4/16/2012
HROMATOGRAFIJA
dr Mara Aleksić, vanr. prof.
HROMATOGRAFIJA Fizičkohemijska metoda koja se bavi: ♣ ♣ ♣ ♣
Razdvajanjem SEPARACIONA METODA Izolovanjem Identifikacijom (kvalitativna analiza) Određivanjem (kvantitativna analiza)
1
4/16/2012
Razdvajanje komponenata smeše izmeĎu dve faze: koje se ne mešaju koje su različitih pokretljivosti koje se nazivaju stacionarna i mobilna
RAZLIČIT AFINITET KOMPONENTE PREMA STACIONARNOJ I MOBILNOJ FAZI !!!
MOBILNA FAZA
STACIONARNA FAZA
GAS
ČVRSTO TELO (porozno, ili granulisano) SLOJ TEČNOSTI ADSORBOVAN NA ČVRSTOM TELU JONOIZMENJIVAČ
TEČNOST
Klasifikacija hromatografskih metoda
1. 2.
3.
Mehanizam razdvajanja Priroda stacionarne i mobilne faze (agregatno stanje faze) Tehnika izvođenja
2
4/16/2012
Klasifikacija hromatografskih metoda na osnovu mehanizma razdvajanja
adsorpcija – adsorpciona hromatografija različita rastvorljivost – podeona (particiona) hromatografija jonska izmena –jonoizmenjivačka hromatografija
Klasifikacija hromatografskih metoda na osnovu prirode stacionarne i mobilne faze Mobilna faza Naziv hromatografske metode
4 kombinacije faza
GAS Gasna hromatografija (GC)
tečno/tečno tečno/čvrsto gas/tečno gas/čvrsto
TEČNOST Tečna hromatografija (LC)
Stacionarna faza Naziv hromatografske metode TEČNOST Gasno-tečna hromatografija (GLC) ČVRSTO Gasno-čvrsta hromatografija (GSC) TEČNOST Tečno-tečna hromatografija (LLC) ČVRSTO Tečno-čvrsta hromatografija (LSC)
3
4/16/2012
Klasifikacija hromatografskih metoda na osnovu tehnike izvođenja
Planarna hromatografija
Hromatografija u koloni
Klasifikacija hromatografskih metoda na osnovu tehnike izvođenja Ispitivana smeša
Gasovi i isparljive supstance
Vrsta hromatografije Gasna hromatografija
Supstance sličnog hemijskog tipa Podeona hromatografija Supstance različitog hemijskog Adsorpciona hromatografija tipa Neorganske i jonske supstance
Jonoizmenjivačka hromatografija, Hromatografija na tankom sloju i papiru
Jonske od nejonskih supstanci
Jonoizmenjivačka hromatografija, Gel hromatografija
Biološki materijali i jedinjenja Gel hromatografija velike molekulske mase
4
4/16/2012
Nernstov zakon raspodele
K
cs cm
Amobi ln a ⇄ Astacionar
K – koeficijent raspodele cs – ravnotežna koncentracija komponente u stacionarnoj fazi cm – ravnotežna koncentracija komponente u mobilnoj fazi
K zavisi od prirode komponente, prirode jedne i druge faze (afiniteta) temperature
Razdvajanje komponenata smeše
Metoda istiskivanja
Frontalna analiza
Eluiranje
5
4/16/2012
Metoda istiskivanja Primenjuje se samo kod adsorpcione hromatografije
Komponente se adsorbuju po opadajućem afinitetu prema stacionarnoj fazi kroz hromatografski sistem propušta se supstancija koja se adsorbuje jače od svih komponente smeše. istiskuje najjače vezanu komponentu sa stacionarne faze i vezuje se na njeno mesto istisnuta komponenta istiskuje sledeću, slabije vezanu komponentu, i proces istiskivanja se nastavlja kroz sistem. komponente nikada nisu sasvim razdvojene, već napuštaju stacionarnu fazu po redosledu opadajućeg koeficijenta raspodele, ali uvek delimično pomešane sa susednom komponentom.
Metoda istiskivanja Na vrh kolone nanese se mala zapremina smeše A,B,C KONTINUIRANO SE PROPUŠTA rastvor D koji se najjače adsorbuje.
A,B,C D potiskuje A, B, C, pa iz kolone prvo izlazi C, zatim B i na kraju A
K D > KA > KB > KC D A B C
Zone se ne mogu potpuno razdvojiti – samo kvalitativna analiza
6
4/16/2012
Frontalna analiza kontinualno propuštanje smeše kroz stacionarnu fazu
A,B,C
KA > KB > KC
Iz kolone prvo izlazi čista komponenta C, zatim smeša B i C i na kraju smeša A, B i C
može se odvojiti samo prva komponenta (sa najmanjim koeficijentom raspodele) u relativno čistom stanju, dok se sve ostale komponente delimično mešaju sa susednim Veoma retko se koristi
Eluiranje mala količina smeše se unese u kolonu, a zatim se vrši kontinualno propuštanje mobilne faze
7
4/16/2012
Eluiranje Na vrh kolone nanese se mala zapremina smeše A,B,C KONTINUIRANO SE PROPUŠTA ČIST RASTVARAČ !!! A,B,C
Iz kolone prvo izlazi C, zatim B i na kraju A
KA > KB > KC
A B C
Zone se mogu potpuno razdvojiti – kvalitativna i kvantitativna Najvažnija metoda koja se koristi u analitičke svrhe
TEORIJA HROMATOGRAFIJE Komponenta A se raspodeljuje na deo koji se nalazi u stacionarnoj fazi cS i deo koji se nalazi u mobilnoj fazi cm.
Usled pomeranja mobilne faze deo komponente A migrira u smeru kretanja mobilne faze i narušava se uspostavljena ravnoteža.
8
4/16/2012
TEORIJA HROMATOGRAFIJE
1. Teorija platoa 2. Teorija brzina
Stacionarna faza
Mobilna faza
7 6 5 4 3 2 1
16 32
a
7 6 5 4 3 2 1
Teorija platoa
*
16 16
16
a’
8
8
8
8
8
8
b’
b
8
4
4
8
8
8
4
4
c’
c
*
1 2
1
1
1
4
4
2
2
2
6
4
4
4
6
4
8
6
6
6
6
6
6
6
4
8
4
6
6
2
4
4
4
1
1
1
4
2
d
2
d’
6
1
2
e
e’
K
cs 1 cm
cs cm
f
9
4/16/2012
Teorijski plato se može definisati kao mali deo kolone u kome se uspostavlja ravnoteža komponente izmeĎu stacionarne i mobilne faze, pre nego što mala zapremina mobilne faze sa svojim delom rastvorene komponente preĎe u susedni deo kolone, gde se proces ponavlja.
1
1
4
4
4
4
8
8
6
6
4
4
4
4
1
1
c’
e’ Posle 5 uravnoteživanja molekuli se tako raspodeljuju po platoima da se dobija raspodela koja odgovara Gausovoj krivoj
Efikasnost kolone sposobnost kolone da potpuno razdvoji komponente koje se teško razdvajaju i srazmerna je broju teorijskih platoa u koloni
Visina ekvivalentna teorijskom platou – HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate )
HETP
L N
L – dužina hromatografske kolone N – broj teorijskih platoa
Efikasnost kolone biće veća što je vrednost HETP manja.
10
4/16/2012
Teorija brzina
v
oblik krive raspodele zavisi od brzine eluiranja.
HETP
A
B v
Van Deemter –ova jednačina
C v - brzina mobilne faze A, B i C faktori koji doprinose širenju trake
Hromatografske metode
Apsorpciona hromatografija
Podeona (particiona) hromatografija
Jonoizmenjivačka hromatografija
11
4/16/2012
Adsorpciona hromatografija Zasniva se na adsorpciji komponenata smeše na čvrstom adsorbensu Mehanizam adsorpcije:
Langmuirova (fizisorpcija)
V
Freundlichova (hemisorpcija) adsorpciona izoterma U zavisnosti od agregatnog stanja:
G-Č i T-Č
bPVmax 1 bP x m x m
1
kP n 1
kc n
1903 ruski botaničar Cvet je na koloni razdvojio sastojke zelenog lišća (razdvojio je hlorofil od drugih pigmenata iz biljnog ekstrakta uz CaCO3 kao adsorbens i petrol-etar/etanol kao mobilnu fazu)
Adsorpciona hromatografija
Adsorbat adsorbovan na površini stacionarne faze - adsorbensa
12
4/16/2012
Adsorbesi i grupe koje se razdvajaju Nepolarni
aktivni ugalj organske soli
peptidi, ugljeni hidrati aminokiseline
Polarni Al-oksid Mg–oksid
neorganska jedinjenja, boje
Mg-silikat
steroli, estri, gliceridi, alkaloidi steroli, aminokiseline
silika-gel CaCO3 skrob
karotenoidi, ksantofili enzimi
Adsorpciona hromatografija
Adsorpciona hromatografija se izvodi u koloni koja je ispunjena adsorbensom. Na vrh kolone nanosi se mala količina analizirane smeše, zatim se kroz kolonu vrši eluiranje čime se postiže razdvajanje komponenata. Komponente smeše se selektivno adsorbuju na adsorbensu u zavisnosti od koeficijenta raspodele.
13
4/16/2012
Tehnika izvoĎenja adsorpcione hromatografije HROMATOGRAFIJA U KOLONI
Komponente A i B i C su razdvojene adsorpcionom hromatografijom.
Komponenta A ima manji koeficijent raspodele od komponente B, a veći koeficijent raspodele od komponente C. Koristeći sliku kolone ucrtati zone sa razdvojenim komponentama.
KA
KC
KB
KA
cs A
c sB
cm A
csC
c sA
cmC
cmB
c mA
B A C
14
4/16/2012
Particiona - podeona hromatografija G-T, T-T Koeficijent raspodele u podeonoj hromatografiji naziva se PODEONI KOEFICIJENT
K
K
cs cm
Komponenta rastvorena u tečnoj fazi koja je vezana za čvrst nosač PRINCIP Različita rastvorljivost komponenata smeše izmeĎu dve tečne faze ( dva rastvarača koji se ne mešaju) I stacionarna faza II mobilna faza
Tehnike izvođenja hromatografije na papiru ili tankom sloju UZLAZNA TEHNIKA
Rastvarač se kreće pod dejstvom kapilarnih sila; zbog suprotnog dejstva gravitacije dolazi do zaustavljanja protoka rastvarača na određenoj visini Za razdvajanje komponenata sa relativno velikim razlikama Rf vrednosti
SILAZNA TEHNIKA
Za razdvajanje komponenata koje imaju male, ili bliske Rf vrednosti Rastojanje koje prelazi front rastvarača reguliše se dužinom podloge i visinom posude
HORIZONTALNA (KRUŽNA) TEHNIKA
15
4/16/2012
Važne veličine u PODEONOJ HROMATOGRAFIJI Pri HORIZONTALNOM PROTOKU mobilne faze (rastvarača) (horizontalna tehnika) na molekule rastvarača deluju samo kapilarne sile
RETENCIONI FAKTOR (faktor zadržavanja), Rf vrednost IDENTIFIKACIJA KOMPONENTE
z (kt)1 / 2 k t
konstanta (zavisi od prirode sistema ( , i )iT vreme za koje rastvarač pređe put z
Kod uzlazne i silazne tehnike na molekule mobilne faze pored kapilarnih deluje i sila gravitacije koja smanjuje ili povećava njihovu brzinu Pređeni put rastvarača r
Rf
a r
a pređeni put komponente r pređeni put rastvarača Rf veća, ako se komponenta bolje rastvara u mobilnoj fazi Dobro razdvajanje: Rf 0,05
K
cs cm
– podeoni koeficijent
KA R f ( A) Rf
KB R f ( B)
KC R f (C )
predjeni put komponente predjeni put rast var aca
16
4/16/2012
Tehnike izvoĎenja particione hromatografije
Papirna hromatografija
Hromatografija na tankom sloju
Izvođenje particione hromatografije Mobilna faza – Rastvarač II i njegove zasićene pare
---------------------------------------------Mala količina smeše (MRLJA)
----------------------------------------------
Stacionarna faza - Rastvarač I vezan za tanak sloj ili papir Tanak sloj nema ulogu adsorbensa iako se koriste isti materijali kao kod adsorpcione hromatografije zbog porozne strukture i velike protočne moći (kapilarno prodiranje rastvarača). Tanak sloj čvrstog adsorbenta ili papir nosač stacionarne faze
---------------------------------------------Čvrst nosač – staklena ploča
17
4/16/2012
Komponente smeše, A i B, razdvojene su particionom hromatografijom na tankom sloju u sistemu u kome stacionarnu fazu predstavlja voda (ε = 78,55), a mobilnu fazu smeša etanola (ε = 24,35) i benzena (ε = 2,30).
Mobilna faza
PreĎeni put A a (cm)
PreĎeni put B b (cm)
PreĎeni put mobilne faze r (cm)
etanol
5,5
3,5
6
benzen
4,2
0,2
6
Razdvajanje komponenata ponovljeno je dva puta sa različitim sastavom mobilne faze: benzen: etanol = 2 : 1 benzen : etanol = 1 : 2
1 2
Dobijene vrednosti dužina preĎenih puteva komponenti A I B i mobilne faze, i Rf vrednosti Pređeni put A a (cm)
Pređeni put B b (cm)
Pređeni put mobilne faze r (cm)
RfA
RfB
1
5
3
6
0,833
0,500
2
5,2
4
6
0,866
0,667
Mobilna faza
18
4/16/2012
Pređeni put A a (cm)
Pređeni put B b (cm)
1
5
3
2
5,2
4
Mobilna faza
Pređeni put mobilne faze r (cm)
RfA
RfB
6
0,833
0,500
6
0,866
0,667
Voda je polarnija supstancija od benzena i etanola (ima veću vrednost dielektrične propustljivosti, ) B se bolje rastvara u vodi, tj, u stacionarnoj fazi i pokazuje manju Rf vrednost. B je polarnija supstanca od A Sa promenom sastava mobilne faze Rf vrednost B se menja, jer je delimično rastvoran u etanolu, pa kada je etanol dominantan rastvarač u mobilnoj fazi (2) i Rf vrednost je veća. A se bolje rastvara se u rastvaračima sa manjom dielektričnom propustljivošću, - u mobilnoj fazi odnos benzena i etanola u mobilnoj fazi ne utiče znatno na njegovu Rf vrednost, R f (1)
0,833 0,500
0,333
R f (2) 0,866 0,667 0,199 Povoljiniji sastav mobilne faze je sastava
benzen : etanol = 2 : 1:
Komponente ispitivane smeše su dobro razdvojene u oba slučaja, jer je razlika retencionih faktora, Rf uvek veća od 0,05.
Jonoizmenjivačka hromatografija
Razdvajanje jonskih vrsta na osnovu njihovog afiniteta ka izmeni sa jonima funkcionalnih
grupa.
19
4/16/2012
Podela jonoizmenjivača
Neorganski
Organski
prirodni /
prirodni
sintetički
•zeoliti •gline •minerali
•oksidi •kisele soli viševalentnih metala •heteropoli kiseline
sintetički •polistiren
Umrežavanjem dobija se smola koja na površini mora imati funkcionalne grupe.
Podela jonoizmenjivača katjonski anjonski -SO3H -COOH -SH
-OH -NH2 -NHR -NR2
amfoterni sadrže i katjonske i anjonske funkcionalne grupe
Funkcionalna grupa se sastoji iz dva dela: 1. Fiksirani jon –kovalentno vezan za matricu smole R 2. Kontrajon – izmenjuje se sa jonima iz rastvora
R-SO3H + NaCl
R-OH + NaCl
R-SO3Na + HCl
RCl + NaOH
20
4/16/2012
Tehnika izvođenja jonoizmenjivačke hromatografije Suspenzija
izmenjivača u vodi sipa se u kolonu koja je delimično napunjenu vodom (da ne uđe vazduh) višak vode se ispusti ali iznad smole uvek mora postojati sloj tečnosti
Prečišćavanje izmenjivača Prevođenje jonoizmenjivača u željeni jonski oblik
Kapacitet jonoizmenjivača Definicija: - Broj funkcionalnih grupa po jedinici mase suvog jonoizmenjivača - Količina jednovalentnog jona u mmol koju može da razmeni 1g suvog izmenjivača 4 mmolg-1 H+ jona - katjonski 4 mmolg-1 OH- jona - anjonski
C
Vc m
V zapremina utrošenog titranta c molarna koncentracija titranta m odmerena masa smole
21
4/16/2012
LITERATURA
1.
2.
M. Aleksić, Teorija hromatografije skripta
V. Kuntić, M. Aleksić, N. Pejić, S. Blagojević, Praktikum iz fizičke hemije, Farmaceutski fakultet, Beograd 2010.
22
