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UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO FACULT ACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA INGENI ERÍA EN ALIMENTOS INFORME DE PRÁCTICA DE LABORATORIO DATOS INFORMATIVOS: Carrera: Ingeniería Bioqupimica Ciclo Acad!ico: abril-septiembre 2016 A"i#$a%&ra: Bioquímica I Pr'c%ica de La(ora%orio N): 2 Fec*a de Reali+aci,$: 02/05/2016 Fec*a de Pre"e$%aci,$: 22/05/2016 TEMA: Ide$%i-caci,$ de .ro%e/$a" Ta(la 0: Resultado del tratamiento de las soluciones con el Reactivo Reactivo de Biuret. a prueba es positiva si el comple!o "ormado es de color violeta.
+ransparen +ransparen &eque3os precipitados te violeta. +ransparen +ransparen eleste te
ec$e natural ec$e comercial 'ase 'a seos osa a ()ev ()even en up* up*
Re"&l%a do &ositivo &ositivo egativ o egativ o &ositivo
egativ o
Ela(orado .or: #onseca 4 'uanoquia 4 una 7. 2016. Ta(la 1: Resultado del tratamiento de las soluciones con el reactivo de in$idrina. in$idrina. a prueba es positiva si el comple!o "ormado entra entre la escala de colores colores de viol8ceo o amarillo. amarillo.
(d* (e* ("* Fi#&ra 0: oloraciones resultantes de las muestras mediante la reaccin de Biuret. 7n (a* de iquierda a derec$a se observa la coloracin violeta de la lec$e natural 9 el segundo tubo muestra su color original: la prueba es positiva. 7n (b* el primer tubo 9 la coloracin original de la lec$e comercial4 9 el resultado positivo de la misma a la prueba en el segundo tubo4 su coloracin violeta opaco. 7n (c* el color transparente de la gaseosa utiliada con su resultado negativo en el segundo tubo. 7n (d* la coloracin ;nal de la solucin de ca"4 coloracin ca" oscuro. (e* muestra la solucin de albmina al 14 en ella nicamente se observa peque3as precipitaciones oscuras4 resultado< se in;ere que es positivo. 7n ("* la solucin del amino8cido -metionina 9 su resultado negativo para la prueba4 su coloracin< celeste.
(a*
(b*
(c*
(d* (e* ("* Fi#&ra 1< oloraciones resultantes de la reaccin con in$idrina. 7n (a* )e aprecia la coloracin violeta de la lec$e natural. Resultado< positivo. 7n (b* la coloracin violeta de la muestra de lec$e comercial4 sta es menos intensa que (a*. Resultado< positivo. 7n (c* la coloracin transparente de la muestra de gaseosa ()even up*. Resultado< negativo. 7n (d* la coloracin ca" claro de la solucin de ca" en polvo. Resultado< negativo. 7n (e* la albmina de $uevo no cambi su color. Resultado< negativo. 7n ("* el amino8cido -metionina 9 su coloracin violeta intensa. Resultado< positivo. PRUEBA E2TRA3
Fi#&ra 4: ,lbmina de $uevo coagulado 9 su resultado positivo a la prueba de in$idrina por su coloracin violeta intenso. DISCUSI5N
as proteínas son biomolculas de gran tama3o 9 peso molecular "ormadas principalmente por carbono (*4 $idrgeno (=*4 o>ígeno (?* 9 nitrgeno (*. )on polímeros de amino8cidos los cuales se unen por medio de un tipo especí;co de enlace covalente denominado enlace peptídico. )e $an desarrollado distintas tcnicas para la identi;cacin de proteínas que se basan principalmente en la "ormacin de comple!os coloridos entre las proteínas 9 reactivos especí;cos. @na de las tcnicas m8s utiliadas para la cuanti;cacin de proteínas en una mecla es mediante la utiliacin del reactivo de Biuret. )egn ?rtega4 (2005* el reactivo de Biuret es una solucin alcalina de cobre que "orma un comple!o de color aul prpura4 con los enlaces peptídicos de las proteínas. &ara la determinacin de la presencia de proteínas mediante la reaccin de Biuret se analiaron diversas muestras< lec$e natural4 lec$e comercial4 gaseosa (seven up*4 solucin de ca"4 solucin de albmina 9 una solucin de amino8cidos (-met$ionina*. a lec$e natural4 comercial 9 solucin de albmina al reaccionar con la solucin de )ul"ato de obre e =idr>ido de )odio (reactivo de Biuret* "ormaron un comple!o de color violeta constatando de esta manera la presencia de proteínas en dic$as muestras. )in embargo el comple!o "ormado en la muestra de lec$e natural vari en la intensidad de color en relacin a las dem8s muestras. Auesada4 (200* mani;esta que la intensidad de
coloracin es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos*4 por lo tanto la lec$e natural present un ma9or contenido proteico en relacin a la lec$e comercial 9 a la solucin de albmina. +rum4 (1CD* menciona que
la composicin de la lec$e
natural es el CE del total lipídico 9 cu9os 8cidos grasos que la "orman son ma9ormente saturados4 proteínas (caseína4 albmina 9 proteínas del suero* 9 glcidos (lactosa4 acar especí;ca de la lec$e*4 por otro lado la lec$e comercial es sometida a varios procesos industriales que aseguran la calidad de la misma4 ran por la cual disminu9e la concentracin de proteínas (desnaturaliacin de proteínas*. 7n la solucin de albmina al estar mu9 diluída (ba!a concentracin* el comple!o "ormado present un color levemente violeta en presencia del reactivo de Biuret4 pero bibliogr8;camente el $uevo es un alimento con alta densidad nutritiva4 su composicin proteica es considerada de alto valor biolgico4 9a que contiene todos los amino8cidos esenciales 9 en la proporcin adecuada FidealG4 para cubrir las necesidades de las personas. &or ello4 se utilia como patrn de re"erencia para la evaluacin de la calidad proteica de los alimentos Rivera4 (2005*. a solucin de ca"4 amino8cidos 9 gaseosa (seven up* dieron pruebas negativas manteniendo el color característico de cada muestra lo que indica que no $a9 presencia de proteínas. ?tra de las tcnicas empleadas para la identi;cacin de proteínas 9 especí;camente para la deteccin cualitativa 9 cuantitativamente de amino8cidos es la reaccin de la in$idrina. a in$idrina es un agente o>idante poderoso 9 lleva a cabo la desaminacin o>idativa de los grupos H-amino4 liberando amoniaco4 bi>ido de carbono 9 el correspondiente alde$ído4 así como la "orma reducida de la in$idrina. 7l amoniaco entonces reacciona con un mol adicional de in$idrina o>idada 9 un mol de in$idrina reducida dando una sustancia de color aul-violeta4 determinando de esta manera la presencia de amino8cido
?campo4 (200E*. as muestras que dieron prueba positiva mediante la reaccin con in$idrina "ueron< lec$e natural4 lec$e comercial4 albmina de $uevo coagulada 9 solucin de amino8cidos (-met$ionina*. 7n aquellos casos donde no da positiva la prueba de Biuret4 da positiva la de nin$idrina4 e indica que no $a9 proteínas pero sí $a9 amino8cidos libres ste acontecimiento surgi con el ,mino8cido (-metionina 1* $ang4 (1C*. ,l igual que con el reactivo de Biuret4 la solucin de ca" 9 gaseosa (seven up* dieron pruebas negativas cono el reactivo de in$idrina debido a que al no tener proteínas4 tampoco e>iste presencia de amino8cidos. CONCLUSIONES •
)e determin la presencia de proteínas en di"erentes muestras como lec$e comercial4 lec$e natural4 gaseosa )even up4 ca"4 9 $uevo mediante la reaccin de Biuret4 la cual en la lec$e natural muestra la presencia de pptidos que presentan enlaces peptídicos (dos o m8s* 9 una coloracin aul violeta mu9 intensa 9 en la gaseosa )even up4 present una coloracin celeste mu9 clara 9 al ;nal un precipitado amarillo debido a que no e>isten proteínas
•
en esa muestra. )e identi;c las reacciones de las proteínas al a3adir la reaccin de Biuret (u2)?4 el cual el reactivo de Biuret contiene u)? en solucin acuosa alcalina en este caso a?=. a reaccin consiste en la "ormacin de un compuesto de color violeta4 debido a la "ormacin de un comple!o de coordinacin entre los iones u2J 9 los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que "orma
•
parte de los enlaces peptídicos. )e determin la presencia de proteínas en di"erentes muestras mediante la reaccin con in$idrina4 la cual result positiva para la lec$e natural4 lec$e comercial 9 la solucin de amino8cido por la alta intensidad del color aul violeta4 tambin menos intensidad en la albmina de $uevo4 9a que al momento de agitar no se
$omogenei de una manera correcta la solucin para la prueba 9 no se obtuvo los resultados deseados 9 negativa para la gaseosa •
)even up 9 la solucin de ca" por la ausencia de proteínas. )e anali la importancia de los mtodos aplicados en la determinacin de proteínas4 9a que es adecuado conocer los alimentos ricos en proteínas 9a que las proteínas constitu9en una de las molculas m8s importantes en el organismo 9a que cumplen muc$as "unciones 9 est8n constituidas por amino8cidos por los cuales los mtodos se basan en el reconocimiento de los amino8cidos.
RECOMENDACIONES
7l reactivo de Biuret es mu9 sensible a la lu tanto así que se descompone inmediatamente en su presencia4 por ello se recomienda una preparacin 8gil 9 aislada de la lu del mismo4 así como su conservacin durante la pr8ctica en "rascos polariados o taparlo inmediatamente con papel aluminio. o se recomienda su almacenamiento por el $ec$o de ser mu9 reactivo 9 "ormar r8pidamente precipitados da3ando su composicin. &ara todo tipo de muestras se recomienda no realiar soluciones mu9 diluidas de las mismas puesto que la prueba no es tan sensible a ba!as concentraciones4 un claro e!emplo es lo ocurrido con la solucin de albmina de $uevo que debi ser positiva 9 sali negativa. CUESTIONARIO 67&
!&e"%ra
.re"e$%,
!a8or
co$%e$ido
de
.ro%e/$a"9
F&$da!e$%e "& re".&e"%a3
)egn las pruebas de Biuret 9 in$idrina realiadas en el aboratorio se pudo observar que la lec$e natural contiene m8s proteína comparando con las dem8s muestras analiadas4 por la intensidad del color violeta que demuestra que tiene ma9or contenido proteico4 9a que el suero de
lec$e se deriva del proceso de $acer queso que a su ve es un derivado de la lec$e4 la cual contiene cientos de tipos de proteínas4 la ma9oría de ellas en mu9 peque3as cantidades. os tres grupos principales de las proteínas en la lec$e son distinguidos por sus amplias di"erencias en cuanto a comportamiento 9 "orma de e>istencia se re;ere. as caseínas son "8cilmente precipitadas de la lec$e en una variedad de "ormas4 mientras que las proteínas del suero usualmente permanecen en solucin. Ke otro lado4 las proteínas que con"orman la membrana de los glbulos grasos se ad$ieren4 tal como su nombre lo indica4 a la super;cie de los glbulos grasos4 9 solamente son liberadas por accin mec8nica4 como por e!emplo4 durante el batido de la crema para producir la mantequilla. (Bartrina L Ma!em4 2005*. 6C,!o .odr/a!o" "a(er &e &$a "&"%a$cia de"co$ocida e" &$a .ro%e/$a9
&ara saber si una sustancia desconocida4 contiene proteínas se utilia el Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas4 pptidos cortos 9 otros compuestos o m8s enlaces peptídicos en sustancias con descomposicin desconocida indicando un color violeta que resulta una prueba positiva. 7n realidad se determina la presencia del enlace peptídico --?=2 unido a otro --?=2. )in embargo algunos otros compuestos podrían con"undir con su presencia. omo las proteínas deben contener ciertos amino8cidos tambin se puede realiar la prueba de in$idrina o pruebas "ísicas sencillas como la coagulacin 9 precipitacin en sales neutras. (#ranco L Nepes4 2000*. 6Por & el reac%i;o de Bi&re% $o e" <%il e$ la ide$%i-caci,$ de a!i$o'cido"9
a reaccin de Biuret la producen los pptidos 9 las proteínas4 pero no los amino8cidos4 9a que se debe a la presencia del enlace peptídico (?- = -* que se destru9e al liberarse los amino8cidos. uando una
proteína se pone en contacto con un 8lcali concentrado4 se "orma una sustancia comple!a denominada Biuret. Kebido a dic$a reaccin "ue que se observ que al agregar el reactivo de sul"ato de cobre m8s solucin de proteína precipit una coloracin violeta. Auedando en el "ondo del tubo una tonalidad aul cielo reaccin positiva. &recipitando a una coloracin amarilla la reaccin nos torna negativa al no $aber presencia de proteínas. ('ri!alva4 ). 2015*. 6U$a .ro%e/$a coa#&lada .odr/a dar la reacci,$ de Bi&re%9
@na proteína coagulada si podría dar la reaccin de Biuret4 debido a que el reactivo reacciona con cualquier proteína4 líquida o slida4 por e!emplo cuando se $ace la cuanti;cacin de proteínas en suero (líquida* o una prueba cualitativa en $uevos carne o papas4 etc. 67&
#r&.o"
=&$cio$ale"
"e
re;ela$
e$
la
reacci,$
de
Ni$*idri$a9
7>isten varias reacciones de coloracin tiles que permiten la identi;cacin tanto de amino8cidos como de las proteínas. ,lgunas son especí;cas para determinados amino8cidos: otras son generales 9 reconocen tanto amino8cidos como proteínas. &or e!emplo4 las proteínas4 polipptidos 9 H-amino8cidos dan positiva la prueba de la in$idrina4 9a que reconoce sustancias que contienen el grupo H- amino4 identi;c8ndolos con una coloracin que puede ir desde color aul a violeta. (Bo9er4 R. 200*. 67& .a.el >&e#a la %e!.era%&ra e$ la .r&e(a co$ la Ni$*idri$a9
7l tiempo 9 la temperatura son importantes para obtener resultados precisos en la prueba de in$idrina< una temperatura m8s alta (por encima de la temperatura ambiente* o un tiempo m8s prolongado (m8s de minutos* pueden dar resultado "also positivo.
6E" adec&ada la
reacci,$
de
Ni$*idri$a
.ara
di"%i$#&ir
a!i$o'cido" de .ro%e/$a"9 6Por &9
a nin$idrina es un poderoso agente reactivo comn para observar las bandas de separacin de amino8cidos por cromatogra"ía o electro"oresis4 tambin es utiliada con ;nes cuantitativos para la determinacin de amino8cidos. Reacciona con todos los amino8cidos al"a cu9o p= se encuentra entre 9 E4 dando una coloracin que varía de aul a violeta intenso. 7ste producto colorido (llamado prpura de Ru$emann* se estabilia por resonancia4 la coloracin producida por la nin$idrina es independiente de la coloracin original del amino8cido. 7sta prueba es positiva tanto para proteínas como para amino8cidos. (astro4 O 201*. Bi(lio#ra=/a
