PRACTICA No 6 BALANCE DE FERMENTACIÓN. PARTE 1 1. OBJETIVO Realizará el balance óxido-reducción durante el proceso de fermentación. Discutirá y evaluará el significado de dicho balance para la célula microbiana. 2. INTRODUCCIÓN La palabra fermentación proviene del latín que significa hervir. Éste proceso se remonta desde la prehistoria, además de la producción de alcohol o bebidas alcohólicas, la palabra fermentación se aplica a cualquier proceso en el cual los microorganismos (bacterias, hongos, mohos, levaduras) actúan sobre una gran variedad de sustancias para conservar la carne, quesos, mantequilla, yogur, etc. Se utiliza asimismo en la producción de antibióticos, vitaminas y muchos materiales químicos importantes impor tantes para la industria. El primer investigador que estudió este proceso fue L. J. Thenard en 1803en donde observó que la fermentación se debía a las levaduras. Más tarde en 1878, Wilhem Kuhne dio nombre de enzimas a los fermentos que catalizaban la reacción. Posteriormente en 1856 Louis Pasteur estudió la pasteurización de vinos y cervezas como medio para evitar la descomposición y en 1897 Hans y Edward Buchner estudiaron la fermentación de los carbohidratos en extractos libres de células. En presencia de oxígeno, aumenta la respiración y disminuye disminu ye la fermentación; sucediendo lo contrario en procesos de anaerobiosis, a éste efecto se le llama Efecto Pasteur. Cuando las levaduras actúan para convertir los carbohidratos en etanol, usan básicamente las mismas reacciones de la glucólisis, la principal diferencia es el modo como metabolizan el ácido pirúvico, al cual descarboxilan formando acetaldehído y requiriendo Mg+2 y pirofosfato de tiamina en la célula. Posteriormente el acetaldehído es reducido por una deshidrogenasa alcohólica que utiliza NADH + H+ como coenzima formando etanol. Los balances estequiométricos en procesos de fermentación son esenciales para su entendimiento y/o aplicación. El cálculo de flujos metabólicos resulta fundamental en los estudios cuantitativos en fisiología celular 3. MATERIAL Y EQUIPO Agitador mecánico Balanza granataria Baño maría Bulbos y Pipetas Pasteur Centrífuga clínica Centrífuga refrigerada Gradillas Jeringas de 1 mililitro de aguja larga Matraces para la fermentación Matraces volumétricos de 10 y 100 mililitros Mecheros tipo Fisher Pipetas de 1, 2.5 y 10 mililitros Probetas de 25 y 100 mililitros Parafilm Tapones de hule
Tubos de ensayo de 16 por 150 mm Material biológico: Levadura comercial (Saccharomyces cerevisiae)
4. REACTIVOS Ácido tricloroacético al 10% Agua destilada Glucosa 2 M Hidróxido de potasio al 10% Cloruro de Bario al 5% Regulador de fosfatos de 50 mM pH 6.8 Suspensión de levaduras al 30% v/v 5. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA OBTENCIÓN DE LA SUSPENSIÓN CELULAR. 1. Resuspender tres gramos de levadura en 10 mililitros de medio YPG e incubar 30 minutos a 28°C. 2. Las células se lavan de 6 a 8 veces con agua destilada por centrifugación y se recupera el paquete celular que se resuspende en el regulador de fosfatos hasta obtener una concentración final del 30% v/v. PROCESO DE FERMENTACIÓN. 1. En un matraz de 50 ml, se colocan 24 ml de suspensión celular y 12 ml de regulador de fosfatos (véase la tabla indicada) y se realiza una conexión como se muestra en la figura de abajo, los matraces deben estar conectados herméticamente durante 5 minutos a 32°C.
Suspensión de levadura
CONDICIÓN 48 ml de suspensión celular sin glucosa 48 ml de suspensión celular con Glucosa 2 M 48 ml de suspensión celular con Glucosa 2 M con 1 mililitro de solución de cloruro de mercurio 100 mM
Solución de Cloruro de Bario
48 ml de suspensión celular con Glucosa 2 M con 1 mililitro de solución de fluoruro de sodio 100 mM 2. Después de los cinco minutos de incubación, se inyecta 12 mililitros de solución de glucosa 2 M y se incuban a la misma temperatura. 3. Después de 30 minutos el proceso de fermentación se detiene agregando a la mezcla se mezcla 600 microlitros de ácido tricloroacético concentrado y se continúa la incubación 15 minutos más. 4. Checar el pH de la solución y si es necesario neutralice con KOH al 10% y se lleva a un volumen final de 100 mililitros con agua destilada. USE MATRACES VOLUMÉTRICOS O AFORADOS A partir de ésta mezcla de fermentación recuperada (muestra fermentada) se determina ETANOL Y GLUCOSA RESIDUAL de la siguiente práctica.
6. INFORME Mencione otros tipos de fermentación Como realizaría Usted un proceso fermentativo a nivel industrial Cuál es la enzima ausente en el ser humano que metaboliza el ácido pirúvico a acetaldehído 7. BIBLIOGRAFÍA J. Hicks, J. Bioquímica Editorial McGraw-Hill Interamericana. 2001. México, D. F. Rose, A. H. 1976. Energy Yielding metabolism: Chemical Microbiology, 3a Ed. Sutterworths. Boston. pp. 187-188 y 208-214 Sokatch, J. R. 1969. Fermentation of sugars. En: Bacterial physiology and metabolism. Academia Press London. pp. 72-74
PRACTICA No. 7 BALANCE DE FERMENTACIÓN. PARTE 2 1. OBJETIVO Determinará la cuantificación de etanol y bióxido de carbono producidos en el proceso cuantitativo de la fermentación con los productos obtenidos de la sesión anterior 1. INTRODUCCIÓN Dos productos resultantes en el proceso de la fermentación son el alcohol etílico y el bióxido de carbono. La medición del contenido de alcohol es de capital importancia en el proceso de elaboración de vinos debido fundamentalmente a dos motivos. Normalizar el producto en cuanto a sus características y sus componentes indicada en la etiqueta y el origen fiscal, ya que el vino, como toda bebida alcohólica, está sujeto a pago de impuesto y por tanto el fabricante debe ser cuidadoso en el manejo de este componente para evitar sufrir penalizaciones. Sin embargo, debe tenerse en consideración que en elaboraciones artesanales y principalmente en las caseras, la determinación de alcohol resulta de menor importancia que en las elaboraciones industriales y sólo estará en función de la legislación establecida en cada país. Existe un buen número de metodologías diseñadas para la medición de alcohol (etanol) en el vino tradicional y en el vino de frutas, pero la principal y más universalmente extendida es la técnica densimétrica. Ésta se basa en la determinación de la densidad de una solución hidroalcohólica obtenida previamente por destilación del vino. La densidad puede ser medida a través de diversos instrumentos que el analista seleccionará según su conveniencia. Entre ellos están el hidrómetro, alcoholímetro, picnómetro y el ebullómetro. Hay otras metodologías para la determinación de alcohol como la cromatografía gas líquido, la enzimática donde el etanol se puede oxidar a acetaldehído por el NAD en presencia de la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) para producir NADH. El NADH producido se determina espectrofotométricamente a 334, 340 o 360 nm dependiendo de la concentración de etanol. Otra metodología es utilizando bicromato de potasio donde el etanol lo reduce a acetaldehído y posteriormente a ácido acético reduciendo el cromo VI a cromo III determinándolo espectrofotométricamente. El bióxido de carbono se puede determinar volumétricamente y gravimétricamente usando reacciones de precipitación a carbonatos insolubles. 3. MATERIAL Y EQUIPO Agitador mecánico Balanza analítica Balanza granataria Baño maría Bulbos y pipetas Pasteur Bomba de vacío Cajas Conway y placas de vidrio Centrífuga clínica Centrífuga refrigerada Desecador
Embudos Buchner Estufa de 60°C Espectrofotómetro y celdas para el mismo Gradillas Hielo picado Matraces Erlenmeyer de 125 mililitros Matraces kitasato de 500 mililitros Matraces volumétricos de 10 y 100 mililitros Mecheros tipo Fisher Papel Whatman No. 1 Desecados Pipetas de 1, 2.5 y 10 mililitros Probetas de 25 y 100 mililitros Tubos de ensayo de 16 por 150 mm Vaselina sólida neutra
4. REACTIVOS Ácido tricloroacético al 10% Agua destilada Agua destilada libre de CO2 Antrona al 0.2% en H2SO4 Solución saturada de Carbonato de potasio Dicromato de potasio 14 mM en H2SO4 de 46-49% Etanol absoluto Etanol a una concentración de 1500 microgramos por mililitro Glucosa 100 miligramos/ mililitro 5. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA DETERMINACIÓN DE ETANOL El etanol producido se cuantifica por el método de Conway, como se indica a continuación: En cajas Conway (ver esquema correspondiente), se coloca una cantidad de vaselina sólida sobre el borde externo y 2 mililitros de solución de K 2Cr 2O7 en la cámara central. En la cámara externa se colocan alícuotas de la muestra y se completa a un mililitro con agua destilada. Se adicionan 2 mililitros de carbonato de potasio saturado y se sella inmediatamente la tapa. Se mezcla con ligeros movimientos de inclinación de la caja y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Al término de la incubación se recupera cuantitativamente el Dicromato de potasio y se afora a 10 mililitros con agua destilada. Se lee absorbencia a 445 nm contra agua destilada. Se realiza una curva de calibración de 0 a 1500 microgramos de etanol.
Cámara central (K 2Cr 2O7) Vaselina
Cámara externa (Muestra, agua y carbonato saturado)
VISTA LATERAL VISTA FRONTAL
CÁMARA CONWAY
DETERMINACIÖN DE GLUCOSA RESIDUAL Una vez que se retiran las alícuotas para la cuantificación de etanol, parte de la muestra se centrífuga en tubos Eppendorf de 1.5 mililitros y se rescata el sobrenadante que debe ser transparente. Después de haber llevado a cabo la dilución conveniente de cada sobrenadante (según la concentración inicial de glucosa), se pasan diferentes alícuotas a tubos de ensaye de 16 x 150 mm y se lleva a 1 mililitro con agua destilada. Los tubos se sumergen en un baño de hielo hasta que adquieran la temperatura del baño y se les adiciona 2 mililitros del reactivo de Antrona fría despacio (¡Cuidado, puede proyectar la mezcla). Se mantienen los tubos en hielo y para el desarrollo de la reacción colorida, los tubos se mezclas vigorosamente (Mucha precaución) hasta obtener una solución homogénea y luego se someten a calentamiento en un baño de agua a ebullición durante 10 minutos. Se dejan enfriar a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a 620 nm contra un blanco de reactivos. Siguiendo el protocolo anterior, se efectúa una curva de calibración de 0 a 100 microgramos de glucosa, usando una solución tipo de glucosa de 100 microgramos por mililitro. DETERMINACIÓN DE CO2 POR GRAVIMETRÍA La solución de cloruro de bario se filtra al vacío. Se hacen dos lavados de dicho matraz con agua destilada libre de CO2 y se le agregan a la muestra transferida. El precipitado se lava con acetona al 50% y luego con acetona pura. El papel con la muestra se deseca en una estufa a 60°C durante 20 a 24 horas y posteriormente se pesa.
6. RESULTADOS CURVA TIPO ETANOL Microgramos de Etanol 0 (1 ml de agua)
Absorbancia a 445 nm
150 (100 microlitros de Etanol de 1500 +900 microlitros de agua) 300 600 900 1200 1500 DETERMINACIÓN DE ETANOL FORMADO EN LA FERMENTACIÓN Muestras Absorbancia a 445 nm 0.1 mililitros de muestra fermentada 0.5 mililitros de muestra fermentada 1 mililitro de muestra fermentada Estos valores se obtienen al efectuar la lectura de absorbencia contra agua destilada. CURVA TIPO DE GLUCOSA Microgramos de glucosa Absorbancia a 620 nm 0 10 20 30 40 50 60 90 DETERMINACIÓN DE GLUCOSA RESIDUAL DE LA FERMENTACIÓN Muestras Absorbancia a 620 nm sobrenadante diluido 1:10 sobrenadante diluido 1:100 sobrenadante diluido 1:1000 sobrenadante diluido 1:10000 sobrenadante diluido 1:1000 + Inhibidor 1 sobrenadante diluido 1:1000 + Inhibidor 2 Los valores de absorbencia se obtienen al efectuar la lectura contra un blanco de reactivos. DETERMINACIÓN DE CO2 Muestras Papel filtro Papel filtro + BaCl2 BaCl2 de fermentación Papel filtro testigo Papel filtro + BaCl2 testigo
Peso en gramos (g)
BaCl2 testigo Papel filtro + BaCl2 + Inhibidor 1 BaCl2 Inhibidor 1 Papel filtro + BaCl2 + inhibidor 2 BaCl2 Inhibidor 2
7. CÁLCULOS Calcule la cantidad de etanol formado en la fermentación (en mg /10 mililitros de muestra) Calcule la cantidad de azúcar residual y de azúcar fermentado (en mg / 10 mililitros de muestra) Calcule la cantidad de CO2 formado a partir del peso de BaCO3 obtenido (en miligramos) Convierta a unidades molares los miligramos de glucosa fermentada y los miligramos de productos formados Haga el balance de carbonos y el balance óxido-reducción 8. INFORME Discuta y evalúe el significado del balance de fermentación que obtuvo en su equipo sobre la base de los antecedentes
9. BIBLIOGRAFÍA J. Hicks, J. Bioquímica Editorial McGraw-Hill Interamericana. 2001. México, D. F. Rose, A. H. 1976. Energy Yielding metabolism: Chemical Microbiology, 3a Ed. Sutterworths. Boston. pp. 187-188 y 208-214 Sokatch, J. R. 1969. Fermentation of sugars. En: Bacterial physiology and metabolism. Academia Press London. pp. 72-74.
PRACTICA No. 8 MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO SINTASA (GlcN-6-P-sintasa) EN LEVADURAS. PARTE 1 1. OBJETIVO Determinar aminoazúcares por el método de Elson-Morgan y proteínas por el método de Bradford para el cálculo de la actividad específica de la enzima GlcN-6-P sintasa. 2. INTRODUCCIÓN La Glucosamina-6-fosfato sintasa (L-glutamina: D-fructosa-6-fosfato amidotransferasa; EC 2.6.1.16; GlcN-6-P sintasa) cataliza el primer paso de la biosíntesis de hexosaminas, convirtiendo la fructosa-6-fosfato a glucosamina-6-fosfato usando glutamina como donador de amonio. En eucariotas hay tres reacciones que convierten glucosamina-6-fosfato a uridina-5-difosfo-N-acetil-D-glucosamina, un precursor de biomacromoléculas que contienen aminoazúcares en hongos, bacterias y mamíferos tales como glicoproteínas y quitina. La glucosamina-6-fosfato sintasa y la quitina sintasa catalizan el primer y último paso de las reacciones para la síntesis de quitina. La glucosamina-6-fosfato sintasa es una enzima que se ha propuesto como blanco en la quimioterapia antifúngica y como resultado de éstas investigaciones, numerosos inhibidores de la glucosamina-6-fosfato sintasa han sido descritos. La actividad de la ruta de las hexosaminas incrementada es importante en los hongos durante los cambios morfológicos, en la síntesis de quitina y manoproteínas ambos son esenciales como componentes en la pared celular del hongo y también involucra las interacciones entre el hongo y su hospedero. 3. MATERIAL Y EQUIPO Perlas de vidrio Homogenizador MSK Braun Centrífuga Ultracentrífuga Tubos para centrífuga Baño metabólico Pipetas Pasteur Micropipetas Tubos de ensayo Gradillas. 4. REACTIVOS Regulador de fosfato de potasio 25 mM pH 6.5 Anhídrido acético al 5% (prepararse en el instante) Solución saturada de bicarbonato de sodio Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9 P-Dimetilaminobenzaldehído (PDMB) HCl 0.1 M Ácido acético glacial Levadura de panificación Reactivo de Bradford Glucosamina 1 mg/ml
BSA 100 mg/ml (albúmina sérica bovina)
5. DESARROLLO *Las concentraciones que se indican de fructosa-6-fosfato, L-Glutamina, EDTA y DTT es la concentración final en el regulador de fosfato *Reactivo de Ehrlich: por cada tubo necesario para la reacción lleva 25 microlitros de ácido clorhídrico, 3 mililitros de ácido acético glacial y 0.03 gramos de PDMB. PREPARACIÓN DE LA FRACCIÓN ENZIMÁTICA. Se trabajará con tres cultivos de Saccharomyces cerevisiae con dos diferentes concentraciones de rojo congo 0.001%, 0.01% y 0.1%, además de un control (sin rojo congo) un día antes de la práctica. Filtrar por medio del equipo Millipore los medios de cultivo donde se encuentra el hongo y recuperar las pastillas de cada matraz. Colocar cada pastilla del hongo en un tubo de vidrio y agregar dos volúmenes de perlas de vidrio y un volumen determinado de regulador todo bajo condiciones de 4°C (en hielo) Homogenice por 20 minutos, 2 minutos homogenizando por 30 segundos de descanso. Recupere el homogenado celular aspirando con una pipeta Pasteur y centrifugarlo a 10,000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Recupere el sobrenadante y manténgalo en hielo. Medir la concentración de proteína y usar esta fracción como fuente de enzima. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE BRADFORD Microlitros de Absorbencia a 595 Microlitros de agua proteína nm 0 100 5 95 10 90 Reactivo de 25 75 Bradford 1 50 50 mililitro a todos los tubos 75 25 100 0 Problema 1:10 Problema 1:100 Problema 1:1000 CURVA DE CALIBRACIÓN PARA EL MÉTODO DE ELSON-MORGAN Tomar 300 microlitros de agua y agregue 50 microlitros de anhídrido acético al 5% y 50 microlitros de solución saturada de bicarbonato de sodio e incubar 3 minutos. Calentar la muestra durante tres minutos en agua hirviendo y posteriormente enfriar en hielo. Mezclar las muestras acetiladas con 100 microlitros de Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9 y hervir durante tres minutos. Enfriar en hielo. Agregar 3 mililitros de reactivo de Ehrlich. Incubar durante 20 minutos a 37°C. Leer la absorbencia de las muestras a 585 nm.
Microgramos de Glucosamina-6 fosfato 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Absorbancia a 585 nm
6. RESULTADOS Haga una gráfica para proteína y otra para la glucosamina de absorbencia contra concentración para determinarla en la muestra problema. 7. INFORME Mencione otros métodos para determinar proteína Mencione algunos inhibidores de la enzima Glucosamina-6-fosfato sintasa y quitina sintasa. 8. BIBLIOGRAFÍA J. Smith, Rachel; Milewsky, Slawomir; J. P. Brown, Alistair and W. Gooday, Graham. Isolation and Charaterization of the GFA1 Gene encoding the glutamine: Fructosa-6-fosfato amidotransferase of Candida albicans. Journal of Bacteriology, Vol. 178, No. 8. Apr. 1996, p 2320-2327 González-Ibarra, J; Milewsky, Slawomir; Villagómez-Castro, Julio-César; Cano-Canchola, C; López-Romero, E. Sporothrix schenckii: Purification and partial biochemical characterization of the glucosamine-6-phosphate synthase, a potential antifungal target. Medical Mycology. 2009, p 1-12
PRACTICA No. 9 MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO SINTASA (GlcN-6-P-sintasa) EN LEVADURAS. PARTE 2 1. OBJETIVO Determinar la actividad catalítica de una enzima esencial en el metabolismo de eucariotas y procariotas. 2. MATERIAL Y EQUIPO Perlas de vidrio Homogenizador MSK Braun Centrífuga Ultracentrífuga Tubos para centrífuga Baño metabólico Pipetas Pasteur Micropipetas Tubos de ensayo Gradillas. 3. REACTIVOS Regulador de fosfato de potasio 25 mM pH 6.5 Fructosa-6-fosfato 15 mM L-Glutamina 10 mM EDTA 1 mM DTT 1 mM Anhídrido acético al 5% (prepararse en el instante) Solución saturada de bicarbonato de sodio Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9 P-Dimetilaminobenzaldehído HCl 0.1 M Ácido acético glacial Levadura de panificación Reactivo de Bradford Glucosamina 1 mg/ml BSA 100 mg/ml (albúmina sérica bovina) 4. DESARROLLO Las concentraciones que se indican de fructosa-6-fosfato, L-Glutamina, EDTA y DTT es la concentración final en el regulador de fosfato Reactivo de Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehído al 1% en HCl 0.1 M en ácido acético glacial). DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO
En un tubo coloque un mililitro de la mezcla de regulador de fosfato con las concentraciones indicadas de fructosa-6-P, L-Glutamina, EDTA y DTT y la cantidad de extracto que contenga una cantidad de proteína de 0.15 a 1.5 mg /ml. Prepare una adicional que no contenga glutamina, en su lugar agregue regulador de fosfato. Una vez que agregue el extracto celular incube a 30°C por 30 minutos y luego un minuto en agua hirviendo para parar la reacción. Enfriar a temperatura ambiente. Medir la cantidad de Glucosamina-6-fosfato por el método de Elson-Morgan. MÉTODO DE ELSON-MORGAN Tome 300 microlitros de la mezcla y agregue 50 microlitros de anhídrido acético al 5% y 50 microlitros de solución saturada de bicarbonato de sodio e incubar 3 minutos. Calentar la muestra durante tres minutos en agua hirviendo y posteriormente enfriar en hielo. Mezclar las muestras acetiladas con 100 microlitros de Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9 y hervir durante tres minutos. Enfriar en hielo. Agregar 3 mililitros de reactivo de Ehrlich. Incubar durante 20 minutos a 37°C. Leer la absorbancia de las muestras a 585 nm.
5. RESULTADOS Consultar como se calcula la actividad específica de la enzima y calcúlela para las muestras problema. 6. BIBLIOGRAFÍA J. Smith, Rachel; Milewsky, Slawomir; J. P. Brown, Alistair and W. Gooday, Graham. Isolation and Charaterization of the GFA1 Gene encoding the glutamine: Fructosa-6-fosfato amidotransferase of Candida albicans. Journal of Bacteriology, Vol. 178, No. 8. Apr. 1996, p 2320-2327 González-Ibarra, J; Milewsky, Slawomir; Villagómez-Castro, Julio-César; Cano-Canchola, C; López-Romero, E. Sporothrix schenckii: Purification and partial biochemical characterization of the glucosamine-6-phosphate synthase, a potential antifungal target. Medical Mycology. 2009, p 1-12.
PRACTICA No. 10 ACTIVIDAD PARCIAL DE ORNITINA DESCARBOXILASA EN SEMILLAS 1. OBJETIVO Determinar la actividad de ornitina descarboxilasa de manera parcial en semillas de frijol germinado. 2. INTRODUCCIÓN La Ornitina descarboxilasa (ODC, E.C. 4. 1. 1. 17) es una enzima altamente regulada que cataliza el primer paso limitante para la producción de poliaminas, transformando la ornitina a putrescina y posteriormente a espermidina y espermina. La ODC es una de las enzimas más reguladas en organismos eucariotas, es inducida por diferentes activadores del crecimiento y suprimida por inhibidores específicos o por mutaciones que inhiben el crecimiento celular y la transformación. También puede ser inducida por otros estímulos, tales como el tratamiento hipotónico o estímulos que inducen la diferenciación celular. La ODC es una enzima de alto recambio cuya vida media usualmente está en el orden de entre algunos minutos a una hora. Este recambio está sujeto a cambios marcados dependiendo de las condiciones celulares, indicando que su degradación también es regulada. También está regulada la ODC bajo control negativo por las poliaminas, ya que si son agregadas exógenamente no solo inhiben la síntesis de ODC sino que también provocan un rápido decaimiento en su actividad. La degradación de la ODC es acelerada por las poliaminas lo cual es confirmado al seguir el decaimiento de la ODC marcada con anticuerpos. Las poliaminas ejercen dos acciones de supresión en la ODC, una sobre la síntesis de la ODC y la otra sobre la inducción de una proteína que posee un rápido recambio denominada antienzima, cuya síntesis es inducida por una exposición a un exceso de poliaminas y se une a la ODC con gran afinidad inhibiendo su actividad. En forma resumida, los tres mecanismos que modulan negativamente a la ODC por las poliaminas son: a) Supresión traduccional de la síntesis, b) aceleración de su degradación y c) la inducción de la antienzima. 3. MATERIAL Y EQUIPO Homogenizador Potter Hielo picado Pipetas Pasteur Micropipetas Matraces especiales Tapas para los matraces especiales
Jeringa con aguja Cuadros de papel filtro Baño metabólico 4. REACTIVOS Regulador de Tris-HCl 100 mM pH 7.5 adicionado con EDTA 1 mM, DTT 2 mM y PLP 0.2 mM Semillas de frijol sin germinar y germinadas Hidróxido de potasio 5 M Ácido clorhídrico 1 M Agua destilada libre de CO2 Inhibidores 2 mM Cloruro de bario al 5% en agua libre de CO2 5. DESARROLLO SE USARAN SEMILLAS GERMINADAS Y SIN GERMINAR Muela las semillas de una por una en un mortero congelado en presencia de hielo y agregue un determinado volumen de regulador compuesto de acuerdo a la cantidad de semillas que tenga. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ODC La actividad de ODC de la muestra se determinó midiendo la liberación de CO2 gravimétricamente usando solución de cloruro de bario para su cuantificación. Se coloca en matraces Erlenmeyer especiales en su compartimento exterior 200 microlitros de extracto de semilla y 100 microlitros de inhibidor (MGBG, Ornitina, Putrescina y DAB) a una concentración de 6 mM final (deje un matraz sin inhibidor como blanco) y en el compartimiento interno se coloca un pedazo de papel filtro (1x1.5 cm) impregnado con 45 microlitros de KOH 5M. Se tapa inmediatamente y se deja incubando a 37°C por 90 minutos. La reacción se detuvo inyectando a través del tapón de hule 100 microlitros de HCl 1 M en el compartimento exterior. PRECAUCIÓN NO TOQUE EL PAPEL FILTRO CON EL HCl. Se dejan incubando toda la noche para permitir que el CO2 liberado reaccione con el KOH. DETERMINACIÓN DE CO 2 POR GRAVIMETRÍA La muestra del vaso central que queda después de la fermentación se transfiere cuantitativamente sobre 20 mililitros de BaCl 2 al 5%, contenidos en un matraz Erlenmeyer de 125 mililitros. Se hacen dos lavados de dicho vaso central con agua destilada libre de CO 2 y se le agregan a la muestra transferida. El precipitado de carbonato de bario que se forma por filtración a través de papel filtro Whatman No. 1 de peso conocido. El precipitado se lava con acetona al 50% y luego con acetona pura.
El papel con la muestra se deseca en una estufa a 60°C durante 20 a 24 horas y posteriormente se pesa. 6. RESULTADOS Determinación de CO2 Muestras
Peso en gramos (g)
Papel filtro Papel filtro + BaCO3 blanco Papel filtro + BaCO3 inhibidor 1 Papel filtro + BaCO3 inhibidor 2 Papel filtro + BaCO3 inhibidor 3 Papel filtro + BaCO3 inhibidor 4 7. INFORME A que nivel afectan a la ODC los distintos inhibidores que usó en la práctica. 8. BIBLIOGRAFIA Arteaga-Nieto, P; López-Romero, E; Terán-Figueroa, Y; Cano-Canchola, C; Luna-Arias, J. P.; Flores-Carreón, A. Entamoeba histolytica: Purification and characterization of Ornithine decarboxylase. Experimental Parasitology 101 (2002), pp-215-222 Macias-Segoviano, J. I. Papel de las poliaminas en el desarrollo de Sclerotium cepivorum . Tesis de maestría. 2004.
