RELATÓRIO DE ESTÁGIO EM MICROBIOLOGIA - FARMÁCIA

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UNIVERSIDADE PRESIDENTE ANTÔNIO CARLOS COORDENAÇÃO DE ESTÁGIO PROFESSOR ORIENTADOR: Túlio Lage ESTAGIÁRIO(A): Gesiane Gonçalves Ferreira

MICROBIOLOGIA CLÍNICA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR - I

EMPRESA: UNIPAC SETOR: de Microbiologia PERÍODO DE REALIZAÇÃO: 18/06/2011 a 30/06/2011 30/06/2011 TOTAL DE DIAS: 5 dias TOTAL DE HORAS: 25 horas  NOME DO(A) SUPERVISOR(A): Túlio Lage FUNÇÃO: Professor / Supervisor de estágio FORMAÇÃO PROFISSIONAL: Bacharel e licenciado licenciado em Biologia

Ipatinga - MG 2011

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................ INTRODUÇÃO....................................................... .............................................. .............................................. .........................................2 ..................2 2 CARACTERIZAÇÃO DO LOCAL DE ESTÁGIO...................................................... ESTÁGIO................................................................4 ..........4 3 SÍNTESE DA CARGA HORÁRIA SEMANAL.................................................. SEMANAL....................................................................5 ..................5 4 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS.............................. DESENVOLVIDAS..................................................... .............................................. ..................................6 ...........6 4.1 Coleta, transporte e conservação conservação de amostra.............................. amostra..................................................... ..........................................6 ...................6 4.2 Esfregaço.......................... Esfregaço................................................. .............................................. .............................................. .............................................. ................................7 .........7 4.2.1 Fixação do Esfregaço.......................... Esfregaço................................................. .............................................. .............................................. .................................8 ..........8 4.3 Exames diretos sem coloração ......................................................... ................................................................................ ....................................9 .............9 4.3.1 Salina .............................................. ..................................................................... .............................................. .............................................. .....................................9 ..............9 4.3.2 Hidróxido de potássio......................... potássio................................................ .............................................. .............................................. .................................9 ..........9 4.4 Coloração de Gram........................................ Gram............................................................... .............................................. .............................................. .......................10 10 4.5 Procedimentos para semeadura em meios de cultura............................. cultura.................................................... .............................11 ......11 4.5.1 Semeadura qualitativa............... qualitativa...................................... .............................................. .............................................. .........................................11 ..................11 4.5.2 Semeadura quantitativa............. quantitativa.................................... .............................................. .............................................. .........................................11 ..................11 4.5.3 Procedimentos Procedimentos gerais.................................. gerais......................................................... .............................................. .............................................. .......................12 12 4.6 Incubação......................... Incubação................................................ .............................................. .............................................. .............................................. ..............................13 .......13 4.7 Características Características macroscópicas macroscópicas das colônias....................... colônias.............................................. .............................................. ..........................14 ...14 4.8 Identificação de Staphylococcus ............................................. .................................................................... ...........................................16 ....................16 4.9 Identificações de Streptococcus e Enterococcus ........................................... ...............................................................16 ....................16 4.10 Provas de identificação de cocos Gram positivos ............................................. ............................................................17 ...............17 4.10.1 Prova da catalase ............................................................. .................................................................................... .............................................. .......................17 17 4.10.2 Coagulase ............................................. .................................................................... .............................................. .............................................. ...........................17 ....17 4.10.3 Teste de CAMP ............................................ ................................................................... .............................................. ..........................................18 ...................18 4.11 Enterobactérias Enterobactérias ............................................ ................................................................... .............................................. .............................................. .......................18 18 4.12 Bacilos Gram negativos não fermentadores.................. fermentadores......................................... .............................................. .............................19 ......19 4.13 Meios de cultura............................. cultura.................................................... .............................................. .............................................. .....................................20 ..............20 4.14 Teste de suscetibilidade suscetibilidade antimicrobiana............... antimicrobiana...................................... .............................................. .....................................21 ..............21 4.14.1 Prova de sensibilidade sensibilidade por Disco-Difusão (Kirby-Bauer).................................... (Kirby-Bauer)............................................21 ........21 5 CONCLUSÃO.............................. CONCLUSÃO..................................................... .............................................. .............................................. ...........................................22 ....................22 REFERÊNCIAS............................... REFERÊNCIAS...................................................... .............................................. .............................................. ...........................................23 ....................23

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1 INTRODUÇÃO

O Laboratório de Microbiologia possui o objetivo de apontar o responsável por um determinado estado infeccioso e indicar através do monitoramento de populações microbianas qual qual o perf perfil il dos dos mi micr cror orga gani nism smos os que que estã estãoo inte intera ragi gind ndoo com com o home homem. m. Com Com essa essass infor informaç mações ões,, a equipe equipe de saúde saúde é capaz capaz de defini definirr quais quais mi micro crorga rganis nismos mos podem podem ser  responsáveis pelo quadro clínico do paciente e assim, propor um tratamento mais adequado. As atividades em um laboratório de microbiologia incluem estabelecer informações sobre a melho melhorr amost amostra ra bio biológ lógica ica,, reconh reconhece ecerr a flora flora norma normall e os conta contami minan nantes tes,, deter determi minar nar o trat tratam amen ento to que que bene benefi fici ciar aráá o paci pacien ente te,, iden identi tifi fica carr mi micr cror orga gani nism smos os com com prop propós ósit itos os epidemiológicos, obter resultados rápidos em casos de emergência, racionalizar no uso de antimicrobianos, relatar os resultados e ainda, manter uma educação médica contínua em relaç relação ão aos aspec aspectos tos das infec infecçõe çõess (ORGAN (ORGANIZA IZAÇÃ ÇÃO O MUNDIAL MUNDIAL DA SAÚDE, SAÚDE, 2002; 2002; MURRAY et al.,2002). Diferent Diferentes es microrgan microrganismo ismoss como bactéri bactérias, as, fungos, fungos, e vírus vírus causam causam infecçõ infecções es ao organismo humano. O grupo patogênico em destaque são as bactérias que constituem a flora humana e que normalmente não trazem risco aos indivíduos saudáveis, devido sua baixa virulência, mas que causam infecções em indivíduos em estado clínico comprometido, por  isso isso são denomi denominad nadas as como como bacté bactéria riass oportu oportuni nista stass (ORGAN (ORGANIZA IZAÇÃ ÇÃO O MUNDIAL MUNDIAL DA SAÚDE, 2002). O segund segundoo grupo grupo de im impor portâ tânci nciaa médic médicaa nas nas infec infecçõe çõess são os fungo fungos, s, sendo sendo a Cândida albicans

e o  Aspergillus os patógenos mais freqüentes. Dentre as viroses, o vírus da

hepatite hepatite B e C, enteroviroses enteroviroses e viroses associadas associadas com pneumonia são comumente registrados (MURRAY et al.,2002). Os patóge patógenos nos im impli plica cados dos nas nas infec infecçõe çõess são transm transmit itido idoss ao ind indiví ivíduo duo tanto tanto via endógena, ou seja, pela própria flora do paciente, quanto pela via exógena. Esta última é veiculada pelas mãos, secreção salivar, fluidos corpóreos, ar e materiais contaminados, como  por exemplo, equipamentos e instrumentos utilizados em procedimentos médicos invasivos, que facilitam a penetração destas barreiras de modo a elevar o risco de infecção (MURRAY et al.,2002).

Os principais fatores que influenciam a aquisição de uma infecção são o estado imuno im unológ lógico ico,, idade idade (recé (recém-n m-nasc ascido idoss e idoso idososs são são mais mais vul vulner neráve áveis) is),, uso abusi abusivo vo de

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antibióticos, procedimentos médicos (invasivos), imunossupressão e falhas nos procedimentos de controle de infecção (ROSSI e ANDREAZZI, 2005). O estágio de Microbiologia tem o objetivo de ampliar e aprimorar os conhecimentos sobre a área de atuação clínica microbiológica, preparar o estudante para a rotina de um laboratório de microbiologia tomando por conhecimento os princípios de elaboração e da colheita, conservação e transporte do material de interesse clínico; estabelecer e executar  rotinas microbiológicas, dentro dos padrões técnico-científicos vigentes, que permitam o isola isolamen mento to e ident identif ific icaçã açãoo dos princ principa ipais is agent agentes es infec infecci cioso ososs de imp import ortânc ância ia clíni clínica ca;; determinar a sensibilidade às drogas antimicrobianas; efetuar o controle de qualidade de suas ativ ativid idad ades es e dos dos proc proces esso soss de este esteri rili liza zaçã çãoo e divu divulg lgar ar e pôr pôr em prát prátic icaa norm normas as de Biossegurança. Este relatório tem como objetivo descrever as atividades desenvolvidas no estágio de Análises Clínicas no setor de Microbiologia no Laboratório de Microbiologia da Faculdade Presidente Presidente Antônio Carlos, assim como as principais atribuições do profissional profissional farmacêutico neste setor.

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2 CARACTERIZAÇÃO DO LOCAL DE ESTÁGIO

O estágio de parasitologia clínica foi realizado no laboratório 417 no quarto andar da Faculdade Presidente Antônio Carlos, Campus Ipatinga, localizado na Rua Salermo, 299 Bairro Bethânia. As atividades foram instruídas e supervisionadas pelo professor Túlio Lage. O laboratório onde foram feitas as atividades do estágio é amplo, disposto com   bancada bancadass nas quais quais estão estão disposto dispostoss os microscó microscópios pios,, também: também: cadeiras cadeiras,, televis televisor, or, lousa lousa  branca, armários com equipamentos e materiais para a realização de análises diversas, pia, armários, produtos químicos, materiais de coleta de urina e equipamentos equipamentos de laboratório laboratório como capela de fluxo laminar e centrífuga.

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3 SÍNTESE DA CARGA HORÁRIA SEMANAL

Semana 18.06.11 20.06.11 – 21.06.11- 22.06.11 30.06.11

Número de dias 01 03 01

4 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

Número de horas 05 15 05

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Durante o período de estágio foram ministradas pequenas aulas teóricas antes de iniciar as práticas, com ilustrações dos procedimentos e esquemas das técnicas que seriam realizadas. Estas atividades e as informações concedidas durante o estágio em microbiologia estão descritas a seguir.

4.1 Coleta, transporte e conservação conservação de amostra Todo Todo resul resultad tadoo li liber berado ado pelo pelo labor laborat atóri órioo de mi micro crobio biolog logia ia é conseq consequê uênci nciaa da qualidade da amostra recebida. O material coletado deve ser representativo do processo infeccioso investigado e escolhido o melhor sítio da lesão, evitando contaminação com as áreas adjacentes. A coleta e o transporte inadequados podem ocasionar falhas no isolamento do agente etiológico e favorecer o desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a um tratamento não apropriado. Portanto, procedimentos adequados de coleta devem ser adotados para evitar  o isola isolamen mento to de um “fals “falso” o” agente agente etiol etiológi ógico co,, result resultand andoo numa numa orien orienta tação ção terap terapêut êutic icaa inadequada. O profissional responsável pela coleta será também responsável por identificar de forma legível o material a ser encaminhado ao laboratório de microbiologia. A amostra deve conter: •

 Nome e registro do paciente

•

Leito ou ambulatório e especialidade

•

Material colhido

•

Data, hora e quem realizou a coleta

Transportar as amostras imediatamente imediatamente ao laboratório laboratório para: •

Assegurar a sobrevivência e isolamento do microrganismo, pois o laboratório

de microbiologia trabalha basicamente em função da viabilidade dos microrganismos. •

Evitar o contato prolongado dos microorganismos com anestésicos utilizados

durante a coleta, pois eles poderão exercer atividade bactericida. •

Evitar erros de interpretação nas culturas quantitativas, principalmente urina e

lavado broncoalveolar.

4.2 Esfregaço

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Os esfregaços devem ser preparados com um gradiente de espessura suficientemente dens densoo para para faci facili lita tarr a visu visual aliz izaç ação ão,, mas, mas, tamb também ém,, bast bastan ante te espa espars rsoo para para reve revela larr as carac caracte terís rístic ticas as do agrupa agrupame mento nto.. Os melhor melhores es result resultado adoss serão serão obt obtido idoss se as mesma mesmass  permanecerem  permanecerem no álcool até o momento do uso. A técnica para preparo do esfregaço deve ser  realizada da seguinte maneira: •

Identificar a lâmina.

•

Rolar toda a superfície do swab sobre a lâmina para não destruir as células.

•

Fixar rapidamente na chama.

•

Quando material é escasso, demarcar a área do esfregaço.

•

Proceder o método de coloração mais apropriado.

 Amostra coletada com swab

‫ـ‬ Rodar o  swab suavemente pela lâmina limpa, evitando a destruição dos elementos celulares e dos grupamentos ‫ـ‬ Quando somente um  swab for coletado, colocá-lo em um tubo estéril contendo uma  pequena quantidade quantidade de salina estéril (0,4 ( 0,4 ml) e agitar (vortex) ‫ـ‬ Comprimir o  swab contra as paredes do tubo e utilizá-lo para fazer o esfregaço. O restante do material pode ser inoculado nos meios de cultura. Observação: materiais clínicos coletados com  swab são menos recomendados para cultura. Coletar, sempre que possível, dois  swabs: um será utilizado para fazer o esfregaço e o outro para cultura.  Aspirados,  Aspirados, exsudatos, etc.

‫ـ‬ Materiais recebidos em seringas serão transferidos para um tubo estéril e agitados (vortex), quando necessário ‫ـ‬ Selecionar a porção mais purulenta ou mucosa com pipeta ou alça bacteriológica ‫ـ‬ Amostras muito espessas ou purulentas podem ser diluídas com uma gota de salina estéril e espalhadas sobre uma grande área da lâmina formando um esfregaço delgado

 Escarro

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‫ـ‬ Com auxílio de alça bacteriológica ou um palito de madeira, “pescar” uma porção  purulenta do escarro que seja representativa ‫ـ‬ Rolar esta porção na parede do frasco para separar do material salivar  ‫ـ‬ Em seguida, colocar o material na extremidade de uma lâmina limpa confeccionando um esfregaço delgado ‫ـ‬ Quando a quantidade de saliva for grande e pequenas porções purulentas forem visíveis, transferir a amostra para uma placa de Petri para facilitar a retirada do material representativo Urina jato médio

- Homogeneizar bem o material e utilizar uma gota da amostra, sem centrifugação Cultura em caldo

- Transferir uma a duas gotas para uma lâmina limpa utilizando alça bacteriológica bacteriológica ou  pipeta; - Espalhar suavemente o material a fim de obter um esfregaço delgado. Meio sólido

- Utilizar uma gota de salina estéril em uma lâmina limpa; - Transferir uma pequena porção da colônia com alça bacteriológica; - Misturar suavemente para obter um esfregaço levemente turvo e homogêneo. para evit evitar ar a form formaç ação ão de aero aeross ssói óis, s, nunc nuncaa mi mist stur urar ar o mate materi rial al Observação : para vigorosamente. 4.2.1 Fixação do Esfregaço

Todo o esfregaço, antes de ser submetido à coloração, deve estar seco (exposto ao ar), sendo fixado com calor brando à 50ºC. A fixação excessiva e o superaquecimento irão distorcer a morfologia celular e a fixação insuficiente permitirá a saída do material durante o  processo de coloração. Deixar a lâmina esfriar antes de iniciar a coloração. A fixação pelo metanol ou etanol também pode ser utilizada. Além de prevenir a lise das das hemác hemácia ias, s, evita evita que os esfre esfregaç gaços, os, princi principal palmen mente te os de urina urina,, despre desprenda ndam-s m-see no momento da coloração. Deixar o esfregaço secar numa superfície plana; após, colocar uma a

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duas gotas de álcool (1min), drenando o excesso, sem lavar. Não aquecer a lâmina antes da coloração.

4.3 Exames Diretos sem Coloração 4.3.1 Salina

O exame direto com salina permite observar a morfologia bacteriana e verificar a existência de motilidade. É utilizado também para pesquisa à fresco de Trichomonas em secreções e fungos (leveduriformes ou filamentosos) em diversos materiais. Materiais

- Salina (Soro fisiológico a 0,85%) - Lâmina - Lamínula  Procedimento

- Goteja-se uma gota de salina no centro da lâmina de microscopia e nela suspende-se uma colônia ou uma alçada do material a ser investigado. - Cobre-se com a lamínula e observa-se ao microscópio microscópio em objetiva objetiva de 40X ou 100X. 4.3.2 Hidróxido de potássio

É utilizado para pesquisar fungos (leveduriformes e principalmente filamentosos) filamentosos) em material biológico na presença de muco, restos celulares, escamas de pele, pelos e unhas. A adição de hidróxido de potássio facilita a microscopia já que esse dissolve a queratina e o muco destacando as estruturas fúngicas, quando presentes. Materiais

- Hidróxido de potássio em solução aquosa a 10% ou 20% - Lâmina - Lamínula  Procedimento :

- Coloca-se uma pequena quantidade do material no centro da lâmina - Adiciona-se uma ou duas gotas de KOH

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- Cobre-se com a lamínula e aguardar 30 minutos ou aquecer ligeiramente para acelerar o clareamento - Examina-se com objetiva de 10X ou 40X. Obs: As lâminas poderão ser colocadas em câmara úmida e, após 24 horas, realizar  segunda leitura ao microscópio.

4.4 Coloração de Gram A coloração de Gram é usada para classificar as bactérias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes. No laboratório de microbiologia clínica este é um teste rápido para o diagnóstico de agentes infecciosos, sendo também util utiliz izado ado para para avali avaliar ar a quali qualidad dadee da amostr amostraa clíni clínica ca anali analisad sada. a. As inter interpre preta taçõe çõess dos esfregaços corados pelo Gram envolvem considerações relacionadas relacionadas com as características da color coloraç ação, ão, tamanh tamanho, o, forma forma e agrupa agrupamen mento to das célul células. as. Estas Estas caract caracterí erísti sticas cas podem podem ser  influenciadas por vários fatores, incluindo idade da cultura, o meio de cultivo utilizado, a atmosfera de incubação e a presença de substâncias inibidoras. É o método de análise util utiliz izad adoo para para bact bacter erio iosc scop opia ia da maio maiori riaa dos dos mate materi riai aiss biol biológ ógic icos os ou cult cultur uras as de microrganismos microrganismos em meios sólidos ou líquidos; para as amostras analisadas de culturas jovens (<24h) de meio de cultura sem inibidores e amostras clínicas recém-coletadas, para as quais fornecem os melhores resultados, e ainda, para a verificação verificação da morfologia bacteriana bacteriana a partir  de esfregaços de cultura em caldo.  Procedimento :

- Cobre-se a área com a solução de cristal-violeta por cerca de um minuto. - Decanta-se o cristal-violeta e lava-se suavemente com a própria solução de iodo ou água da torneira. (Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta das células Gram-positivas). - Cobre-se a área do esfregaço com a solução de iodo Lugol durante cerca de um minuto. - Descora-se a lâmina com a mistura álcool-acetona (1:1), até que o solvente escorra incolor. - Alterna-se com água corrente. O tempo usualmente utilizado nesta etapa é de cerca de 10 segundos. (Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta

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das células Gram-positivas, assim como, a pouca descoloração pode resultar em pouca retirada do cristal violeta, ocasionando uma tonalidade azulada nas bactérias Gram-negativas). - Cobre-se o esfregaço com a solução de safranina (ou Fucsina básica 0.1% a 0.2%),  por cerca de 30 segundos. - Lava-se com água corrente. - Deixa-se secar ao ar, em temperatura branda (50ºC). As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração violeta enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto, coradas com o corante de fundo (fucsina) e se apresentam róseas.

4.5 Procedimentos para semeadura em meios de cultura 4.5.1 Semeadura qualitativa

A semeadura para cultivo qualitativo qualitativo pode ser feito com o próprio swab ou amostra do material removida com alça flambada e semeada de forma a obter um gradiente decrescente de concentração do inóculo, que permita o isolamento de todas as colônias diferentes. Reco Recome mend ndaa-se se que que a seme semead adur uraa e a leit leitur uraa das das plac placas as seja sejam m real realiz izad adas as pelo pelo mesm mesmoo  profissional para aprimorar a técnica de semeadura e isolamento de colônias.

Fonte: ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2002. 4.5.2 Semeadura quantitativa

O cultivo quantitativo baseia-se na semeadura de um volume conhecido de material e a contagem do número de UFC (unidades formadoras de colônia) obtidas após incubação. Utilizam-se dois artifícios para o efeito de diluição do material: - Uso de pequenos volumes: normalmente de 1, 10 ou 100 µL. O número de UFC obtido deverá ser multiplicado pelo fator de correção para 1 ml, relativo ao volume inoculado;

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1.000, 100 ou 10, respectivamente. Pode ser realizada utilizando-se volume de material definido por alça calibrada ou pipeta com ponteira estéril. - Técnicas dilucionais: costuma-se utilizar a diluição seriada do material em escala decimal, isto é, 1:10, 1:100, 1:1.000 … O número de UFC obtido deverá ser multiplicado pelo fator de correção para 1 ml, relativo à diluição utilizada; 10, 100, 1.000 ..., respectivamente. 4.5.3 Procedimentos gerais

- Descarrega-se o material num canto da placa; - Flamba-se a alça; - Esfria-se a alça em um canto do ágar; - Semea-se partindo da ponta da primeira semeadura. - A cada mudança de direção flamba-se a alça e esfria-se. - Homogeneiza-se o material com agitação manual em diferentes direções ou em vortex (mixer). - Obtém-se o volume definido pela técnica com o auxílio de uma pipeta com ponteira estéril ou alça calibrada. No caso da alça, observa-se a integridade da película formada até depositá-la na parte superior da placa. Ainda com a alça, sem flambar até o final da semeadura, distribuir o material em linha reta até a outra extremidade. Perpendicularmente, distribui-se o material por toda a superfície de maneira uniforme. Repete-se o mesmo  procedimento por 3 vezes, ou até que a superfície da placa esteja seca, alterando a direção da estria (vide figura abaixo). - Evita-se o uso de placas úmidas e, após semeada, não incubar caso haja umidade na superfície superfície do ágar. - Evita-se o rompimento do ágar, estriando o material suavemente. suavemente.

Fonte: ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2002.

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4.6 Incubação A incubação deve seguir alguns parâmetros determinados:  Atmosfera

- Para bactérias não exigentes em secreções, urina, fezes, etc. incubar em estufa em atmosfera ambiente. - Para Para bactér bactéria iass exige exigent ntes es tais tais como: como: pneumo pneumococ cocos, os, hemófi hemófilo loss e Neisse Neisseria riass ou fastidiosos fastidiosos incubar em microaerofilia (Jarra com vela acesa de modo a obter 3-5% de CO 2). - Para Campylobacter  é necessário tensão de 5 a 10% de CO2 e restrição de O2 sendo conveniente o uso de geradores específicos. - Para bactérias bactérias anaeróbias, incubar em sistema de anaerobiose estrita. Temperatura

- 36oC +/- 1oC é a temperatura para a grande maioria das bactérias da rotina, incluindo os anaeróbios e micobactérias. - Fungos podem ser cultivados a 30 oC ou 25 e 35oC. - Temperatura à 42 oC pode ser necessário para isolar espécies de Campylobacter,  Acinetobacter aumannii, e algumas espécies de  Pseudomonas.

Umidade

- Bactéria Bactériass fastidio fastidiosas sas e exigente exigentess (neisseri (neisserias as patogêni patogênicas cas e hemófil hemófilos) os) crescem crescem melhor se forem incubadas num recipiente com tensão de 5% de CO 2 com um chumaço de algodão embebido em água estéril. Tempo

- Em geral a primeira leitura é realizada com 18 a 24 horas de incubação ou em casos de urgência para iniciar a identificação e antibioGrama, a partir de 6 horas é possível visualizar crescimento de algumas enterobactérias. - Para anaeróbios é recomendável a primeira leitura com 48 a 72 horas de incubação. incubação. - Para bactérias exigentes ou de crescimento lento o período de incubação pode ser   bastante prolongado: Micobactérias de 3 a 45 dias;  Nocardia, 4 a 7 dias;  Brucella 3 a 7 dias (hemoculturas (hemoculturas até 45 dias).

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4.7 Características macroscópicas das colônias Alguns aspectos são fundamentais na leitura inicial das placas para se estabelecer um diagnóstico presuntivo e direcionar o exame: Tamanho

O tamanho das colônias deverá ser considerado na placa como um todo, uma mesma cepa pode formar colônias de tamanhos variados em diferentes pontos da placa: - Puntiforme (<1 mm de diâmetro) - colônias muito pequenas, características de  bactérias mais exigentes. - Pequena (até 2 mm de diâmetro) –  Shigella e Yersinia costumam crescer em MaC Conkey e Salmonella-Shigella como colônias pequenas e lactose negativa. Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter  maltophilia,  Acinetobacter  spp, Enterococcus

spp, pneumococos, Streptococcus spp. Cândida

spp e alguns esfafilococos coagulase negativo também costumam formar colônias pequenas. - Média (até ( até 3 mm de diâmetro) – Enterobactérias, Enterobactérias, não fermentadores e Estafilococos. Estafilococos. - Grandes (mais de 4 mm de diâmetro) –  Bacillus spp, algumas enterobactérias como  Klebsiella e Enterobacte r, o mesmo ocorre com não fermentadores como  Pseudomonas. Vale

lembrar a formação de véu, característico característico do gênero  Proteus, Comamonas e algumas cepas de  Pseudomonas.

Cor 

A coloração dependerá do meio de cultura utilizado. utilizado. Meios não diferenciais diferenciais – pode-se identificar a coloração características de alguns microrganismos: - S. aureus –  amarelo - Micrococcus  – amarelo - Serratia  – avermelhado avermelhado - Roseomonas - róseo - Pseudomonas – diferentes tons de verde e castanho - Enterococcus casseliflavus –  amarelo Meios diferenciais – a coloração da colônia sofre interferência das reações que ocorrem com substratos dos meios de cultura: - Utilização da lactose no Mac Conkey – vermelho - Utilização da lactose no CLED – amarelo - Utilização do manitol em Ágar manitol salgado – amarelo

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- Produção de H2S no Hecktoen Enteric e Salmonella-Shigella Salmonella-Shigella – negro  Hemólise

Baseada na lise de hemácias contidas no Ágar Sangue (5%) - Lise total – denominada beta-hemólise, ocorre a formação de halo de transparência ao redor e/ou sob a colônia: S. pyogenes, S. agalactiae, agalactiae, Listeria, S. aureus, S. haemolyticcus,  Enterococcus.

- Lise parcial – denominada alfa-hemólise, há formação de halo com coloração esverdeada: S. viridans, S. pneumoniae, Enterococcus. - Ausência de lise – definida como gama-hemólise, meio de cultura inalterado:  Enterococcus,

Estafilococos coagulase negativo.

Forma da colônia

- Redonda –    E. coli, coli, Klebsi Klebsiel ella, la, Serra Serrati tia, a, Steno Stenotro tropho phomon monas, as, Acine Acinetob tobact acter er,, Estafilococos, Estreptococos - Irregular –  Pseudomonas,   Pseudomonas, Proteus, Providencia, Morganella, Bacillus - Produção de véu –  Proteus,  Proteus, Comamonas, Pseudomonas - Filamentosas – fungos filamentosos - Formando pontas, como estrelas –  Cândida - Com depressão no centro – Pneumococo - Cerebriforme –  Pseudomonas  Pseudomonas stutzeri - Elevada –  Klebsiella,   Klebsiella, Bacillus - Chata –   Enterobacter, Pseudomonas Consistência

- Friável, quebradiça - Moraxella - Mucóide –   Klebsiella, Pseudomonas,  Bacillus

- Seca –  E.  E. coli, Citrobacter, S. aureus - Butirosa (manteiga) –  Candida Cheiro

- Eikenella corrodens – cheiro de cloro - Pseudomonas – cheiro adocicado

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- Anaeróbios – cheiro fétido  Densidade

- Opaca: E. coli, Candida, S. aureus - Brilhante: Stenotrophomonas, Pneumococo

4.8 Identificação de  Staphylococcus Para Para a iden identi tifi fica caçã çãoo de bact bactér éria iass do gêne gênero ro Staphylococcus,   principa principalmen lmente te o Staphylococcus aureus , uma das espécies de maior importância médica, utiliza-se a prova da

coagulase. De maneira geral, os estafilococos são divididos em duas categorias: coagulase  positivos e coagulase negativos. Este teste, pode, ainda, ser realizado de duas formas: em lâmina e em tubo.

4.9 Identificações de  Streptococcus e Enterococcus Para se diferenciar as espécies dentro do gênero dos estreptococos são utilizadas três etapas de identificação: 1. Propriedades sorológicas (grupos de Lancefield). Lancefield). 2. Padrões hemolíticos 3. Propriedades bioquímicas (fisiológicas) (fisiológicas) A identificação sorológica é feita apenas para os estreptococos β-hemolíticos, porém, essa prova não é acessível a todos os laboratórios. É importante notar que as identificações devem ser feitas e ágar sangue e elas se dividem em: •

β-hemolítico

•

α-hemolítico

•

γ-hemolítico

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4.10 Provas de identificação de cocos Gram positivos 4.10.1 Prova da catalase

 Reagentes :

Peróxido de hidrogênio 3% armazenado em frasco âmbar. Cultura de 10 a 48 horas do microorganismo a ser testado  Procedimento :

Com a alça bacteriológica ou com um palito coleta-se o centro de uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Coloca-se sobre este esfregaço uma gota de água oxigenada a 3% e observar a formação de bolhas.  Interpretação :

O teste é positivo se houver formação de bolhas rapidamente.  Interferentes:

Algumas bactérias contêm outras enzimas, que não catalase, que podem decompor o   peróx peróxido ido de hidro hidrogên gênio io,, mostra mostrando ndo o aparec aparecime iment ntoo de bol bolha hass pequen pequenas as após após 20 a 30 segundos. Nesse Nesse caso, o teste é considerado negativo. negativo. A catalase está presente presente nas células vermelhas do sangue, por isso deve-se tomar cuidado para não carregar porções do ágar  sangue juntamente com as colônias para evitar a obtenção de resultados falso-positivos. 4.10.2 Coagulase

A maioria das cepas de S. aureus possui a coagulase ligada – fator de aglutinação “clumping factor”- na superfície da parede celular, que reage com o fibrinogênio do plasma causando coagulação do mesmo.  Reagentes:

Plasma com EDTA Colônia a ser testada  Procedimento:

Colocam-se 2 gotas de salina em uma lâmina Emulsiona-se uma colônia isolada a ser testada Adiciona-se Adiciona-se 1 gota de plasma e mistura-se com palito de plástico ou madeira

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Observa-se se há aglutinação em 10 segundos  Interpretação :

O teste é positivo quando ocorre a formação de precipitado granuloso ou de grumos  brancos. Essa prova é considerada apenas presuntiva e todas as culturas que apresentarem resultado negativo ou positivo tardio devem ser examinados através da prova em tubo, pois algumas cepas produzem coagulase livre que não reagem na prova em lâmina. 4.10.3 Teste de CAMP 

 Reagentes :

Deve ser realizada na mesma placa do teste da Bacitracina Cepa de S. aureus produtor de beta lisina Cepa de estreptococos alfa-hemolíticos a ser testada  Procedimentos :

- Inocula-se uma estria única de uma amostra de Staphylococcus Staphylococcus aureus  produtor de  beta lisina no centro de uma placa de ágar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro. - Inoculam-se as amostras a serem testadas em estrias formando um ângulo reto com a linha de inoculação da amostra teste de estafilococo. estafilococo. As estrias não devem se tocar, ficando a 1 mm de distância, e deste modo várias amostras podem sertestadas em uma mesma placa de ágar sangue. A maneira de inocular é fundamental para a observação do efeito esperado. - Incuba-se a placa a 35-37°C durante um período de 18-24 horas.  Interpretação :

O teste é positivo para Streptococcus agalactiae , quando há evidencia de alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha característica, na área de intersecção entre as duas estrias.

4.11 Enterobactérias A família  Enterobacteriaceae constitui constitui a maior e mais heterogênea heterogênea coleção de bacilos Gram negativos de importância médica, sendo o grupo de bactérias bactérias mais isolado das amostras  biológicas. Tipicamente, estas bactérias produzem colônias secas ou mucóides relativamente gran grande dess de cor cor cinz cinzaa opac opacoo em ágar ágar sang sangue ue.. Entr Entret etan anto to,, a dife difere renc ncia iaçã çãoo base baseia ia-s -see

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  princ princip ipalm alment entee na prese presença nça ou ausênc ausência ia de difere diferent ntes es enzim enzimas as codif codific icada adass no materi material al genético bacteriano. Com poucas exceções, todos os membros da família  Enterobacteriaceae possuem as seguintes características: 1. Fermentação da glicose 2. Citocromo oxidase negativa 3. Redução de nitrato a nitrito As principais provas para a identificação das enterobactérias de importância clínica são: ⋅

Fermentação da glicose

⋅

Fermentação da lactose

⋅

Motilidade

⋅

Utilização de citrato

⋅

Descarboxilação da lisina

⋅

Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S)

⋅

Produção de gás (CO2)

⋅

Oxidase

⋅

Produção de indol

⋅

Produção de urease

⋅

Produção de fenilalanina desaminase ou opçãotriptofanase

⋅

Produção de gelatinase ou opção DNAse

Os esquemas de identificação baseiam-se na determinação dos gêneros e espécies mais isolados na clínica, e nas provas mais características de cada gênero e espécie, baseado em alguns critérios como: facilidade de execução, facilidade de interpretação, custo, rapidez  para leitura, etc.

4.12 Bacilos gram negativos não fermentadores Os baci bacilo loss Gram Gram nega negati tivo voss nãonão-fe ferm rmen enta tado dore ress (BNF (BNFs) s) são são um grup grupoo de microorganismos aeróbios, ou seja, não utilizam carboidratos como fonte de energia ou os degrada por outras vias metabólicas que não a fermentação. Embora a sua incidência seja

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 pequena, geralmente apresentam resistência á vários antibióticos e são capazes de causar  infecções graves. Suspeita-se que um bacilo Gram negativo desconhecido pertence ao grupo de nãofermentadores quando se observa uma ou mais das características seguintes: ⋅

Ausência de evidências de fermentação da glicose

⋅

Reação positiva de citocromo oxidase

⋅

Ausência de crescimento em ágar MacConkey

4.13 Meios de cultura O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.

Ágar sangue (AS) – meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele crescem a maioria dos Gram negativo e Gram positivo, além de fungos filamentosos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies de hemófilos e outros fastidiosos

Ágar chocolate (AC) – meio rico e não seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactérias aeróbias e facultativas. Quando incubado em CO 2 dá suporte também ao crescime crescimento nto dos microaer microaerófil ófilos. os. Pode-se Pode-se observar observar halos halos esverdead esverdeados os com colônias colônias alfaalfahemolíticas

Ágar Mac Conkey (MC) – meio seletivo para Gram negativo e diferencial para a utilização de lactose. Deve inibir o crescimento de microrganismos Gram positivo. ‫ـ‬ Lactose positiva – coloração avermelhada ‫ـ‬ Lactose negativa – coloração inalterada ‫ـ‬ Como exceção, eventualmente, podem crescer  Enterococcu s, Candida e Bacillus

Ágar Salmonela-S Salmonela-Shige higella lla (SS) – meio meio sele seleti tivo vo para para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose (coloração rósea) e produção de H2S (coloração negra)

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Ágar Hecktoen Enteric (HE) - meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial  para a utilização de lactose (coloração alaranjada) e produção de H2S (coloração negra)

Ágar Thayer Martin Modificado (TMM) – meio seletivo pela adição de colistina, vancomic vancomicina ina e nistati nistatina na ini inibe be crescime crescimento nto de enterobac enterobactéri térias, as, Gram positi positivos, vos, fungos fungos e algumas espécies de Neisserias saprófitas. Enriquecido Enriquecido com a adição de complementos complementos para a recuperação recuperação de N. meningitidis e N. gonorrhoeae

4.14 Teste de suscetibilidade antimicrobiana O princípio do teste de susceptibilidade microbiana é medir a capacidade de um antibiótico inibir o crescimento bacteriano in vitro. Utilizam-se os discos comercialmente disponíveis com diâmetro apropriado. Após a incubação das bactérias no meio devidamente  preparado, faz-se a interpretação dos resultados de acordo com os diâmetros onde não houve crescimento dos microrganismos. Os valores das medidas dos diâmetros são comparados ao de uma tabela e través da qual, determina-se a capacidade da bactéria ser “susceptível”, “intermediário” ou “resistente”. O teste de disco-difusão, ou antibiograma, é baseado na presença ou ausência de um halo de inibição e a medida do seu diâmetro é correlacionada às concentrações inibitórias mínimas (CIMs). Os testes de sensibilidade sensibilidade são indicados quando se acredita que o organismo causador da infecção pertence a uma espécie capaz de demonstrar resistência aos agentes antimicrobianos normalmente usados. 4.14.1 Prova de sensibilidade por Disco-Difusão (Kirby-Bauer)

Leitura das Placas e Interpretação dos Resultados Após Após 16-1 16-188 hora horass de incu incuba baçã ção, o, exam examin inaa-se se cada cada plac placa. a. A plac placaa deve deve ser  ser  satisfatoriamente semeada para que os halos de inibição resultantes se formem círculos uniformes. Os diâmetros dos halos de inibição total são mensurados em milímetros com um  paquímetro  paquímetro ou uma régua, incluindo-se incluindo-se o diâmetro do disco. O tamanho dos halos de inibição é interpretado com a utilização de uma tabela, onde, classificam-se os organismos como sensíveis, intermediários, ou resistentes aos agentes testados.

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5 CONCLUSÃO

O setor de Microbiologia, como qualquer outro setor do Laboratório de Análise Clíni Clínica cass é um setor setor onde onde preci precisa sa trabal trabalhar har com com mui muita ta atenç atenção ão e precau precauçã çãoo util utiliz izand andoo adequadamente os equipamentos de proteção individual (EPI’s) devido o manuseio com amostras amostras de sangue. sangue. Os procedim procedimento entoss dos testes testes devem devem ser realiza realizados dos cuidados cuidadosamen amente te analisando analisando cada passo e observando possíveis contaminações cruzadas como falta de limpeza, esterilização meio de cultura não eficiente e outros, os quais podem vir a levar alteração no resultado do exame, assim faz-se necessário a padronização da execução dos métodos para um resultado mais seguro e confiável. O papel do farmacêutico no setor é acompanhar a realização correta dos exames, a  padronização da execução dos métodos, interpretação dos resultados para liberação do laudo e garantia do controle de qualidade.

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REFERÊNCIAS

MINISTÉRIO DA SAÚDE. SECRETARIA NACIONAL DE ASSISTÊNCIA À SAÚDE. Manual de procedimentos básicos em microbiologia clínica para o controle da infecção hospitalar. Brasília, 1991. MOURA, Robeto de Almeida. WADA, Carlos S. PURCHIO, Adhemar. ALMEIDA, Therezinha Therezinha Verrastro de. Técnicas de Laboratório .3 ed. São Paulo: Editora Atheneu, 2006. MURRAY, Patrick R. et al . Microbiologia médica . 4.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Guanabara Koogan, 2002. 762p. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Procedimentos laboratóriais em bacteriologia clínica. 2.ed. São Paulo: Santos Livraria Editora, 2002. 122p. PARDINI, Hermes. Manual de Exames e Serviços . Belo Horizonte, 2006/2007

Procedimentos Procedimentos Laboratoriais. Disponível em: . Acesso em 30 de Junho de 2011. ROSSI, Flávia; ANDREAZZI, Denise B. Resistência bacteriana : interpretando o antibiograma. antibiograma. Rio de Janeiro: Atheneu, 2005. 118p