Pre Info Final I Unidad

“DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR 14690”

POR LOTES DE Ralstonia eutropha NRRL B-

FACULTAD DE INGENIERIA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL AGROINDUSTRIAL TITULO: DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR

“

POR LOTES”

DOCENTE: Dr. AUGUSTO CASTILLO CALDERON

GRUPO: D-3

CURSO: LABORATORIO DE BIOPROCESOS

ALUMNOS: ALONSO ROSSEL, Fiorella E. CABRERA RISCO, Bárbara A. CHUQUI DIESTRA, Alexander D. HUANIO ESTRADA, Lilibet N. LOZANO VILLAR, Carolin M.    



Nvo.Chimote, Septiembre Septiembre del 2014 2014 [Escriba texto]



Tabla de contenido “DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR ............................................. 4 POR LOTES DE Ralstonia eutropha NRRL B-14690 ........................................................ 4 .................................................................................................... ................................................................. ............ 4 I. OBJETIVOS: ............................................... 1.1. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................ 4 1.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS .................................................................................. 4 II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL ....................................................................... 5 .............................................................. .......... 5 2.1. DISEÑO DEL MEDIO DE CULTIVO. CULTIVO..................................................... 2.2. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ...................................................... 6 2.2.1. Medio solido de Mantención: Preparar 50 ml de medio .............................. 11 2.2.2. Medio Activación: Para 20 ml de solución. .................................................. 15 2.3. DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA ..................................................................................................... ........................................................................ .................. 18 BIOMASA ............................................... 2.4. DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CONSUMO DE LA L A FUENTE ............................................................................................................... .................. 19 DE CARBONO ............................................................................................. 2.5. DETERMINACIÓN DE LOS RENDIMIENTOS DEL NUTRIENTE LIMITANTE EN CÉLULAS: ....................................................................................... 19 2.6. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR D.O. ... 20 III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS ......................................... 23 3.1. Preparación del medio solido de mantención .................................................... 23 ..................................................................................................... ...................................................... 23 3.1.1. Materiales ................................................. ............................................................................... .................................... 23 3.1.2. Instrumentos e Equipos ........................................... ....................................................................................................... ...................................................... 23 3.1.3. Reactivos ................................................... 3.2. Resiembra celular ........................................................ .................................................................................................... ............................................ 24 ..................................................................................................... ...................................................... 24 3.2.1. Materiales ................................................. ............................................................................... .................................... 24 3.2.2. Instrumentos e Equipos ........................................... ............................................................................................. ........................... 24 3.3. Medio de activación .................................................................. ..................................................................................................... ...................................................... 24 3.3.1. Materiales ................................................. ............................................................................... .................................... 24 3.3.2. Instrumentos e Equipos ........................................... ....................................................................................................... ...................................................... 25 3.3.3. Reactivos ................................................... ........................................................................................ .................................... 25 3.4. Medio de fermentación .................................................... ..................................................................................................... ...................................................... 25 3.4.1. Materiales ................................................. ............................................................................... .................................... 25 3.4.2. Instrumentos e Equipos ........................................... ....................................................................................................... ...................................................... 26 3.4.3. Reactivos ................................................... ”

[Escriba texto]



........................................................ ........ 26 3.5. Activación celular y desarrollo del inóculo................................................ ..................................................................................................... ...................................................... 26 3.5.1. Materiales ................................................. ............................................................................... .......... 26 3.5.2. Instrumentos y Equipos ..................................................................... 3.6. Determinación de la cinética de crecimiento de la biomasa............................. 26 ..................................................................................................... ...................................................... 26 3.6.1. Materiales ................................................. ............................................................................... .......... 26 3.6.2. Instrumentos y Equipos ..................................................................... 3.7. Determinación de la cinética de consumo de la fuente de carbono ................. 27 ..................................................................................................... ...................................................... 27 3.7.1. Materiales ................................................. ............................................................................... .......... 27 3.7.2. Instrumentos y Equipos ..................................................................... ....................................................................................................... ...................................................... 27 3.7.3. Reactivos ................................................... 3.8. Hidrólisis de la sacarosa ...................................................................................... 27 ..................................................................................................... ...................................................... 27 3.8.1. Materiales ................................................. ............................................................................... .......... 27 3.8.2. Instrumentos y Equipos ..................................................................... ....................................................................................................... ...................................................... 27 3.8.3. Reactivos ................................................... .............................. ........................... 28 3.9. Método del DNS (Ácido Dinitrosalicílico) ......................................................... ..................................................................................................... ...................................................... 28 3.9.1. Materiales ................................................. ............................................................................... .......... 28 3.9.2. Instrumentos y Equipos ..................................................................... ....................................................................................................... ...................................................... 28 3.9.3. Reactivos ................................................... .................................................................. 29 IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ................................................................ ..................................................................... .................. 31 V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................... VI. ANEXOS .................................................................................................................. 32 6.1. Cálculos para el medio solido de mantención: .................................................. 32 .................................................................. 33 6.2. Cálculos para el medio de activación ................................................................ ............................................................ ........ 34 6.3. Cálculos para el medio de fermentación .................................................... Ralstoni a eutr eutr opha 6.4. Composición del medio mínimo de cultivo de Ralstoni NRRL NRRL b14690 para un crecimiento en biomasa de 1.5 g/l ........................................................ 36 ................................................................................... ................... 37 A. Cálculo de % Nutriente ................................................................ B. Calculo de: Yx/s (cambiar el % célula) ............................................... 39 C. Calculo de S (g/L) ............................................................................................. 40 D. Calculo de S° (g/L) ........................................................................................... 41 Ralstoni a eutr eutr opha 6.5. Composición del medio mínimo de cultivo de Ralstoni NRRL NRRL B...................................................................................................... ............................................................... .......... 43 14690 (SALES) ................................................. 6.6. CONFECCIÓN DE LOS CAPACHOS ............................................................. 47 6.7. CONFECCIÓN DEL TAPÓN PARA MATRACES ........................................ 47 6.8. ESTERILIZACIÓN DE PIPETAS .................................................................... 48 [Escriba texto]



DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR

“

POR LOTES DE

I.

Ralstonia eutropha NRRL B-14690

”

OBJETIVOS:

1.1. OBJETIVO GENERAL Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces empleando una cepa de Ralstonia eutropha NRRL B-14690, evaluándose el efecto de la razón C0/N0 en la cinética de creciente microbiano.

1.2.OBJETIVOS ESPECIFICOS Preparación del medio de cultivo Activación celular y desarrollo del inóculo. Determinar de la cinética de crecimiento de la biomasa Determinación de la cinética de consumo de la fuente de carbono Determinación de la cinética de producción de etanol Determinación del µM y los rendimientos del nutriente limitante en células y en proteínas, además de las respectivas productividades pr oductividades Evaluar el valor del pH durante toda la cinética

[Escriba texto]


II.


METODOLOGIA EXPERIMENTAL

Para realizar la formulación del diseño de cultivo es necesario tener en cuenta los siguientes requerimientos nutricionales para el cultivo de Ralstonia eutropha NRRL B-14690.

2.1.DISEÑO DEL MEDIO DE CULTIVO. El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos correspondientes al proceso a desarrollar.

Metabolismo celular: Autotrófico Volumen del medio 120 ml Fuente de carbono: Glucosa C6H12O6 Fuente de nitrógeno: Sulfato de amonio (NH4)2 SO4 Tampón: Citrato a pH 7.0 Formula estimada del m.o: CH 1.77O0.5 N0.248

Tabla 01: Composición elemental Fuente de carbono y energía

Glucosa

Fuente de N

Sulfato de amonio

Fuente de Mg

Sulfato de magnesio (7 H2O)

Fuente de Fe

Sulfato ferroso(7 H2O)

Fuente de K

Fosfato diácido de Potasio

Fuente de P

Fosfato diácido de Potasio

[Escriba texto]



        Condiciones de Cultivo: Temperatura 28°C, velocidad de agitación 200 rpm en shaker y ajustar el valor de pH a un valor de 7.

Requerimientos nutricionales: Los requerimientos nutricionales están determinados por el tipo de metabolismo celular, ya sea autotrófico, que corresponde a los microorganismos que obtienen el carbono del CO2 como las algas y algunas bacterias, ó heterotrófico que lo poseen organismos que necesitan compuestos orgánicos como fuente de carbono. Para ello utilizamos un Medio de cultivo mínimo. Solución de sales concentrada (100 veces concentrada) Fuente de Ca

:

CaCl2.2H2O

Fuente de Zn

:

ZnSO4 7H20

Fuente de Cu

:

CuCl2.2H2O

Fuente de Co

:

CoCl2.6H20

Fuente de Mn

:

MnCl2 4H2O

2.2.PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO La preparación de medios para el desarrollo de procesos de fermentación es una etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Los componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza química que desempeñan un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con los requerimientos del crecimiento y de formación de productos y además suministrar energía para biosíntesis y mantenimiento celular.

[Escriba texto]



Calculo para hallar la diferencial de biomasa:

  ⁄



Asumir que xi es 0.15

    

[Escriba texto]

“DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR

POR LOTES DE Ralstonia eutropha NRRL B- 14690”

Tabla 02: Diseño del medio de fermentación mínima para Ralstonia eutropha -NRRL B-14690 FUENTE

ELEMENTO

% CELULA

% NUTRIENTE

GLUCOSA

C

47.54

40.00

0.5

2.7

4.05

(NH4)2SO4

N

13.75

21.21

1.54

0.88

1.313

KH2PO4

K

2.75

28.66

10.42

0.130

0.194

KH2PO4

P

2.50

22.78

9.11

0.148

0.22

MgSO4.7H2O

Mg

0.30

9.87

32.91

0.041

0.062

FeSO4.7H2O

Fe

0.11

20.09

182.67

0.007

0.011

* Nutriente Li mitante:

[Escriba texto]

Fuente Nitrógeno y Carbono

Yx/s

S (G/L)

S ° (G/L)



Tabla 03: Diseño del medio de fermentación mínima experimental para Ralstonia eutropha -NRRL B-14690 FUENTE

ELEMENTO

% CELULA

% NUTRIENTE

GLUCOSA

C

47.54

40.00

0.5

2.7

4.05

5.0

(NH4)2SO4

N

13.75

21.21

1.54

0.88

1.313

0.8

KH2PO4

K

2.75

28.66

10.42

0.130

0.194

KH2PO4

P

2.50

22.78

9.11

0.148

0.22

MgSO4.7H2O

Mg

0.30

9.87

32.91

0.041

0.062

FeSO4.7H2O

Fe

0.11

20.09

182.67

0.007

0.011

* Nutriente Li mitante:

[Escriba texto]


Yx/s

S (G/L)

S ° (G/L)

S ° (exp)



Tabla 04: Composición del medio mínimo de cultivo de Ralstonia eutropha NRRL B-14690 (SALES) Elemento

[Escriba texto]

Fuente

% % Cél Compuesto ula

Yx/s

S0 (g/L)

S’0 (g/L)

Peso (gr)

Ca

CaCl2. 2H2O

0.56

27.21

48.59

3.087

4.631

1.39

Fe

FeSO4. 7H2O

0.11

20.09

128.64 0.821

1.232

0.37

Cu

CuCl2. 2H2O

0.56

37.26

66.54

2.254

3.381

1.014

Mn

MnCl2. 2H2O

0.56

33.9

60.54

2.478

3.717

1.1151

Co

CoCl2. 6H2O

0.56

24.76

44.21

3.39

5.085

1.525

Zn

ZnSO4. 7H2O

0.56

22.8

40.71

3.684

5.526

1.66



Mediante la composición de la célula y de los nutrientes se diseña el medio de fermentación para una producción de 1.5 g/L de biomasa y tomando como nutriente limitante a la fuente de carbono y dándole 1.5 por demás a los otros nutrientes

2.2.1.

Medio solido de Mantención: Preparar 50 ml de medio Tabla Nº 05 Nutriente

Cantidad (g/l)

Cantidad (g/50ml)

Extracto de levadura

3.5

0.175

Peptona de caseína

7.0

0.35

K 2HPO4

1.0

0.05

Agar

20

1

Glucosa

1.4

0.07

Preparación de medio de mantención:

Pesar

Nutrientes de la Tabla 5

50En mlmatraz de aguadedestilada 250 ml en matraz de 250ml

[Escriba texto]

Calentar

Con mechero Bunsen

Agitar

Hasta aparecer burbuja ϴ = 1-2 min


Distribuir


En 6 tubos de ensayos

Cerrar

Con sus respectivas tapas

Cubrir

Con papel aluminio

Re osar

Por 1 hora

Colocar

Los tubos en vaso precipitado con agua

Llevar

A olla de presión

Esterilizar

A 121°C x 15 min.

Despurgar

[Escriba texto]

Abrir

La tapa de la olla

Enfriar

De forma inclinada para solidificación del medio de cultivo



Resiembra celular (Solido- Solido)

[Escriba texto]

Desinfectar

El medio de trabajo con alcohol

Colocar

Bajo mechero para un ambiente estéril

Someter

La asa bacteriana al fuego a rojo vivo

Enfriar

La asa por las paredes del tubo las células desarrolladas

Extraer

Una gota de la célula desarrollada

Flamear

El tubo para cerrarlo

Resembrar

Tubo por tubo

Llevar

Por dentro del tubo del medio solido la azada

Arrastrar

Por la superficie desde adentro hacia afuera En zig zag



Preparación del DNS (Ácido Dinitrosalicílico) y determinación de la curva de calibrado para azucares reductores. La preparación del reactivo DNS para 100 ml, se requiere de lo siguiente:

REACTIVOS

CONCENTRACIÓN (g/l)

PARA 100 mL

10 g/l

1g

200 mL/l

20 mL

300 g/l

30 g

ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) NaOH 2N Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado.

Tenemos los siguientes datos: REACTIVOS NaOH

VOLUMEN (L) 0.020

NORMALIDAD 2N

PESO

NaOH

MOLECULAR

(g)

40

1.6

Para determinar la cantidad de NaOH concentrado que se necesita para preparar 20ml de NaOH a 2N, lo determinamos de la siguiente manera:



Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 ml de agua destilada, y 200 ml/l de NaOH 2N, que es equivalente a 1.6 gr. NaOH.

[Escriba texto]



Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 L y se agita hasta la



completa disolución de todos los componentes. Se disuelve el DNS en pequeñas cantidades con ayuda de un agitador



magnético y calentando. 

Dejar enfriar a temperatura ambiente.



Luego verter en una fiola de 100 ml, enrazar y mezclar



Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra:

-

Se añade 1 mL de reactivo DNS a un 1 mL de solución de sacarosa hidrolizada.

-

Se mantiene la mezcla en baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego enfriar con agua helada por 3 minutos.

-

Se añaden 10 ml de agua destilada, y se deja reposar por 10 minutos, luego agitar.

-

Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco. La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado.

-

La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestra de concentración conocida y analizadas según este procedimiento, previo hidrólisis acida de cada muestra.

2.2.2. Medio Activación: Para 20 ml de solución. Tabla Nº 06

Nutriente

Cantidad

Cantidad (g/20 ml)

Glucosa

1.4 g/l

0.028


1.0 g/l

0.02

Peptona de caseína

1.0 g/l

0.02

K 2HPO4

1.0 g/l

0.02

Temperatura: 28 °C Número de revoluciones: 200 rpm [Escriba texto]



Activación celular y desarrollo del inóculo 

De estos tubos de mantención, se inoculará con 3 azadas en el matraz de 125 ml que contiene 20 ml de medio de activación líquido. Asépticamente, bajo un mechero.



Llevar al shaker para la incubación con una temperatura de 28 ºC con una velocidad de control de 200 rpm. por un tiempo de 5 horas hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.



Una hora antes de terminar la activación poner a incubar el medio de fermentación a 28 º C.

2.2.3. Medio Fermentación:

Preparación para 100 ml

An tes debemos tener li sto el T ampón Ci tr ato a pH 7, se prepara de la sigu iente manera:

Pesar Diluir

21.01 gr de Ácido cítrico sol. A y 29.41 gr de Citrato de Sodio sol. B Por separado en fiolas de 100ml

Aforar

Homogenizar

[Escriba texto]

Ambas soluciones

Agregar

31.5ml de sol. A y 18.5ml de sol. B

Aforar

En fiola de 100ml



Agregar

La solución a un vaso precipitado

Agitar

En el agitador magnético

Medir

pH inicial

Gotas de hidróxido de sodio hasta regular el pH a 7.0

Añadir

Ah ora vamos a la sigui ente tabla:

Tabla Nº 07 Nutriente

Cantidad (g/l)

Cantidad (g/120ml)

Glucosa

5

0.6

EDTA

20mg/l

2.4 mg

(NH4)2SO4

1.314

0.158

KH2PO4

0.194

0.023

MgSO4.7H2O

0.061

0.0073

FeSO4.7H2O

0.011

0.0013

Solución de sales

10 ml/l

1.2ml

Tampón citrato pH 7

100 ml/l

12ml

[Escriba texto]



Preparaci ón de medio de fermentaci ón en matr az de 1000 ml par a un volu men de 120 ml

Pesar

Los componentes

Diluir

Cada componente con agua destilada

Preparar

100ml de medio de fermentación en matraz de 1000 ml

Extraer

El medio de fermentación

Extraer

20 ml del inoculo

Separar

En 2 tubos de ensayo

Esterilizar

Por separado las diluciones

Adicionar

Inoculo en el medio de fermentación

2.3.DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA BIOMASA 

De la activación, se inoculará este (medio rico + biomasa) al matraz de 1 litro, conteniendo 270 ml de medio de cultivo de la fermentación. A partir de este paso se determinará la cinética de crecimiento de la biomasa.



Sacar 5 ml. del matraz de 1 litro y llevar a espectrofotómetro, para obtener la biomasa inicial (Xo) a un tiempo cero.

[Escriba texto]





Iniciar el medio de fermentación en el Shaker a 28 ºC a 200 rpm. y tomar la absorbancia de la biomasa cada hora y media por 10 horas.



De las absorbancias obtenidas en cada medida podremos obtener la concentración celular en cada instante, utilizando el espectrofotómetro y haciendo la curva de calibración de biomasa.

2.4.DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CONSUMO DE LA FUENTE DE CARBONO 

Las muestras (viales) serán analizadas mediante el método de DNS -dS / dt = (1/ Y ) (dX/dt) X/S



Reemplazando en esta ecuación y conociendo YX/S. 

Tenemos: -dS / dt = (1/ Y X/S ) μm X

Conociendo μm ya para diferente concentraciones finales podemos determinar la cinética de consumo de sustrato.

2.5.DETERMINACIÓN

DE

LOS

RENDIMIENTOS

DEL

NUTRIENTE

LIMITANTE EN CÉLULAS: F uente de carbono y energía: Glucosa C6H12O6

M= 180

YX/S = % de C en el nutriente / % de C en la célula % de C en el nutriente = 12(6) x 100 / 180 = 40.0 % % de C en la célula = 47.54% YX/S = (40/47.54) x 0.6 (este factor por ser aireado) YX/S = 0.5048 g/g [Escriba texto]



2.6.DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR POR D.O. 

El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la concentración de microorganismos a medida que avanza el tiempo, esto puede ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm.



Para ésta determinación es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:



Se toman 9 muestras de volumen conocido



Se agitan bien y se procede a medir D.O.



Se centrifuga a 1200 rpm durante 20 minutos.



Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua destilada.



Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinación.



Se elimina el sobrenadante, se redisueIve el precipitado y se coloca en los capachos de papel y se coloca en la estufa a 80°C en la bandeja por 24 horas. Posteriormente graficar ABS. vs. X (g/l)

Teniendo en cuenta los siguientes parámetros: Fórmula para el µmax:

Ln(X / X0) =

m t

Para el rendimiento del nutriente limitante

YX/S = X / - S [Escriba texto]



Para el rendimiento en etanol

YP/S = P / -

 

Y°P/S = P / -

 





Para el rendimiento teórico: 



Fórmula para el cálculo de la productividad En células:

QX = X / t

En Producto:

QP = P / t

Con los datos que se obtienen se grafica tiempo vs. Ln X y encontramos el μm (pendiente de la recta)

Gráfico 01

[Escriba texto]



FA SE EXPONENCIAL :

Datos:

µmáx=0.28 h-1

Xf =1.5 g/L

FORMULA:

(  ) SOLUCION:

 ) (    

[Escriba texto]

X0= 0.15 g/l



III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS 3.1. Preparación del medio solido de mantención 3.1.1. Materiales 

Pipetas de 10 ml.



Tubos de ensayo con tapas



Varilla de vidrio



Matraz Erlenmeyer



Probeta graduada



Mechero Bunsen



Espátula



Guantes.



Capachos de papel



Vaso de precipitados

3.1.2. Instrumentos e Equipos 

Balanza analítica



Olla a presión

3.1.3. Reactivos Componentes según Tabla Nº 1 

Extracto de levadura 0.175 g/L de solución



Peptona de caseina 0.35 g/L de solución



K 2HPO4 0.05 g/L



Agar 1 g/L de solución



Glucosa 0.07 g/L



Muestra: Ralstonia E utr opha NRRL B-14690



Fuente de Carbono: Glucosa

[Escriba texto]


3.2.




Fuente de Nitrogeno: Sulfato de amonio



Agua destilada.

Resiembra celular

3.2.1. Materiales 

Aza bacteriológica



Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M.O.

 

Mecheros. Alcohol.


Incubadora

3.3. Medio de activación 3.3.1. Materiales 

Matraz de 125 ml.



2 tubos de ensayo con tapa



Varilla de vidrio



Pipetas de 1, 5, y 10 ml



Pinzas, espátula.



Algodón ,gasa



Guantes

 

Capachos de papel aluminio Mechero Bunsen, trípode y rejilla.

3.3.2. Instrumentos e Equipos [Escriba texto]

“DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR 14690”    

Shaker Balanza analítica pH metro Olla a presión

3.3.3. Reactivos Componentes según Tabla Nº 2 

0.028 g/L de Glucosa



0.02 g/L de extracto de levadura



0.02 g/L de peptona de caseína



0.02 ml/L de K 2HPO4



Alcohol



Ácido ascórbico



Agua destilada

3.4. Medio de fermentación 3.4.1. Materiales 

Matraz de 1 L



Matraces de 125 ml



Espectrofotómetro



Varilla de vidrio



Capachos de papel



Gasa y algodón



Laminillas porta y cubre objeto


Microscopio



Incubadora



pH metro

[Escriba texto]


“DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR 14690” 


Balanza analítica

3.4.3. Reactivos Componentes según tabla Nº 3 

g/L de glucosa



0.02 mg/L de EDTA



10 mL/L de Solución de sales



20 mL/L de Tampón citrato

3.5. Activación celular y desarrollo del inóculo 3.5.1. Materiales 

Matraz de 125 ml.



Algodón



Gasa



Agua destilada



Mecheros.

3.5.2. Instrumentos y Equipos 

Shaker

3.6. Determinación de la cinética de crecimiento de la biomasa 3.6.1. Materiales 

Matraz de 1 L



Tubos de ensayo



Gasa y algodón



Capachos de papel aluminio

3.6.2. Instrumentos y Equipos [Escriba texto]

“DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR 14690”   


Espectrofotómetro pH metro Centrifuga

3.7. Determinación de la cinética de consumo de la fuente de carbono 3.7.1. Materiales 

Viales conteniendo el sobrenadante


Espectrofotómetro

3.7.3. Reactivos 

Glucosa



Agua destilada

3.8. Hidrólisis de la glucosa 3.8.1. Materiales 

Tubos de ensayo con tapa



Tubos de ensayo sin tapa



Fiola de 100ml



Pipetas de 10ml



Vasos de precipitado


Micropipetas



Pera de succión



Baño maría

3.8.3. Reactivos [Escriba texto]

“DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR 14690” 

Solución estándar de glucosa



Hidróxido de glucosa



Ácido clorhídrico



Agua destilada


3.9. Método del DNS (Ácido Dinitrosalicílico) 3.9.1. Materiales 

Vaso de precipitado



Matraz de aforo de 1000ml.



Papel aluminio



Frasquito


Barra magnética



Balanza de platos



Balanza analítica



Agitador calentador

3.9.3. Reactivos 

10g de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)



200 ml/L de NaOH 2N.



300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado.

[Escriba texto]


IV.


CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE

Ralstonia Eutropha NRRL B – 14690

FECHA Actividades

SETIEMBRE 8

- Presentación del preinforme - Preparación de medio de mantención agar nutriente y esterilización. - Resembrado de células en el medio de mantención agar sólido. - Preparación y esterilización del medio rico líquido para inoculo. - Inoculación con asa bacteriológica a medio rico - Esterilización de materiales de vidrio necesario. - Preparación de reactivos DNS. - Obtención de las curvas de calibrado de azúcares reductores DNS (Galactosa). - Determinación de la curva de calibrado de Biomasa. - Preparación de los medios de fermentación y esterilización del medio líquido para cinética de crecimiento microbiano. - Inoculación de medios y seguimiento de la cinética de crecimiento microbiano. - Evaluación y supervisión del medio. - Determinación de las cinéticas de crecimiento, consumo. - Imprevistos - Presentación y sustentación del informe final.

[Escriba texto]

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

OCTUBRE 23

24

25

26

27

28

29

30

1

2

3

x

x

x x x

4

5

6

7

x x x x x x x x x x

x x x x


[Escriba texto]


“DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE Ralstonia eutropha NRRL B14690”

V.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

√ FENTON, D. Solvent treatment for b D galactosidase release from Yeast cells.

Enzyme Microb. Technol. 4: 229-232. 1982. √ CHUNG YJ, HJ CHA, JS YEO and YJ YOO. 1997. Prodcution of poly (3-

hydroxybutyric-co-3-hydroxyvaleric) acid using propionic acid by ph regulation. J Ferment Bioeng 83: 492-495. √ SHIMIZU H, S TAMURA, S SHIVA, KI SUGA. 1993. Kenetic study of poly-D(-)-

3-hydroxybutiricacid(PHB) production and its molecular weigth distribution in a fed-bacth culture of Alcaligenes Eutrophus. J Ferment Bioeng 76:465-469. √ LEE SY.1996. Bacterial poluhydroxyalkanoates. Biotechnol Bioeng 49: 1-49

pág. 31


VI.

ANEXOS

6.1. Cálculos para el medio solido de mantención: Tabla Nº 05 Nutriente

Cantidad (g/l)

Cantidad (g/50ml)


3.5

0.175

Peptona de caseína

7.0

0.35

K 2HPO4

1.0

0.05

Agar

20

1

Glucosa

1.4

0.07

Extracto de levadura 3.5g  1000 ml X  50 ml

X = 0.175 g

Peptona de caseína 7g  1000 ml X  50 ml

X = 0.35 g

K 2HPO4 1g  1000 ml X  50 ml

X = 0.05 g pág. 32


Glucosa 1.4g  1000 ml X 50 ml

X = 0.07 g

Agar 20g  1000 ml X 50 ml

X=1g

6.2. Cálculos para el medio de activación Tabla Nº 06

Nutriente

Cantidad

Cantidad (g/20 ml)

Glucosa

1.4 g/l

0.028


1.0 g/l

0.02

Peptona de caseína

1.0 g/l

0.02

K 2HPO4

1.0 g/l

0.02

Glucosa 1.4g  1000 ml X 20 ml

X = 0.028 g

Extracto de levadura pág. 33


1.0gr  1000 ml X 20 ml

X = 0.02 g

K 2HPO4 1.0gr  1000 ml X 20 ml

X = 0.02 g

Peptona de caseìna 1.0 gr  1000 ml X 20 ml

X = 0.02 gr

6.3. Cálculos para el medio de fermentación Tabla Nº 07

pág. 34

Nutriente

Cantidad (g/l)

Cantidad (g/120ml)

Glucosa

5

0.6

EDTA

20mg/l

2.4 mg

(NH4)2SO4

1.314

0.158

KH2PO4

0.194

0.023

MgSO4.7H2O

0.061

0.0073

FeSO4.7H2O

0.011

0.0013

Solución de sales

10 ml/l

1.2ml

Tampón citrato pH 7

100 ml/l

12ml


Glucosa 5 g 1000 ml X 120 ml

X = 0.6 g

EDTA 20mg  1000 ml X 120 ml

X = 2.4 mg

(NH4)2SO4 1.314g  1000 ml X

120 ml

X = 0.158 g

KH2PO4 0.194g 1000 ml X 120 ml

X = 0.023g

MgSO4.7 H2O 0.061 1000 ml X 120 ml

X =0.0073 g

FeSO4.7H2O pág. 35


0.011g 1000 ml X 120 ml

X = 0.0013g

Solución de Sales 10ml  1000 ml X 120 ml

X = 1.2ml

Tampón Citrato 100 ml  1000 ml X 120 ml

X = 12 ml

6.4. Composición del medio mínimo de cultivo de Ralstonia eutr opha NRRL b-14690 para un crecimiento en biomasa de 1.5 g/l

  Elemento C Mg S N K F P

pág. 36

Peso At. 12 24.3 32.06 14 39.09 55.84 30.97

Peso molecular = 25.242

Compuesto Glucosa MgSO47H2O (NH4)2SO4 KH2PO4 FeSO4.7H2O

Peso At. 180 246.3 132.06 174.1 277.9


Tabla Nº 02 FUENTE

ELEMENTO

% CELULA

% NUTRIENTE

GLUCOSA

C

47,54

40,00

0,5

2,7

4,05

(NH4)2SO4 lim.

N

13,75

21,21

1,54

0,88

1,313

KH2PO4

K

2,75

28,66

10,42

0,130

0,194

KH2PO4

P

2,50

22,78

9,11

0,148

0,22

MgSO4.7H2O

Mg

0,30

9,87

32,91

0,041

0,062

FeSO4.7H2O

Fe

0,11

20,09

182,67

0,007

0,011

Nutr iente L imitante:

Yx/s


A. Cálculo de % Nutriente Peso molecular de la Glucosa C6H12O6 = 6(12)+12(1)+6(16)

Peso molecular del C6H12O6 = 180 Carbono 180 100 % 72 X 40% XX==40% Peso molecular de (NH4)2 SO4 = 2 (18)+32+4(16)

Peso molecular del (NH4)2 SO4 = 132 Nitrógeno 132  100 % 28  X X = 21,21% pág. 37

S (G/L)

S ° (G/L)


Peso molecular de MgSO47H2O = 24.3+32+4(16)+7(18)

Peso molecular del MgSO47H2O = 246.3 Magnesio 246.3  100 % 24.3  X X = 9,87%

Peso molecular de KH2PO4 = 39+2+31+4(16)

Peso molecular del KH2PO4= 136 Fosforo 136  100 % 31  X

X = 22,79%

Peso molecular de KH2PO4 = 39+2+31+4(16)

Peso molecular del KH2PO4= 136 Potasio 136  100 % 39  X

X = 28,67%

Peso molecular del FeSO4.7H2O = 55,84+32,6+4(16)+7(18) Peso molecular del KH2PO4= 278,44 Fierro 278,44  100 % 55,84  X pág. 38


X = 20,09% B. Calculo de:

Yx/s (cambiar el % célula)

Glucosa: C6H12O6 40

Y x / s



Y x / s



47.54

(NH4 )2 SO4:N 21.21 13.75

MgSO47H2O: Mg Y x / s

KH2PO4: P

pág. 39

9.87 

0.30

* 0.6


Y x / s

22.78 

2.50

KH2PO4: K Y x / s

28.66 

2.75

FeSO4.7H2O : Fe Y x / s

20 .09 

C. Calculo de S (g/L)

Glucosa: S

1.35 

0,5

(NH4 )2 SO4: N S

MgSO47H2O: Mg

pág. 40

1.35 

1.54

0,11


S

1.35 

32.91

KH2PO4: P S

1.35 

9.11

KH2PO4: K S

1.35 

10.42

FeSO4.7H2O S

1.35 

182.67

D. Calculo de S° (g/L)

Glucosa: S 0

(NH4 )2 SO4: N pág. 41

= 2,7 *1.5


S 0

= 0,88 *1.5

MgSO47H2O: Mg S 0

= 0,041 *1.5

KH2PO4: P S 0

= 0,148 *1.5

KH2PO4: K S 0

= 0,130 *1.5

S 0

= 0.007 *1.5

FeSO4.7H2O

pág. 42


6.5. Composición del medio mínimo de cultivo de Ralstonia eutr opha NRRL B-14690 (SALES) Tabla Nº 04

Elemento Ca Fe Cu Mn Co Zn

Fuente CaCl2. 2H2O FeSO4. 7H2O CuCl2. 2H2O MnCl2. 2H2O CoCl2. 6H2O ZnSO4. 7H2O

% Cél ula 0.56 0.11 0.56 0.56 0.56 0.56

% Compuesto

Yx/s

27.21 20.09 37.26 33.9 24.76 22.8

48.59 128.64 66.54 60.54 44.21 40.71

Calculo de % Compuesto

Fuente CaCl2. 2H2O PM = 147

Elemento Ca PM=40

X= 27.21 Ca Fuente FeSO4. 7H2O PM = 277.8

Elemento Fe PM=55.8

X= 20.09 Fe Fuente CuCl2. 2H2O PM= 170.54

Elemento Cu PM= 63.54

X= 37.26 Cu pág. 43

S0 (g/L) 3.087 0.821 2.254 2.478 3.39 3.684

S’0 (g/L)

Peso (gr)

4.631 1.232 3.381 3.717 5.085 5.526

1.39 0.37 1.014 1.1151 1.525 1.66


Fuente

Elemento

MnCl2. 2H2O PM = 161.9

Mn PM=54.9

X= 33.9 Mn Fuente

Elemento

CoCl2. 6H2O PM = 237.9

Co PM=58.9

X= 24.76 Co Fuente ZnSO4. 7H2O PM = 287,41

Elemento Zn PM=65,38

X= 22.75 Zn

Cálculo de Yx/s:



CaCl2. 2H2O:



FeSO4. 7H2O:



CuCl2. 2H2O

                

pág. 44




MnCl2. 2H2O

    

CoCl2. 6H2O

      

ZnSO4. 7H2O

      Calculo de So :



CaCl2. 2H2O:



FeSO4. 7H2O:



CuCl2. 2H2O

pág. 45

             


     

MnCl2. 2H2O

     

CoCl2. 6H2O

     

ZnSO4. 7H2O

      Calculo de S´0 :



CaCl2. 2H2O:



FeSO4. 7H2O:

       



CuCl2. 2H2O

 pág. 46


MnCl2. 2H2O



     CoCl2. 6H2O



 ZnSO4. 7H2O



 6.6. CONFECCIÓN DE LOS CAPACHOS Se corta el papel aluminio en forma cuadrada, de tal manera que pueda ser suficientemente grande como para cubrir el molde el cual se desea confeccionar. Luego el papel aluminio que se ha cortado se coloca encima del molde y se empieza a dar forma de éste. Luego de haberse realizado el moldeado se procede a sacar del molde. Posteriormente de haber realizado el procedimiento anterior, ya no se puede manipular directamente, sino que debe hacerse por medio de pinzas.

6.7. CONFECCIÓN DEL TAPÓN PARA MATRACES Para confeccionar este tapón se cortará un pedazo de gasa, el cual debe de ser doble para obtener una buena consistencia del tapón. Luego este pedazo de seda es colocado perpendicularmente en la boca del matraz. pág. 47


Después se hundirá con algodón hasta que cubra todo el cuello del matraz, pero este llenado deberá ser a presión para que no deje entrar mucho aire, sólo el necesario para el microorganismo Luego de haber culminado se realizarán los nudos respectivos para sujetar el algodón y así impedir su caída, pero también servirá para poder manipular los matraces a través de estos nudos.

6.8. ESTERILIZACIÓN DE PIPETAS Se lavan las pipetas con cuidado y se dejan secar por un lapso de tiempo. Después se colocará algodón la boquilla de la pipeta, cuidando de no presionarse mucho ya que cumplirá la función de un filtro. Luego de haber realizado este procedimiento se agrupan las pipetas y al mismo tiempo envolverlas con papel aluminio, tratando de cubrir todas las pipetas y marcando la sección en donde está colocado el filtro de la pipeta para que así al manipularlas no se contaminen. Se introducirán las pipetas a la estufa a 120 C por 2 horas. Pasado este tiempo se sacarán de la estufa, pero cuidando de no desenvolver las pipetas, para evitar su contaminación.

pág. 48

Pre Info Final I Unidad

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