Departamento Acadêmico de Química Curso Técnico Integrado: Disciplina: Microbiologia Industrial Relatório de Aulas Práticas
Grupo: Lara Machado Rodrigues Letícia Thaís de Oliveira Alves Mariana Loures Morais Nídia Mayra Duarte Dias Subturma: T2 Professora: Leila Saddi Ortega
1. Título: Ação de Agentes Físicos e Químicos Sobre o Crescimento Bacteriano 2. Introdução:
O controle de crescimento bacteriano é algo indispensável para o bem estar e a sobrevivência humana, pois evita transmissão de doenças, decomposição de alimentos, contaminação de água, ambiente, cosméticos, preparações farmacêuticas e outros. 1 Esse controle pode ser feito de várias maneiras diferentes, mas tem a sempre a finalidade de inibir a reprodução do microrganismo, determinando um bloqueio a uma função microbiológica, ou destruílo, havendo perda irreversível da capacidade de reprodução. É interessante saber a diferença entre os conceitos de esterilização, desinfecção e antissepsia, pois são muito utilizados nesta área. A esterilização consiste na inativação total da capacidade reprodutiva de um organismo, a desinfecção é a inativação ou redução de microrganismos numa superfície de material inanimado e a antissepsia é a destruição de patógenos vegetativos em tecido vivo. Os métodos de controle de crescimento microbiológico são divididos em dois grandes grupos: agentes químicos e agentes físicos. O método a ser utilizado deve ser escolhido de acordo com a natureza do agente e do material que contém o microrganismo para que um resultado de qualidade seja assegurado. Alguns fatores que influenciam o tempo de ação dos agentes físicos e químicos são número e natureza do microrganismo, pois quanto maior a população maior será o tempo gasto para matá-la e a temperatura, já que quanto maior a temperatura mais rápida será a morte da população.
3. Objetivos:
Verificar a ação de métodos físicos sobre diferentes micro-organismos. Avaliar a eficácia dos agentes químicos através da redução ou eliminação de microorganismos em superfícies sanitizadas/desinfetadas.
Atividade 1- Controle da População Microbiana por Agentes Físicos 4. Materiais Necessários: 4.1. Reagentes:
- Caldo lactosado simples (CLS); - Caldo tioglicolato (TGE);
4.2. Materiais:
- Cultura em caldo de E.coli e Bacillus sp. - Tubos de ensaio secos e estéreis. - Tiras de papel de filtro esterilizadas. - Tubos com caldo lactosado simples (CLS) e caldo tioglicolato (TGE). - Pinça. - Tesoura. - Alça de platina. - Placas de ágar nutriente. - Swabs.
4.3. Equipamentos:
- Capela com fluxo laminar com lâmpada UV. - Forno de Pasteur (ou forno comum). - Autoclave. - Bico de Bunsen. Atividade 2- Controle da População Microbiana por Agentes Químicos 5. Materiais Necessários: 5.1. Reagentes:
- Álcool 70% - Água destilada esterilizada
5.2. Materiais:
- Swabs - Papel toalha - Tesoura - Moldes de papel de 10x10cm² - Tubos de ensaio com água esterilizada - Tubos com ágar padrão para contagem - Placas esterilizadas 5.3. Equipamentos:
- Capela com fluxo laminar com lâmpada UV. - Forno de Pasteur (ou forno comum). - Autoclave. - Bico de Bunsen. 6. 1ª etapa – Preparação da atividade prática principal: 6.1. Preenchimento da Ficha Informativa de Reagentes (Tabela 1)
Tabela 1 - Ficha Informativa de Reagentes Nomes do Meio de Cultura Caldo Lactosado (CLS)
Tioglicolato (TGE)
Plate Count Agar (PCA)
Constituintes
Composição Química
Lactose, extrato de carne, peptídeo digesto de tecido animal
Proteínas, carboidratos, polissacarídeos
Peptona de caseína, extrato de levedura, dextrose, Lcisteína, tioglicolato de sódio, NaCl, resazurina, ágar bacteriológico Agar, extrato de levedura, caseína enzimatica hidrolisada, dextrose
Proteínas, carboidratos, polissacarídeos, NaCl, ágar
Ágar, proteínas, carboidratos, polissacarídeos
Descrição FísicoQuímica
Riscos à Saúde/ Impacto Ambiental
Manuseio
Estocagem
pH = 6,9 ±0,2 higroscópico Pó amarelo, homogêneo e sem pó circulante. pH = 7,1 ±0,1 higroscópico
Manter bem fechado longe de luz
pH: 7.0 ± 0.2
Conservar em temperatura ambiente, longe de luz
higroscópico Pó amarelo claro, homogêneo e livre circulante
Manter bem fechado, longe de luz, conservar em 15-30°C
7. 2ª etapa – Execução da atividade principal: 7.1. Procedimento/ metodologia: I. Atividade 1 – Controle da População Microbiana por Agentes Físicos:
1. Numerar os tubos de ensaio da seguinte forma: Grupos A,B,C Tubo 1- E.coli – autoclave Tubo 2 - E.coli – forno de Pasteur Tubo 3 - E.coli – Controle
Grupos A,B,C Tubo 1- Bacillus sp – autoclave Tubo 2 - Bacillus sp – forno de Pasteur Tubo 3 - Bacillus sp – Controle
2. Retirar as rolhas de algodão segundo a técnica de assepsia. 3. Flambar a abertura dos tubos antes da inoculação. 4. Inocular, com auxílio da pinça, nos tubos 1 e 2, secos e estéreis, identificados como tendo E.coli , tiras de papel embebidas nas culturas de Ecoli. 5. Inocular, com auxílio da pinça, nos tubos 1 e 2, secos e estéreis, identificados como tendo Bacillus sp., tiras de papel embebidas nas culturas de Bacillus sp. 6. Flambar a abertura dos tubos após a inoculação. 7. Tampar os tubos com suas respectivas rolhas. 8. Inocular os tubos 3, um com E.coli e adicionar o caldo lactosado, o outro com Bacillus sp e adicionar com caldo tioglicolato. 9. Submeter os tubos 1 ao tratamento em autoclave por 20 minutos a 121°C e os tubos 2 ao forno nas mesmas condições. 10. O tubo 3 não será submetido a nenhum tratamento. 11. Após o tratamento, colocar assepticamente os meios caldo lactosado para E.coli e caldo tioglicolato para Bacillus sp. 12. Incubar os tubos na estufa a 35°C por 48 horas. II. Radiciação ultra-violeta;
1. Identificar as placas da seguinte forma: Grupos A,B,C Placas com E.coli – UV Placa com E.coli - controle positivo
Grupos A,B, C Placas com Bacillus sp – UV Placa com Bacillus sp - controle positivo
2. Semear as culturas microbianas, com auxílio dos swabs, em placas contendo ágar nutriente. 3. Remover as tampas das placas e colocá-las debaixo da lâmpada ultra-violeta. 4. Retirar as placas após 20 minutos.
5. Recolocar as tampas e incubar por 48 horas a 35°C. III. Atividade 2 – Controle da População Microbiana por Agentes Químicos
1. Escolher uma superfície a ser analisada e delimitar uma área dessa superfície com o molde. 2. Coletar o material da área com o swab. 3. Na zona estéril do bico de bunsen, colocar o swab imerso no tubo de água esterilizada. 4. Identificar o tubo (área contaminada) e mantê-lo na área estéril do bico de bunsen. 5. Fazer a desinfecção da área, com o papel toalha embebido em álcool 70%. 6. Após a secagem da área (aproximadamente 15 minutos) coletar material na região desinfetada com auxílio do swab. 7. Na zona estéril do bico de bunsen, colocar o swab imerso no tubo de água esterilizada. 8. Identificar o tubo (área desinfetada) e mantê-lo na área estéril do bico de bunsen. 9. Inocular o conteúdo do tubo “tratado” e do tubo “contaminado” em placas.
10. Adicionar o meio PCA fundido de acordo com a técnica “Pour Plate”. 11. Incubar as placas a temperatura 37°C por 24 a 48 horas. Obs.: Todos os tubos e placas devem ser identificados com: nº do tubo/tipo de placa (UV ou controle), grupo, turma, data e micro-organismo. 7.2. Leitura e interpretação dos resultados:
Tabela 1 Crescimento após os tratamentos Cultura
Autoclave
Forno de Pasteur
Controle
UV/ controle
E.coli
-
-
+
+/+
Bacillus sp.
-
-
-
+/+
Legenda: + crescimento positivo - crescimento negativo Tabela 2 Resultados com o uso do álcool 70% na bancada
Numero de colônias Diversidade de colônias
Piso contaminado
Após desinfecção
2 grandes e 2 pequenas = 4
2 maiores e 6 menores = 8
2
2
7.3. Discussão dos resultados e Conclusão: Discussão
A autoclave e o forno de Pasteur tiveram a capacidade de esterilizar a cultura de E.coli . Não foi detectado nenhum crescimento (turvação ou formação de precipitado) nos tubos comparandoos com o tubo controle, que, por ter sido incubado, teve um crescimento bacteriológico. A tubos contendo Bacillus sp. que foram esterilizados pela autoclave e o forno de Pasteur também não apresentaram crescimento. Porém, nem mesmo no controle pode-se notar turvação ou formação de precipitado, indicando que não houve crescimento. Supõe-se que o erro desse crescimento pode ter vindo da pouca quantidade de microorganismos que foram colocados no tubo controle (apenas uma alçada). Houve crescimento das placas controle, assim como esperado. Mas houve também crescimento das placas que foram expostas à radiação, ainda que reduzido, tanto para E. coli como para Bacillus, indicando que a radiação UV não teve eficácia para esterilizar, causando apenas uma diminuição pequena no crescimento de microorganismos. O método químico que foi escolheu para desinfetar a bancada que serve de apoio para as aulas práticas, região onde a professora Leila se situa, foi o álcool 70% utilizando-se o método de contato de superfícies com swab. Esse mesmo produto é utilizado para se fazer à desinfecção das mãos dos alunos antes de se iniciar as práticas no laboratório. De acordo com a tabela 2, observa-se que o álcool 70% não está eliminando os micro-organismos da bancada. Essa solução deveria eliminar uma grande parte desses seres, pois a atividade antimicrobiana dos alcoóis deve-se principalmente a sua capacidade de desnaturar proteínas. Eles são também solventes de lipídeos, lesando assim as estruturas lipídicas da membrana das células microbianas. Além disso, parte de sua eficiência como desinfetante de superfície pode ser atribuída a ação de detergente e de limpeza, que auxilia na remoção mecânica dos micro-organismos. ¹ Dessa forma, ao se passar ele na bancada, o mesmo deveria eliminar esses seres, mas isso não ocorreu, como podese comprovar observando a tabela 2: foram encontrados um numero maior de colônias na bancada após a desinfecção do que antes, quando ela estava contaminada. Além disso, mesmo após a desinfecção, a diversidade de colônias continuava a mesma. Essa situação pode ter ocorrido pelo motivo do álcool 70% não está tendo sua eficácia como um agente químico, pois o resultado após a desinfecção era para ser outro, com um menor número de colônias. Apesar de ele matar esses seres, ele não mata os esporos dos mesmos. Isso leva a concluir que na área após a desinfecção havia esporos. Além disso, sua concentração pode não estar apropriada. Outro motivo poderia ser a infecção do swab após ele ter sido passado na bancada já desinfetada com o álcool 70%, mas esse fato é muito pouco provável, pois o procedimento de toda a atividade foi realizado com bastante atenção e calma. Conclusão
Podemos concluir que a esterilização por calor seco e calor úmido foi eficiente para esterilizar a cultura de E. coli , mas não podemos concluir o mesmo para a cultura de Bacillus sp. já que não houve crescimento nem mesmo no controle. Podemos concluir também que a radiação não pode ser considerada, nesse caso, como processo de esterilização, e talvez a eficácia da lâmpada germicida já esteja comprometida, sendo necessário ser substituída. Também não é possível concluir, por meio desse experimento, se a esterilização pela autoclave é mais eficiente ou não do que a esterilização pelo forno de Pasteur.
Já em relação ao controle de população microbiana por agentes químicos, conclui-se que, através do procedimento realizado, que o álcool 70%, não está tendo sua ação germicida no laboratório. Para se confirmar isso, é necessário realizar todo o procedimento novamente, para ver se realmente ele não está tendo sua devida eficácia. Dessa forma, de acordo com todos os resultados obtidos, conclui-se que o método mais eficaz para eliminar os micro-organismos em relação ao métodos físicos e químico utilizados na aula, é o método físico no qual utilizou-se a autoclave e o forno de Pauster. 8.
Questões 1- Diferencie os mecanismos de ação relacionados aos métodos de controle microbiano empregados no experimento.
Calor úmido (autoclave) – atua desnaturado as proteínas das células microbianas, enquanto a água influencia na destruição das membranas e enzimas, por destruir as ligações de hidrogênio. Calor seco (forno de Pasteur) – o calor seco oxida os constituintes celulares orgânicos e desnatura as proteínas da célula, matando o microorganismo. Radiação ultravioleta – é um tipo de radiação não-ionizante. Altera o DNA através da formação de dímeros de pirimidina, impedindo o processo de duplicação do DNA, causando a morte celular.
2- Como você explica os resultados diferentes para os diferentes microorganismos?
A colônia de E. coli foi esterilizada tanto pela autoclavagem como pelo forno de Pasteur. Já a colônia de Bacillus sp. não foi esterilizada pelo forno, devido ao fato de que esse microorganismo forma esporos, mais resistentes. Segundo a tabela: Tabela 3. Tempos de destruição de alguns esporos bacterianos pelo calor úmido e calor seco [1]
Espécie Bacillus sp.
Calor úmido Temperatura Tempo de (°C) morte (min) 100 2-15
Calor seco Temperatura Tempo de (°C) morte (min) 140 acima de 180
Como o tempo de exposição dos tubos foi de 15min para os dois processos, podemos ver que o calor úmido foi capaz de matar os esporos e o forno não foi, resultando no crescimento de microorganismos. Obs: essa resposta não se refere aos resultados obtidos, mas explicam os resultados esperados. 3- Quais as principais aplicações do calor seco e úmido nos processos de esterilização na indústria?
A pasteurização e a fervura (calor úmido) são amplamente utilizadas em processos na indústria alimentícia. Embora não sejam métodos de esterilização, reduzem a quantidade de microorganismos nos alimentos (principalmente os patogênicos) sem causar alterações significativas no sabor e teor nutricional dos mesmos. Já a incineração (calor seco) é utilizada na eliminação de lixo hospitalar e materiais biológicos contaminados, já que destrói o produto. A flambagem é uma prática rotineira em laboratórios.
4- Justifique por que a ação antimicrobiana em utensílios e maquinas pode ser dificultada na presença de altas concentrações de substâncias orgânicas.
É dificultada porque as bactérias e os fungos degradam a matéria orgânica, e, como nesses locais há altas concentrações desses micro-organismos, a ação antimicrobiana vai ser dificultada. Dessa forma, será preciso de um agente germicida com uma alta eficácia para eliminar todos esses seres. 5 - O uso de agentes químicos na sanitização de superfícies pode não ser eficaz na redução da contagem microbiana. Explique a não redução da c ontagem de micro-organismos em relação a:
A) resistência dos micro-organismos ao agente químico Se os micro-organismos forem resistentes ao agente químico, não irá ocorrer a redução da contagem desse seres, pois o agente químico não será capaz de ter sua ação germicida. Esse fato é observado quando as bactérias podem produzir os seus esporos que é uma forma de resistência das mesmas. Assim, não irá ocorrer a redução da contagem desses seres. B) Diluição ou concentração do agente químico utilizado Se o agente químico estiver diluído, é preciso que ele contenha um amplo espectro de atividade antimicrobiana, o que significa que ele deve inibir ou matar muitos tipos diferentes de microorganismos. Se ele não tiver esse amplo espectro, conseqüentemente não irá ter a redução da contagem de micro-organismos. Já a concentração do agente químico utilizado ?
9. Referências Bibliográficas
PELCZAR, M.J.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. MICROBIOLOGIA CONCEITOS E APLICAÇÕES. Volume 1. São Paulo, 1996 BORELLI, B.M.; WANDERLEY, E.C; DOS SANTOS, E.J.; GOMES, F.C.O.; BADOTTI, F.; DE SOUZA, M.C.M. MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL I. Belo Horizonte, CEFET-MG. Revisão 20 12. Referências da Tabela 1 – Rótulo dos reagentes
