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ZAMORANO Carrera de Ciencia y Producción Agropecuaria
Módulo de Biotecnología Aplicada Area de Actividad: Cultivo de Tejidos Vegetales y Propagación In Vitro
IV. PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Esta parte del laboratorio permitirá al estudiante llevar a cabo todos los pasos correspondientes en la preparación de un medio de cultivo usando como base las sales minerales del medio de Murashige y Skoog (MS). Este medio fue originalmente desarrollado para cultivo de tejidos de tabaco pero ha sido utilizado en muchas otras especies con muy buenos resultados. La característica distintiva del medio MS es su alto contenido de sales, especialmente las sales de K y de N. También utiliza B, Mn y Zn en cantidades altas. La manipulación de los niveles de auxina y citocinina va a influenciar la respuesta en cuanto a morfología de los tejidos; esta respuesta puede variar desde la formación de tejido calloso no diferenciado, hasta la formación de raíces, yemas, o embrioides. Macroelementos CaCl2•2H2O KH2PO4 KNO3 MgSO4•7H2O NH4 NO3
mg/L 440 170 1900 370 1650
Microelementos H3BO3 CoCl2•6H2O CuSO4•5H2O KI MnSO4•4H2O Na2MoO4•2H2O ZnSO4•7H2O
mg/L 6 .2 0.025 0.025 0.8 3 22.3 0. 2 5 8. 6
Componentes orgánicos myo-inositol ácido nicotínico piridoxina-HCl tiamina-HCl
AIA (u otra auxina) 2.0 (1-30) Kinetina (u otra citocinina) 0.2 (0.04-10) (Se pueden usar otros reguladores del crecimiento en lugar de, o en adición a las auxinas y citocininas) pH 5.7 - 5.8
Hierro FeSO4•7H2O Na2EDTA
4.1 4.1
mg/L 100.0 0 .5 0 .5 0 .1
mg/L 27.8 37.3
Modi Modifi fica caci cion ones es de dell medi medio o MS: MS:
35 Las cantidades recomendadas para los compuestos orgánicos del medio de Murashige y Skoog (MS) (MS) (196 (1962) 2) fuer fueron on desa desarr rrol olla lada dass como como produ product cto o de una una inve invest stig igac ació ión n exte extens nsiv iva. a. Una Una modificación en las cantidades de orgánicos dio origen al medio Linsmaier-Skoog (1965). Este medio contiene los mismos compuestos inorgánicos que el medio MS, y los orgánicos que incluye son el myo-inositol con la misma dosis y la tiamina en una dosis de 0.4 mg/L; el resto de compuestos orgánicos (piridoxina y ácido nicotínico) se omiten. En años recientes el hierro ha sido incorporado al medio en forma de FeNaEDTA a razón de 50 mg/L en lugar de la mezcla de FeSO4•7H2O y Na2EDTA que se utilizó en el medio original.
4.2
Pasos Pasos a seguir seguir en la Prepa Preparac ración ión de Medios Medios Nutr Nutriti itivos vos
Los pasos a seguir en la preparación de un litro de medio de cultivo son: 1. En un beaker agregar agregar la mitad mitad (500 ml) de agua bidesti bidestilad ladaa del volúmen volúmen total total de medio medio a preparar. Colocar una barra agitadora magnética en el fondo del beaker y mantener en agitación constante con la ayuda de un agitador automático; 2. Si el medi medio o util utiliz izaa el 100% 100% de las las sale saless mine minera rale less MS entonce entoncess agre agrega garr las las sigu siguie ient ntes es soluciones: a) 100 ml de la solución madre de macroelementos que ha sido previamente preparada a una concentración de 10x; b) 1 ml de la solución madre de microelementos que ha sido previamente preparada a una concentración de 1000x; c) 5 ml de la solución madre de hierro que ha sido previamente preparada a una concentración de 200x; 3. A continuación continuación agregar agregar los compuestos compuestos orgánico orgánicoss (vitaminas, (vitaminas, aminoácidos aminoácidos,, reguladores reguladores del crecimiento) de acuerdo al protocolo del cultivo con que esté trabajando. Para la mayoría de compuestos orgánicos que se utilizan se preparan con anticipación soluciones madres en varias diluciones (1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, etc.), recuerde de utilizar la dilución correcta de acuerdo a la concentración requerida del compuesto; 4. Seguidament Seguidamentee agregar la la sacarosa sacarosa y esperar esperar a que se se disuelva disuelva totalment totalmente; e; 5. Aforar al volúme volúmen n deseado deseado (en este este caso es es de 1L) con un frasc frasco o volumétrico volumétrico de 1000 1000 ml; 6. Colocar Colocar el medio medio nuevamente nuevamente en el beaker beaker y nivelar nivelar el pH de de acuerdo acuerdo al cultivo cultivo con el que que esté trabajando. El pH se regula con soluciones 0.1N, 1N o 2N de KOH, NaOH o HCl; 7. Si el medio es sólido sólido entonc entonces es este este es el moment momento o de agrega agregarr la cantid cantidad ad recomend recomendada ada de agar. Si el medio es líquido entonces no se agrega agente gelatinizador y se pasa directamente al paso 9; 8. Si se agregó agregó agar, éste éste necesita necesita ser disuelt disuelto o en un horno microondas. microondas. Se coloca coloca el beaker con con el medio en el horno microondas y se calienta suficiente tiempo hasta que el agar este disuelto. Durante el tiempo que esta calentándose es conveniente estar agitando el medio
36 en el agitador automático cada dos minutos aproximadamente. El tiempo que va a permanecer el medio en el microondas calentándose va a depender del volúmen de medio que se esté preparando; 9. Disp Dispen ensa sarr el medi medio o en los los conte contened nedor ores es.. Es impor importa tant ntee que los los conte contene nedor dores es esté estén n previamente identificados con el nombre del cultivo que se va a sembrar y la etapa en el proceso de micropropagación a que corresponde ese medio; 10. Tapar los contenedores contenedores;; 11. Esterilizar en el autoclave.
Una vez que los contenedores con el medio salen del autoclave hay que dejarlos enfriar y luego refrigerarlos hasta que se vayan a utilizar. Es recomendable utilizar el medio dentro de una semana después de haber sido preparado.
4.3 Como Como Prepar Preparar ar Soluc Solucio iones nes Madre Madre Siempre antes de preparar una solución madre hay que estar seguro cuánto del químico se debe agregar a la cantidad de medio nutritivo que estamos preparando. Por ejemplo: Si la cantidad requerida de BA en un medio de cultivo es de 1 mg/L, esto equivale a decir que: 0.1 mg de BA se requieren requieren para para preparar 100 100 ml de medio, y 0.25 mg se requieren si es que la cantidad a preparar es de 250 ml de medio. Entonces, si vamos a preparar solamente 250 ml de medio de cultivo, vamos a necesitar agregar 0.25 mg de BA. Esta cantidad de BA se puede agregar utilizando una solución madre de 1:1 (1mg = 1ml). Así que con una pipeta de 1 ml, se agregan 0.25 ml de esta solución madre de 1:1 al medio de cultivo para llenar el requisito correspondiente a 0.25 mg de BA en el medio nutritivo. Para la preparación de soluciones madre dependiendo del tipo de solvente y de la dilución a utilizar referirse a la información que aparece a continuación.
