) Click Treelife kemudian open Click Tree mencari/menentukan define outgroup kemudian click tree kembali dan memilih edit preferences, kemudian memilih Phylogram. f. Click file save as graphic dalam suatu folder tersendiri. 6. Pengeditan nama (editing ) strain dalam phylogeny tree
Meng-import tree yang telah disimpan dalam format wmf ke dalam WORDS dengan cara: a. b. c. d.
Membuka program WORDS Insert-picture-from file ( Enter ) Mengedit nama strain dengan cara double click pada tree Apabila nama strain melampaui batas gambar, dapat disesuaikan batas gambar dengan mengklik reset picture boundary (bila menu tidak muncul, mengaktifkan Picture dalam melalui Tool-Customize) e. Jika textbox nama strain tidak aktif, mengaktifkan dengan cara regrouping yaitu meletakkan crusor pada tree lalu klik tombol kanan pada mouse, dan memilih regrouping/ungrouping f. Caption untuk tree dapat diberi dengan cara menyisipkan textbox di bawah tree, lalu ketik sesuai dengan yang dikehendaki. 7. Presentasi phylogeny tree
Hasil yang berupa tree dipresentasikan dengan menggabungkannya ke dalam teks yang dikehendaki.
8. Konstruksi matriks similaritas dan perbedaan nukleotide 16S rRNA
Mengkonstruksi matriks dilakukan dengan menggunakan file yang berisi sequence dalam fasta format (>) sudah di align yang disimpan dalam format GDE mengikuti langkah berikut: a. Membuka program PHYDIT untuk mengkonstruksi matriks similaritas dan perbedaan nukleotida 16S rRNA b. File-New c. OK d. Akan muncul: No entry to tag e. Data-Import-GDE ( NT replace) f. Click File Name, mencari di folder ClustalX nama file fun3.gde g. Open h. OK i. Click Analysis-Sim Table: Generating Similarity Table j. OK ( Enter ) k. OK ( Enter ) l. Akan muncul Similarity Table dalam bentuk Note Pad. m. Mengkopikan table ini dalam program EXELL agar mudah dibaca isinya dengan cara: Copy paste pada baris pertama kolom kedua nama-nama identitas strain Copy paste sisa Tabel yang tersisa dengan cara meletakkan pada kolom pertama baris kedua dalam program EXELL. n. Membuat table dalam WORDS untuk mempresentasikan hasil print out table dalam EXELL.
BAB III HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Analisis dilakukan setelah didapatkan strain bakteri Escherichia, kemudian dilakukan bantuan software PFE dengan memasukkan strain yang terpilih ke dalam software tersebut. Seperti gambar berikut:
Gambar 1. Pengaplikasian sequence menggunakan PFE Setelah itu hasil dari copy-paste sequence kemudian diluruskan dan disave dengan nama yang sesuai nama sequence strain terpilih. Kemudian dilanjutkan dengan metode alignment sequence 16S rRNA menggunakan program ClustalX. File yang telah disimpan dari program PFE, dimasukkan ke dalam program ClustalX. Saat mengonstruksi file tersebut, terdapat tampilan berupa urutan basa nitrogen masing-masing sekuens. (Gambar 1). Urutan basa nitrogen ditampilkan sesuai dengan panjang sekuens dan setiap basa nitrogen memiliki satu warna tertentu, yaitu hijau untuk A, merah untuk T, ungu untuk G, dan biru untuk C. Selain itu, tampilan urutan basa nitrogen juga dapat diubah menjadi urutan asam amino sesuai dengan urutan kodonnya. Sehingga didapatkan hasil sebagai berikut:
Gambar 2. Pengaplikasian Alignment sequence 16S rRNA menggunakan ClustalX Setelah didapatkan hasil seperti gambar diatas, melanjutkan metode selanjutnya. Untuk mendapatkan pohon filogenetik didapatkan dari metode sebelum-sebelumnya. Pohon filogenetik yang terbentuk dari kesepuluh organisme yang dianalisis terdiri atas 2 cabang utama yang membentuk cabang-cabang lanjutan (Gambar 3).
Gambar 3. Pohon filogenetik dari spesies genus Escherichia Keterangan gambar (3) : Albert = Escherichia albertii NBRC 102203 = Escherichia coli ATCC = Escherichia fergusonii
DSM = Escherichia blattae CIP = Escherichia hermanii LMG = Escherichia adecarboxylata Berbagai spesies dari genus Escherichia yang saling berdekatan posisinya dalam pohon filogenetik dapat diduga memiliki hubungan kekerabatan yang dekat, begitupun sebaliknya. Pada gambar (3) kode strain DSM dari Escherichia blattae berjarak jauh dengan kode strain yang lain, sehingga dapat dikatakan bahwa hubungan kekerabatannya tidak dekat. Berbeda dengan kode strain dari ATCC dari Escherichia fergusonii dan kode strain NBRC 102203 dari Escherichia coli berjarak sangat dekat dengan kode strain Albert dari Escherichia Albertii. Analisis kekerabatan secara lebih akurat dapat dilakukan dengan menggunakan panjang cabang. Jika selisih panjang cabang antara 2 organisme tersebut sangat jauh, hubungan kekerabatan di antara keduanya juga jauh, begitupun sebaliknya. Panjang cabang yang bernilai 0.0 menunjukkan bahwa organisme tersebut sangat dekat dengan nenek moyangnya, bahkan organisme itu sendiri dapat diduga sebagai nenek moyang. Dengan mengetahui skala pada tiap titik dapat mengetahui antara hubungan kekerabatan yang terkait. Dapat dilihat indeks similartas dari setiap spesies dengan jarak yang berbeda-beda. Ada yang jaraknya saling berdekatan sehingga dapat disimpulkan memiliki kesamaan yang dekat. Dan ada juga yang berjarak agak berjauhan yang tidak memiliki kesamaan yang dekat.
BAB IV PENUTUP A. Kesimpulan Berdasarkan hasil yang telah diperoleh Berbagai spesies dari genus Escherichia yang saling berdekatan posisinya dalam pohon filogenetik dapat diduga memiliki hubungan kekerabatan yang dekat, begitupun sebaliknya. Pada gambar (3) kode strain DSM dari Escherichia blattae berjarak jauh dengan kode strain yang lain, sehingga dapat dikatakan bahwa hubungan kekerabatannya tidak dekat. Berbeda dengan kode strain dari ATCC dari Escherichia fergusonii dan kode strain NBRC 102203 dari Escherichia coli berjarak sangat dekat dengan kode strain Albert dari Escherichia Albertii. Analisis kekerabatan secara lebih akurat dapat dilakukan dengan menggunakan panjang cabang. Jika selisih panjang cabang antara 2 organisme tersebut sangat jauh, hubungan kekerabatan di antara keduanya juga jauh, begitupun sebaliknya. B. Saran Saran yang dapat diberikan adalah praktikan hendaknya memahami terlebih dahulu apa yang akan dipraktikumkan, sehingga praktikan dapat mengikuti jalannya praktikum dengan baik, dan praktikan seharusnya lebih teliti dalam memasukkan data, sehingga hasil yang diperoleh akan lebih akurat.
