Analisis Filogenetik
Phyllanthus niruri L. (menir (meniran) an),, yang yang dikenal dikenal oleh oleh masyar masyaraka akatt Indones Indonesia ia khususnya sebagai obat tradisional untuk menyembuhkan diare, sariawan, kencing batu, malaria dan peluruhan air seni (diuretikum), merupakan salah satu kelompok tumbuhan besar dan beraneka ragam dalam morfologinya dan belum menjadi obyek penelitian dalam bidang filogenetik molekuler. Meniran merupakan tumbuhan terna, berumah satu dan bunganya berkelamin tunggal, batang tumbuh tegak mencapai 1 cm dengan warna yang ber!ariasi, antera memecah secara hori"ontal, dan berbuah licin. licin. #istribus #istribusii tumbuhan tumbuhan ini sangat luas meliputi meliputi $sia, $ustrali $ustralia, a, $merika, $merika, dan $frika (%nander et al ., ., 1&&1). 'umbuhan ini tumbuh liar di tempat terbuka (misalnya di pantai, ladang, dan tepi sungai) pada ketinggian mulai dari satu sampai 1 m dpl (acker and !an den rink, 1&*). Meskipun karakteristik jenis ini secara morfologi sudah jelas (acker and !an den rink, rink, 1&*), 1&*), tetapi tetapi hubungan hubungan filogen filogeneti etik k atau atau kekerab kekerabata atan n di dalam dalam jenis jenis (intraspecies) intraspecies) dan kekerabatannya dengan jenis+jenis lainnya (interspecies (interspecies)) di dalam famili famili uphorbiacea uphorbiaceaee masih belum terselesa terselesaikan ikan karena keanekaragam keanekaragaman an morfologi morfologi anggo anggota ta+an +angg ggot otan anya ya,, misa misaln lnya, ya, warn warnaa batan batangg-ca caba bang, ng, bent bentuk uk daun, daun, dan dan pola pola percabangan. atu sistem klasifikasi yang tersedia saat ini adalah sistem yang dius diusul ulka kan n oleh oleh /ada /adad d et al . (1&&*) (1&&*).. istem istem ini membag membagii menira meniran n menjad menjadii tiga tiga kelompok berdasarkan karakter morfologi warna batang dan cabang, yaitu meniran merah, merah, meniran meniran kuning, dan meniran meniran hijau. hijau. 'etapi karakter karakter warna batang cenderung sangat dipengaruhi oleh lingkungan (0est and aith, 1&&).
2arena kelemahan karakter morfologi inilah, data yang diperoleh dari urutan basa #3$ digunakan untuk membangun hubungan filogenetik. 2arakter #3$ diketahui relatif lebih konsisten dibandingkan karakter morfologi (Morit" and /illis, 1&&4 /idayat, 56). #alam penelitian ini, analisis filogenetik dilakukan menggunakan karakter #3$, yaitu urutan nukleotida daerah I' (Internal Transcribed Spacer ) , untuk menyediakan bukti lain mengenai (1) hubungan filogenetik antarindi!idu di dalam Phyllanthus niruri, dan (5) hubungan filogenetik Phyllanthus niruri dengan jenis+jenis lainnya di dalam famili uphorbiaceae. eberapa tahun ke belakang, daerah I' sering digunakan para ahli untuk analisis filogenetik molekuler pada tumbuhan dalam rangka memahami keanekaragaman dan menjawab beberapa masalah filogenetik. /al ini karena daerah I' memiliki karakteristik unggul, diantaranya, yaitu berukuran kecil (kurang lebih 7 pasang basa) dan memiliki salinan yang banyak di dalam genom inti (aldwin et al ., 1&&6). 2arakteristik ini menyebabkan daerah I' mudah untuk diisolasi, diamplifikasi, dan dianalisis. istematika memiliki peran sentral di dalam iologi dalam menyediakan sebuah perangkat pengetahuan untuk mengkarakterisasi organisme dan sekaligus merekognisinya dalam rangka memahami keanekaragaman. ecara fundamental, sistematika bertujuan untuk memahami dan mendeskripsikan keanekaragaman suatu organisme dan merekonstruksi hubungan kekerabatannya terhadap organism lainnya, dan juga mendokumentasikan perubahan+perubahan yang terjadi selama e!olusinya dan merubahnya ke dalam sebuah sistem klasifi kasi yang mencerminkan e!olusinya tersebut.
8leh karena itu, salah satu tugas yang penting dari sistematika adalah merekontruksi hubungan e!olusi (e!olutionary relationship) dari kelompok+kelompok organisme biologi. ebuah hubungan e!olusi yang direkontruksi dengan baik dapat digunakan sebagai landasan untuk melakukan penelitian+penelitian komparatif (comparati!e in!estigations) misalnya dalam bidang ekologi danbiogeografi ampai saat ini ada dua pendekatan untuk merekonstruksi hubungane!olusi dari
sebuah
kelompok
organisme
biologi,
yaitu
fenetik
dan
kladistik.
2alaupendekatan pertama menaksir hubungan e!olusi berdasarkan kepemilikan karakter atau ciri yang sama (o!erall similarity) dari anggota+anggota suatu kelompok, makapendekatan kedua mendasari sebuah hubungan pada perjalanan e!olusi karakter atau ciri dari setiap anggota suatu kelompok yang sedang dipelajari. 2ladistik sering disebut atau ditulis di dalam literature ilmiah sebagai filogenetika dan merupakan pendekatan yang umum digunakan di dalam banyak penelitian sistematika. #i dalam pendekatan filogenetika, sebuah kelompok organisme dimana anggota+anggotanya memiliki banyak kesamaan karakter atau ciri dianggap memiliki hubungan yang sangat dekat dan diperkirakan diturunkan dari satu nenek moyang. 3enek moyang dan semua turunannya akan membentuk sebuah kelompok monofiletik. #alam analisis filogenetika kelompok outgroup sangat dibutuhkan dan menyebabkan polarisasi karakter atau ciri, yaitu karakter apomorfik dan plesiomorfik. 2arakter apomorfik adalah karakter yang berubah dan diturunkan dan terdapat pada ingroup, sedangkan karakter plesiomorfik merupakan karakter primiti!e yang terdapat pada outgroup. 2arakter sinapomorfik adalah karakter yang diturunkan dan
terdapat pada kelompok monofiletik. 9ambar 1 memperlihatkan sebuah pohon kekerabatan sebagai hasil dari analisis filogenetika.
Lebih lanjut, pohon filogenetika yang dihasilkan dapat diterjemahkan ke dalam sebuah sistem klasifikasi (sering disebut klasifikasi filogenetika), dan untuk itu hanya kelompok monofiletik yang dapat digunakan. erbeda dengan klasifikasi tradisional (klasifikasi Linnaeus), klasifikasi filogenetika mengelompokkan satu takson berdasarkan pengetahuan tentang hubungan filogenetika takson tersebut dengan takson lainnya, sehingga sistem klasifikasi yang dihasilkan bersifat obyektif. 2. Filogenetika Molekuler
2arakter
morfologi
telah
lama digunakan
dalam
banyak penelitian
filogenetika. #engan pesatnya perkembangan teknik+teknik di dalam biologi molekuler, seperti :;< (polymerase chain reaction) dan sikuensing #3$,
penggunaan sikuen #3$ dalam penelitian filogenetika telah meningkat pesat dan telah dilakukan pada semua tingkatan taksonomi, misalnya famili, marga, dan species. ilogenetika molekuler mengkombinasikan teknik biologi molekuler dengan statistik untuk merekonstruksi hubungan filogenetika. :emikiran dasar penggunaan sikuen #3$ dalam studi filogenetika adalah bahwa terjadi perubahan basa nukleotida menurut waktu, sehingga akan dapat diperkirakan kecepatan e!olusi yang terjadi dan akan dapat direkonstruksi hubungan e!olusi antara satu kelompok organisme dengan yang lainnya. eberapa alasan mengapa digunakan sikuen #3$= (1) #3$ merupakan unit dasar informasi yang mengkode
organisme4
menggabungkan
(5)
informasi
relatif
lebih
mengenai
mudah proses
untuk e!olusi
mengekstrak suatu
dan
kelompok
organisme,sehingga mudah untuk dianalisis4 (*) peristiwa e!olusi secara komparatif mudah untuk dibuat model4 dan (>) menghasilkan informasi yang banyak dan beragam, dengan demikian akan ada banyak bukti tentang kebenaran suatu hubungan filogenetika. ikuen #3$ telah menarik perhatian para praktisi taksonomi dunia untuk dijadikan
karakter
dalam
penelitian
filogenetika
karena
beberapa
fakta.
:ertama,sikuen #3$ menawarkan data yang akurat melalui pengujian homologi yang lebih baik terhadap karakter+karakter yang ada. 2edua, sikuen #3$ menyediakan banyak 2ursus imgkat $plikasi :eramgkat Lunak :$%: dan Mrayes untuk :enelitian ilogenetika Molekuler I'/+I' 5 character states karena perbedaan laju perubahan basa+basa nukleotida di dalam lokus yang berbeda adalah besar. #an ketiga, sikuen #3$ telah terbukti menghasilkan
sebuah hubungan kekerabatan yang lebih alami (natural). umber karakter #3$ dapat diperoleh dari inti (n#3$), kloroplas (cp#3$),dan mitokondria (mt#3$). 'abel 1 memuat beberapa sistem gen dan genom yang telah digunakan dalam penelitian filogenetika molekuler.
#ari tabel di atas, para peneliti dihadapkan pada dua dasar pemilihan. Pertama, gen atau genom yang mana yang harus dipilih sebagai jawaban terbaik terhadap suatu pertanyaan filogenetika. Misalnya, masalah filogenetika pada tumbuhan, maka genom yang tepat harus dipilih adalah kloroplas atau inti bukan mitokondria, karena pada tumbuhan #3$ mitikondria memiliki. *. 'ahapan dalam analisis filogenetika molekuler $nalisis filogenetika molekuler merupakan proses bertahap untuk mengolah data sikuen #3$ atau protein sehingga diperoleh suatu hasil yang menggambarkan estimasi mengenai hubungan e!olusi suatu kelompok organisme. $da sejumlah asumsi yang harus diperhatikan sebelum menggunakan data sikuen #3$ atau protein
ke analisis, diantaranya yaitu (1) sikuen berasal dari sumber yang spesifik, apakah dari inti, kloroplas atau mitokondria4 (5) sikuen bersifat homolog (diturunkan dari satu nenek moyang)4 (*) sikuen memiliki sejarah e!olusi yang sama (misalnya bukan dari campuran #3$ inti dan mitokondria)4 dan (>) setiap sikuen berkembang secara bebas. :aling sedikit, ada tiga tahap penting dalam analisis filogenetika molekuler, yaitu
se?uence alignment , rekonstruksi pohon filogenetika, dan e!aluasi pohon
filogenetika dengan uji statistik. 3.1 Sequences alignment
'ujuan utama dari tahap ini adalah untuk menentukan apakah satu sikuen #3$ atau protein adalah homolog dengan yang lainnya. $lignment yang melibatkan dua sikuen yang homolog disebut pairwise alignment, sedangkan yang melibatkan banyak sikuen yang homolog disebut
multiple alignment. 2eberhasilan analisis
filogenetika sangat tergantung kepada akurasi proses alignment. aat ini, banyak program komputer tersedia secara gratis di internet untuk membantu proses alignment, misalnya ;lustal@. #alam studi filogenetika molekuler, tahap ini akan menjadikan, misalnya setiap basa nukleotida ($,;,',9), menjadi site tertentu yang e?ui!alen dengan karakter, seperti karakter lebar daun atau sifat permukaan batang ketikamenggunakan data morfologi. Aadi, misalnya diperoleh ukuran sikuen #3$ sepanjang pasang basa, maka jumlah karakter yang digunakan adalah sebanyak k arakter.
#alam proses alignment sering ditemukan adanya gap, yang ditandai oleh garis putus+putus. 9ap terjadi karena adanya insersi dan atau delesi. #alam prakteknya, gap bisa dianggap sebagai data yang hilang, walaupun dalam bany ak kasus gap dapat dilibatkan dalam analisis karena bisa bersifat informatif. 3.2 Rekonstruksi pohon filogenetika
Metode dalam membangun suatu pohon filogenetika dengan menggunakan karakter molekuler, sikuen #3$ misalnya, dibagi menjadi empat kelompok utama, yaitu distance method (#M), likelihood method (LM), ayesian method (M), dan parsimony method (:M). :rinsip #M adalah jumlah perbedaan nukleotida antara dua sikuen #3$ menunjukkan jarak e!olusi yang terjadi. Aarak e!olusi dihitung untuk semua pasang sikuen #3$ dan sebuah pohon filogenetika direkonstruksi dari jarak atau perbedaan pasangan basa nukleotida tersebut dengan menggunakan kriteria least s?uare, minimum e!olution, neighbor joining, dan distance measure. ebelum digunakan untuk merekonstruksi pohon filogenetika, LM telah lama digunakan untuk data frekuensi gen. :rinsip dari LM ini adalah bahwa perubahan+ perubahan diantara semua basa nukleotida adalah sebanding. Masalah serius dari metode ini adalah waktu perhitungan yang lama, walaupun telah dikembangkan algoritma baru yang dianggap dapat mempercepat proses perhitungan. %ntuk M, pada dasarnya adalah sama dengan LM, hanya berbeda dalam penghitungan distribusi prior untuk membangun pohon filogenetika. alah satu metode untuk menghitung distribusi prior adalah metode M;M; (Marko! chain Monte ;arlo).
:M beranggapan bahwa perubahan mutasional berlangsung pada semua arah diantara empat basa nukleotida atau 5 asam amino yang berbeda dan, berbeda dengan ketiga metode yang lain, hanya jumlah perubahan basa nukleotida atau asam amino yang terkecil yang dapat memberikan penjelasan yang baik mengenai 2ursus imgkat $plikasi :eramgkat Lunak :$%: dan Mrayes untuk :enelitian ilogenetika Molekuler I'/+I' 5 keseluruhan proses e!olusi yang terjadi. 2emudian, topologi pohon yang dipilih sebagai yang terbaik adalah yang mengalami jumlah perubahan yang paling kecil. #ari keempat metode di atas, :M sangat sering dipilih, antara lain karena pohon yang dibentuk lebih menggambarkan perubahan e!olusioner yang terjadi setiap waktu, mengandung asumsi bahwa proses e!olusi akan menempuh jalan yang paling singkat (parsimonious), dan perhitungan relatif lebih sederhana dan cepat dengan tingkat realibilitas yang tinggi.
3.3 Evaluasi pohon filogenetika
!aluasi pohon filogenetika berkaitan dengan uji reliabilitas dari sebuah pohon dan uji topologi antara dua atau lebih pohon yang berbeda berdasarkan set data yang sama. anyak metode telah dikembangkan untuk menguji reliabilitas, diantaranya yaitu interior branch test (I) dan
elsenteinBs bootstrap test ().
:rinsip I adalah estimasi pohon dengan menguji reliabilitas setiap cabang sebelah dalam (interior branch).
:ada , reliabilitas diuji dengan menggunakan metode fronBs bootstrap. ebuah set dari site basa nukleotida dicuplik secara acak yang dilakukan secara berulang, kemudian dilakukan konsensus, sehingga hanya satu pohon filogenetika yang dihasilkan. 2arena pada dasarnya pola perubahan basa nukleotida sangat rumit dan sering berubah sejalan dengan waktu e!olusi, metode sangat baik digunakan dalam menge!aluasi pohon filogenetika. 4. rogram komputer
aat ini terdapat dua program komputer utama yang sering digunakan untuk merekonstruksi pohon filogenetika, yaitu :$%: dan Mrayes. :$%: ( :hylogeny $nalysis of %sing :arsimony) merupakan paket yang menyediakan banyak program untuk menyelesaikan berbagai aspek dalam analisis filogenetika molekuler. :aket antara lain terdiri dari program untuk menyusun format data sikuen #3$ atau protein,
untuk
merekonstruksi
pohon
filogenetika
(berdasarkan
metode
parsimoni),dan untuk e!aluasi pohon filogenetika. :erlu dicatat bahwa program :$%: dapat me+runset data selain molekuler, misalnya morfologi. :rogram :$%: dapat dijalankan baik dengan menggunakan komputer ber+8 (operating system) Macintosh dan 0indows. eperti program :$%:, Mrayes merupakan program multifungsi untuk merekonstruksi pohon filogenetika (berdasarkan metode ayesian). ayangnya, program ini dibuat khusus hanya untuk set data molekuler. :rogram Mrayes dapat diinstal pada berbagai macam 8 (operating system) komputer= Macintosh, 0indows,%niC, dan LinuC. %ntuk memperoleh hasil yang optimum, komputer harus memiliki speed yang tinggi dan memori penyimpan data yang besar.
