UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA FORESTAL
PROCEDIMIENTOS DE DESINFECCIÓN DE EXPLANTES SIEMBRA ASÉPTICA
CURSO
: BIOTECNOLOGIA FORESTAL
ALUMNO
: MIXAN CAMACHO, Jean Rommel
DOCENTE
: Ing. Msc. HEMERYTH BARTRA, Jhinmy
SEMESTRE
: VII
FECHA
: 14/07/17 TINGO MARÍA – PERÚ
ÍNDICE GENERAL I.
Pag. INTRODUCCIÓN ......................... ............ .......................... .......................... .......................... .......................... ........................ ........... 1
II.
REVISION DE LITERATURA........................... ............. ........................... .......................... ......................... ................. ..... 2 2.1. Explante ......................... ............ .......................... .......................... .......................... ........................... ........................... ................... ...... 2 2.1.1
............ ................. .... 2 Semillas “Calycophyllum “Calycophyllum spruceanum (Benth.) ......................... ”
2.2. Medios de cultivo ..................................................................................... 2 2.2.1. Agar .......................... ............. .......................... ........................... ........................... .......................... .......................... ................. .... 2 2.2.2. Asepsia.......................... ............ ........................... .......................... .......................... .......................... .......................... ............. 3 2.3. Puntos a tener en cuenta para disminuir la contaminación contaminación por manipulación ......................................................................................... 5 III. MATERIALES Y METODOS ......................... ............ .......................... ........................... .......................... ................... ....... 6 3.1. Lugar de ejecución .................................................................................. 6 3.2. Materiales ................................................................................................ 6 3.2.1. Equipos e instrumentos de Laboratorio ......................... ............ ......................... ................. ..... 6 3.2.2. Reactivos y sustancias .......................... ............. .......................... .......................... .......................... ............... .. 7 3.2.3. Material vegetativo ......................... ............ .......................... .......................... .......................... ...................... ......... 7 3.2.4. Otros materiales ......................... ............ .......................... .......................... .......................... .......................... ............. 7 3.3. Metodología ............................................................................................. 7 3.3.1. Preparación del área de trabajó ......................... ............ ......................... .......................... ................ .. 7 IV. RESULTADOS........................... ............. ........................... .......................... .......................... .......................... ........................ ........... 10 V. CONCLUSION ........................... ............. ........................... .......................... .......................... .......................... ........................ ........... 11 VI. REFERENCIA BIBLIOGRAFICA ......................... ............ .......................... .......................... ........................ ........... 12
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I.
INTRODUCCIÓN
La expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes, etc.), y el control de los factores que afectan el crecimiento. Uno de los principales problemas que se presentan cuando se trata de establecer los cultivos in vitro, es la contaminación de los mismos con diversos microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, toplasmas, entre otros). El ambiente generado por explante-medio de cultivo-condiciones físicas de incubación es altamente propicio para la proliferación de muchos de estos microorganismos, pueden provocar la destrucción de los l os explantes. El primer paso para la desinfestación del tejido es su lavado con agua potable y en algunos casos un poco de detergente, de preferencia antibacterial, esto se realiza con la finalidad de eliminar algunos contaminantes localizados en la superficie del mismo. Es importante considerar el origen del material a esterilizar, aquéllos que provienen de campo, con porciones de suelo (raíces o tallo), pueden presentar más problema durante este proceso que los que provienen de invernadero y condiciones controladas.
Objetivos Familiarizarse con los procedimientos de establecimiento in vitro vitro y
siembra de explante (Semilla de Capirona – Calycophyllum spruceanum). Conocer las normas para el trabajo aséptico en el área de siembra. Identificar los puntos clave para disminuir la contaminación por manipulación. manipulación.
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II.
REVISION DE LITERATURA
2.1 . Explante Tejido vivo separado de su órgano su órgano propio y transferido a un medio artificial de crecimiento Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, de tejido, células células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas.
2.1.1
Semillas “C alycophyllum
s pruc eanum eanum (Benth.)
”
Son pequeñas, comprimidas, con alas laterales. El embrión bien desarrollado con cotiledones foliáceos. Sus dimensiones incluyendo el ala varían de 5 a 6 mm de largo, 1 a 2 mm de ancho y de 1 mm de altura. Entre 10-30 semillas por fruto y entre 3-6 millones de semillas por kg.
2.2. Medios de cultivo Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. La diversidad metabólica de estos es tan grande que la variedad de medios de cultivo es enorme, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos, ni siquiera refiriéndonos a las bacterias con exclusividad.
2.2.1. Agar Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. En el agar bacteriológico el componente dominante es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas y que presenta la indudable ventaja de que a excepción de algunos microorganismos marinos, no es utilizado como
3 nutriente. Un gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los 100ºC y se gelifica alrededor de los 40ºC, dependiendo de su grado de pureza.
2.2.2. Asepsia Uno de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminación de los mismos con diversos tipos de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus). El procedimiento general consiste en inocular un medio de cultivo gelificado (generalmente con agar, Gelrite o Phytagel®) con un fragmento de tejido u órgano vegetal, llamado explante, previamente tratado para eliminar todo organismo que se encuentre en su superficie (desinfestación). La finalidad de los desinfectantes es destruir o inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos, sin alterar la estructura celular de los tejidos vivos. El desinfectante interactúa con la membrana celular del microorganismo, seguida de la penetración dentro de la célula y luego su acción sobre un blanco, alterando las funciones normales del microorganismo. (Sánchez et al., 2005) En general el mecanismo de acción de los desinfectantes depende de tres mecanismos básicos: Capacidad de coagular y precipitar proteínas, Alterar las características de permeabilidad celular, Toxicidad o envenenamiento envenenamiento de los sistemas enzimáticos de
las bacterias. Estos pueden producir la muerte o inhibición celular de las bacterias por oxidación, hidrólisis o inactivación de enzimas, con pérdida de los constituyentes celulares. (Sánchez et al., 2005) Los agentes desinfectantes más empleados en la micropropagación vegetal, teniendo en cuenta su bajo costo, fácil adquisición y menor efecto fitotóxico sobre los tejidos son el hipoclorito de sodio y el alcohol al 70%.
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2.2.2.1. Hipoclorito de sodio El cloro es un potente agente germicida con amplio espectro de actividad, frente a bacterias, esporas, hongos, virus y protozoos. Presenta efectos bactericidas rápidos, es un agente oxidante que inactiva proteínas enzimáticas. (Sánchez et al., 2005) El hipoclorito tiene como mecanismo de acción sobre los microorganismos la inhibición de las reacciones enzimáticas y desnaturalización de las proteínas. (Sánchez et al., 2005). Este compuesto actúa como un solvente de materia orgánica, especialmente de ácidos grasos, a quienes transforma en sales de ácidos grasos (jabones) y glicerol, reduciendo la tensión superficial de la solución remanente. Además, el hipoclorito de sodio neutraliza los aminoácidos, formando agua y sales
2.2.2.2. Alcoholes Son compuestos orgánicos del agua, conocidos desde la antigüedad y usados como antisépticos de limpieza y desinfección. Además de la actividad antimicrobiana, son un buen solvente de otros productos, entre ellos muchos antisépticos y desinfectantes, potenciando su actividad. (Sánchez et al., 2005) Los alcoholes poseen una rápida acción y amplio espectro de actividad, actuando sobre bacterias gram-negativas y gram-positivas, incluyendo micobacterias, hongos y virus, pero no son esporicidas. (Sánchez et al., 2005). El mecanismo de acción consiste en destruir la membrana celular y desnaturalizar las proteínas. Su eficacia Su eficacia está basada en la presencia de agua, esto se debe a que estos compuestos acuosos penetran mejor en las células y bacterias permitiendo así el daño a la membrana y rápida desnaturalización de las proteínas con la consiguiente interferencia en el metabolismo y lisis celular. (Sánchez et al., 2005) Los alcoholes habitualmente usados son el alcohol etílico o etanol y el alcohol isopropílico. Las concentraciones varían entre el 70% y el 96% para el primero, y entre el 70% y el 100% para el segundo. Aunque sus aplicaciones son
5 idénticas se suele usar habitualmente el etanol por ser menos irritante. (Sánchez et al., 2005).
2.3. Puntos a tener en cuenta para disminuir la contaminación por manipulación (Eskew et al., 1984) menciona, que la primera condición para la realización de cultivo de tejidos vegetales es lo relativo a la asepsia, debido a que los medios de cultivo ofrecen condiciones favorables también para el desarrollo de patógenos (hongos y bacterias). Las causas de contaminación de los cultivos establecidos in vitro son las siguientes: El aire o ambiente, el cual puede contener en suspensión diversos microorganismos (esporas). tejidos vegetales, vegetales, en su exterior o interior (tejido vascular) Los tejidos pueden contener microorganismos que pueden o no ser patógenos, bajo condiciones normales; sin embargo, cuando el tejido o el órgano es cultivado in vitro, el crecimiento de los microorganismos limita el desarrollo de las células. esterilización poco El medio de cultivo con un proceso de esterilización efectivo (desde el lavado de la cristalería, condición de los reactivos, esterilización en el autoclave). El cuerpo cuerpo humano, limpieza de manos, en el pelo, pelo, respiración, respiración,
trabajo de poca precisión durante la exposición al fuego de bisturíes, pinzas, cajas etc.
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III.
MATERIALES Y METODOS
3.1. Lugar de ejecución La siguiente práctica de desinfección de explantes y siembra aséptica, se realizó en el laboratorio de Biotecnología Vegetal, perteneciente a la Universidad Nacional Agraria de la Selva, Tingo María- Perú.
3.2. Materiales 3.2.1.
Equipos e instrumentos de Laboratorio
Vaso de precipitados Tubo de ensayo Pinzas Pipetas (10 ml. Y 5 ml.) Gradilla Papel filtro Mechero de Bunsen Placa Petri Cámara de siembra
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3.2.2.
Reactivos y sustancias
cultivo MS, suplementado con BAP BAP 1mg/l y AIA Frascos con medio de cultivo 0.5 mg/l. Alcohol de 70 Lejía Agua destilada
3.2.3.
Material vegetativo
Semillas de capirona “Calycophyllum spruceanum (Benth.)
”
3.2.4.
Otros materiales
Un lapicero Una libreta de apuntes El manual de practicas Cámara fotográfica Internet Revistas Libros
3.3. Metodología 3.3.1. Preparación del área de trabajó 1. Día anterior a la siembra Preparar los materiales necesarios.
8 Aplicar lejía 1% en la cabina cabina de flujo, suelo y áreas áreas de trabajo. Encender la luz UV (OJO: radiación cancerígena, NO VER
DIRECTAMENTE Y DESALOJAR EL ÁREA INMEDIATAMENTE).
2. En la siembra Apagar la luz UV y esperar 10 minutos antes de entrar. Encender la cabina de flujo laminar 15 minutos antes antes de iniciar las
actividades de siembra. alcohol 70° 70° en toda la superficie del interior de la cabina. Aplicar alcohol Desinfectar con con alcohol alcohol 70° los materiales antes de colocarlos en el
interior de la cabina de flujo. se disipe disipe el alcohol alcohol y encender el mechero. mechero. Esperar que se Colocarse lentes de protección protección si se va a trabajar trabajar por periodos periodos
prolongados. Retirarse los relojes o pulseras. Quitar el papel envoltorio de los instrumentos, frascos, etc. afuera de
la cabina de flujo laminar. Aplicar alcohol 70° en las manos frecuentemente, frecuentemente, para evitar
contaminación por tocar superficies o instrumentos fuera de la cabina. Flamear en todo momento los instrumentos quirúrgicos. En caso de quemaduras, quemaduras, interrumpir inmediatamente la siembra y
aplicar los primeros auxilios o al servicio médico.
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3. Después de la siembra Retirar todos los materiales materiales y limpiar la superficie de la cabina cabina de flujo
laminar. alcohol de 70° a sus frascos respectivos. Devolver el alcohol
Desinfección y siembra de los expalntes: 1. Lavar generosamente generosamente (pero delicadamente) con agua y detergente detergente neutro los explantes. Usar un cepillo si es necesario. 2. Cortar, con una tijera limpia, los explantes de un tamaño ideal ideal para poder poder sumergirlos completamente en el frasco. 3. Sumergir por un un tiempo determinado determinado los explantes en alcohol 70°. 4. Llevar a la cabina cabina de flujo laminar. 5. Sumergir por un tiempo determinado la semilla en lejía a una concentración definida. 6. Enjuagar 3 veces con agua destilada, destilada, por un mínimo 3 minutos cada enjuague. 7. Usar las pinzas pinzas y bisturíes estériles. 8. Sembrar la cantidad cantidad de semillas según según el tamaño del envase. envase.
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IV.
RESULTADOS
4.1 Se familiarizó con los procedimientos del establecimiento in vitro y siembra de explante (Semilla de Capirona – Calycophyllum s pruc pr uceanum eanum). Se llevó a cabo dichos procedimientos teniendo como referencia la desinfección del explante, luego se trasladó a la sala de siembra las semillas, introduciéndolos en cada uno de de los 15 tubos de ensayos ensayos los cuales cuales contenían el medio de cultivo MS.
4.2 Del Conocimiento de las normas para el trabajo aséptico en el área de siembra. De las normas en las cuales se pusieron más énfasis fue que todo el procedimento de siembra se realizó dentro de la cámara de flujo laminar, manteniendo una distancia prudente, tanto el explante como como el medio de cultivo cultivo MS del fuego
4.3 Identificar los puntos puntos clave para disminuir la contaminación por manipulación. Para ello los factores que influenciaron en el trabajo realizado es la asepsia al personal encargado de la práctica (uso de guantes, mascarilla y el lavado de manos manos con alcohol de 70°), el material vegetativo como el medio de de cultivo. En la siembra se tuvo muy en cuenta la desinfección de los materiales usados; manteniendo el explante como el medio de cultivo MS a una distancia prudente del fuego.
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V.
CONCLUSION
Se logró la familiarización teniendo en cuenta la desinfección del explante, para luego luego ser trasladado a la sala de de siembra las semillas, semillas, introduciéndolos en cada uno de de los 15 tubos de ensayos ensayos los cuales cuales contenían el medio de cultivo MS. Se logró conocer conocer las normas, pero las que más resaltaron en el trabajo al momento de realizar la siembra fue que todo el procedimento se realizó dentro de la cámara de de flujo laminar, manteniendo manteniendo una distancia prudente, prudente, tanto el explante como el medio de cultivo MS del fuego. Los puntos clave para disminuir la contaminación por manipulación es la asepsia al personal encargado de la práctica (uso de guantes, mascarilla y el lavado de manos manos con alcohol de 70°), el material vegetativo como el medio de cultivo. En la siembra se tuvo muy en cuenta la desinfección de los materiales usados; manteniendo el explante como el medio de cultivo MS a una distancia prudente del fuego.
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VI.
REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
Clavell, L; Rossi, L. 1994. Campanas de Flujo Laminar. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Farmacia ROCA, W. y MROGINSKI, L. Cultivo de tejidos en la agricultura, f undamentos y aplicaciones. Colombia: CIAT, 1991. Sánchez L, Sáens E. 2005. Antisépticos y desinfectantes. Dermatología Peruana. Volúmen 15. N° 2.
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ANEXO
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Fig. 1 Filtrado de las semillas.
Fig. 2 Secado de la semilla.
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Fig. 3 Atado del material vegetativo.
Fig. 4 Obtención del Hipoclorito de sodio.
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Fig. 5 Enrrazamiento de legía al 1% con agua estéril.
Fig. 6 Medio de cultivo MS para siembra de explante.
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Cuestionario 1. ¿Qué es la tasa de multiplicación? Es la fase más importante y determinante en todo programa de propagación in vitro, en ella se define no sólo el número de plantas o propágulos a obtener, sino su calidad genética por ser esta fase en la que se producen las variantes somaclonales. (Roca, W. 1991). El objetivo de esta fase es la producción del mayor número posible de propágulos (plantas, microtubérculos, microbulbillos) a partir de explantes (meristemos apicales o axilares, yemas axilares o adventicias), ya establecidos in vitro. (Roca, W. 1991). 2. ¿Por qué se utiliza alcohol 70° para desinfectar superficies o el material vegetal? Alcohol al 70% es uno de los agentes desinfectantes más empleados en la micropropagación vegetal, teniendo en cuenta su bajo costo, fácil de adquisición y menor efecto fitotóxico sobre los tejidos y es menos irritante para el ser humano. (Sánchez et al., 2005) 3. ¿Qué otras sustancias sustancias se utilizan para la desinfección de explantes? Benlate hipoclorito de calcio calcio [Ca (OCl)]2, del 6 al 12 % (HgCl2) del 0.1 al 1.5 %. aunque este compuesto compuesto cloruro de mercurio (HgCl2) es altamente tóxico y no es fácilmente removible del explante. (Roca, W. 1991). 4. ¿Cuáles son los errores errores más frecuentes frecuentes que que causa la contaminación en la siembra in vitro? Tocar la boca boca del tubo de ensayo ensayo con la mano. Sacar la mano de la cámara de siembra realizar el proceso de siembra lejos del fuego, etc. 5. ¿Qué son los filtros HEPA? (Clavell, L; Rossi, L. 1994)son filtros de alta eficiencia capaces de retener partículas ≥ 0,3 μm con una eficiencia mínima del 99,97% y resulatan
adecuados para retener los aerosoles que se generan cuando se realizan procedimientos experimentales con agentes biologicos como agitacion,centrifugacion agitacion,centrifugacion o mezcla. Cuando todo el aire que entra a la zona de trabajo es filtrado a través de los filtros HEPA se produce un flujo unidireccional, ya que el aire se
18 mueve a través del área de trabajo con una velocidad uniforme a lo largo de líneas paralelas logrando un barrido o eliminación de las partículas presentes en el mismo.
¿Cuál es la diferencia entre una cabina de flujo horizontal con una de flujo f lujo vertical?
Cabina de flujo horizontal Existe un grado menor m enor de turbulencia. El flujo de aire golpea la superficie de trabajo. Genera mayor turbulencia alrededor de las piezas grandes. El aire purificado ingresa a la cabina en una corriente unidireccional horizontal.
Fuente: Elaboración propia.
Cabina de flujo vertical El grado de turbulencia es mayor. El flujo de aire no golpea golpea la zona de trabajo. Genera menor turbulencia alrededor de las piezas grandes. El aire purificador ingresa a la cabina en una corriente unidireccional vertical.
