Purificação de Produtos Biotecnológicos

P URIFICAÇÃO DE P RODUTOS B IOTECNOLÓGICOS

P URIFICAÇÃO DE P RODUTOS B IOTECNOLÓGICOS 

Diversidade de produtos biotecnológicos  não há processos de purificação e aplicação geral geral

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Escolha das operações unitárias  uso da molécula alvo e suas características características físico-químicas físico-químicas

P URIFICAÇÃO DE P RODUTOS B IOTECNOLÓGICOS 

Diversidade de produtos biotecnológicos  não há processos de purificação e aplicação geral geral



Escolha das operações unitárias  uso da molécula alvo e suas características características físico-químicas físico-químicas

E TAPAS P RINCIPAIS 

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Clarificação = separação de células e seus fragmentos do meio de cultivo Concentração e/ou purificação de baixa resolução = separação da molécula alvo Purificação de alta resolução = separação separação de classes de moléculas com algumas características físico-químicas semelhantes Operações para acondicionamento final do produto

P URIFICAÇÃO DE P RODUTOS B IOTECNOLÓGICOS 

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Para Para produtos associados às células  rompimento celular A redução do número de etapas é de fundamental importância na viabilidade do processo Exemplo, se a cada operação unitária o rendimento em produto for de 90%, a aplicação de 9 operações levará a um rendimento final de cerca de apenas 40%

O PERAÇÕES U NITÁRIAS CLARIFICAÇÃO: 

Filtração convencional

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Centrifugação

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Filtração tangencial

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Floculação

O PERAÇÕES U NITÁRIAS ROMPIMENTO DE CÉLULAS: 

Homogeneização

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Moagem em moinho de bolas

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Rompimento químico ou enzimático

O PERAÇÕES U NITÁRIAS PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO: 

Precipitação

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Ultrafiltração

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Extração em sistemas de duas fases líquidas

O PERAÇÕES U NITÁRIAS PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO: 

Cromatografia de troca iônica

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Cromatografia de afinidade (biológica ou química)

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Cromatografia de fase reversa

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Cromatografia de exclusão molecular

O PERAÇÕES U NITÁRIAS TRATAMENTOS FINAIS: 

Cristalização

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Liofilização

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Secagem

C LARIFICAÇÃO 

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



É a separação de células suspensas de um meio de cultivo É a primeira operação unitária do processo de purificação O meio resultante (isento de células) é denominado clarificado ou filtrado Depende da dimensão da partícula a ser removida

C LARIFICAÇÃO Filtros convencionais Centrifugação Microfiltração

0,1 m Bactérias

1 m

10 m

Leveduras Bolores

100 m

F ILTRAÇÃO C ONVENCIONAL 

Aplica-se à clarificação de grandes volumes de suspensões diluídas de células (da ordem de milhares de litros), produtos extracelulares e situações nas quais a assepsia não é necessária

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A contínua deposição das células sobre o meio filtrante resulta a formação de uma “torta” de filtração

F ILTRAÇÃO C ONVENCIONAL

Filtro Rotativo à Vácuo

C ENTRIFUGAÇÃO 

Processo que acelera o processo de sedimentação pela ação de um campo gravitacional centrífugo



Resulta em suspensões mais concentradas em relação à original

C ENTRIFUGAÇÃO

Centrífugas Tubulares

C ENTRIFUGAÇÃO

Centrífugas de Discos

M ICROFILTRAÇÃO 

Filtração tangencial  fluido de alimentação escoa tangencialmente à superfície do meio filtrante  a tensão de cisalhamento do fluido minimiza o acúmulo de células e seus fragmentos na superfície da membrana

M ICROFILTRAÇÃO

M ICROFILTRAÇÃO

Filtro Tubular com Fibra Oca

M ICROFILTRAÇÃO

Filtro Tipo Quadro e Placa

M ICROFILTRAÇÃO 

Pode ser conduzida em um ou mais filtros

R OMPIMENTO DE C ÉLULAS M ICROBIANAS 

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Produtos associados às células requerem o rompimento ou a permeabilização destas através de operações conduzidas sobre o adensado obtido após a clarificação Para recuperação de produtos termolábeis ou sujeitos a ação de proteases  processo deve ser rápido e conduzido em baixas temperaturas

PAREDE C ELULAR  Bactérias Gram (+) Bactérias Gram (-)D Leveduras

Fungos Filamentosos

R OMPIMENTO DE C ÉLULAS M ICROBIANAS MÉTODOS MECÂNICOS: 

Homogeneizador de alta pressão  equipamento constituído de pistões projetados para aplicar altas pressões à suspensão celular, forçando sua passagem através de um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície em uma câmara de baixa pressão. A queda instantânea de pressão associada ao impacto, provoca o efetivo rompimento celular sem danificar proteínas

R OMPIMENTO DE C ÉLULAS M ICROBIANAS MÉTODOS MECÂNICOS:

R OMPIMENTO DE C ÉLULAS M ICROBIANAS MÉTODOS MECÂNICOS: 

Moinho de bolas



Ultrassom

R OMPIMENTO DE C ÉLULAS M ICROBIANAS MÉTODOS NÃO MECÂNICOS: 

Choque osmótico



Congelamento e descongelamento



Secagem

R OMPIMENTO DE C ÉLULAS M ICROBIANAS MÉTODOS QUÍMICOS: 

Álcalis

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Solventes



Detergentes



Ácidos

R OMPIMENTO DE C ÉLULAS M ICROBIANAS MÉTODOS ENZIMÁTICOS:  Adequados para a recuperação de biomoléculas sensíveis à tensão de cisalhamento ou pressão de trabalho geradas pelos métodos mecânicos  Quando uma certa quantidade de parede é removida, a pressão osmótica interna rompe a membrana citoplasmática, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado para o meio externo

R OMPIMENTO DE C ÉLULAS M ICROBIANAS MÉTODOS ENZIMÁTICOS: 





Sistemas líticos são específicos para cada grupo de microrganismo Para leveduras  como glucanases, proteases e mananases Para bactérias  enzimas como glicosidases, acetilmuramilalanina amidases, endopeptidases e proteases

R OMPIMENTO DE C ÉLULAS M ICROBIANAS MÉTODOS ENZIMÁTICOS: 

Vantagens  facilidade no controle do pH e temperatura, baixo investimento de capital e alta especificidade para degradação da parede celular



Desvantagens  alto custo das enzimas e variação da eficiência da lise enzimática com o estado fisiológico do microrganismo

P RECIPITAÇÃO 

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Método utilizado para separar os produtos microbianos em meio aquoso Método tradicional de concentração e purificação de proteínas A solubilização de proteínas precipitadas pode ser dimensionada de modo a promover a redução do volume inicial e, portanto, levar ao aumento da concentração  pode proceder processos de elevada resolução, como cromatografia

P RECIPITAÇÃO 



Proteínas precipitadas têm sua estrutura tridimensional modificada  sua aplicação só é viável quando a conformação da proteína é recuperada após a precipitação “Salting-out” = precipitação de proteínas em altas concentrações salinas. Mais usados: citrato de sódio, sulfato de sódio e sulfato de amônio

P RECIPITAÇÃO 

“Salting-out”

= precipitação de proteínas em altas concentrações salinas. Mais usados: citrato de sódio, sulfato de sódio e sulfato de amônio

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Precipitação por solventes = devido à redução da constante dielétrica do meio

U LTRAFILTRAÇÃO 

Utilizada para concentrar macromoléculas como proteínas ou polissacarídeos



Transporte de soluções através de membranas com poros de diâmetros de 0,001 a 0,1m, sob pressão de transmembrana de 100 a 500kPa e fluxo de filtrado de 10 a 200 L/hm 2

U LTRAFILTRAÇÃO VANTAGENS:  Separação de bioprodutos de caldos fermentados diluídos  Promover a concentração de compostos a baixa temperatura e pressão  Possibilitar a retirada de sais e outras moléculas pequenas  Manter constante o pH do meio

E XTRAÇÃO EM S ISTEMAS DE D UAS FASES A QUOSAS As moléculas alvo e as impurezas são separadas como resultado de suas diferentes solubilidades nas fases líquidas imiscíveis (fase aquosa e solvente) Sistemas de suas fases aquosas:  Polietilenoglicol (PEG)/ dextrana (Dx)  Polipropilenoglicol (PPG)/ Dx  Sulfato dextrana de sódio/PPG  PEG/ fosfato de potássio  PEG/ sulfato de magnésio  PEG/ citrato de sódio 

C ROMATOGRAFIA 

Processo  os solutos de um meio líquido (proteínas, peptídeos, anticorpos) são adsorvidos ou retidos em um leito de material poroso

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A posterior remoção gradual dos solutos por ação de uma fase líquida móvel (eluente), resulta na separação das diferentes moléculas

C ROMATOGRAFIA

C ROMATOGRAFIA

C ROMATOGRAFIA Processos cromatográficos industrialmente mais utilizados: 

Gel filtração  baseado na separação de moléculas em função do volume efetivo em solução



Troca iônica  baseado na adsorção das moléculas sobre o leito cromatográfico

T RATAMENTOS F INAIS

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Liofilização

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Cristalização

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Secagem

L IOFILIZAÇÃO 

Processo de remoção de um solvente (tipicamente a água) de uma solução por sublimação

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Nesse processo o material é congelado e em seguida submetido a baixa pressão para sublimação da água livre

C RISTALIZAÇÃO 

Processo de agregação de cristais de moléculas presentes em soluções homogêneas supersaturadas

Operação Unitária Centrifugação

Características determinantes Densidade e tamanho das células Viscosidade do meio

Filtração convencional

Compressibilidade e tamanho das células

Microfiltração

Tamanho das células ou partículas Resistência física da parede celular ao gradiente de pressão Resistência física da parede celular à tensão de cisalhamento

Homogeneização Moinho de bolas

Extração em SDFA Solubilidade de proteínas Precipitação Cromatografia de troca Mobilidade eletroforética de proteínas iônica Ultrafiltração Massa molecular