DEFINICIONES -
Electroforesis: Técnica utilizada para separar partículas coloidales tales como proteínas o ácidos nucléicos a través una matriz sólida (gel de agarosa o poliacrilamida) de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica mediante la aplicación de un campo eléctrico (IUPAC, NHLBI, DOE).
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Desnaturalización de proteínas : pérdida de las estructuras nativas (secundaria, terciaria y cuarternaria) de una proteína, adoptando la estructura primaria únicamente.
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Enfoque isoeléctrico: técnica en gradiente de pH montada entre un ánodo y un cátodo, de donde éste último tiene un pH más alto que el primero.
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Marcador estándar de peso molecular : Fragmentos de ADN de peso molecular conocido utilizados para determinar el tamaño de una molécula de ADN de interés por comparación después de una electroforesis.
olimerización: Acción química por el cual las moléculas de acrilamida y bisacrilamida
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forman un entramado a manera de malla por la acción de catalizadores (TEMED y APS) generando una sustancia gelatinosa.
ELEMENTOS NECESARIOS PARA UNA ELECTROFORESIS Cámara de electroforesis -
Permite la generación de un campo eléctrico alrededor de un gel en el que se depositan las muestras.
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Cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía GEL Da soporte para evitar perturbaciones perturbacio nes mecánicas durante la separación
Gel de Agarosa - Polisacárido -
extraído de algas marinas
100 pb a 25 kb. No es tóxico
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Permite realizar el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares variados
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Menor poder de resolución que el de los geles de poliacrilamida.
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El tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la concentración de agarosa utilizada y la concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido.
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La concentración de agarosa más utilizada para electroforesis de ácidos nucleicos es de 0.5 a 2%.
Gel de acrilamida -
La acrilamida es un polímero sintético, termoestable, incoloro y químicamente inerte.
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Polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida.
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El tamaño del poro de un gel (acrilamida + bisacrilamida), 19:1. siempre menores que la de los geles de agarosa.
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¿Soportar mayores voltajes y es susceptible de teñirse por varios procedim ientos;
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La electroforesis con geles de acrilamida siempre se realiza en cámaras verticales.
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Un gel superior o concentrador y un gel inferior de separación o de resolución
Buffer de corrimiento
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El buffer de corrimiento es de la misma composición y pH que el buffer con el que se prepara el gel de resolución, ya sea de agarosa o de acrilamida.
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Proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento.
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En el caso de los ácidos nucleicos, pueden emplearse TBE o TAE como buffer de corrimiento. El buffer TBE contiene Tris base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. El buffer TAE contiene Tris base, ácido acético y EDTA, ajustado a pH 8.5. El buff er de corrimiento de electroforesis de proteínas lleva Tris, 25 mM, SDS al 1% y glicina, 192 mM, a un
Buffer de carga -
Este amortiguador tiene como fin brindar peso, densidad y color a la muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su salida del gel
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Monitorea el corrimiento de la muestra en el gel.
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Se emplea en relación 1:3 para ácidos nucleicos o 1:6 para proteínas, respecto a la cantidad de muestra.
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El buffer de carga de ácidos nucleicos contiene Tris, azul de bromofenol, azul de xileno y glicerol.
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Mientras que el buffer de carga para proteínas contiene TrisHCl, pH 6.8, ditiotritiol (DTT), SDS, glicerol y azul de bromofenol.
Marcador de peso molecular Son una mezcla de moléculas de DNA o de proteínas de tamaño conocido que permiten determinar por comparación el tamaño de las moléculas (ácidos nucleicos o proteínas) contenidos en las muestras sometidas a electroforesis
Transiluminador ultravioleta Es un aparato que transmite luz del espectro ultravioleta a través de la muestra, lo cual excita la molécula cromogénica que emite energía fluorescente y permite visualizarla. En general emiten energía a una longitud de onda a 302 nm, aunque también existen para 254 y 365 nm
PROCEDIMIENTO GENERAL DE UNA ELECTROFORESIS 1. 2. 3. 4. 5.
Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentración requerida. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado. Cargar las muestras en el gel. Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente. Visualizar los ácidos nucleicos o las proteínas.
Electroforesis de ácidos nucleicos Reactivos Tampón TBE (5x) …. 0.45 M Tris Base, 045 M acido bórico, 10 mM EDTA , ajustar a Ph 8 Tamppón de carga … 40% sacarosa, 0.25 azul de bromofenol , 0.1 M EDTA
Metodologia 1. 2. 3. 4. 5.
Preparación del gel de garosa Mezclar la muestra con el tampón de carga Cargar la muestra en el gel Corrido electroforético Visualización
Factores que afectan la migración del adn Generalmente, estos factores suelen confundir los resultados finales, por lo que se recomienda al investigador estandarizar algunos parámetros importantes que en la práctica suelen pasar desapercibidos. Estos factores pueden ser: Tamaño del ADN La tasa de migración del ADN es inversamente proporcional al log10 del número de pares de bases que conforman la molécula. Esto significa que las moléculas de ADN más grandes generalmente migran más lentamente que las más pequeñas. Concentración de la agarosa -
Una molécula de ADN migrará y se distribuirá de modo diferente a medida que varíe la concentración de la matriz de agarosa o poliacrilamida.
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Este fenómeno se explica matemáticamente mediante la fórmula: log μ = log μo – Krt
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Donde: log μ es el logaritmo de la movilidad electroforética del ADN,
t es la concentración de la agarosa, μo es la libre movilidad electroforética del ADN Kr es el coeficiente de retraso relacionado a las propiedades del gel y del tamaño y forma de las moléculas que se desplazan. Conformación del ADN Existen moléculas de ADN que a pesar de presentar el mismo peso molecular adoptan conformaciones estructurales diferentes. Un ejemplo de ello son l os plásmidos que en la mayoría de los casos generan estructuras superenrrolladas, formas lineales o formas circulares menos enrolladas o relajadas. En la electroforesis, estos plásmidos migran de manera no uniforme y se distribuyen en la matriz de agarosa de tal manera que dan la impresión de tratarse de moléculas de diferente peso molecular. Sin embargo, estas diferencias pueden ser alteradas variando algunos parámetros físicos como la fuerza iónica del buffer, el voltaje aplicado o la concentración misma de agarosa. Voltaje aplicado Permiten la movilización de las moléculas de ADN de un polo a otro. A medida que aumenta la fuerza del campo eléctrico (aumento de voltaje), se incrementa la movilidad de las moléculas de ADN de alto peso molecular pero de manera indistinta. Ello
genera que las moléculas no se separen co mpletamente unas de otras pese a aumentar la velocidad de la electroforésis. En consecuencia, se recomienda no aplicar más de 5V/cm para moléculas de ADN mayores de 2 Kb. Dirección del campo eléctrico Durante una electroforesis normal, las moléculas de ADN migrarán a través de una determinada dirección influenciada por un campo eléctrico. Esta dirección tiene singular repercusión sobre la tasa de migración de una molécula de ADN. Mientras este factor permanezca constante, la dirección de la migración del ADN se mantendrá inalterable. Sin embargo, existe la posibilidad de alterar la dirección del campo eléctrico y con ello es posible cambiar el curso de la migración del ADN. En ese sentido, si consideramos fraccionar dos grandes moléculas de ADN que miden entre 50 y 100 kb (por ejm. ADN g enómico) bajo un campo eléctrico de una sola dirección el resultado final será la presencia de una sola banda difusa en el que se encuentren ambos fragmentos. Pero, si realizamos un cambio en la dirección del campo eléctrico, las moléculas más grandes de 100 kb se autoalinearán, alterarán su migración y se podrán separar en dos fragmentos completamente distinguibles. Este tipo de electroforesis es conocido como electroforesis de campo pulsado (PFGE o Pulse Field Gel Electrophoresis), y es bastante usado para la separación de moléculas de ADN de grandes tamaños (por encima de 100 kb). Composición de las bases y temperatura En geles de agarosa, la composición de las bases del ADN y la temperatura no son factores que influyen sobre la migración del ADN. En ese sentido no existen diferencias de migración de las moléculas de ADN desde 4° C a 30° C. Sin embargo, en concentraciones de ADN por debajo del 0,8%, un eventual aumento de temperatura por encima de 50°C (cambio que puede ocurrir al aumentar el voltaje de electroforesis o por la alta fuerza iónica del buffer) puede generar la licuación del gel y en consecuencia la pérdida de la muestra del ADN. Presencia de agentes intercalantes Algunos investigadores prefieren mezclar el ADN con el bromuro de etidio antes de realizar la electroforesis. Ello genera que el bromuro de etidio se intercale entre las bases del ácido nucleico produciendo una alteración del peso molecular del ADN y reduciendo su movilidad durante la electroforesis, en aproximadamente un 15%. Para evitar este problema se recomienda realizar primero la electroforesis y posteriormente la tinción del gel de agarosa con bromuro de etidio a fin de evitar distorsiones en la migración del ADN. Composición del buffer de electroforesis La migración del ADN es afectada por la composición y la fuerza iónica del buffer de electroforesis. En un caso hipotético en que por error se llevase a cabo la electroforesis usando agua en lugar de buffer, la conductividad eléctrica disminuiría drásticamente por la falta de iones y, en consecuencia, la migración del ADN sería casi nula. Si la concentración de iones fuera excesivamente alta, la conductividad eléctrica sería muy eficiente y se generaría un sobrecalentamiento del buffer. El calor excesivo podría causar la licuación de la agarosa o la desnaturalización del ADN. Actualmente se dispone de distintos buffers para electroforesis de ADN de doble hebra. Los más usados son el buffer TAE (Tris, ácido acético y EDTA) y el TBE (Tris Borato EDTA). La ventaja de usar TAE es que es menos costoso y a diferencia del TBE permite que las moléculas de ADN migren 10% más rápido. El TBE por su parte es un buffer
muy eficiente y no se sobrecalienta fácilmente a grandes voltajes. Por esta razón, este buffer es usado para la resolución de grandes fragmentos de ADN en matrices poco concentradas
Electroforesis de proteínas Metodologia 1. Preparación del gel de acrilamida Gel de resolución o separación -
5,3 mL Agua bidestilada
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2,5 mL TrisHCl 1,5M pH 8,8
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2,0 mL Acrilamida/bisacrilamida 30% v/v
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0,1 mL SDS 10%
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2. 3. 4. 5.
0,05 mL Persulfato de amonio 10%
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0,05 mL
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TEMED
Gel concentrador o compactación -
Agua bidestilada
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TrisHCl 1,5M pH 6,8
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Acrilamida/bisacrilamida 30% v/v
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SDS 10%
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Persulfat
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TEMED
Preparación de la cubeta Carga de la muestra Corrido electroforético Tinción de la proteína
FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Fuerza del campo eléctrico (E) -
Es la fuerza que determina el movimiento o migración de la proteína a través del campo eléctrico.
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Su unidad de medición es voltios/cm y es por esa razón que la tasa de migración de una proteína puede ser alterada cambiando tanto la distancia comprendida entre los electrodos (cm) como el potencial eléctrico del sistema (Voltaje).
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Del mismo modo, los valores de E dependen de la fuerza direccional (Fa) y de la car ga neta de la molécula (Q).
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Puede ser calculada a través de la siguiente fórmula: E = Fa/Q E= v/d
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Donde: Fa = Fuerza direccional. v = voltios. d = distancia de los electrodos (en centímetros) Q = carga en (coulomb)
Temperatura Depende básicamente del voltaje de la electroforesis, la co ncentración de sales (poder de conductancia) del buffer y del pH. Un aumento en la temperatura del buffer genera el efecto "sonrisa" o smiling.
Carga neta de la molécula La presencia de aminoácidos de diferentes grupos bioquímicos otorga a una determinada proteína una carga neta totalmente diferente a otra, compuesta por diferentes grupos de aminoácidos. Debido a que en la electroforesis, las muestras son sometidas a un determinado campo eléctrico, la migración de las proteínas en el gel dependerá básicamente de su carga y no de su peso molecular. Para evitar este efecto, es importante igualar la carga neta de todas las proteínas aprovechando sus propiedades anfotéricas. En ese sentido, el SDS evita el efecto de diferencias de carga entre las proteínas, a fin de favorecer la separación de ésta únicamente por su peso molecular. Tamaño y forma de la molécula Las proteínas tienen características moleculares que actúan c omo factores intrínsecos durante la electroforesis alterando su migración y generando bandas de diferentes tamaños, que no necesariamente van acorde al peso molecular real del polipéptido. Ciertas modificaciones postraduccionales, multimerización y formación de complejos con otro tipo de moléculas generan modificaciones en el tamaño de la proteína dando pesos moleculares aparentes en el momento del análisis. Debido a la dificultad de reconocer la naturaleza bioquímica de una proteína no caracterizada, previamente deberá estandarizarse diversas condiciones experimentales a fin de optimizar el análisis de la proteína por electroforesis
VARIANTES DE ELECTROFORESIS Electroforesis bidimensional -
Es un proceso de separación e identificación de proteínas en dos dimensiones, orientando los frentes de corrida en ángulo recto uno de otro.
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En tal sentido, las moléculas primero son separadas por su carga o punto isoeléctrico (pI) por la técnica de enfoque isoeléctrico o IEF (Isoelectric Focusing).
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Posteriormente, las proteínas son separadas de acuerdo con su tamaño o peso molecular por electroforesis en SDS PAGE, diferencia de la electroforesis en una dimensión en el que se puede resolver cerca de 50 bandas, la electroforesis de dos dimensiones permite resolver 2500 manchas de polipéptidos.
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Separa 4000 o 5000 proteinas de una celula
Electroforesis de capilar -
Se lleva a cabo en finos capilares de sílica fundida cubierta con poliamida. Los t ubos de sílica tienen una longitud de 30 a 100 cm con un diámetro de 25 a 100 μm y presentan radicales oxidrilo que al disociarse confieren una carga neta negativa.
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El proceso se realiza en condiciones de alto voltaje y de campo eléctrico, donde el calor generado es eficientemente disipado gracias a la acción de los pequeños capilares.
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Para este propósito, el buffer utilizado en el sistema Tris 0,02 M pH = 8,6 pasa por los capilares removiendo los H+ de los radicales oxidrilos. Con ayuda de corriente eléctrica
se generará un flujo de protones hacia el cátodo, proceso conocido como flujo endoosmótico. -
En este sistema el tiempo de separación es relativamente corto (5 a 10 minutos), mientras que la eficiencia de separación es muy alta
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Las distintas moléculas de CE permiten separar moléculas de muy diferentes propiedades físicas (peso molecular, carga, polaridad, etc.)
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La técnica CE tiene aplicación en la detección y cuantificación de la mayoría de moléculas orgánicas e inorgánicas.
Equipo de electroforesis capilar
Capilar de sílice fundida: Las paredes externas del capilar están recubiertas de una capa de poliimida, para dotarlo de una mayor resistencia. Dentro del capilar se realiza la separación de los analitos. Sistema de refrigeración del capilar: Debido a la resistencia al movimiento de las cargas se genera una gran cantidad de calor, que debe disiparse para evitar que el capilar se funda. ➢ Fuente de corriente eléctrica de alto voltaje: 2030kV 200 250μA
Viales con el electrolito y la muestra: Contienen una disolución tampón en la que se va a realizar la separación. El sistema mueve los viales automáticamente y los inserta en los extremos del capilar Dos electrodos de platino: Cada uno se encuentra en contacto con un extremo del capilar y sumergido en los recipientes que contienen el tampón donde se va a realizar la separación. (cátodo: electrodo negativo; ánodo: electrodo positivo). Detector: Sistema que registra la propiedad física de los analitos. El más común es de absorción de radiación UVVIS. La representación de la propiedad físicoquímica medida (absorbancia), en función del tiempo de migración= electroforetograma. Sistema de registro y análisis de señal: La señal del detector es registrada por un ordenador; que es capaz de generar un electroforetograma.
