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• Instructo Instructor: r: James James K. Otero: Otero:
[email protected] Nombre:
Fecha __
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Preguntas de Pre-Laboratorio • l,Que es electroforesis?
Introducci Introducci6n La electrof electrofores oresis is es una herramienta herramienta comun comun en la biotecno biotecnologf logfa a util izada para analizar analizar y separar separar macromolecul macromoleculas como como el ADN, ADN, ARN Y protef protefna nas s por medio medio de un campo campo electri electrico co aplica aplicado do a un una a gela gelati tina na de agar. agar. Du Dura rant nte e el proc proces eso o la muest muestra ra de la macrom macromol olec ecul ula a se carg carga a en la gelat gelatin ina a hecha hecha a base de polis polisaca acarid ridos os en conjun conjunto to can un tinte tinte para para visualiz visualizar ar las molecul moleculas as , se aplica una corrien corriente te electr electrica ica y las molec molecula ulas s se separan separan en base a su tamano tamano y carga carga . Debido Debido a esto, esto, la tecni tecnica ca nos nos perm permit ite e sepa separa rarr por por tama tamano no una una mu mues estr tra a mixt mixta a de mo mole lecu cula las, s, dete determ rmin inar ar el tamano tamano molecular molecular y purificar purificar muestras muestras de macromol macromolecula eculas. s. EI equipo equipo utili util izado para electroforesis electroforesis es simple. simple. Esta Esta compu compuest esto o de una camara camara can polos polos opues opuestos tos,, una fuen fuente te de energfa energfa (power (power supply supply)) y solu soluci6 ci6n n amorti amortigua guador dora a par pa ra con conducir la electric electricidad idad y mantener mantener el pH estable. estable.
Terminos Terminos de Trasfondo Trasfondo • Electr Electroforesis de gelatin gelatina a • Macrom Macromolecula ·ADN
• Protef Protefna • Masa • Agar
Experimento Materiales para
cad cad a
persona
• 1 Jabonera • 1 Cable de "stainless steel " (entre 18" y 24" de ancho) • 1 Pinzas para cortar metal • 5 baterfas de 9V • 2 "alligator clips" • Un pedazo de "styrofoam" styrofoam" (pareci (parecido al utili util izado para empacar empaca r la carn carne e) con con dime dimensiones aproximad aproximadas as de 4 4""x3" x3" • 1 Tijera • 1 Bal Balanza de cocina • 1 Probeta
0
0
cucharas cucharas de medida medida
instrumen instrumento to de medici6n medici6n de volumen volumen en mL
• 1 Microondas • 1 Envase para hacer mezclas • 2 g Baking Soda (Aprox.
Y2
cucharadita)
• 200 mL de agua destilada • 1 g Agar-Agar
0
Agarosa (Aprox. % cucharadita) cucharadita)
• 3 Colores de tintes para cocinar • 1 Gotero
0
pipeta
• 1 regia en em
0
mm
Construc Construccio cion n de la cama camarra de elect ectroforesis: 1.
Cort Co rta a dos pedaz pedazos os de un poco mas mas largos largos que que la jabo jabone nera ra del del cabl cable e de "stai "stainl nles ess s stee steel" l"
0
cobre con con las pinzas. pinzas.
2.
Dobla ambos ambos alambr alambres es en forma forma de gancho gancho para para ser puestos puestos en el bo rde de la jaboner jabone ra y el
anch ancho o de la mism misma. a. Un Uno o de los los alamb alambre res s debe debe de esta estarr colo coloca cado do en la par te superio superiorr de la jabonera jabonera (electrodo (electrodo negativo) y el otro otro en la part parte e infe inferi rior or (el (electrod ectrodo o positi positivo) vo).. Ver Ver Figura igura 1. EI alambre que vaya en en el extremo extremo superi superior or de la jabone jabonera ra deb debe e ir un poco poco mas elevado elevado q ue el de la parte inferior. inferior .
3.
Cone Co nect cta a las las 5 bate baterf rfas as de 9-v 9-v oltios en ser serie cone conect ctan and do el pol polo positivo con el e l negati ativo hast hasta
conect conecta ar las 5 baterfas aterfas.. Debe de quedar Iibre un polo positivo y uno negat ivo. Ver Fig Figura 2.
4.
Cuan Cua ndo este esten n Iist Iistos os para come comenz nzar ar el expe experr iment mento, con conecta el clip ti tipo cocod ocodri rilo lo a cada cada
terminal expuest xpuesto o en el set de baterfas baterfas.. Lueg uego o conect conecta a e l lade lade opue puesto sto del clip clip a los electrodos de la jab jabo onera. nera. (Recue (Recuerda rda no conect conecta a r el circ circui uitto completamen completamente te hast sta a el mo mom menta enta exac exacto to de comenzar comenzar el experim experimento)
a. La pein peinil illa la de debe be de ser ser co cort rtad ada a ma mas s an anch cha a en la part parte e su supe perrio iorr de for a qu que e pu pued eda a ponerse pone rse sobre
105
bordes de la jabonera. jabonera . Los diente dientes s de la misma misma de deb b en de ser cortados cortados
de igual igual forma forma y con al menos menos 2mm de sepa separac raci6n i6n en enttre dientes. Ver Fi F igura 4.
Experime Experim ento de Separac Separacii6n de Tin inttes Una vez comple ompletada tada la camara camara de electrofo electroforesis, resis, se preparan preparan las solucion soluciones es y la gelatina. gelatina. 1.
EI
prim pr imer er pa paso so co cons nsis iste te en hacer hacer la las s so solu luci cion ones es a se serr ut utili iliza zada das s pa para ra la gelat gelatin ina a y
correr cor rer las mue muestr stras. as. La soluci soluci6n 6n amo amorti rtigua guador dora a debe de ser de 1 % de bak baking ing sod soda. a. Para hacer hacer la misma, misma, com combin bine e 2 gramos gramos de baking baking sod soda a con 200m 200m 1 de agua destilada y
mezc me zcle le
comp co mple leta tame men nte te..
(De (D e
no
tene te nerr
bala lan nza za,,
2g
de
baking
soda
es
aproximadamente ;I;Izz cucharadita.)
2. Pa Para ra hacer hacer la gela gelatina tina de 1% de Agar ar,, mezcle 1 gr gramo de Aga garr co con n 100 00ml ml de la solu so luci ci6n 6n
de baking
soda
c
(paso ~). De n o ten ene er
balanza,
19 de A ga garr
es
aproximadamente % cucharadita.
a. Caliente la soluci soluci6n 6n de Agar Agar en el microon microondas das en incremen incrementos tos de 15-20 segun segundos dos y mezcle mez cle has hasta ta que la misma comience comience a ha hacer cer burbu ja jas s. La so soluc luci6n i6n deb debe e de qu queda edarr
/ de forma transpare , i e . / ,. -
?
/
/
3. Rem RemuE uE?va ?va105 ala alambr mbres es de la jab jabone onera ra . . '
" t '
.~ . f]
, 4. Ins nse efte la peini peinilla lla de "st "styro yrofoa foam" m" per perpen pendic dicula ularme rmente nte en la parte superio superiorr de la jabo jaboner nera a a , 0.5 cm del bor bo rde. Lue Luego, go, po poco co a poc poco o vie vierta rta la soluci6 soluci6n n de Agar Agar en la jabon jabonera era.. Ana Anada da : . ¢ . ,
.. ; : ; ;.;. . . . .
.
suficient sufic iente e soluc soluci6n i6n hast hasta a que
105 10 5
dientes dien tes esten sumergid sumergidos os aprox aproximad imadamen amente te 0 .5 cm. Ver
Figura 5. (Si la gelatin gelatina a es muy gruesa gruesa sera diffcil diffcil observar sepa separaci6 raci6n n de
Figura 5. 5. Monta Montaje je para prepar preparar gela gelati tin na. 4
105 10 5
tintes..) tintes
6. Atiada 1oom 1oomll de soluci soluci6n 6n amortiguadora amortiguadora sobre la gelatin gelatina a solid solidifica ificada da hast hasta a que la cubra cubra completamente.
8. Rem Remuev ueva a la gelat gelatina ina de la jab jabone onera ra
y
corte los bordes bordes para dejar espacio espacio para los
electrodo elec trodos. s. Vuel Vuelva va a poner los mismos en la jabone jabonera. ra.
Separacii6n Separac
de
105
tintes
Una vez vez esten esten prep preparada aradas s las solucio soluciones nes y la camara camara de electrof electrofores oresis is pode podemos mos proce proceder der a separar sepa rar las muestras. muestras. 1. Utiliz Utilizando ando un gotero gotero
0
pipeta, pipe ta, anada una gota pequena del t inte en los pozos formados
por la peinilla.
2. Ut Utililiz izan ando do lo los s cl clip ips s de co coco codr drilo ilo,, co cone nect cte e el set de ba bate terria ias s en los el elec ecttro rodo dos s de la jabo jaboner nera. a. EI elec electtrod rodo o po posi sittiv ivo o debe de co cone nec c tarse al term rmina inarr po posit sitivo ivo de la bateri bateria. a. EI elect ectrod rodo o pos positi itivo vo deb debe e de estar estar opu opuest esto o a los poz pozos os for formad mados os por la peinilla peinilla . Una vez conect con ectad ado o amb ambos os terminale terminales s de las ba ter eria ias s a los electr electrod odos os se debe deben n de comen comenza zarr a formar for mar bu burbu rbujas jas.. Est Esto o es indicati indicativo vo que la corriente corriente est esta a pa pasan sando do a trave traves s de la sol soluci uci6n 6n amortigua amort iguadora dora.. Ver figura a continuaci continuaci6n 6n..
'- { 1 ~ ~ : r ~l ~l
3. Ver Verifi ifique que el progre progreso so del movimie movimiento nto de los tin tintes tes en la ge latina cada 10-15 minutos. minutos. Corra la gelatina gelatina hast hasta a que yea yea buen buena a sepa separaci6 raci6n n de los tintes tintes y migraci6n. migraci6n.
4. Comp Compare are cada muestra muestra de tinte. tinte. ("Cuantas ("Cuantas bandas bandas obser observa va para cada cada color? ("Cu ("Cual al migro migro la mayor mayor distancia? distancia? Utiliz Utilizando ando una regia en cm/mm cm/mm mida la distanc distancia ia reco recorr rriida por cada banda.. Luego haga una tabla para anotar banda anotar sus observac observaciones iones como la que que se presenta a continuaci6n.
Collor del tinte Co
Numero de bandas
Pregu Preg untas de di diseus seusii6n 1.
("C6 C6m mo el pro proces ceso o de el elec ectr trofores oforesiis se sepa parra molec ecu ulas?
Migraei6n Migra ei6n de eada banda banda (em)
7.
RETO:
Unos investiga investigadore dores s reali realizaron zaron elect electrofo roforesis resis para separar separar una mezcla mezcla de moh§culas. moh§culas.
En el ultimo ultimo carril, ~que molecula molecula es mas grande, grande, A
0
B? Explica. Explica.
Figura Figur a 7: Repre Represent sentacion acion de una Electroforesis Electroforesis
