Universidad Santiago de Chile Facultad de Ingeniería Química Ingeniería en Biotecnología
EXTRACCIÓN EXTRACCI ÓN DE ARN TOTAL TOTAL Y VISUALIZACIÓN EN ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA.
NOMBRE Lissette Riveros u!iga CURSO Biología molecular FEC"# $%&$$&'($) *ROFESOR Se+asti,n Re-es Cer.a
IN/RO0UCCI1N *or su com.osici2n3 .uede de4inirse 5uímicamente como un .olirri+onucle2tido de adenina3 guanina3 citosina - uracilo6 # esta di4erencia 5uímica con el #0N3 ha- 5ue a!adir 5ue su estructura molecular es monocatenaria3 es decir3 5ue se trata de una sola cadena de nucle2tidos unidos .or enlaces 4os4odi7ster en sentido 89 :; %9 - siem.re de menor tama!o 5ue el #0N6<$= E>isten % ti.os de #RN? el #RN mensa@ero es el 5ue se encuentra en menor .ro.orci2n
istentes se+asan en la r,.ida inactivaci2n de dichas enimas6 <%= *ara la e>tracci2n de ,cidos nucleicos e>isten .rocedimientos descritos .or autores como *4annenstiel et al6 <$H(=3Chomc-nsi - Sacchi <$H=3 *all,s et al6 <$H=3 Jang et al6<$'=3 - Lee <$8=6<8= El m7todo de Chomc-nsi - Sacchi3 en el cual el .rinci.io en la +ase del m7todo es 5ue el #RN se se.ara del #0N des.u7s de la e>tracci2n con una soluci2n ,cida5ue contiene tiocianato de guanidina 3 acetato de sodio 3 4enol - cloro4ormo 3 seguido .or centri4ugaci2n6 En condiciones ,cidas3 el #RN total .ermanece en la 4ase acuosa su.erior3 mientras 5ue la ma-oría del #0N - las .roteínas
.ermanecen -a sea en la inter4ase o en la .arte in4erior4ase org,nica6 El #RN total se recu.era a continuaci2n .or .reci.itaci2n con iso.ro.anol - se .uede utiliar .ara varias a.licaciones6 El original .rotocolo3 lo 5ue .ermite el aislamiento de #RN a .artir de c7lulas - te@idos en menos de ) horas3 avanado enormemente el an,lisis de la e>.resi2n g7nicaen modelos de animales - .lantas3 así como en las muestras .atol2gicas6 <%= Una t7cnica e4iciente .ara o+servar el #RN e>traído es la electro4oresis6 El t7rmino electro4oresis se usa .ara descri+ir la migraci2n de una .artícula cargada +a@o la in4luencia de un cam.o el7ctrico6 Muchas mol7culas im.ortantes +iol2gicamente isten en soluci2n como es.ecies cargadas3 +ien como cationes3 o +ien como aniones6 Estas es.ecies cargadas se van a se.arar en 4unci2n de su carga cuando se a.lica un volta@e a trav7s de los electrodos6 <= La electro4oresis en gel es una t7cnica mu- utiliada .ara se.arar mol7culas o 4ragmentos de mol7culas de ,cidos nucleicos6 Los materiales m,s comunes .ara se.arar mol7culas de ,cidos nucleicos son .olímeros como la .oliacrilamida o la agarosa6 Estos geles se colocan en la cu+eta de electro4oresis3 sumergidos en un tam.2n de ." alrededor de H6 0e esta 4orma3 las mol7culas de 0N# o RN# sometidas a electro4oresis se des.laar,n al .olo .ositivo -a 5ue a ." su.eriores a 8 .oseen carga negativa6 Los geles se com.ortan como un tami molecular .ermiten se.arar mol7culas cargadas en 4unci2n de su tama!o - 4orma6 #sí3 mol7culas de #RN de di4erente tama!o3 van a emigrar de 4orma distinta en un gel de electro4oresis6 Es im.ortante la utiliaci2n de marcadores de tama!o conocido .or5ue nos .ermitir,n calcular los .esos moleculares de las muestras de #RN .ro+lema6 En el caso de los geles de agarosa3 se le a!ade +romuro de etidio3 sustancia 5ue se intercala entre las +ases del #RN enrollado - es 4luorescente cuando se ilumina con lu ultravioleta6 /ras la electro4oresis3 se visualia el gel con una l,m.ara de lu U3 - se ver,n las +andas corres.ondientes a las muestras de #RN a.licado - los marcadores de .eso molecular6 <=
OBE/IOS
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O+tener #RN total a .artir de las c7lulas Ra 'D) O+tener se.arados los ti.os de #RN +as,ndonos en su di4erencia en .eso molecular6 Evaluar la integridad de cada ti.o de #RN e>traído mediante la realiaci2n de la electro4oresis6 0eterminar la e4ectividad del m7todo de Chomc-nsi - Sacchi en la e>tracci2n de #RN a .artir de c7lulas Ra 'D)6
M/O0OLOP#
a= Se.araci2n de mol7culas de una c7lula con 4enol:cloro4ormo6 # ( mm de c7lulas Ra 'D) crecidas a con4luencia estimuladas con *oliC se les agreg2 $ ml de /riSsure6 # esta mecla se le agreg2 '(( L de cloro4ormo3 se agit2 la mecla en un vorte> - se incu+2 durante % minutos a tem.eratura am+iente6 Luego se centri4ug2 el homogeneiado .or $8 minutos a $)6((( r.m en una microcentri4uga E..endor4 a )TC6 += E>tracci2n de #RN Se recu.er2 8(( L de 4ase acuosa <4ase su.erior= luego del centri4ugado con una micro.i.eta - se de.osit2 en otro tu+o E..endor46 # este segundo tu+o se le agreg2 (38 L de iso.ro.anol 4río6 Se homogenei2 la mecla .or inversi2n D veces - se incu+2 a tem.eratura am+iente .or %( minutos6 Se centri4ug2 la mecla .re.arada .or $( minutos a $)6((( r.m - luego se elimin2 el so+renadante a .ulso6 Se agreg2 $ ml de Etanol 8A 4río al tu+o E..endor4 5ue contiene el .ellet - se centri4ug2 .or 8 minutos a 86((( r.m a )TC6 Una ve terminada la centri4ugaci2n3 se elimin2 com.letamente el so+renadante con una micro.i.eta6 Se de@2 secar el #RN al aire durante %( segundos - se agreg2 8( L de agua li+re de nucleasas6 Se calent2 durante '( minutos a D)3DTC6 c= Se.araci2n del #RNs .or electro4oresis Se reali2 electro4oresis so+re gel de agarosa al $A en +u44er /#E $6 En los .ocillos u+icados el e>tremo negativo del gel
#l mirar +a@o lu U el gel de agarosa con el #RN - la muestra de .eso conocido se .uede o+servar la siguiente imagen6
Figura 1 Muestras ARN luego de aplicada la electroforesis
En la 4igura $ se .uede o+servar 5ue a am+os e>tremos de la imagen tenemos muestras de #RN de .eso molecular conocido tremo su.erior tenemos una gran cantidad de +andas acumuladas3 mientras 5ue cuando descendemos se o+servan +andas m,s se.aradas entre sí6 Estas +andas tienen .esos moleculares 5ue van desde los $(6((( - '8( .+
encuentra entre los 8(( .+ - '8( .+6 *or otro lado se a.recia 5ue en el e>tremo in4erior de la columna C' ha- una +anda intensa .ero di4usa mu- .or de+a@o de los '8( .+6 *or otro lado3 a lo largo de la columna se5ue ha- un di4uminado con intensidad varia+le a lo largo de la columna6
0ISCUSI1N
La metodología utiliada result2 ser e4ectiva3 -a 5ue en los geles de agarosa e4ectivamente se .udo a.reciar #RN6clusivamente en la 4ase acuosa6 0e esta manera se est, asegurando la se.araci2n de esta mol7cula de los dem,s com.onentes e>istentes en las c7lulas Ra 'D)6 Los siguientes .asos realiados 4ue .ara lavar el #RN en caso de 5ue tenga residuos llegar a un .ellet de #RN .uro6 <8= En la electro4oresis se .uede a.reciar 5ue el .orcenta@e con 5ue se hio la agarosa era la indicada .ara hacer la se.araci2n de la mol7cula -a 5ue el #RN .uedo escurrir lo necesario .or los .oros del .olisac,rido6 <= Se o+serva 5ue #RN se movi2 al encender la corriente en los electrodos desde el .olo negativo hacia el e>tremo .ositivo 5ue se encuentra en la .arte in4erior de la 4igura $3 esto se de+e a 5ue el #RN es una mol7cula negativa dada .or la carga del 4os4ato encontrado en el nucle2tido6<'= El marcador de .eso molecular est,ndar usado en este .r,ctico 4ue el O VPeneRuler $ + 0N# Ladder3 read-:to:use WSM$$D%6 <$'=
Figura 2: Marcador de peso molecular conocido. O ´GeneRuler 1 kb NA !adder"
En la 4igura $ se .uede o+servar 5ue en la columna C' tenemos manchas de colores amarillo intenso3 estas son +andas de #RN3 las .odemos ver de esta manera -a 5ue en el gel tenemos un marcador sensi+le a la lu U <+romuro de etidio=3 el cual se u+ica dentro de los .liegues de la sim.le cadena del #RN a medida 5ue esta mol7cula avana3 .ermitiendo o+servar la u+icaci2n del #RN en el gel6 <= 0ado 5ue los distintos ti.os de #RN .resentan diversas 4ormas - tama!os3 en el gel de agarosa se .roducir, una di4erenciaci2n de acuerdo a estas características6 <= Sin em+argo3 dado 5ue el #RN ha sido calentado3 se ha .roducido una desnaturaliaci2n de las he+ras - .or ende solo estaremos com.arando tama!o3 no así su con4ormaci2n3 teniendo como consecuencia 5ue la velocidad de migraci2n s2lo de.ende la longitud de cada cadena6 <$= /e2ricamente se sa+e 5ue el #RN ri+osomal3 es el m,s a+undante
El #RN de trans4erencia se encuentra dis.erso .or el cito.lasma3 constitu-e en torno al $8A del total de #RN - es el de menor .eso molecular3 -a 5ue consta de tan solo ( a ( nucle2tidos6<'= El #RN mensa@ero3 el cual es una su+categoria de los #RN .e5ue!os nucleolares3 se encuentran en menor .ro.orci2n3 -a 5ue re.resenta menos del 8A del #RN celular6 Este ti.o de #RN .uede llegar a ser el de ma-or longitud de todos3 sin em+argo esta longitud varía de acuerdo a la cantidad de in4ormaci2n 5ue re.roduca del #0N6 <'= Se ha estudiado 5ue estos #RN tienen entre $((( - $8(( nucle2tidos6 <= 0e acuerdo a las características se!aladas3 se .uede in4erir a .artir de la electro4oresis estimada 5ue en las dos .rimeras +andas encontramos #RN ri+osomal3 en donde3 la .rimera +anda 5ue se encuentra entre los 8(.+ - 8((.+ corres.onde a #RNr 'HS3 la segunda +anda u+icada entre los 8((.+ - los '8( .+ corres.onde a #RNr $HS6 <$$= Ba@o estos #RN encontramos los #RN mensa@eros3 los cuales se .resentan como un SMIR dada su +a@a concentraci2n - .or su diversidad de tama!os6 <= Finalmente3 en la Xltima +anda .oco de4inida3 la cual se encuentra .or mu- de+a@o de los '8( .+ encontraremos #RN de trans4erencia @unto con los #RNr 8S - 83HS .or su .eso molecular6 0ado 5ue la +anda no se encuentra lo +astante de4inida3 .or lo 5ue se .uede deducir 5ue este #RN no est, íntegro6 <= 0e los resultados o+servados en el gel de agarosa3 se .uede o+servar 5ue la muestra de .eso molecular conocido no re4le@a de manera correcta los .esos moleculares de cada #RN .resentes en el gel6 Sin em+argo3 .odemos rescatar 5ue el orden en el 5ue se encuentran los #RN est,n de manera correcta6 0e esta manera3 solo se .uede rescatar la integridad 5ue .resenta cada #RN3 la concentraci2n - el orden +a@o el cual se rigen de manera lineal dado su .eso molecular6 <$%= Cada SMIR .resentado en la columna re.resenta #RN3 los cuales .resentan una am.lia diversidad de .esos moleculares de+ido a 5ue en la c7lula 7stos di4ieren en su actividad - .ro.iedad6 <$=
CONCLUSI1N
El m7todo de e>tracci2n de #RN a .artir de c7lulas Ra 'D) .or el m7todo de Chomc-nsi - Sacchi result2 ser un m7todo e4iciente - selectivo3 lo cual se .udo a.reciar en la electro4oresis realiada3 .ues se a.reciaron +andas 4luorescentes +a@o la lu ultravioleta como era es.erado6 La se.araci2n de mol7culas con carga en electro4oresis resulta tener muchas venta@as a la hora de analiar muestras3 sin em+argo se hace necesario conocer el tama!o de .oro con el 5ue se va a tra+a@ar .ara una alta e4iciencia6 0ado 5ue e>isten % ti.os de #RN3 cada uno con distinto .eso molecular3 en el gel de agarosa se .uede a.reciar su di4erenciaci2n luego de desnaturalio -a 5ue se encuentran todos en su con4ormaci2n lineal Encontramos ' +andas con #RN íntegro3 lo cuales .ertenecen a #RN ri+osomal 'HS - $HS3 siendo el 'HS de ma-or .eso molecular3 luego se a.reci2 un SMIR de #RN mensa@ero no íntegro dado a 5ue el tama!o de este #RN de.ende de la in4ormaci2n 5ue transcri+a del #0N6 Finalmente encontramos el #RN de trans4erencia en con@unto con los #RN 8S - 86HS 5ue son los de menor .eso molecular6
REFERENCI#S $6 YIntroducci2n a la +iología celularZ6 Bruce #l+erts3 'da edici2n '((D6
'6 [cido ri+onucleico o #RN \ La guía de Biología htt.&&+iologia6laguia'(((6com&+io5uimica&acido:ri+onucleico:o: arnWi>%InEUo5Rt %6 htt.&&6ma.h)6galeon6com&evol&ri+orna6html )6 htt.&&.h-siolog-6med6cornell6edu&4acult-&mason&la+&um+o&4iles&*"ENOL: C"LOROFORM6.d4 86 Y/he single:ste. method o4 RN# isolation +- acid guanidiniumthioc-anate] .henol]chloro4orm e>traction tent-:something -ears onZ*iotr Chomc-nsi^NicolettaSacchi6 *u+lished online ' une '((D D6 htt.&&6redal-c6org&.d4&D$'&D$'$H$(D6.d4 6 htt.&&6scielo6org6co&.d4&+iote&v$8n$&v$8n$aH6.d4 H6 htt.&&6uco6es&d.tos&+io5uimica:+iol: mol&.d4s&$A'(ELEC/ROFORESISA'(#CSA'(NUCLEICOSA'(PELES A'(#P#ROS#6.d4 6 htt.&&6ivic6go+6ve&ecologia&ueg&4ormatos&Electro4oresisA'(deA'(#0N A'(enA'(gelesA'(deA'(agarosa6.d4 $(6 htt.&&6uco6es&d.tos&+io5uimica:+iol:mol&.d4s&%A'(*URIFIC#CI AC%A%NA'(#CSA'(NUCLEICOS6.d4 6 $$6 htt.&&dieumsnh654+6umich6m>&+io5ui'&ca.'+6htm $'6 htt.&&6thermoscienti4ic+io6com&nucleic:acid:electro.horesis&generuler:$: +:dna:ladder:'8(:to:$((((:+.& $%6YPenomasZ6 Bron %ra edici2n '((6Editorial M7dica *anamericana6
