6. ANÁLISIS DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA J. Pacheco A.
Introducción La electroforesis se ha convertido en la técnica más utilizada para la separación y caracterización de moléculas de ácidos nucleicos. Los soportes mas utilizados en este procedimiento son la agarosa y la poliacrilamida, dependiendo su elección del tamaño de las moléculas a separar. Moléculas por debajo de los 500 pares de bases (pb) son generalmente resueltas con mayor claridad en geles de poliacrilamida. En agarosa pueden pueden separarse separarse moléculas DNA de miles de pb. La agarosa es un polisacarido natural que se obtiene principalmente de algas marinas. Es capas de formar geles con rigidez suficiente para ser manipulados a partir del 0,2 % la agarosa no polimeriza al melificar si no que simplemente sufre un cambio de estado, por lo que la variabilidad de la polimerización de la poliacrilamida desaparece. Para formar los geles, la agarosa agarosa sólida es disuelta en tampón tampón TB 0,5X por calentamiento el punto punto de fusión de la agarosa ordinaria esta alrededor alrededor de los 80°C . sin embargo, la agarosa no gelifica por debajo de unos 45°C.
La movilidad del DNA en los geles de agarosa puede considerarse dependiente del molécula choca con efecto tamiz de las fibras del gel, ya que cada vez que una molécula una fibra del gel es retenida. El tamaño de la malla depende de la concentración de la agarosa . En términos generales puede decirse que a mayor concentración mayor resistencia al avance de la muestra sin embargo embargo la linealidad solo se mantiene mantiene en un margen estrecho de concentraciones concentraciones perdiéndose en valores
extremos,
especialmente a concentraciones altas de agarosa.
La electroforesis en gel puede ser usada para determinar el tamaño de las moléculas del DNA debido a la variabilidad de experimento a experimento, es necesario introducir patrones de tamaño conocido en cada gel que luego nos permitirá determinar el tamaño del DNA problema.
Objetivo: Analisis de ADN a través de electroforesis electroforesis en gel de agarosa. agarosa.
Reactivos: -
buffer TAE 50x
-
buffer sample
-
Agarosa
Preparacion del gel de agarosa al 1.5 % Pesar
750 mg de agarosa y disolverlos con 50 ml de buffer TAE 1X
en un
erlenmeyer de 200 ml de capacidad, calentarlo hasta una ebullición para lograr una disolución completa. Enfriar hasta aproximadamente 45 °C, añadir 1 ul de Bromuro de etidio y vaciar sobre un vidrio (como se muestra en la figura 2) y en posición horizontal. colocar luego una peineta para formar los pocillos y dejar enfriar durante 30 minutos. DIBUJE EL PROCEDIMIENTO DE LA PREPARACION DEL GEL
Electroforesis y visualisacion del DNA -
Colocar el gel dentro de la cubeta de electroforesis, y cubrir con TAE- 1X
-
Con mucho cuidado colocar en los pocillos 20 ul de DNA mezclado previamente
con tampón de muestra (Loading Buffer ). -
En uno de los pocillos colocar un muestra de DNA patron.
-
Conectar la cubeta a una fuente de poder y aplicar una potencia de 100 V
-
Terminada la electroforesis retirar el gel y observar en un cuarto obscuro por
transiluminación con lampara Ultra-violeta.
RESULTADOS: Esquematize las partes del gel de agarosa en donde se observan as bandas e indicar el tamaño de las bandas del ADN Muestra, usando como referencia la curva de PM elaborado con el DNA marcador. Para hacer la curva de PM: plotear en un papel semi logarítmico la distancia recorrida por la banda (mm) vs el, PM de dicha banda. El marcador de peso molecular es el de 100pb (100 bp DNA Ladder - Life Technologies), es decir cada banda mide 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 , etc pb
Medida de las concentración del ADN. La concentración de ADN y ARN debe ser determinada midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro. Para mayor precisión, las lecturas de absorbancia a 260 nm debe estar entre 0,15 y 1,0. ADN puro tiene una relación A260/A280 de 1,8-2,0 en Tris 10 mM · HCl, pH 8,5. Absorbancia a A280 fuerte que resulta en una baja relación A260/A280 indica la presencia de contaminantes, tales como proteínas. Absorbancia fuerte a 270 nm y 275 nm puede indicar la presencia de contaminación de fenol.
La absorbancia a 325 nm sugiere la contaminación por partículas en la solución o cubetas sucias.
Conversiones espectrofotométricas de la absorbancia a 260 nm A260 unit
Concentration (µg/ml)*
dsDNA
50
ssDNA
33
Oligonucleotides
20 –30
Procedimiento: En un tubo que contiene 1 ml de agua destilada pura, colocar 10 ul de la solución de ADN, mezclar y vaciar a una cubeta de espectrofotometría y medir su absorbancia a 260 y a 280 nm. Hacer los cálculos para determinar la concentración de ADN
CUESTIONARIO: 1. Cuantas bandas de DNA se observan en el carril del marcador?
2. Indique las diferencias de Teñir el gel con Azul de metileno y teñir con BrEt?
3. Que otro método se utiliza para visualizar el DNA?
4. Que es DNA Genómico?
5 cual es la concentración (ug/ul) de ADN encontrada
5.
Comente el índice encontrado 260/280 para su muestra de ADN
