Producción de Anticuerpos Contra Albúmina Humana en Conejo

Técnico en farmacéutico industrial cetís 32

alumno Francisco Lozano Gómez

Producción de anticuerpos contra albúmina humana en conejo

Objetivos   

Ensayar las técnicas de inmunización con conejos, practicando algunos de los esquemas de inmunización ya establecidos. Efectuar la purificación de gamma globulina por precipitación con sulfato de amonio a una saturación final del 33%. Conocer distintas maneras de poner en evidencia la reacción de precipitación que ocurre cuando un antígeno soluble interacciona con su anticuerpo homólogo.

Introducción El sistema inmunológico tiene como función principal proteger al organismo de agentes extraños, está integrado por diferentes órganos, tejidos, células y moléculas que funcionan coordinadamente. Sus componentes más importantes son: la piel y las mucosas, los órganos linfoides como las amígdalas, las adenoides, el bazo, el timo, los ganglios linfáticos; numerosas células leucocitarias (linfocitos) y sus productos de secreción como citocinas, quimiocinas e inmunoglobulinas entre otros. Este sistema tiene tres propiedades esenciales: primera, tiene la habilidad de reconocer sustancias extrañas denominadas antígenos principalmente provenientes de patógenos, tales como bacterias, virus, hongos. Los anticuerpos, también llamados inmunoglobulinas, son glucoproteínas producidas por células específicas del sistema inmunitario en respuesta a una proteina extraña o antígeno. Inmunoglobulinas, término introducido por vez primera por J. F. Heremans en 1959 para referirse a aquellas globulinas que se asocian al sistema li nforreticular y que a menudo son referidas como “anticuerpos” que son producidas por las células plasmáticas. El descubrimiento de los anticuerpos fue el resultado global de un cúmulo de conocimientos derivados de observaciones científicas recabadas a lo largo de varios siglos, desde las vacunas rudimentarias de la antigua civilización China (variolización), hasta la primera estructura resuelta por Edelman y Porter (Sanabria y Landa; 2007). En general los anticuerpos, independientemente de su especificidad tienen una estructura común, consistente de cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas idénticas de 55-70 kDa denominadas con la letra H (del inglés heavy), unidas covalentemente a un oligosacárido, y un par idéntico de cadenas livianas no glicosiladas de 24 kDa denominadas con la letra L (del inglés light). Un puente disulfuro y otras uniones no covalentes unen las cadenas pesadas con las livianas. Las cadenas pesadas también están unidas entre sí por al menos un puente disulfuro, tal unión está localizada en una región conocida como “bisagra”, región formada por aproximadamente 12 residuos de aminoácidos que proporciona una gran flexibilidad a la molécula, éstos residuos están expuestos a la ruptura química y enzimática.



Clases o Isotipos

Existen diferentes clases de anticuerpos, las cuales son determinadas por el tipo de cadena pesada. Hay cinco tipos de cadenas pesadas, denotados por las letras griegas          y  para cada una de las inmunoglobulinas IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, respectivamente. En estas clases pueden existir cadenas livianas ya sea de tipo kappa ) o tipo lambda ( ). Los genes que codifican para las distintas variantes isotípicas están presentes en todos los individuos sanos, es decir, éstos poseen los genes para las cadenas pesadas denominadas  1,  2,  3,  4, , 1, 2 localizados en el brazo largo del cromosoma 14 y para las cadenas livianas  y , en los cromosomas 2 y 22, respectivamente. Factores que intervienen en la reacción antígeno-anticuerpo

La reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) es la piedra angular de la respuesta inmune y se pone de manifiesto in vitro por la formación de un precipitado o aglutinación de partículas (eritrocitos). El acoplamiento estructural entre las macromoléculas está dado por varias fuerzas débiles que disminuyen con la distancia, como los puentes de hidrógeno, las fuerzas de Van Der Waals, las interacciones electrostáticas y las hidrofóbicas. El reconocimiento Ag-Ac es una reacción de complementariedad, por lo que se efectúa a través de múltiples enlaces no covalentes entre una parte del antígeno y los aminoácidos del sitio de unión del anticuerpo. La reacción se caracteriza por su específicidad, rápidez, espontaneidad y reversibilidad: (Bautista;2005) 

Específicidad: capacidad de los anticuerpos para distinguir entre dos ligandos de estructura similar. La unión dada por la especificidad es muy precisa y permite distinguir entre grupos químicos con diferencias mínimas.



Clases o Isotipos


La reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) es la piedra angular de la respuesta inmune y se pone de manifiesto in vitro por la formación de un precipitado o aglutinación de partículas (eritrocitos). El acoplamiento estructural entre las macromoléculas está dado por varias fuerzas débiles que disminuyen con la distancia, como los puentes de hidrógeno, las fuerzas de Van Der Waals, las interacciones electrostáticas y las hidrofóbicas. El reconocimiento Ag-Ac es una reacción de complementariedad, por lo que se efectúa a través de múltiples enlaces no covalentes entre una parte del antígeno y los aminoácidos del sitio de unión del anticuerpo. La reacción se caracteriza por su específicidad, rápidez, espontaneidad y reversibilidad: (Bautista;2005) 

Específicidad: capacidad de los anticuerpos para distinguir entre dos ligandos de estructura similar. La unión dada por la especificidad es muy precisa y permite distinguir entre grupos químicos con diferencias mínimas.


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Rapidez: la velocidad con que ocurre la pr imera etapa de la reacción Ag -Ac es del orden de milésimas de segundo, y está limitada únicamente por la difusión. La segunda etapa, que es más larga, incluye todas las manifestaciones que se presentan como consecuencia de la interacción, tales como precipitación, aglutinación, neutralización, etcétera. Espontaneidad: la reacción Ag-Ac no requiere energía adicional para efectuarse efect uarse y es factible f actible explicarla en términos de la ley de acción de masas. Reversibilidad: dado que la r eacción se debe a fuerzas no covalentes, es reversible y, en consecuencia, se ve afectada por factores como la temperatura, la proporción de Ag-Ac, el pH y la fuerza iónica.

Metodología Medición de albúmina en suero A) -La concentración inicial de albumina sérica bovina era 22%, equivalente a 220 mg/mL -De ahí se tomaron 272 microlitros, que equivalen a 60 mg de albumina -Se aforaron a 10 mL B) -Se tomaron 5 mL de éstos 10 mL (=30 mg de albumina) y se aforaron a 10mL -De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=15 mg de albumina) y se aforaron a 10 mL -De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=7.5 mg de albumina) y se aforaron a 10 mL -De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=3.75 mg de albuina) y se aforaron a 10 mL C) -De esos 5 ml restantes se tomó una alícuota de 1 mL (=6 mg de albumina) -se le adicionó a esa alícuota de 1ml, 5 mL de biuret. Volumen final= 6mL. -Se leyó en el espectro, la concentración de albúmina era de 6mg/6mL=1 mg/mL D) -Se repitió éste último procedimiento C) para los matraces 2,3,4 y 5.

Obtención del antígeno 1. 2. 3. 4.

Se extrajo sangre de tres individuos sanos en un tubo sin anticoagulante por venopunción. Se dejó coagular durante una hora a temperatura ambiente. Se centrifugó a 3,000 rpm durante 15 minutos para obtener el suero. Se extrajo la fracción del suero y se calentó a 60ºC durante 15 minutos para obtener coagular el suero. 5. Se inoculó en el conejo.

Inoculaciones Inoculacione s del conejo Se hizo vía subcutánea: 1. Se rasuró el lomo del conejo. 2. Se introdujo la aguja de 22x32 mm punta verde en la dermis del conejo con el bisel hacia arriba. Una vez dentro de la piel, se giró 180º y se depositó el inóculo. En el sitio de la inoculación se observó la formación de una pápula que días después evolucionó en costra. El programa de inoculación fue el siguiente:

Tabla 1. Programa de inoculación de suero humano en el conejo por vía subcutánea.

Día

Fecha

0

31-oct-13

Cantidad inoculada (ml) 0.5

Número de puntos 2


4 7 11 14 19 21

4-nov-13 7-nov-13 11-nov-13 14-nov-13 19-nov-13 21-nov-13


1.0 4 1.5 6 2.0 8 2.0 8 VIA INTRAVENOSA** SANGRADO**

*Se administró por vía intravenosa 3 días antes del sangrado para asegurarse que presentara alta concentración de anticuerpos. Se administraron 0.8 ml correspondientes a 54 mg de albúmina sérica humana. **El sangrado se obtuvo de la oreja del conejo en la vena central. Se obtuvieron 10 ml de sangre.

Precipitación de gamma globulina con sulfato de amonio 1. Se ajustó a 7.8 el pH de una solución saturada de sulfato de amonio con NaOH 2N. 2. Se adicionó un volumen de suero, contenido en un tubo cónico, medio volumen de la solución saturada de sulfato de amonio para dejar el sulfato de amonio a una concentración final de 33%. 3. Se continuó la agitación por 10-15 minutos, después de terminada la adición de sulfato de amonio. 4. Se centrifugó a temperatura ambiente a 3,500 rpm por 15 minutos. 5. Se disolvió el sedimento en solución salina a pH 7.8 hasta alcanzar el volumen original del suero. 6. Se repitieron los pasos 2-5 y posteriomente los pasos 2-4. 7. Se disolvió en SSRB el sedimento después de la última centrifugación hasta alcanzar la mitad o un tercio del volumen original del suero. 8. Se dializó contra SSRB en frío a 4ºC y agitación durante 3-5 días, realizando dos cambios diarios de la solución de diálisis hasta eliminar completamente el sulfato de amonio. 9. Se transfirió la gamma-globulian dializada a un tubo y se centrifugó en frío a 2,500 rpm durante 10 minutos para eliminar el precipitado que se hubiera formado. 10. Se determinó la concentración de proteínas por espectrofotometría.

Precipitación en capilar 1. Se hicieron una serie de diluciones dobles de antígeno en tubos eppendorf de la siguiente manera: se depositaron 0.2 ml de SS en 10 tubos de ensaye. Al primer tubo se agregaron 0.2 ml de la solución concentrada de antígeno y se mezcló. De éste tubo se tomaron 0.2 ml y se transfirieron al siguiente tubo. Se repitió el procedimiento hasta el tubo 10. 2. Se llenó un tubo capilar con antisuero hasta la primer marca y se limpió el exterior del tubo con papel absorbente para eliminar el antisuero adherido a las paredes externas. 3. Se invirtió el tubo capilar para hacer descender el antisuero hasta el borde del extremo contrario. 4. Se tomó un volumen de antígeno de tal manera que el volumen en el capilar llegara hasta 2/3 partes. 5. Se mezcló el contenido por movimientos de rotación e inversión repetidos del capilar. Se centró el contenido del capilar y tapó uno de los extremos del mismo con el dedo índice y se introdujo el extremo contrario en una gradilla de plastilina. 6. Se utilización como testigos un tubo capilar conteniendo antisuero más solución salina y otro conteniendo antígeno sin diluir más solución salina. 7. Se mantuvieron los tubos capilares a temperatura ambiente durante 24-48 horas.

Reacciones de Precipitación en medio semisólido 1.

2.

Se agregó una muestra de 50 µl del antisuero al pozo central de un gel comercial, y se tomaron 10 µl del antígeno en sus diferentes diluciones, así como dos muestras de antígeno diferentes. Se dejó reaccionar durante 48 h en condiciones de refrigeración.

Resultados y discusión



Antígeno

Figura 2. Curva tipo obtenida por el método del reactivo de Bradford para determinación de proteínas en suero. La medición de absorbancia obtenida fue de 0.042 que corresponde a 0.1142 mg/ml y que multiplicada por el factor de dilución 6,000 da una concentración en suero de 68.5 mg/ml, valor que se ajusta a lo esperado para albúmina humana.

La medición directa de las diluciones en suero dio una concentración de C=(Abs-0.0131)/0.2531 = (0.0420.0131)/0.25310=0.1142 mg de albúmina/ mL Pero ésta medición tiene la siguientes diluciones: iii) la diluyó 6 veces ii) La diluyó 0 veces i) La diluyó 100 veces Lo que nos da un factor de dilución de 6,000 veces, lo que nos deja una concentración inicial real en suero de 68.51 mg/mL, COMPROBACIÓN -Se tienen 68.51 mg/mL, se toman 100 microlitros, osea 6.85 mg de albumina -Se aforan esos 6.85 mg de albumina a 10 ml -Se toman 1 mL de alícuota, osea 0.685 mg -Se adicionan 5 ml de biuret, lo que nos deja una concentración de 0.685 mg/6mL=0.1142 mg/mL Para la cuantificación de las proteínas séricas presente en el suero, se empleó la reacción de Biuret debido a que al estar constituida por sulfato de cobre en una solución alcalina (ya sea hidróxido de sodio o hidróxido de potasio) van a formar un complejo entre los iones Cu 2+ y los electrones no ocupados del nitrógeno que se encuentran presentes en los enlaces peptídicos (en este caso la albumina humana es una proteína), el resultado de lo anterior es la formación de una coloración violeta. Presentan su máxima absorción a 540nm (UNLP, n/a).



Figura 3. Reacción de Biuret, observándose la formación del complejo entre el Cu2+ y los electrones del nitrógeno.

La inmunogenicidad es la medida de antigenicidad de un material y está en función de la zona de administración y de la especie que es inmunizada (Rojas 2006). Las proteínas y carbohidratos al poseer estructuras químicas complejas presentan un mayor grado de inmunogenicidad (salvo ciertas excepciones) en comparación con los polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos. Así mismo las moléculas de composición mixta (por ejemplo: las glicoproteínas, nucleoproteínas, glicolípidos, lipopolisacáridos y las lipoproteínas) son más inmunógenas que sus componentes individuales. También si los compuestos presentan estructura terciara o cuaternaria presentarán mayor inmunogenicidad (Rojas 2006). Las moléculas que presentan pesos moleculares superiores a los 100kD son más inmunogénicas que aquellas con pesos moleculares inferiores a los 20kD (Rojas 2006). Además Rojas (2006) menciona que los antígenos solubles son menos inminogénicos que los particulados, por lo que en el caso de los antígenos solubles es necesario emplear un adyuvante para incrementar su inmunogenicidad debido a: -

Concentración de la cantidad de antígeno administrado (por las micelas formadas).

-

Retienen por más tiempo al antígeno en el lugar de inoculación, prolongando el tiempo de estimulación.

-

Una vez que el antígeno ha sido particulado se presenta con mayor facilidad su captula por las células fagocitarias procesadoras y presentadoras de antígeno.

Un adyuvante es aquella sustancia o conjunto de sustancias heterogéneas e inespecíficas que permiten potenciar la respuesta inmune. Se caracterizan por contar con tres mecanismos de reacción (Asociación Española de Vacunología, 2013): a) Formación de un depósito con liberación gradual del antígeno adsorbido, aumentando una mayor interacción CPA-antígeno. En modelos animales de monos, se ha podido recuperar aluminio hasta seis meses después de la administración del mismo. b) Presentación de los antígenos de una manera multivalente particulada, que permite una internalización más eficiente por parte de las CPA. c) Activación del complemento y la formación de un ambiente inflamatorio en el lugar de la inyección.



d) No activan directamente los TLR (Toll-like receptors, receptores de los macrófagos que al reconocer estructuras, generalmente de origen infeccioso, forman parte importante de la respuesta del sistema inmunitario innato), pero facilitan la maduración de los mismos, i. ↑ citoquinas pro-inflamatorias. ii. ↑ la expresión MHC clase II CD86 iii. ↓ CD14.

Para la elección de un adyuvante se toman en cuenta las siguientes características: composición química, características físicas (dureza, pH, densidad, viscosidad, tamaño de partícula y carga), características bioquímicas, pureza, vía de administración, además de la patología o naturaleza del antígeno (European Medicines Agency, 2013). Sin embargo, en esta experimentación, no se utilizó adyuvante porque como la vía de administración fue subcutánea y en esa vía se asegura que el antígeno es retenido por más tiempo. Con base a la información anterior, la albúmina humana es poco inmunogénica, ya que a pesar de que es una proteína (que es estable, de carácter ácido y no cuenta con carbohidratos) es soluble y su peso molecular es de 66kD (Telijón, 2006) además de que pudo haber generado tolerancia; por lo que para el desarrollo de la práctica era necesario emplear un adyuvante (como el Freund completo o incompleto) para aumentar la inmunogenicidad de la albúmina.

Manejo de conejos En primera instancia, se trató el aspecto del manejo adecuado de los animales. Si un procedimiento produce dolor o estrés en los animales de laboratorio, las normas internacionales urgen a los usuarios a buscar nuevas alternativas (Lobato-García, 2009). Tomando en cuenta esta recomendación, se decidió establecer protocolos de inmunización y prácticas de laboratorio que disminuyeran el sufrimiento del conejo utilizado. Básicamente, los esfuerzos se orientaron a disminuir el estrés del animal durante la o btención de la muestra de sangre y durante su inmunización. Para ello, se utilizó lidocaína en pomada 15 minutos antes de cada punción y una zanahoria para ayudar a reducir el estrés.

Inmunización Una vez capacitados en el manejo de los conejos, se inició la discusión sobre la mejor vía de inmunización con los antígenos. La inmunización puede realizarse a través de la vía oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intracardíaca, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, etc. La elección de la vía depende, entre otras cosas, de la especie animal que se utilice y de las características del antígeno. Originalmente se planeaba hacerlo por vía intravenosa. Esta vía proporciona un contacto inmediato y directo del antígeno con las células inmunes; sin embargo, la inoculación del antígeno a través de esta vía requiere de amplia experiencia en la canalización de venas o arterias. Dado que los protocolos de inmunización establecían inoculaciones periódicas con los antígenos, el posible fallo de la inoculación por vía intravenosa podría constituir una limitante para la estimulación de una adecuada respuesta inmune. En este sentido, la inoculación de los antígenos por vía intravenosa no es muy adecuada para los fines didácticos que se persiguen con la producción de anticuerpos. Sin embargo, esta vía podría utilizarse exitosamente si fuera precedida de un curso sobre toma de muestras en animales de laboratorio. Por otra parte, la vía subcutánea es utilizada frecuentemente para la inmunización de antígenos solubles como la albúmina sérica humana, por lo tanto se decidió utilizar esta vía para la inoculación de estos antígenos. Para disminuir una reacción local severa y abarcar una mayor superficie de absorción, cada dosis de antígeno fue distribuida en diferentes sitios (máximo ocho) a lo largo del dorso torácico y lumbar. La inmunización subcutánea de los antígenos estimuló una fuerte respuesta de producción de anticuerpos como se demostró en la pruebas de precipitación.



En ambos conejos, los inmunizados con suero o los inmunizados con albúmina, se presentó una reacción inflamatoria que llevó a la formación de una costra en la zona de inoculación, que finalmente se descamó sin dejar ninguna lesión posterior. La formación de esta lesión podría estar relacionada con el volumen de la dosis de antígeno inoculada. Sería interesante desarrollar nuevos protocolos para determinar el volumen mínimo necesario para una adecuada producción de anticuerpos sin que se produzcan lesiones importantes. Durante el desarrollo del protocolo de inmunización el conejo no presentó fiebre o alteración de su estado general de salud.

Figura 4. Sitio de inmunización por vía subcutánea del conejo. Se muestran dos costras y algunas pápulas formadas después de la inmunización. Imagen del día 11.

Pruebas Se obtuvo una concentración de proteínas totales en el concentrado de suero de conejo dializado de 0.818 mg/ml, alrededor de 80 veces menor que en suero humano sin dializar. La absorbancia obtenida fue de 0.020 a 540 nm por la técnica de reactivo de Biuret. Se disolvieron 100 µL de solución de anticuerpos, 400 µL de solución salina y 2.5 ml de reactivo de Biuret. Factor de dilución: 30. Veintiún días después de la primera inoculación, los animales fueron sangrados siguiendo el protocolo previamente establecido. La formación de un precipitado abundante entre el antígeno y su anticuerpo depende de que las concentraciones de ambos sean equivalentes (zona de equivalencia); el exceso de alguno de éstos disminuye e incluso inhibe la formación del precipitado. Con objeto de determinar la zona de equivalencia del antisuero contra albúmina, se realizó una serie de diluciones dobles de la albúmina como se indica en la tabla (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024). En este caso la concentración del anticuerpo permaneció constante. Como se esperaba, concentraciones muy bajas o muy altas del antígeno inhibieron la formación del complejo antígeno-anticuerpo (extremos de la curva). La zona de equivalencia para el anticuerpo anti-albúmina se presentó entre las diluciones 1:4 y 1:8 del antígeno (zona central de la curva). Este resultado demostró que el protocolo de inmunización establecido fue adecuado para la producción de anticuerpos contra esta proteína.



Figura 5. Izquierda: agitación y mezclado del capilar que contienen antígeno y anticuerpo. Derecha: Punción en gradilla de plastilina para posterior almacenaje hasta observar la presencia de precipitado.

Figura 6. Tubos 1-10 y los controles A y Ao. A=antisuero + solución salina. Ao=Antígeno sin diluir + solución salina.



Figura 7. Resultados de precipitación capilar a las 36 horas. Se observa sólo precipitación en los tubos 1-4. Los tubos 5-10 se observan algo turbios pero sin precipitado. Los dos controles, A y Ao no presentan precipitados ni turbidez.

Figura 8. Resultados de precipitación capilar a las 48 horas. Se observaron precipitados en todos los tubos. Los tubos control siguieron sin mostrar precipitados o turbidez.



Figura 9. Resultados de precipitación capilar de los tubos 1-6 a las 60 horas. Todos ellos presentan precipitado. Tabla 2. Resultados de precipitación capilar en los tubos 1-10 y controles con las diluciones indicadas a las 48 horas de estar en reposo.

Tubo

Dilución

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A Ao

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 Testigo suero Testigo antígeno

Precipitado (+) +++ ++++ +++++ ++++ +++ ++ ++ + -



Figura 10. Se muestra el grado de formación de precipitado para cada tubo a las 48 horas basado en la tabla anterior. El tubo con mayor reacción de precipitación fue el tubo 3. En la realización de esta prueba se observan 2 zonas formadas respecto a la concentración del antígeno empleado (suero humano): en la primera ocurre un incremento de la formación del precipitado conforme se va reduciendo la concentración del antígeno; la otra zona comienza después de la tercera dilución (1:8) la cantidad de precipitado disminuye hasta llegar a un punto (dilución 1:512) en donde ya no hay precipitado. Lo anterior se puede adecuar a la curva de inmunoprecipitación (Ver figura 11) donde ocurre lo mencionado previamente, además se observa que hay una zona intermedia (en donde el aumento/descenso del precipitado se da en una proporción menor). Para la primera etapa (Ver figura 10, inciso c) como lo menciona Fuentes (1998) al haber mayor cantidad de antígeno los 2 centros de unión están ocupados, mientras que en el caso de los antígenos presentes sus epítopos no están totalmente ocupados, por lo que no hay una formación de complejos grandes, haciendo que solamente hayan complejos pequeños y que sean solubles. Conforme la concentración del antígeno se va disminuyendo los epítopos se van combinando con las zonas libres de los anticuerpos hasta ocupar las 2 zonas de unión de estos, con lo anterior se forman inmunocomplejos grandes e insolubles formando los precipitados. A esta zona se le

denomina la “zona de equivalencia” (Ver figura 10, inciso b). En esta prueba se observa que en el tubo 3 hay mayor precipitado, por lo que correspondería a esta zona. Para los tubos 1 y 2 si bien hay inmunoprecipitado la cantida es menor por lo mencionado anteriormente (formación de pequeños complejos solubles). Al seguir disminuyendo la concentración del antígeno, estos se van a ir reduciendo, por lo que varios anticuerpos se unirán en los diferentes epítopos, formando complejos solubles y de esa manera se reduce la formación del inmunoprecipitado (como en los tubos 9 y 10) (Fuentes, 1998).



Figura 11. Reacciones entre una concentración fija de anticuerpos y concentraciones crecientes de antígeno en la prueba de inmunoprecipitación (Fuentes, 1998).

Figura 12. Curva de la formación del inmunoprecipitado en función de la concentración de antígeno (Fuentes, 1998). Inmunodifusión



Cuando al difundir por el gel el antígeno y el anticuerpo contactan, forman inmunocomplejos estables, produciéndose una línea de precipitación que puede observarse a simple vista. La formación de una línea de precipitación indica una sola reacción antígeno-anticuerpo, estando el grosor de la línea en relación con la cantidad de antígeno presente en la precipitación. Cuando la línea de precipitación se cierra y se acerca al pocillo del anticuerpo, ello significa un exceso de antígeno, mientras que cuando ocurre lo contrario se trata de un exceso de anticuerpo. En algunos casos, si el exceso de uno de los dos es muy importante, la banda de precipitación no llega a formarse (Fuentes, et al , 1998). Se nota en la Figura 13, que efectivamente se presentaron líneas de inmunoprecipitación (circunferencia más opaca), para las diluciones 1:2 (a), 1:4 (b), 1.8 (c), así como para 1:128 (d), 1:256 (e) y 1:512 (f). También se realizó la prueba con dos antígenos utilizados (R) y (E). Se observa que a concentraciones iniciales se presentan varias bandas (línea naranja).

Figura 13. Resultados de la prueba de inmunodifusión. Se inoculo al animal con el antígeno. Además se observó que más bandas aparecieron con el antígeno que más se usó para inocular, posiblemente el anticuerpo reconoció un epítopo característico de esta muestra. Mientras que el antígeno que se usó una vez no presento alguna banda, esto fue por dos causas: se presentó el fenómeno de prozona (Exceso de antígeno) o la muestra estaba concentrada (postzona). Al comparar los resultados con la teorí a se observa que (comparando con la Figura 14):

Figura 14. Patrones de precipitación de la doble inmunodifusión A y B son los antígenos y S son los anticuerpos.



En la Figura 14y 13, se nota que en el primer caso (superior izquierdo) se produjo un anticuerpo para sólo un tipo de antígeno, y no se cruzan las bandas; mientras que cuando se promueve la formación de un anticuerpo con más de dos antígenos se observa bandas compartidas es decir una respuesta cruzada y finalmente la figura de abajo, es el mismo tipo de antígeno solo con determinante diferente se observa un ligero cruce. En esta corrida experimental se observó el primer tipo. Lo cual corrobora que las albúminas humanas son muy parecidas entre individuos diferentes de la misma especie. Para tener una mayor confiabilidad es recomendable cuantificar y estandarizar la concentración de los anticuerpos, por ejemplo la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimesura establece

que la sensibilidad del ensayo de inmunodifusión doble es de 20 1 200 μg/ml.

Conclusiones        

Si hubo presencia de anticuerpos contra albúmina sérica humana como demostró la precipitación en capilar. La dilución 1:8 fue la que presentó mejor precipitación a las 36 y 48 horas. Se necesita de un control de muestra de sangre del conejo antes de las inmunizaciones para corroborar que no tenía anticuerpos antes y que fueron producto de los protocolos de inmunización. La concentración de proteínas en suero humano que se administró al conejo fue de 68 mg/ml y se le administró en dosis crecientes de 0.5 ml hasta 2 ml para un total de cinco inmunizaciones subcutáneas con máximo 8 puntos. Con la reacción de inmunoprecipitación se comprobó que el anticuerpo producido por el conejo es útil para el antígeno administrado (suero – albúmina humana). En la prueba de inmunoprecipitación se observó la zona de equivalencia (relación entre las concentraciones de antígeno y anticuerpo para formar inmunocomplejos insolubles) en la dilución de albúmina sérica humana de 1:8. La prueba de inmunodifusión doble fue positiva y se comprobó la identidad del anticuerpo a las concentraciones de 1:2, 1:4 y 1:8. Es recomendable estandarizar la concentración del antisuero para poder aceptar por completo el ensayo de inmunoprecipitación.

Bibliografía 

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Producción de anticuerpos contra albúmina humana en conejo

Objetivos   

Ensayar las técnicas de inmunización con conejos, practicando algunos de los esquemas de inmunización ya establecidos. Efectuar la purificación de gamma globulina por precipitación con sulfato de amonio a una saturación final del 33%. Conocer distintas maneras de poner en evidencia la reacción de precipitación que ocurre cuando un antígeno soluble interacciona con su anticuerpo homólogo.

Introducción El sistema inmunológico tiene como función principal proteger al organismo de agentes extraños, está integrado por diferentes órganos, tejidos, células y moléculas que funcionan coordinadamente. Sus componentes más importantes son: la piel y las mucosas, los órganos linfoides como las amígdalas, las adenoides, el bazo, el timo, los ganglios linfáticos; numerosas células leucocitarias (linfocitos) y sus productos de secreción como citocinas, quimiocinas e inmunoglobulinas entre otros. Este sistema tiene tres propiedades esenciales: primera, tiene la habilidad de reconocer sustancias extrañas denominadas antígenos principalmente provenientes de patógenos, tales como bacterias, virus, hongos. Los anticuerpos, también llamados inmunoglobulinas, son glucoproteínas producidas por células específicas del sistema inmunitario en respuesta a una proteina extraña o antígeno. Inmunoglobulinas, término introducido por vez primera por J. F. Heremans en 1959 para referirse a aquellas globulinas que se asocian al sistema li nforreticular y que a menudo son referidas como “anticuerpos” que son producidas por las células plasmáticas. El descubrimiento de los anticuerpos fue el resultado global de un cúmulo de conocimientos derivados de observaciones científicas recabadas a lo largo de varios siglos, desde las vacunas rudimentarias de la antigua civilización China (variolización), hasta la primera estructura resuelta por Edelman y Porter (Sanabria y Landa; 2007).



En general los anticuerpos, independientemente de su especificidad tienen una estructura común, consistente de cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas idénticas de 55-70 kDa denominadas con la letra H (del inglés heavy), unidas covalentemente a un oligosacárido, y un par idéntico de cadenas livianas no glicosiladas de 24 kDa denominadas con la letra L (del inglés light). Un puente disulfuro y otras uniones no covalentes unen las cadenas pesadas con las livianas. Las cadenas pesadas también están unidas entre sí por al menos un puente

disulfuro, tal unión está localizada en una región conocida como “bisagra”, región formada por aproximadamente 12 residuos de aminoácidos que proporciona una gran flexibilidad a la molécula, éstos residuos están expuestos a la ruptura química y enzimática.

Clases o Isotipos


La reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) es la piedra angular de la respuesta inmune y se pone de manifiesto in vitro por la formación de un precipitado o aglutinación de partículas (eritrocitos). El acoplamiento estructural entre las



macromoléculas está dado por varias fuerzas débiles que disminuyen con la distancia, como los puentes de hidrógeno, las fuerzas de Van Der Waals, las interacciones electrostáticas y las hidrofóbicas. El reconocimiento Ag-Ac es una reacción de complementariedad, por lo que se efectúa a través de múltiples enlaces no covalentes entre una parte del antígeno y los aminoácidos del sitio de unión del anticuerpo. La reacción se caracteriza por su específicidad, rápidez, espontaneidad y reversibilidad: (Bautista;2005)  

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Específicidad: capacidad de los anticuerpos para distinguir entre dos ligandos de estructura similar. La unión dada por la especificidad es muy precisa y permite distinguir entre grupos químicos con diferencias mínimas. Rapidez: la velocidad con que ocurre la pr imera etapa de la reacción Ag -Ac es del orden de milésimas de segundo, y está limitada únicamente por la difusión. La segunda etapa, que es más larga, incluye todas las manifestaciones que se presentan como consecuencia de la interacción, tales como precipitación, aglutinación, neutralización, etcétera. Espontaneidad: la reacción Ag-Ac no requiere energía adicional para efectuarse y es factible explicarla en términos de la ley de acción de masas. Reversibilidad: dado que la r eacción se debe a fuerzas no covalentes, es reversible y, en consecuencia, se ve afectada por factores como la temperatura, la proporción de Ag-Ac, el pH y la fuerza iónica.

Metodología Medición de albúmina en suero A) -La concentración inicial de albumina sérica bovina era 22%, equivalente a 220 mg/mL -De ahí se tomaron 272 microlitros, que equivalen a 60 mg de albumina -Se aforaron a 10 mL B) -Se tomaron 5 mL de éstos 10 mL (=30 mg de albumina) y se aforaron a 10mL -De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=15 mg de albumina) y se aforaron a 10 mL -De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=7.5 mg de albumina) y se aforaron a 10 mL -De esos 10 mL se tomaron 5 ml (=3.75 mg de albuina) y se aforaron a 10 mL C) -De esos 5 ml restantes se tomó una alícuota de 1 mL (=6 mg de albumina) -se le adicionó a esa alícuota de 1ml, 5 mL de biuret. Volumen final= 6mL. -Se leyó en el espectro, la concentración de albúmina era de 6mg/6mL=1 mg/mL D) -Se repitió éste último procedimiento C) para los matraces 2,3,4 y 5.

Obtención del antígeno 1. 2. 3. 4.

Se extrajo sangre de tres individuos sanos en un tubo sin anticoagulante por venopunción. Se dejó coagular durante una hora a temperatura ambiente. Se centrifugó a 3,000 rpm durante 15 minutos para obtener el suero. Se extrajo la fracción del suero y se calentó a 60ºC durante 15 minutos para obtener coagular el suero. 5. Se inoculó en el conejo.



Inoculaciones del conejo Se hizo vía subcutánea: 1. Se rasuró el lomo del conejo. 2. Se introdujo la aguja de 22x32 mm punta verde en la dermis del conejo con el bisel hacia arriba. Una vez dentro de la piel, se giró 180º y se depositó el inóculo. En el sitio de la inoculación se observó la formación de una pápula que días después evolucionó en costra. El programa de inoculación fue el siguiente:

Tabla 1. Programa de inoculación de suero humano en el conejo por vía subcutánea.

Día

Fecha

0 4 7 11 14 19 21

31-oct-13 4-nov-13 7-nov-13 11-nov-13 14-nov-13 19-nov-13 21-nov-13

Cantidad inoculada Número de (ml) puntos 0.5 2 1.0 4 1.5 6 2.0 8 2.0 8 VIA INTRAVENOSA** SANGRADO**

*Se administró por vía intravenosa 3 días antes del sangrado para asegurarse que presentara alta concentración de anticuerpos. Se administraron 0.8 ml correspondientes a 54 mg de albúmina sérica humana. **El sangrado se obtuvo de la oreja del conejo en la vena central. Se obtuvieron 10 ml de sangre.

Precipitación de gamma globulina con sulfato de amonio 1. Se ajustó a 7.8 el pH de una solución saturada de sulfato de amonio con NaOH 2N. 2. Se adicionó un volumen de suero, contenido en un tubo cónico, medio volumen de la solución saturada de sulfato de amonio para dejar el sulfato de amonio a una concentración final de 33%. 3. Se continuó la agitación por 10-15 minutos, después de terminada la adición de sulfato de amonio. 4. Se centrifugó a temperatura ambiente a 3,500 rpm por 15 minutos. 5. Se disolvió el sedimento en solución salina a pH 7.8 hasta alcanzar el volumen original del suero. 6. Se repitieron los pasos 2-5 y posteriomente los pasos 2-4. 7. Se disolvió en SSRB el sedimento después de la última centrifugación hasta alcanzar la mitad o un tercio del volumen original del suero. 8. Se dializó contra SSRB en frío a 4ºC y agitación durante 3-5 días, realizando dos cambios diarios de la solución de diálisis hasta eliminar completamente el sulfato de amonio. 9. Se transfirió la gamma-globulian dializada a un tubo y se centrifugó en frío a 2,500 rpm durante 10 minutos para eliminar el precipitado que se hubiera formado. 10. Se determinó la concentración de proteínas por espectrofotometría.

Precipitación en capilar 1. Se hicieron una serie de diluciones dobles de antígeno en tubos eppendorf de la siguiente manera: se depositaron 0.2 ml de SS en 10 tubos de ensaye. Al primer tubo se agregaron 0.2 ml de la solución concentrada de antígeno y se mezcló. De éste tubo se tomaron 0.2 ml y se transfirieron al siguiente tubo. Se repitió el procedimiento hasta el tubo 10. 2. Se llenó un tubo capilar con antisuero hasta la primer marca y se limpió el exterior del tubo con papel absorbente para eliminar el antisuero adherido a las paredes externas. 3. Se invirtió el tubo capilar para hacer descender el antisuero hasta el borde del extremo contrario. 4. Se tomó un volumen de antígeno de tal manera que el volumen en el capilar llegara hasta 2/3 partes.



5. Se mezcló el contenido por movimientos de rotación e inversión repetidos del capilar. Se centró el contenido del capilar y tapó uno de los extremos del mismo con el dedo índice y se introdujo el extremo contrario en una gradilla de plastilina. 6. Se utilización como testigos un tubo capilar conteniendo antisuero más solución salina y otro conteniendo antígeno sin diluir más solución salina. 7. Se mantuvieron los tubos capilares a temperatura ambiente durante 24-48 horas.

Reacciones de Precipitación en medio semisólido 1.

2.

Se agregó una muestra de 50 µl del antisuero al pozo central de un gel comercial, y se tomaron 10 µl del antígeno en sus diferentes diluciones, así como dos muestras de antígeno diferentes. Se dejó reaccionar durante 48 h en condiciones de refrigeración.

Resultados y discusión Antígeno

Figura 2. Curva tipo obtenida por el método del reactivo de Bradford para determinación de proteínas en suero. La medición de absorbancia obtenida fue de 0.042 que corresponde a 0.1142 mg/ml y que multiplicada por el factor de dilución 6,000 da una concentración en suero de 68.5 mg/ml, valor que se ajusta a lo esperado para albúmina humana.

La medición directa de las diluciones en suero dio una concentración de C=(Abs-0.0131)/0.2531 = (0.0420.0131)/0.25310=0.1142 mg de albúmina/ mL Pero ésta medición tiene la siguientes diluciones: iii) la diluyó 6 veces ii) La diluyó 0 veces i) La diluyó 100 veces Lo que nos da un factor de dilución de 6,000 veces, lo que nos deja una concentración inicial real en suero de 68.51 mg/mL, COMPROBACIÓN -Se tienen 68.51 mg/mL, se toman 100 microlitros, osea 6.85 mg de albumina -Se aforan esos 6.85 mg de albumina a 10 ml -Se toman 1 mL de alícuota, osea 0.685 mg -Se adicionan 5 ml de biuret, lo que nos deja una concentración de 0.685 mg/6mL=0.1142 mg/mL Para la cuantificación de las proteínas séricas presente en el suero, se empleó la reacción de Biuret debido a que al estar constituida por sulfato de cobre en una solución alcalina (ya sea hidróxido de sodio o hidróxido de potasio) van a formar un complejo entre los iones Cu 2+ y los



electrones no ocupados del nitrógeno que se encuentran presentes en los enlaces peptídicos (en este caso la albumina humana es una proteína), el resultado de lo anterior es la formación de una coloración violeta. Presentan su máxima absorción a 540nm (UNLP, n/a).

Figura 3. Reacción de Biuret, observándose la formación del complejo entre el Cu2+ y los electrones del nitrógeno.

La inmunogenicidad es la medida de antigenicidad de un material y está en función de la zona de administración y de la especie que es inmunizada (Rojas 2006). Las proteínas y carbohidratos al poseer estructuras químicas complejas presentan un mayor grado de inmunogenicidad (salvo ciertas excepciones) en comparación con los polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos. Así mismo las moléculas de composición mixta (por ejemplo: las glicoproteínas, nucleoproteínas, glicolípidos, lipopolisacáridos y las lipoproteínas) son más inmunógenas que sus componentes individuales. También si los compuestos presentan estructura terciara o cuaternaria presentarán mayor inmunogenicidad (Rojas 2006). Las moléculas que presentan pesos moleculares superiores a los 100kD son más inmunogénicas que aquellas con pesos moleculares inferiores a los 20kD (Rojas 2006). Además Rojas (2006) menciona que los antígenos solubles son menos inminogénicos que los particulados, por lo que en el caso de los antígenos solubles es necesario emplear un adyuvante para incrementar su inmunogenicidad debido a: -

Concentración de la cantidad de antígeno administrado (por las micelas formadas).

-

Retienen por más tiempo al antígeno en el lugar de inoculación, prolongando el tiempo de estimulación.

-

Una vez que el antígeno ha sido particulado se presenta con mayor facilidad su captula por las células fagocitarias procesadoras y presentadoras de antígeno.

Un adyuvante es aquella sustancia o conjunto de sustancias heterogéneas e inespecíficas que permiten potenciar la respuesta inmune. Se caracterizan por contar con tres mecanismos de reacción (Asociación Española de Vacunología, 2013): a) Formación de un depósito con liberación gradual del antígeno adsorbido, aumentando una mayor interacción CPA-antígeno. En modelos animales de monos, se ha podido recuperar aluminio hasta seis meses después de la administración del mismo. b) Presentación de los antígenos de una manera multivalente particulada, que permite una internalización más eficiente por parte de las CPA.



c) Activación del complemento y la formación de un ambiente inflamatorio en el lugar de la inyección. d) No activan directamente los TLR (Toll-like receptors, receptores de los macrófagos que al reconocer estructuras, generalmente de origen infeccioso, forman parte importante de la respuesta del sistema inmunitario innato), pero facilitan la maduración de los mismos, i. ↑ citoquinas pro-inflamatorias. ii. ↑ la expresión MHC clase II CD86 iii. ↓ CD14.

Para la elección de un adyuvante se toman en cuenta las siguientes características: composición química, características físicas (dureza, pH, densidad, viscosidad, tamaño de partícula y carga), características bioquímicas, pureza, vía de administración, además de la patología o naturaleza del antígeno (European Medicines Agency, 2013). Sin embargo, en esta experimentación, no se utilizó adyuvante porque como la vía de administración fue subcutánea y en esa vía se asegura que el antígeno es retenido por más tiempo. Con base a la información anterior, la albúmina humana es poco inmunogénica, ya que a pesar de que es una proteína (que es estable, de carácter ácido y no cuenta con carbohidratos) es soluble y su peso molecular es de 66kD (Telijón, 2006) además de que pudo haber generado tolerancia; por lo que para el desarrollo de la práctica era necesario emplear un adyuvante (como el Freund completo o incompleto) para aumentar la inmunogenicidad de la albúmina.

Manejo de conejos En primera instancia, se trató el aspecto del manejo adecuado de los animales. Si un procedimiento produce dolor o estrés en los animales de laboratorio, las normas internacionales urgen a los usuarios a buscar nuevas alternativas (Lobato-García, 2009). Tomando en cuenta esta recomendación, se decidió establecer protocolos de inmunización y prácticas de laboratorio que disminuyeran el sufrimiento del conejo utilizado. Básicamente, los esfuerzos se orientaron a disminuir el estrés del animal durante la o btención de la muestra de sangre y durante su inmunización. Para ello, se utilizó lidocaína en pomada 15 minutos antes de cada punción y una zanahoria para ayudar a reducir el estrés.

Inmunización Una vez capacitados en el manejo de los conejos, se inició la discusión sobre la mejor vía de inmunización con los antígenos. La inmunización puede realizarse a través de la vía oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intracardíaca, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, etc. La elección de la vía depende, entre otras cosas, de la especie animal que se utilice y de las características del antígeno. Originalmente se planeaba hacerlo por vía intravenosa. Esta vía proporciona un contacto inmediato y directo del antígeno con las células inmunes; sin embargo, la inoculación del antígeno a través de esta vía requiere de amplia experiencia en la canalización de venas o arterias. Dado que los protocolos de inmunización establecían inoculaciones periódicas con los antígenos, el posible fallo de la inoculación por vía intravenosa podría constituir una limitante para la estimulación de una adecuada respuesta inmune. En este sentido, la inoculación de los antígenos por vía intravenosa no es muy adecuada para los fines didácticos que se persiguen con la producción de anticuerpos. Sin embargo, esta vía podría utilizarse exitosamente si fuera precedida de un curso sobre toma de muestras en animales de laboratorio. Por otra parte, la vía subcutánea es utilizada frecuentemente para la inmunización de antígenos solubles como la albúmina sérica humana, por lo tanto se decidió utilizar esta vía para la inoculación de estos antígenos. Para disminuir una reacción local severa y abarcar una mayor superficie de absorción, cada dosis de antígeno fue distribuida en diferentes sitios (máximo ocho) a



lo largo del dorso torácico y lumbar. La inmunización subcutánea de los antígenos estimuló una fuerte respuesta de producción de anticuerpos como se demostró en la pruebas de precipitación. En ambos conejos, los inmunizados con suero o los inmunizados con albúmina, se presentó una reacción inflamatoria que llevó a la formación de una costra en la zona de inoculación, que finalmente se descamó sin dejar ninguna lesión posterior. La formación de esta lesión podría estar relacionada con el volumen de la dosis de antígeno inoculada. Sería interesante desarrollar nuevos protocolos para determinar el volumen mínimo necesario para una adecuada producción de anticuerpos sin que se produzcan lesiones importantes. Durante el desarrollo del protocolo de inmunización el conejo no presentó fiebre o alteración de su estado general de salud.

Figura 4. Sitio de inmunización por vía subcutánea del conejo. Se muestran dos costras y algunas pápulas formadas después de la inmunización. Imagen del día 11.

Pruebas Se obtuvo una concentración de proteínas totales en el concentrado de suero de conejo dializado de 0.818 mg/ml, alrededor de 80 veces menor que en suero humano sin dializar. La absorbancia obtenida fue de 0.020 a 540 nm por la técnica de reactivo de Biuret. Se disolvieron 100 µL de solución de anticuerpos, 400 µL de solución salina y 2.5 ml de reactivo de Biuret. Factor de dilución: 30. Veintiún días después de la primera inoculación, los animales fueron sangrados siguiendo el protocolo previamente establecido. La formación de un precipitado abundante entre el antígeno y su anticuerpo depende de que las concentraciones de ambos sean equivalentes (zona de equivalencia); el exceso de alguno de éstos disminuye e incluso inhibe la formación del precipitado. Con objeto de determinar la zona de equivalencia del antisuero contra albúmina, se realizó una serie de diluciones dobles de la albúmina como se indica en la tabla (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024). En este caso la concentración del anticuerpo permaneció constante. Como se esperaba, concentraciones muy bajas o muy altas del antígeno inhibieron la formación del complejo antígeno-anticuerpo (extremos de la curva). La zona de equivalencia para el anticuerpo anti-albúmina se presentó entre las diluciones 1:4 y 1:8 del antígeno (zona central de la curva). Este resultado demostró que el protocolo de inmunización establecido fue adecuado para la producción de anticuerpos contra esta proteína.



Figura 5. Izquierda: agitación y mezclado del capilar que contienen antígeno y anticuerpo. Derecha: Punción en gradilla de plastilina para posterior almacenaje hasta observar la presencia de precipitado.

Figura 6. Tubos 1-10 y los controles A y Ao. A=antisuero + solución salina. Ao=Antígeno sin diluir + solución salina.



Figura 7. Resultados de precipitación capilar a las 36 horas. Se observa sólo precipitación en los tubos 1-4. Los tubos 5-10 se observan algo turbios pero sin precipitado. Los dos controles, A y Ao no presentan precipitados ni turbidez.

Figura 8. Resultados de precipitación capilar a las 48 horas. Se observaron precipitados en todos los tubos. Los tubos control siguieron sin mostrar precipitados o turbidez.



Figura 9. Resultados de precipitación capilar de los tubos 1-6 a las 60 horas. Todos ellos presentan precipitado. Tabla 2. Resultados de precipitación capilar en los tubos 1-10 y controles con las diluciones indicadas a las 48 horas de estar en reposo.

Tubo

Dilución

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A Ao

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 Testigo suero Testigo antígeno

Precipitado (+) +++ ++++ +++++ ++++ +++ ++ ++ + -



Figura 10. Se muestra el grado de formación de precipitado para cada tubo a las 48 horas basado en la tabla anterior. El tubo con mayor reacción de precipitación fue el tubo 3. En la realización de esta prueba se observan 2 zonas formadas respecto a la concentración del antígeno empleado (suero humano): en la primera ocurre un incremento de la formación del precipitado conforme se va reduciendo la concentración del antígeno; la otra zona comienza después de la tercera dilución (1:8) la cantidad de precipitado disminuye hasta llegar a un punto (dilución 1:512) en donde ya no hay precipitado. Lo anterior se puede adecuar a la curva de inmunoprecipitación (Ver figura 11) donde ocurre lo mencionado previamente, además se observa que hay una zona intermedia (en donde el aumento/descenso del precipitado se da en una proporción menor). Para la primera etapa (Ver figura 10, inciso c) como lo menciona Fuentes (1998) al haber mayor cantidad de antígeno los 2 centros de unión están ocupados, mientras que en el caso de los antígenos presentes sus epítopos no están totalmente ocupados, por lo que no hay una formación de complejos grandes, haciendo que solamente hayan complejos pequeños y que sean solubles. Conforme la concentración del antígeno se va disminuyendo los epítopos se van combinando con las zonas libres de los anticuerpos hasta ocupar las 2 zonas de unión de estos, con lo anterior se forman inmunocomplejos grandes e insolubles formando los precipitados. A esta zona se le

denomina la “zona de equivalencia” (Ver figura 10, inciso b). En esta prueba se observa que en el tubo 3 hay mayor precipitado, por lo que correspondería a esta zona. Para los tubos 1 y 2 si bien hay inmunoprecipitado la cantida es menor por lo mencionado anteriormente (formación de pequeños complejos solubles). Al seguir disminuyendo la concentración del antígeno, estos se van a ir reduciendo, por lo que varios anticuerpos se unirán en los diferentes epítopos, formando complejos solubles y de esa manera se reduce la formación del inmunoprecipitado (como en los tubos 9 y 10) (Fuentes, 1998).



Figura 11. Reacciones entre una concentración fija de anticuerpos y concentraciones crecientes de antígeno en la prueba de inmunoprecipitación (Fuentes, 1998).

Figura 12. Curva de la formación del inmunoprecipitado en función de la concentración de antígeno (Fuentes, 1998). Inmunodifusión



Cuando al difundir por el gel el antígeno y el anticuerpo contactan, forman inmunocomplejos estables, produciéndose una línea de precipitación que puede observarse a simple vista. La formación de una línea de precipitación indica una sola reacción antígeno-anticuerpo, estando el grosor de la línea en relación con la cantidad de antígeno presente en la precipitación. Cuando la línea de precipitación se cierra y se acerca al pocillo del anticuerpo, ello significa un exceso de antígeno, mientras que cuando ocurre lo contrario se trata de un exceso de anticuerpo. En algunos casos, si el exceso de uno de los dos es muy importante, la banda de precipitación no llega a formarse (Fuentes, et al , 1998). Se nota en la Figura 13, que efectivamente se presentaron líneas de inmunoprecipitación (circunferencia más opaca), para las diluciones 1:2 (a), 1:4 (b), 1.8 (c), así como para 1:128 (d), 1:256 (e) y 1:512 (f). También se realizó la prueba con dos antígenos utilizados (R) y (E). Se observa que a concentraciones iniciales se presentan varias bandas (línea naranja).

Figura 13. Resultados de la prueba de inmunodifusión. Se inoculo al animal con el antígeno. Además se observó que más bandas aparecieron con el antígeno que más se usó para inocular, posiblemente el anticuerpo reconoció un epítopo característico de esta muestra. Mientras que el antígeno que se usó una vez no presento alguna banda, esto fue por dos causas: se presentó el fenómeno de prozona (Exceso de antígeno) o la muestra estaba concentrada (postzona). Al comparar los resultados con la teorí a se observa que (comparando con la Figura 14):

Figura 14. Patrones de precipitación de la doble inmunodifusión A y B son los antígenos y S son los anticuerpos.



En la Figura 14y 13, se nota que en el primer caso (superior izquierdo) se produjo un anticuerpo para sólo un tipo de antígeno, y no se cruzan las bandas; mientras que cuando se promueve la formación de un anticuerpo con más de dos antígenos se observa bandas compartidas es decir una respuesta cruzada y finalmente la figura de abajo, es el mismo tipo de antígeno solo con determinante diferente se observa un ligero cruce. En esta corrida experimental se observó el primer tipo. Lo cual corrobora que las albúminas humanas son muy parecidas entre individuos diferentes de la misma especie. Para tener una mayor confiabilidad es recomendable cuantificar y estandarizar la concentración de los anticuerpos, por ejemplo la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimesura establece

que la sensibilidad del ensayo de inmunodifusión doble es de 20 1 200 μg/ml.

Conclusiones        

Si hubo presencia de anticuerpos contra albúmina sérica humana como demostró la precipitación en capilar. La dilución 1:8 fue la que presentó mejor precipitación a las 36 y 48 horas. Se necesita de un control de muestra de sangre del conejo antes de las inmunizaciones para corroborar que no tenía anticuerpos antes y que fueron producto de los protocolos de inmunización. La concentración de proteínas en suero humano que se administró al conejo fue de 68 mg/ml y se le administró en dosis crecientes de 0.5 ml hasta 2 ml para un total de cinco inmunizaciones subcutáneas con máximo 8 puntos. Con la reacción de inmunoprecipitación se comprobó que el anticuerpo producido por el conejo es útil para el antígeno administrado (suero – albúmina humana). En la prueba de inmunoprecipitación se observó la zona de equivalencia (relación entre las concentraciones de antígeno y anticuerpo para formar inmunocomplejos insolubles) en la dilución de albúmina sérica humana de 1:8. La prueba de inmunodifusión doble fue positiva y se comprobó la identidad del anticuerpo a las concentraciones de 1:2, 1:4 y 1:8. Es recomendable estandarizar la concentración del antisuero para poder aceptar por completo el ensayo de inmunoprecipitación.

Bibliografía 

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Producción de Anticuerpos Contra Albúmina Humana en Conejo

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