PRINCIPIOS DE INTERPRETACION DEL HEMOGRAMA AUTOMATIZADO
Lic. TM Boris Valdivia Vizarraga Servicio de Hematología Hospital Nacional “ Guillermo Almenara Irigoyen “ ESSALUD
Introducción • El desarrollo de los Autoanalizadores hematológicos comenzó en la década de los 50 con los hermanos Wallace y Joseph Coulter, quienes inventaron en 1956 el primer contador automático de células sanguíneas • Hasta 1973 los hermanos coulter mantuvieron sus diseños en forma exclusiva, desarrollándolos desarrollándolos y mejorándolos • Posteriormente otros fabricantes introducen nuevos modelos basados en el mismo principio • En 1980 se introduce el diferencial 3 Diff además del estudio de la serie roja con los cómputos de eritocitos, la determinación de la hemoglobina y el cálculo de los índices eritrocitarios
Introducción • El desarrollo de los Autoanalizadores hematológicos comenzó en la década de los 50 con los hermanos Wallace y Joseph Coulter, quienes inventaron en 1956 el primer contador automático de células sanguíneas • Hasta 1973 los hermanos coulter mantuvieron sus diseños en forma exclusiva, desarrollándolos desarrollándolos y mejorándolos • Posteriormente otros fabricantes introducen nuevos modelos basados en el mismo principio • En 1980 se introduce el diferencial 3 Diff además del estudio de la serie roja con los cómputos de eritocitos, la determinación de la hemoglobina y el cálculo de los índices eritrocitarios
Hermanos Hermano s Wallace y Joseph Coulter
Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff
Parametro
Abreviarura
Unidades Recuento total de glóbulos blancos Porcentaje de neutrófilos
WBC
x 103 / ul
NEUT %
%
Porcentaje de linfocitos
LYNPH %
%
Porcentaje de monocitos
MONO %
%
Porcentaje de eosinófilos
EO
%
%
Porcentaje de basofilos
BASO %
%
Valor absoluto de neutrófilos
NEUT
#
x 103 / ul
Valor absoluto de linfocitos
LYNPH #
x 103 / ul
Valor absoluto de monocitos
MONO #
x 103 / ul
Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff
Parametro Valor absoluto de basófilos
Abreviarura
Unidades
BASO #
x 103 / ul
Recuento total de glóbulos rojos
RBC
Hemoglobina
HGB
G / dl
Hematocrito
HCT
%
Volumen Corpuscular Medio
MCV
fL
Hemoglobina Corpuscular Media
HCM
pg
MCHM
g / dl
Concentración de HGB Corpuscular Media
x 106 / ul
Ancho de Distribución Eritrocitaria
RDW - SD
fL
Ancho de Distribución Eritrocitaria – CV
RDW – CV
%
Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff
Parametro
Abreviarura
Unidades Recuento total de Plaquetas
PLT
x 106 / ul
Volumen Plaquetario Medio
MPV
fL
Ancho de Distribución Plaquetario
PDW
%
Estudio de la Serie Roja • Los años y evaluaciones han dado total aprobación a la impedancia eléctrica para el estudio de las serie roja, en la obtención del computo de eritrocitos • Hematocrito electrónico • Hemoglobina • VCM, HCM, CHCM • Nuevos índices como RDW y PDW • Gráficos de distribución de la población eritroide, histogramas que se obtienen de los parámetros de volumen celular Vs distribución de frecuencia
• En el hemograma automatizado por la metodología usada el valor de Hto es menor al método del capilar. Disminuye 5% ( 1 – 2 unidades del Hto ) • La CHCM deja el significado del método manual debido a la menor variabilidad debido a que el Hto se obtiene electrónicamente • Solo es significativa si presenta variaciones muy importantes ( < 29% ) o elevaciones extremas ( > de 37% ) como se observa en la esferocitosis • Entonces en un caso de anemia la clasificación inicial se realiza con las cifras de HB, Hto, constantes corpusculares , RDW y el histograma • Toda esta información muy valiosa para el clínico debe ser corroborada por el examen microscópico de la serie roja, atendiendo a las alarmas que estos equipos mostrarán en sus pantallas .
Para tener en cuenta : •
A pesar del avance tecnológico alcanzado, los autoanalizadores hematológicos presentan limitaciones :
1.
No detectan poiquilocitosis
2.
No detectan inclusiones eritrocitarias
3.
Lo que nos presentan los fabricantes son distintos tipos de alarmas con diversa sensibilidad, que tienen que ver con el tamaño celular, línea celular, error intramétodo y/o de proceso.
4.
Finalmente, no se debe por ningún motivo, dejar de realizar el examen microscópico de las células
Estudio de la Serie Roja • Por lo tanto, la observación microscópica nos permite confirmar lo señalado por los índices hemáticos, asi como, establecer la presencia de anormalidades • Deben considerarse además una serie de interferencias que alteran el hemograma automatizado : • • • • • • •
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
lipemia ictericia severa hemólisis auto-aglutinación por anticuerpos fríos plaquetas gigantes leucemias otras anormalidades
ANEMIA
MCV
RDW CV
RDW SD
elevado
elevado
elevado
bajo
elevado
elevado
Hemoglobinopatías heterocigóticas
normal
normal
bajo
Hemoglobinopatías homocigótas
normal
elevado
elevado
Mielofibrosis / anemia sideroblástica
normal
elevado
elevado
Anemia hemolítica
normal
normal
elevado
Anemia secundaria
normal
normal
normal
Talasemia y Hemoglobina S combinada
bajo
elevado
elevado
Talasemia
bajo
normal
bajo
Deficiencia de B12/folato, hemólisis Causa inmune, aglutinación de GR Por anticuerpos fríos, anemia aplásica Insuficiencia severa de fierro
Principio de Medición por el Método de la Impedancia Eléctrica
El número de pulsos eléctricos indica la
cantidad de partículas que pasan a través de la apertura y el tamaño de los pulsos es proporcional al volumen
de las partículas
Un pequeño voltaje aparece A travez de los electródos
Señal celular
Apertura Cuando una célula suspendida en una solución electrolítica pasa a través De la apertura, el cambio de la impedancia eléctrica es detectado como un Pulso. El número total de pulsos corresponde al conteo total de células y La altura de cada pulso es proporcional al correspondiente volumen celula
Apertura
Célula 1 Célula 2 Apertura
Cuando 2 o mas células son detectadas en La apertura, la célula 1 y célula 2 son Detectadas como un gran pulso, por lo tanto Una de las células no es contada ( perdida De coincidencia ). El grado de perdida de Coincidencia depende de la concentración Celular .
VOLUMETRIA No se puede obtener el recuento celular absoluto a menos que se conozca el volumen preciso de sangre total diluida que atraviesa la abertura durante el ciclo de recuento
Talasemia
Estudio de la Serie Blanca • Es en el estudio diferencial de leucocitos donde se han desarrollado mas y nuevas tecnologías, con el fin de detectar con mayor precisión : tamaño, forma, morfología nuclear, granularidad y estructuras complejas. • La cuenta total de leucocitos se da con la impedancia en la mayoría de aparatos • Algunos aparatos usan la impedancia para medir el volumen nuclear y realizar un diferencial 3 Diff, que muestra linfocitos, granulocitos y células mixtas • Estos diferenciales se acompañan de histogramas y deben ser tomados en cuenta, pero nunca ser los definitivos. Mas usados en pacientes saludables
Estudio de la Serie Blanca • Los datos mas confiables para el leucograma electrónico los ofrecen los diferenciales 5 Diff • Estos ofrecen análisis por medi de : • 1. rayo láser ( scatter light ) • 2. radiofrecuencia • 3. impedancia • 4. citoquímica • 5. canales de lobularidad
• La utilización de citoquímica para detectar los granulocitos se encuentra en algunos instrumentos, con el uso de la peroxidasa, en conjunto con un canal de lobularidad, para basófilos • Análoga a la especificidad de los antígenos, la composición y cantidad relativa de diferentes clases de lípidos en la membrana de los leucocitos, muestra patrones característicos, que son diferentes para cada tipo de célula • Una reacción cito-química, basada en estas características de la membrana es la mejor forma de estos instrumentos para diferenciar granulocitos maduros de los inmaduros
• Causas de interferencia en serie blanca : • 1. crioglobulinas • 2. criofibrinógeno • 3. proteínas monoclonales • 4. eritroblastos • 5. agregados plaquetarios • 6. eritrocitos no lisados • 7. microcoagulos • 8. heparina circulante
Estudio de las Plaquetas • El computo se hace habitualmente por impedancia • La condición de una muestra en circunstancias de tiempo, temperatura, homogenización, relación sangre total / anticoagulante, y la no formación de hemólisis y espuma. Son indispensables para un resultado confiable
Histogramas de Plaquetopenias
•COULTER utiliza su tecnología patentada de SWEET
FLOW que consiste en hacer circular una corriente de diluyente en la parte inmediatamente posterior de la apertura de eritrocitos, a fin de que las plaquetas como son tan pequeñas no permanezcan en el área de recuento y por lo tanto no se cuenten más de una vez
• Ante un recuento plaquetario disminuido, se debe de hacer un examen microscópico de toda la lámina y/o recuento en cámara. • Las plaquetas se comportan de manera particular, ya que cambian de forma desde el momento de su extracción, para luego estabilizarse, despues de varias horas pierde confiabilidad. • Los cambios reales dependen de la alteración en la generación medular de plaquetas • Presenta alteraciones en pacientes con plaquetas gigantes • El PDW o ancho de distribución plaquetaria, corresponde a la amplitud de distribución o anisocitosis plaquetaria y se encuentra alterado en PTI, Mielodisplasia, Mieloproliferación
• Debe tenerse presente que algunas condiciones con producción defectuosa medular liberan plaquetas muy pequeñas y entonces el PDW, VPM y P-LCR presentan valores muy bajos • En trombocitopenias es muy útil el histograma, ya que el equipo no realiza los cálculos • Es definitivo que toda alteración plaquetaria debe realizarse al examen microscópico • • • • • • •
Alteraciones en el recuento automatizado : 1. pseudotrombicitopenia 2. microcitos 3. fragmetos eritrocitarios 4. inclusiones eritrocitarias 5. microcoagulos 6. heparina
• Los sistemas COULTER poseen 2 baños, uno de eritrocitos y otro de leucocitos, en el baño de eritrocitos se encuentra una apertura de 50 µm y en el de los leucocitos otra de 100 µm.
HISTOGRAMAS
Método de Conteo Celular por Dispersión de la Luz Medida a 0º sirve para medir el tamaño celular • Medida a 10º mide la complejidad celular • Medida a 90º mide la superficie celular y la estructura interna ( granularidad ) • Medida a 90ºD mide determinados tipos de granularidad celular •
FOCALIZACIÓN HIDRODINÁMICA • A medida que las células penetran en el área de visualización específica, se produce la interacción con el rayo láser con ángulos diferentes, que suministran información sobre el tamaño de la célula, la estructura interna, la granularidad y la morfología de la superficie.
•
CITOMETRIA DE FLUJO “ Una subdisciplina de la citología analítica, con orientación metodológica, que mide las células en suspensión, dentro de un vehículo líquido, a su paso por una estación de medida ” NCCLS
RADIOFRECUENCIA ( Conductividad ) La conductividad de las ondas de radio A través de las células, nos revelan su composición interna
Una frecuencia alta, generada por un oscilador de cristal, sobreimpuesta a la corriente directa, que incide sobre las células para medir su densidad .
TECNOLOGÍA VCS
• IMPEDANCIA • SCATTER LIGHT • RADIOFRECUENCIA
RF
Centroide inicial De los granulocitos
Centroide Inicial de Linfocitos
Centroide inicial de Monocitos
DC Centroide inicial Del estroma
Eosinófilos
Neutrófilos Polinucleados
Monocítos Basófilos
Linfocítos
PARAMETRO
PRINCIPIO
WBC RBC/PLT
Impedancia Corriente Directa/ enfoque hidrodinámico
HGB
EO BASO IMI
Lauril Sulfato de sodio (SLS ) Cianmetahemoglobia. Fotométrico Acumulación de la altura de los pulsos Citometria ( MAPSS ), CD, Radiofrecuencia ( RF )- VCS CD CD RF, DC, RF
Retic %
Citometria de flujo & fluorescencia
HCT LY, MO, GRAN
Todo conteo celular comparte tres pasos básicos : 1. Dilución de la sangre 2. Toma de muestra de una cantidad medida 3. Enumeración de partículas
Ventajas de los métodos electrónicos : 1. Velocidad 2. Precisión 3. Cálculo automatizado del Hematocrito y constantes 4. Impresión de resultados
•
•
El MCV es calculado sobre las bases de la sumatoria de la altura de los pulsos de las células rojas y dividido por el conteo de G.R.
•
El volumen del paquete celular es calculado del MCV multiplicado por el conteo de células rojas
•
El MCH es calculado del valor de la Hemoglobina y el conteo de G.R.
•
El MCHC es calculado del valor de Hemoglobina y el Hematocrito
1. La turbidez producida por conteos elevados de células blancas, pueden alterar el valor de la Hemoglobina, MVC, y Hematocrito. 2. En LLC y otras leucemias las células son fácilmente dañadas por la apertura, pudiendo aparecer falsos conteos bajos de leucocitos ( WIC / WOC ) 3. Títulos altos de aglutininas frías, que agregan los GR a temperaturaambiente, son responsables de macrocitosis y valores altos de MCHM
Hematocrito : Se mide en % y representa la proporción total de GR en la sangre. •
No se mide directamente con los citómetros de flujo y se calcula a partir del VCM y en en número de GR. Tiene Tiene menor presición
•
El hematocrito es medido electrónicamente : “ el pulso que es generado cuando los GR pasan a través de la abertura es proporcion proporcional al a su volumen “. Se determina comparando el volumen total o acumulado de GR al volumen total de sangre en los 11.7ul de la dilución 1:500
El conteo diferencial manual está sujeto a varios errores • Errores en la preparación del frotis • Errores en la tinción del frotis • Distribución celular • Interpretación celular • Número de células contadas
Un buen buen diferencial diferencial automatizado debe ser ser capaz de : 1. Identi Identificar ficar célula célulass normales normales y anormale anormaless 2. Resu Resultados ltados repro reproducib ducibles les en conte conteos os repe repetitivo titivoss 3. El conteo conteo debe exceder exceder largamen largamente te ( 8,000 – 32,000 32,000 cel. ) al tradicional conteo manual manual ( 100 – 200 células células ) 1. El conteo conteo debe llevars llevarsee a cabo en un mínimo mínimo lapso lapso de tiempo 1. Se debe tener tener capacidad capacidad de almace almacenamie namiento nto de datos
Solo un ejemplo : Tinción Citoquímica 1. eosinófilos y neutrófilos son identificados por su contenido de perooxidasa 2. una mezcla de peróxido de hidrógeno y 4 - cloro - 1 – naftol se adiciona para colorear los gránulos peroxidasa positivos 3. los neutrófilos se tiñen en varios tonos de gris 4. los eosinófilos se tiñen de negro 5. los neutrófilos con alta actividad peroxidasa son contados como juveniles 6. la esterasa monocítica reacciona con el alfa naftil butirato, el alfa naftol se libera y se combina con la fucsina básica diazotizada en la mezcla para formar precipitado rojo intracelular 7. la heparina de los gránulos del basófilo reacciona con el azul alciano, una tinción usada para demostrar mucopoliscaridos 8. Los linfocitos permanecen sin ser coloreados
Gráfica de Control de los Indices Eritrocitarios 1 +3% 0%
VCM
- 3% + 3%
HCM
0% -3%
+ 3%
CCMH
0% -3%
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
12 13 14
15
Desplazamiento del VCM yHCM en la misma dirección, signo de obturación parcial del orificio de recuento +3%
VCM
0% - 3%
+ 3%
HCM
0% -3% + 3%
CCMH
0%
esviación de la HCM y CCMH en el mismo sentido decreciente, causada por desajustes en la calibración de la Hb o recuento de hematíe +3% 0%
VCM
- 3% + 3%
HCM
0% -3%
+ 3%
CCMH
0% -3%
Patrón con un pico de desviación positiva del VCM y HCM, causada por la incorporación de muestras de enfermos con marcada macrocitosis. +3%
VCM
0% - 3%
+ 3%
HCM
0% -3% + 3%
CCMH
0%
Effect of specimen storage at room temperature ( 18º - 20ºC ) 0n the complete blood count parameters of the Abbott CD 3500 blood analyzer.
10 -
% e
(
)
86-
g
n a h C
420WBC
-2 -
RBC
-4 -
HB
-6 -
MCV PLT
-8 -
HCT
-10 Time ( h )
- 12 -
Efecto del almacenamiento a temperatura ambiente ( 18 -20 ºC ) sobre el conteo diferencial de leucocítos, resultados del autoanalizador hematológico Abbott CD 3500
20
10
0
) % ( e g n a h C
Linfocitos v
Neutrófilos
-10
Eosinófilos -20 Monocitos -30
Basófilos
-40
-50
-60 0
0.5
1
2
4
8
12
24
48
ADVIA 60
Algunas de sus Características •18 Parámetros: WBC, RBC, PLT, Hgb, Hct MCV, MCHC, Pct, MPV, PDW, RDW, Linfocitos, Monocitos, Granulocítos, (% y conteo absoluto). •Histogramas de WBC, RBC & PLT. Muestreo: 10 ul sangre total en tubo cerrad con limpieza automática del capilar de muestreo. •Capacidad: 55 muestras/hora con identificación por teclado alfanumérico y reporte de alarmas por fallas en el conteo o por resultados patológicos. •Tarjetas de Memoria "Smart Cards", para resultados, calibración y control de calidad. Interfase: salida RS 232
Sismex SF - 3000
SX - 21
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