Lucrări practice Fiziologie I
EXPLORAREA SERIEI LEUCOCITARE 1. NUMĂRĂTOAREA LEUCOCITELOR Măduva hematogenă este considerată actualmente ca fiind unul dintre cele mai mari „organe” ale corpului uman adult, dimensiunile sale fiind comparate cu cele ale ficatului. În mod normal, 75% dintre celulele hematopoietice aparţin seriei mieloide, iar 25% aparțin seriei seriei eritrocitare eritrocitare.. Măduva hematogenă conţine: celule stem pluripotente sunt celu celule le de orig origin inee ale ale tutu tuturo rorr lin linii iilo lorr sa sanguin guinee ; au cap capacit acitat atee de autore torege gennera erare şi dife difere rennţie ţiere. re. celule progenitoare hematopoietice, “ angajate ”, care vor da naştere diferitelor tipuri de celule sangvine : care derivă derivă eritro eritrocit citele ele,, o parte parte din celule celule progenito progenitoare are mieloide mieloide, din care leucocite (granulocitele neutrofile, eozinofile, bazofile şi monocitele) şi trombocitele . celule progenitoare limfoide, din care rezultă limfocitele B şi T. Celulele adulte aparţinând seriei leucocitare vor acţiona împreună în vederea apărării organismului împotriva agresiunii infecţioase (virale, bacteriene sau parazitare). •
•
SERIA LEUCOCITARĂ este formată din 3 linii celulare: 1. SERIA GRANULOCITARĂ cuprinde elemente polinucleare cu granulaţii neutrofile, acidofile și bazofile sub formă de: granul granuloci ocitt neseg nesegme menta ntatt (granu (granuloc locitu itull tânăr) tânăr) are nucleu nucleull în formă de potcoavă; granulocit segmentat (granulocitul adult) are nucleul segmentat. Cu cât celula este mai matură, cu atât are mai multe segmente. •
•
În funcţie de tipul granulaţiilor prezente în citoplasmă sunt diferenţiate mai multe tipuri de granulocite: – are citoplasma slab acidofilă (roz-palid), cu granulaţii a). Granulocitul segmentat neutrofil –
neutrofile specifice, mici, punctiforme şi numeroase; nucleul este segmentat în 2-5 lobi legaţi între ei prin punţi fine de cromatină. Are următoarele roluri: în microfagocitoză microfagocitoză - reprezintă funcţia principală în apărarea organismului contr contraa infecţ infecţiil iilor or (repre (reprezin zintă tă prima prima lin linie ie de apăra apărare re prin prin înglob înglobare areaa şi distru distruger gerea ea de particule din mediul extracelular). transcobalamin lamina-I a-I (α1-globul (α1-globulina ina care transportă transportă rol secret secretor or pentru pentru:: transcoba vitamina B12), interleukine (IL1 cu rol în inducerea febrei), prostaglandine. •
•
b). Granulocitul segmentat eozinofil - are în citoplasmă granule mari, egale, eozinofile
(portocalii) iar nucleul său prezintă 2 segmente. Are următoarele roluri: în fagocitoză: fagocitoză: factorii care determină chemotaxia eozinofilului sunt: complexele imune antigen-anticorp (deţin rolul major în reacţiile imune), fibrina, enzime proteolitice, histamina. Eozinofilele pot fagocita şi bacterii sau fungi, dar sunt mai puţin atrase de acestea decât neutrofilele. chiar dacă nu poate poate fagocita fagocita paraziţii, paraziţii, eozinofi eozinofilul lul se în apărarea antiparazitară: antiparazitară: chiar ataşează de aceştia şi eliberează la exterior granulaţii care conţin o substanţă cu o puternică acţiune citotoxică (PBM -proteina bazică majoră). •
•
•
în bolile alergice.
Lucrări practice Fiziologie I
c). Granulocitul segmentat bazofil - conţine granulaţii caracteristice bazofile care ocupă toată
citoplasma citoplasma,, uneori uneori suprapunâ suprapunându-s ndu-see peste nucleu; nucleul nucleul este incomplet incomplet segmenta segmentat.t. Are următoarele roluri: în fagocitoză , dar la o scară mai redusă. în degranulare , cu eliberarea la exteriorul celulei a numeroşi mediatori, fenomen cu impo im porta rtanţ nţăă în pato patoge geni niaa şi diag diagno nost stic icul ul unor unor afec afecţi ţiun unii aler alergi gice ce dar dar avân avândd şi rol rol chemotactic pentru neutrofile şi eozinofile. • •
2. SERIA LIMFOCITARĂ. După mărime limfocitele pot fi: mici, medii şi mari in funcţie de gradul de maturare şi reprezintă componenta celulară majoră din ţesuturile limfatice. Forma limfocitelor este rotundă sau uşor ovalară, cu diametrul de 6–12 µm. Nucleul este mare şi ocupă cea mai mare parte a celulei fiind intens colorat. Citoplasma este slab bazofilă (albastru-deschis). Limfocitele au următoarele roluri: în răspunsul imun , declanşat de pătrunderea în organism a unor celule străine sau a unor macromolecule proteice. Acest răspuns este caracterizat prin producţia de anticorpi de către limfocitele limfocitele B (imunitate umorală) umorală) şi de produşi celulari celulari citotoxici citotoxici eliberaţi eliberaţi de către limfocitele T (imunitate celulară) . •
3. SERIA MONOCITARĂ. Monocitele sunt cele mai mari celule din seria leucocitară, cu un diametru cuprins între 10 - 25 μm şi sunt specializate în apărarea organismului. Nucleul este nesegmentat, reniform şi nu prezintă nucleoli. Citoplasma este abundentă şi intens bazofilă (albastru închis). Seria monocitară include: - prec precur urso sori riii din din mădu măduva va hema hemato toge genă nă - monocitele di din sâ sânge - mac macrofa rofaggele din din ţes ţesutu uturi Monocitele îndeplinesc următoarele roluri: în macrofagocitoza particulelor coloidale, a celulelor degenerate; celule accesorii (prezentatoare (prezentatoare de antigen). în răspunsul imun ca şi celule • •
Fig.2. Sânge periferic normal. Frotiu colorat MGG. 1. granulocit neutrofil segmentat; 2. granulocit eozinofil; 3. granulocit bazofil;
Lucrări practice Fiziologie I
4. limfocit; 5. monocot
PRINCIPIU numărătoarea directă la microscop a leucocitelor dintr-un volum cunoscut de sânge, diluat într-o proporţie cunoscută. Celulele se numără în dispozitive speciale numite hemacitometre (camere de numărat). Metoda automată ( metodă de impedanţă electrică) electrică) : o suspensie de leucocite dintr-un volum cunoscut de sânge, trec printr-un orificiu. Un curent electric constant este aplicat între electrozii de platină aflaţi de-o parte şi de alta a orificiului. Deoarece fiecare celulă este nonconductoare ea va produce la trecerea prin orificiu o modificare bruscă de tensiune = un puls. Aceste pulsuri vor fi numărate electronic.
•
Metoda manuală:
•
VALOAREA NORMALĂ valoare medie a numărului de leucocite: 4000-10000/ mm 3 la adult: 5000 – 9000 leucocite/mm 3 la copil (până la 18 ani): 4500 – 13000 leucocite/mm 3 • • •
VARIAŢII FIZIOLOGICE numărul numărul de leucocite leucocite crește (leucocito (leucocitoză) ză) la sugari, în sarcină, după un efort fizic, în perioadele postprandiale, postprandiale, la altitudine, stres emoţional emoţional etc.; numărul de leucocite scade scade (leucopenie) la vârstnici, în somn, la surmenaţii fizic; •
•
VARIAŢII PATOLOGICE numărul numărul de leucocite leucocite crește (leucocitoz (leucocitoză) ă) în boli infecţioase, leucemii, alergii, etc. numă număru rull de leuc leucoc ocit itee scad scadee (leu (leuco cope peni nie) e) în dist distru ruge geri ri ale ale mădu măduve veii hematoformatoare după tratament cu radiaţii ionizante, medicamente citostatice, etc. •
•
2. FORMULA LEUCOCITARĂ DEFINIŢIE Formula leucocitară reprezintă distribuţia procentuală a diferitelor tipuri de leucocite pe un frotiu de sânge periferic. Formula leucocitară se determină prin metode clasice sau metode automate. PRINCIPIU se numără la microscopul optic, folosind obiectivul cu imersie, 200 de leucocite de pe un frotiu din sângele periferic colorat May-Grünwald-Giemsa (MGG) pe care se pune o picătură de ulei de cedru. Se identifică tipurile de leucocite pe baza criteriilor criteriilor morfologic morfologicee (aspectu (aspectull nucleului nucleului,, granulaţii granulaţii citoplasm citoplasmatice atice)) şi se determină determină raportul procentual între acestea. Metoda automată: se izolează şi se efectuează automat raportul procentual dintre tipurile de leucocite din sângele periferic, în funcţie de volum, prezenţa granulaţiilor citoplasmatice şi complexitatea segmentării nucleului, cu obţinerea histogramelor . •
Metoda manuală:
•
FORMULA LEUCOCITARĂ NORMALĂ Leucocite Adult Copil Neutrofile 56-68% 25-40% Eozinofile 1-3% 1-4% Bazofile 0-1% 0-1% Limfocite 20-40% 50-70% Monocite 4-10% 4-8%
Lucrări practice Fiziologie I
OBSERVAŢII valorile normale pot prezenta variaţii de la un laborator la altul în funcţie de metodele şi reactivii folosiţi; la copiii mici , în formula leucocitară predomină limfocitele faţă de neutrofilele segmentate. Procentele se egalează în jurul vârstei de 5-6 ani, apoi se inversează, ajungând treptat la valorile adultului. •
•
VARIAŢIILE FORMULEI LEUCOCITARE •
reprezint intăă creşte creşterea rea număru numărului lui de neutr neutrofi ofile le peste peste valoa valoarea rea normal normală. ă. Neutrofilia reprez
Prezenţa elementelor neutrofile tinere în sângele periferic este dovada unei activităţi medulare intense sau a citolizei accentuate. Neutrofilia poate fi: fiziologică: în cursul unor eforturi fizice mari, graviditate, stres; patologică: în infecţii acute, intoxicaţii endogene (uremie) şi exogene, leucemia mieloidă cronică, acţiunea agenţilor fizici (traumatisme, arsuri). Neutropenia reprezintă scăderea numărului neutrofilelor sub limita normală. Apare după acţiunea unor medicamente (citostatice, tranchilizante, antiinflamatoare, antibiotice), Eozinofilia reprezintă creşterea numărului de eozinofile; se întâlneşte în alergii, parazitoze, afecţiuni dermatologice. Eozinopenia reprezintă scăderea numărului de eozinofile; se întâlneşte în stări de hiperactivitate adrenocorticoidă. Bazofilia reprezintă creşterea numărului de granulocite bazofile. Apare în bolile contagioase, leucemia mieloidă cronică . reprezintă creşterea creşterea numărului numărului de limfocite. limfocite. Limfocitoz Limfocitozaa Limfocitoza reprezintă poate fi: fiziologică : la copii; afecţiuni uni virale virale acute, acute, mononu mononucle cleoz ozaa infecţ infecţioa ioasă să,, TBC, TBC, patologică : în afecţi leucemia limfatică cronică. reprez ezin intă tă scăd scăder erea ea numă număru rulu luii de limf limfoc ocite ite.. Apar Aparee în Limfopenie repr limfopoieza insuficientă, infecţii virale, SIDA etc. reprez ezin intă tă cre creștere tereaa numă număru rulu luii de mono monoci cite te.. Apar Aparee în Monocitoza repr mononu mononucle cleoza oza infec infecţio ţioasă asă,, infec infecţii ţii bacter bacterien ienee (endo (endocar cardit dită, ă, TBC), TBC), afecţi afecţiuni uni virale virale (hepatită, gripă, rujeolă), convalescenţa infecţiilor bacteriene şi virale. •
•
•
•
•
•
•
3. INVESTIGAREA FUNCŢIONALĂ A GRANULOCITELOR Principala funcţie a granulocitelor este fagocitoza, precedată de diapedeză (trecerea granulocitelor din sînge în ţesuturi prin peretele vascular), care este declanşată de numeroşi factori chemotactici pozitivi (atrag leucocitele spre focarul inflamator, leziuni tisulare). În practica medicală se poate testa, in vitro, funcţia fagocitară a granulocitelor prin: indicele fagocitar al particulelor de latex, testul NBT.
1. INDI INDICE CELE LE FAGO FAGOCI CITA TAR R AL PART PARTIC ICOL OLEL ELOR OR DE LATE LATEX X reprezintă proporţia la % din granulocitele neutrofile care au înglobat particule de latex. Valori normale: 50% - 55%. 2. TESTUL NBT (NITROBLUETETRAZOL (NITROBLUETETRAZOLIUM). IUM). Nitrobluetetrazolium (NBT) este un colorant galben, care este înglobat şi redus de neutrofilele normale la nitroformazan. NBT este un acceptor de electroni şi se reduce, iar
Lucrări practice Fiziologie I
donorul de electroni este NADPH 2 format prin activarea metabolismului leucocitar, în timpul fagocitozei. Testu Testull NBT este este un test test "in "in vitr vitro" o" de util utilit itat atee clin clinic ică, ă, prin prin care care se eval evalue ueaz azăă metabolismul oxidativ al granulocitelor, producerea de radicali liberi ai oxigenului, care asigură funcţia bactericidă a fagocitelor. Se determină proporţia la % a celulelor NBT pozitive, adică a granulocitelor care au înglobat şi redus NBT la nitroformazan, precipitat albastru închis, vizibil în granulocite, colorate cu Giemsa. Valori normale: 1 - 14%.
Importanţa testului NBT în patologia umană Testul NBT este folosit pentru diagnosticul disfuncţiilor neutrofilului, mai ales ale metabolismului oxidativ, situaţii în care reducerea colorantului NBT este insuficientă. Creşterea testului NBT: în infecţii bacteriene (inclusiv tuberculoza miliară, meningita tuberculoasă), infecţii parazitare, gravide, la pacienţii cu arsuri (semnifică apariţia unei stări septice), etc. Test NBT scăzut sau normal, în prezenţa unei infecţii bacteriene: în terapia cu antibi antibioti otice ce (efica (eficacit citate ateaa tratam tratament entulu uluii este este indica indicată tă de scăd scădere ereaa testul testului ui NBT faţă faţă de valorile valorile anterioare anterioare,, uneori în mai puţin de 6 ore), infecţii infecţii localizate, localizate, administr administrarea area de corticosteroizi şi medicamente imunosupresive, boala granulomatoasă cronică, deficienţa de mieloperoxidază sau glucozo 6-fosfat dehidrogenaza a neutrofilului, lupus eritematos sistemic, agamaglobulinemie agamaglobulinemie congenitală congenitală sau câştigată. câştigată. metabo taboli lism smuul oxid xidati tivv leu leucocit ocitaar se poate oate inve invest stig igaa si prin prin chemiluminiscenţă. Obser Observa vaț ie: ie:
BULETINE DE INTERPRETARE Să se interpreteze următoarele leucograme: 1. M.G. ; sex femin, 30 ani 2. P.B. ; sex masculin, 3 ani sarcina luna a IV-a 3 Nr. Leucocite = 11.000/mm Nr. Leucocite = 21.000/mm3 Neutrofile = 77% Neutrofile = 83% Eozinofile = 1% Eozinofile = 4% Bazofile = 0% Bazofile = 1% Limfocite = 28% Limfocite = 55% Monocite = 5% Monocite = 9%
3. S.C. ; sex masculin, 22 ani Nr. Leucocite = 10.000/mm 3 Neutrofile = 58% Eozinofile = 12% Bazofile = 0% Limfocite = 25% Monocite = 5%
4. A.M. ; sex masculin, 27 ani Nr. Leucocite = 12.000/mm3 Neutrofile = 76% Eozinofile = 4% Bazofile = 0% Limfocite = 27% Monocite = 12%
5. R.P.; sex feminin, 22 ani Nr. Leucocite = 11.000/mm 3 Neutrofile = 52% Eozinofile = 1% Bazofile = 6% Limfocite = 35% Monocite = 6%
6. B.C.; sex feminin, 2 ani Nr. Leucocite = 12.000/mm3 Neutrofile = 25% Eozinofile = 14% Bazofile = 1% Limfocite = 52% Monocite = 8%
Lucrări practice Fiziologie I
TESTE (CU UN SINGUR RĂSPUNS CORECT) 1. Valoarea normală a leucocitelor în sângele periferic al adultului este: A. <10.000/mm3 B. 150.000 – 300.000/mm 3 C. 5000 – 9000/mm 3 D. 25% 2. Care dintre următoarele afirmaţii sunt adevărate: A. Creş Creşte tere reaa num număr ărul ului ui de leuc leucoc ocite ite se nume numeşt ştee leu leuco coci citoz tozăă B. Leuc Leucop open enia ia poa poate te fi fi fizi fiziol olog ogic icăă la surm surmen enaţ aţii ii fiz fizic ic şi în în som somnn C. Leu Leucocit ocitoz ozaa semni emnifi ficcă scă scădere dereaa numă număru rulu luii de leuc leucoocite cite în sânge ângele le periferic D. Leuc Leucoc ocit itoz ozaa apa apare re la la vâr vârst stni nici ci în în mod mod fizi fiziol olog ogic ic 3. Leucocitoza fiziologică este întâlnită: A. La sugari B. În somn C. La vârstnici D. După efort fizic 4. Formula leucocitară normală la copil (5 – 6 ani) prezintă: A. Neutrofilie B. Limfocitoză C. Monocitoză D. Limfopenie 5. Granulocitul neutrofil segmentat: A. Are nucleu nucleu segmentat segmentat datorita datorita condensării condensării cromatinei cromatinei nucleare nucleare B. Reprez Reprezint intăă granulo granulocit citul ul adult adult C. Aparţi Aparţine ne serie serieii linfoc linfocita itare re D. Aparţine Aparţine seriei seriei granulocita granulocitare re 6. Caracteristic monocitului este : A. Are nucleu reniform B. Nucleul e segmentat în 2-5 lobi cu citoplasmă abundentă, intens bazofilă C. Are Are rol rol în mic micro rofa fago goci cito toza za par parti ticu cule lelo lorr colo coloid idal alee D. Are rol rol în răsp răspun unsu sull im imuun ca şi celulă lulă acce acceso sori riee (pre (prezzenta ntatoar toaree de antigen) 7. Care din afirmaţiile de mai jos sunt adevărate: A. Eozi Eozino nofi file lele le inte interv rvin in în fago fagoci cito toza za fung fungil ilor or,, bact bacter erii iilo lor, r, comp comple lexe xelo lor r antigen-anticorp B. Mono Monoci cite tele le inte interv rvin in în proc proces esel elee infla inflama mato torii rii (cap (capac acita itate te de apă apăra rare re mai mai redusă) C. Limf Limfoc ocit itel elee secr secret etăă IL-1 IL-1 (subs (substa tanţ nţaa piro piroge genă nă)) şi enzi enzime me lizo lizozo zoma male le
Lucrări practice Fiziologie I
D. Neut Neutro rofi file lele le segm segmeenta ntate inte interv rvin in în apara parare reaa antim ntimic icro robi biaana prin prin microfagocitoză
8. Alegeţi răspunsul corect: A. Erit Eritro roci cite tele le deri derivă vă din din cel celul ulee pro proge geni nito toar aree mie mielo loid idee B. Erit Eritro roci cite tele le deri derivă vă din din celu celule le prog progen enit itoa oare re limf limfoi oide de C. O part partee din din leuco leucoci cite te deri derivă vă din din cel celul ulee proge progeni nito toar aree mielo mieloid ide, e, la fel fel ca ca şi trombocitele D. Eozi Eozino nofi file lele le,, bazo bazofi file lele le si mono monoci cite tele le prov provin in din din celu celule le prog progen enit itoa oare re mieloide 9.Despre formula leucocitară este corectă următoarea afirmaţie : A. Se poate poate citi de pe pe curbe de de distribuţi distribuţiee a leucocitel leucocitelor or B. Se interpre interpreteaz teazăă cu ajuto ajutorul rul histogra histogramelo melor r C. Valoarea Valoarea neutrofil neutrofilelor elor în formula formula leucocita leucocitară ră la adult este 25-40 25-40 % D. Valoarea eozinofilelor în formula leucocitară la adult adult este mai mare mare decât decât la copil 10. Alegeţi răspunsul corect: A. Leco Lecope peni niaa ind indic icăă o star staree de adap adapta tare re a org organ anis ismu mulu luii llaa rar raref efie iere reaa aerului întâlnită la marile altitudini B. Mono Monoci cito toza za apa apare re tip tipic ic în în par paraz azit itoz ozel elee inte intest stin inal alee ale ale cop copil ilul ului ui C. Leuc Leucoc ocit itoz ozaa se înt întâl âlne neşt ştee în dis distru truge geri ri ale ale măd măduv uvei ei hem hemat atof ofor orma mato toar aree după tratament cu radiaţii ionizante, medicamente citostatice etc. D. Bazo Bazofil filia ia se înt întâl âlne neşte şte în în bolil bolilee conta contagi gioa oase se,l ,leu euce cemi miaa mielo mieloid idăă croni cronică că
Răspunsuri : 1-C, 2-B, 3-A, 4-B, 5-D, 6-D, 7-D, 8-C, 9-B, 10-D
