CONCEPTOS:
Dado el pequeño tamaño de los microorganismos, la cantidad de información que puede obtenerse de un individuo es muy limitada. Por ello es necesario el estudio de poblaciones, que contienen miles o millones de individuos. Estas poblaciones se obtienen al hacer crecer los microorganismos bajo condiciones más o menos bien definidas, se conocen como cultivos.
La mezcla de sustancias, naturales, sintéticas o ambas, que permite el crecimiento y la reproducción de microorganismos o bien que permite mantener su viabilidad es lo que conocemos como Medio de Cultivo
Medio de cultivo Cultivo
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.
AGAR
DISUELTO
AGAR PRESIPITADO ( SIN DISOLVER)
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).
CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS TEMPERATURA
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.
NUTRIENTES Y FACTORES DE CRECIMIENTO
ACIDEZ O ALCALINIDAD
GRADO DE HUMEDAD
PRESIÓN DE OXÍGENO
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DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS
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CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO
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PRESENCIA (O AUSENCIA) DE OXÍGENO Y OTROS GASES
Un medio de cultivo adecuado ha de contener como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas, vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento; sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbóno
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, su inconveniente es que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente sino a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
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CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD
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Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos
LUZ AMBIENTAL
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pH
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La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.
TEMPERATURA
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ESTERILIDAD DEL MEDIO
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)
Tipos de medios de cultivo
* MEDIOS DE CULTIVO GENERALES. Permiten el crecimiento deuna gran variedad de microorganismos. Pertenecen a esta categoría las infusiones de extractos de carne y peptona, una mezcla de composición similar a la de los líquidos orgánicos, que se utiliza para muchas bacterias patógenas
* MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS.
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llevan incorporadas determinadas sustancias que inhiben el crecimiento de un microorganismo y facilita el crecimiento del microorganismo que nos interesa. Pertenecen a esta categoría el caldo lactosa bilis verde brillanteo el agar Salmonella-Shigella.
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M EDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES. incorpora determinadas sustancias que nos permiten diferenciar entre dos tipos de microorganismos. Ej. El agar de sal y manitol: nos permite diferenciar en el caso de los Staphylococos, los que utilizan el manitol en su metabolismo de los que no.
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MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO. son aquellos medios en los cuales a un medio base se le añaden determinadas sustancias nutritivas que son necesarias para el crecimiento de un microorganismo exigente.. Por ejemplo el caldo selenito cistina o el caldo agar sangre.
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ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.
Cada lote de medio de cultivo, una vez preparado, esterilizado, revisado y en su presentación final, se identifica mediante una etiqueta con el nombre del medio de cultivo correspondiente, el número de lo te y la fecha de caducidad. Se almacenan en frigorífico a 4ºC
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
REVISIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Es importante comprobar que el medio se comporta correctamente. Las pruebas que debes hacer para tener seguridad son:
Revisión macroscópica: Se examina el medio a simple vista, atendiendo a su color, a su opalescencia y transparencia, a la humedad en las placas ya preparadas y a la posible aparición de precipitados. Vigilancia de Ph: Porque la mayoría de los microorganismos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro.
Vigilancia de la esterilidad: Se lleva a cabo incubando a 30 ºC durante 72 horas una pequeña porción, representativa del lote de medio preparado, para comprobar que allí no crecen gérmenes.
Prueba de la eficacia: En una pequeña porción representativa del medio preparado, se inocula un microorganismo, normalmente el propio fabricante aconseja el más adecuado y se cultiva. Así se comprueba si en el medio de cultivo preparado el moo inoculado se desarrolla correctamente.
MÉTODO DE SIEMBRA POR ESTRÍA
Se toma una muestra de la población mixta
Se
hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petrí. Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos.
Se
flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales.
Se incuba a temperatura adeucuada
Método de siembra en profundidad A
partir de las diluciones seriadas preparadas tomamos 1mL de cada una de ellas y lo depositamos en distintas placas de Petri vacías y estériles.
Después añadimos un determinado volumen del medio de cultivo (10-20 mL) que tenemos en un baño María para evitar que se solidifique.
Dejamos solidificar y luego incubamos en la estufa durante 24 horas a 37ºC.
Transcurrido el tiempo realizamos el recuento
Método de siembra en superficie
El medio de cultivo ya está solidificado en la placa.
Preparamos las diluciones seriadas y añadimos a cada placa 1 mL
Para extender sobre la superficie de la placa la muestra se utiliza un asa de vidrio
