MEDIOS DE CULTIVO Sustrato óptimo para el mantenimiento y crecimiento de microorganismos en el laboratorio Condiciones generales de un medio de cultivo: - Presentar elementos necesarios en proporciones y cantidades adecuadas - pH óptimo - Condiciones osmóticas idóneas - Debe ser estéril y preservado de contaminación
Medios de cultivo
Agua Fuente de energía Nutrientes
Macronutrientes Micronutrientes Factores de crecimiento
COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO •
Agua
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Extracto de levadura Fuente rica en vitaminas del complejo B Contiene nitrógeno orgánico y compuestos de carbono
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Peptonas Producto resultante de digestión de materiales proteicos Fuente principal de nitrógeno orgánico Contiene también vitaminas, y a veces v eces carbohidratos Existen 2 tipos, dependiend dependiendoo del tipo de digestión que hayan sufrido: Hidrólisis química (ácida o alcalina) Hidrólisis enzimática
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Infusiones y extractos Contienen las sustancias solubles en agua de tejidos animales (carbohidratos, compuestos orgánicos nitrogenados, vitaminas solubles en agua y sales) Un caldo se obtiene por ebullición de los tejidos, una infusión implica un "colado" del líquido obtenido. Un extracto es un concentrado de un caldo.
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Azúcares Fuente de energía (cuando su proporción es de 1 g/L) o como sustrato de prueba (1-2%)
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Sales minerales Se distinguen 2 tipos, de acuerdo a la función que desempeñan: 1- Sales para el mantenimiento de la presión osmótica (NaCl) 2- Tampones: carbonatos y fosfatos
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Indicadores de pH Sustancias que cambian de color cuando el medio alcanza algún valor determinado de pH Ejemplos: - Azul de timol - Púrpura bromocresol - Azul de bromotimol - Rojo fenol - Rojo neutro - Azul de bromofenol, rojo de metilo, metil o, rojo de cresol, fenolftaleína, etc...
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Indicadores REDOX Sustancias que cambian de color cuando se producen este tipo de reacciones Ejemplos: Azul de metileno (azul-incoloro) Cloruro de trifenilo (incoloro-rojo)
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Agentes selectivos Sustancias que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos y favorecen el de otros Ejemplos: - Colorantes (antimetabolitos): cristal violeta, verde brillante, etc. - Azida sódica: Inhibe el metabolismo aerobio (inhibe cadena respiratoria); afecta principalmente a bacterias Gram (-) - Sales biliares y detergentes: Agentes tensoactivos, depresores de la tensión superficial. Gram (-) resisten más su acción - NaCl: Elevadas concentraciones son perjudiciales para microorganismos no halófilos - pH: Cada tipo de microorganismo tiene su rango de pH óptimo y sus valores críticos - Antimicrobianos: Sustancias capaces de matar a microorganismos mi croorganismos
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Suplementos (factores de crecimiento) Compuestos orgánicos que un microorganismo requiere como precursor o como constituyente de su material orgánico celular, pero que no puede sintetizar a partir de fuentes de carbono más sencillas, y debe ser administrado como nutriente Hay 3 clases: Aminoácidos Pirimidinas Vitaminas
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Agentes solidificantes Permiten solidificar un medio previamente líquido Ejemplos: - Agar-agar - Gel de sílice - Geles poliacrílicos
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Agentes reductores Disminuyen el contenido de O 2, se obtiene un ambiente de anaerobiosis Ejemplos: - Ácido ascórbico - Tioglicolato sódico - Ácido tiomálico - Cisteína
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Agentes quelantes Agentes que forman complejos solubles con los metales, impidiendo así que estos formen un complejo insoluble con los fosfatos El más utilizado: EDTA
CLASIFICACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Según la composición • Definidos o sintéticos: Composición química conocida definidos o complejos: Composición química no definida, enriquecidos con peptonas, extracto de carne, de levadura, levadura, sangre • No
Según la naturaleza física Líquidos ------ Caldos Sólidos: Llevan un agente solidificante (Agar). Se utiliza a una concentración del Sólidos: 1.5% Semisólidos:: Contienen agar en concentración del 0.7% Semisólidos
Según sus característica característicass • Medios nutritivos o de propagación: propagación: Permiten el crecimiento de cualquier tipo de bacteria Ejemplos: Agar nutritivo Composición por Litro: Extracto de Carne de buey 3g Peptona trípsica de gelatina 5g Agar 15 g Peq cant cloruro sódico y glucosa Agua destilada hasta 1000 mL
Agar TSA (tripticasa-soya-agar) Composición por litro: Peptona de caseína 15.0 g Peptona de soja 5.0 g Cloruro sódico 5.0 g Agar-Agar 15.0 g pH del medio al utilizarse: 7.3 aprox.
Placa con Agar TSA sin inocular
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Medios de enriquecimiento: Medios Medios complejos con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos Agar sangre
Medio rico en nutrientes, con adición de sangre de cordero desfibrinada al 5% Formulado especialmente para diferenciación de cepas por la hemolisis producida
Placa con Agar Sangre sin inocular
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α- hemólisis en Agar
sangre
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β- hemólisis en Agar
sangre
Medios selectivos o inhibitorios: Contienen sustancias que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos permitiendo el crecimiento de otros o cuya composición permite el desarrollo de un grupo determinado •
diferenciales:: Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de diferenciales microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios • Medios
Ejemplos: Agar MacConkey Utilizado para diferenciar entre coliformes (fermentadores de lactosa) y Enterobacterias (no fermentadoras de lactosa)
Inhibe Gram (+) por contener sales biliares Bacterias fermentadoras de lactosa liberarán productos ácidos que producirán un cambio de pH que se detectará gracias al rojo neutro
Agar EMB (Eosina-Azul de Metileno) Para aislamiento selectivo de bacilos Gram (-) Permite desarrollo de las Enterobacterias
Eosina y Azul de metileno ----- Son colorantes indicadores e inhibidores Permiten diferenciar colonias lactosa (+) de (-)
E. coli y Citrobacter spp.
No fermentadores de lactosa en Agar EMB A) Salmonella typhi B) Proteus vulgaris C) Pseudomona aeruginosa
A)
B)
C)
Fermentadores de lactosa en Agar EMB A) E. coli B) Enterobacter cloacae C) Klebsiella pneumoniae
A)
B)
C)
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Agar Chromocult® Medio selectivo para Enterobacterias Permite diferenciar entre coliformes totales y E. coli Tergitol® inhibe Gram (+) y algunas Gram (-). No afecta crecimiento de coliformes Detección simultánea de coliformes totales y E. coli por Salmon-Gal y X-glucurónido (sustratos cromogénicos)
Identficación de coliformes Enzima caract. de coliformes: β-D-galactosidasa, ésta se une a Salmon-Gal produciendo colonias color salmón-rojo Identificación E. coli enzima caract. de E. coli: β-D-glucuronidasa se une con X-glucurónido y Salmon-Gal, produciendo colonias color azul oscuro-violeta
CRECIMIENTO EN CHROMOCULT®
Agar Salmonella-Shigella (SS) Medio de cultivo selectivo y diferencial Selectividad por sales biliares y verde brillante --- Inhiben desarrollo de Gram (+), mayoría coliformes y Proteus sp.
Diferencial por fermentación de lactosa y formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio
Salmonella, Shigella y otros microorganismos son no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo
Colonias lactosa (-) son incoloras Colonias lactosa (+) son rosadas-rojo Colonias de MOS productores de H 2S presentan un centro negro
Apariencia de las colonias Incoloras y translúcidas
MOS Shigella y algunas especies de Salmonella
Translúcidas con centro negro
Proteus y mayoría de sp de Salmonella
Rosadas-rojo
E. coli, Klebsiella
Colonias más grandes que las de E. coli, rosadas o beige opaco (crema), mucoides
Enterobacter aerógenes
Agar cetrimide Medio selectivo para aislamiento de Pseudomona aeruginosa Cetrimide inhibe el crecimiento bacteriano excepto Pseudomona aeruginosa y aumenta la producción de fluoresceína y piocianina
Agar bismuto-sulfito Agar selectivo para el aislamiento de Salmonella typhi y otras Salmonellas Salm onellas Bismuto y verde brillante inhiben flora acompañante H2S (+) ennegrecen el medio por formación de sulfuro de hierro Reducción de iones bismuto a bismuto metálico produce brillo metálico alrededor de colonias después de 24 h de incubación Microorganismos
Apariencia de las colonias
Salmonellas
Colonias centro negro, bordes claros. Medio precipitado negro y lustre metálico
Bacterias coliformes, Serratia, Proteus y otros
Colonias pequeñas amarillas o marrón. Medio circundante claro sin alteraciones
Agar Baird-Parker Aislamiento selectivo de Staphylococcus aureus Cloruro de litio y telurito inhiben el crecimiento crec imiento de de flora acompañante Piruvato y glicina estimulan selectivamente el desarrollo de Staphylococcus
Medio Staphylococcus 110 Medio selectivo para aislamiento y diferenciación presuntiva de Staphylococcus Se base en producción de pigmentos, fermentación de manitol y la hidrólisis de gelatina En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos
Gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa Lactosa y manitol son los hidratos de carbono fermentables Cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para inhibir desarrollo de flora acompañante excepto Staphylococcus spp. Ventajas de este medio: Permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificación presuntiva (desarrollo de pigmentos, fermentación de manitol e hidrólisis hidról isis de gelatina)
Pigmento
Fermentación de manitol
Hidrólisis de la gelatina
Prueba de la coagulasa
S. aureus ATCC 25923
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S. aureus ATCC 6538
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S. epidermidis ATCC 14990
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Microorganismo
