PRÁCTICA No. 4 CUANTIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS 1. INTRODUCCIÓN Una vez se ha realizado la extracción de de ADN, Y ARN para muchas muchas aplicaciones, se requiere conocer la cantidad y/o la calidad del acido nucleico obtenido. Generalmente, se realiza mediante la medición de la cantidad de irradiación ultravioleta absorbida por las bases y para verificar la calidad se evalúa por electroforesis. 2. OBJETIVOS • •
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Identificar varios métodos de cuantificar ácidos nucleicos, Conocer la cantidad del ADN obtenido en la extracción realizada en clase Adquirir conocimiento básico para el manejo y funcionamiento del espectrofotómetro, para realizar la medición del acido nucleico en estudio
3. MARCO TEORICO Para cuantificar el material genético obtenido después de una extracción de ácidos nucleicos o la síntesis química de un un oligonucleico, se debe tomar una una lectura a longitudes de onda de 260 nm y 280nm. La lectura a 260nm permitirá calcular la concentración concentración de ácidos nucleicos nucleicos en la muestra. Se toma como referencia referencia que una O.D. ( Densidad Densidad Óptica), Óptica), medida a 260 nm, corresponde aproximadamente a: 1 2 3
50 ug/ml de ADN de doble cadena, 40 ug/ml de ARN o de ADN de cadena sencilla 20 ug/ml cuando se trata de oligonucleotidos. 1 (A260) unidad de dsDNA=50 µg /ml
La proporción de la lectura entre 260 y 280 (OD 260/OD280) proporciona proporciona una estimación de la pureza pureza del acido nucleico. nucleico. Es así así como preparaciones puras de ADN tienen OD 260/OD280 de 1.8. Cuando se trata de de ARN el valor OD 260/OD280 es muy cercano a 2.0. Si hay contaminación con proteínas, fenol u otras soluciones empleadas durante la extracción, el valor de la proporción es menor a 1.8 y no es posible cuantificar de manera precisa el DNA. Si no es posible cuantificarlo por este método por la poca cantidad de DNA obtenido (<250ng/ml) o el DNA está contaminado con otras sustancias que absorben radiación ultravioleta, se puede realizar utilizando fluorescencia
inducida por luz UV emitida por agentes que se intercala en el DNA, debido a que la cantidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN en la muestra . De esta manera, puede estimarse la cantidad de acido nucleico, comparando la fluorescencia producida por muestra en estudio, con una serie de estándares o patrones. La sensibilidad de este método es de 1 a 5 ng de DNA. Ejemplo: De una solución del plásmido pUC19 se diluyo una alicuota a razon de 5µl / 1000µl en agua, las lecturas de absorbancia son: 260 = 0.789; 280 = 0.4475. (xµg/ml) / (0.789) = (50µg / ml) / (1.0 OD) x= 19.74 µg/ml multiplicando por (1000 µl / 5 µl) = 3948µg dsDNA/ ml La relación A260 /A280 del dsDNA es 0.789 / 0.447 = 1.76 4. PRECAUCIONES Asegurarse que el espectrofotómetro este calibrado y tenga la lámpara adecuada en funcionamiento. Las cubetas de cuarzo son extremadamente frágiles y costosas por lo cual deben ser usadas con sumo cuidado y debe tener la preparación de lavado adecuado. 5. PRE- LABORATORIO Cual es el fundamento de la cuantificación espectrofotométrica del ADN Porque se toman medidas en el espectrofotometro a 260 nm y 280 nm? En en plano cartesiano, Que tipo de curva espera observar al visualizar el ADN en un espectrofotómetro Con que tipo de lámpara en el espectrofotómetro espera poder realizar la medición? En que tipo de espectro se realiza la medición? Porque se utilizan cubetas de cuarzo para realizar esta medición? • • •
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6. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS ADN obtenido con anterioridad Micropipetas Puntas estériles Vortex Microcentrifuga para viales de 1.5 ml Guantes Agua desionizada estéril Solución TE Espectrofotómetro Cubetas de cuarzo
Toallas de papel o servilletas Gradilla para tubos eppendorf 1.5 ml 7. PREPARACION DE REACTIVOS Tris HCL pH 8.0 1M 10 ml EDTA 0.5 M 10 ml A partir de las anteriores soluciones preparar 5 ml de solución TE que contiene: Tris HCL 10 mM y EDTA 1 mM 8. PROCEDIMIENTO Prenda el espectrofotómetro con antelación, ya que requiere que las lámparas estén preparadas antes de ser utilizado •
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Tomar el ADN en estudio y realizar una dilución 1/10 en buffer TE. Preparar 1ml de esta dilución. Colocar la solución de ADN en la cubeta de cuarzo. Esta cubeta debe haber sido previamente lavada con 1 ml de extran diluido 1/10 , agua destilada y purgada con solución TE. Si es necesario, adicionar etanol absoluto para lograr su completo secado. En otra cubeta colocar como solución blanco, el TE si el ADN fue rehidratado con este buffer o agua destilada, si fue esta la solución de hidratación Realizar la medición a 260 nm y a 280 nm Realizar los cálculos respectivos.
9. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS Investigue que otros métodos se utilizan en la actualidad para realizar la cuantificación de acidos nucleicos, cuales son sus ventajas? •
10.BIBLIOGRAFIA 1. Chomczynski P and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162: 156. 2. David, L.G. Dibner, M.D. & Battery, J.F. Basic methods in molecular biology. Elsiever Science publishing Co. Ind. NY. 1986. 3. Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 4. Catálogos de PROMEGA para obtencion de caderna complementaria de DNA.
5. Fundamentos moleculares en medicina. Fernando Lizcano Losada.Manual Moderno. Universidad de la Sabana. 2005. 6. Biología molecular e ingenieria genetica. Texto ilustrado de biología molecular e ingenieria genetica. Luque jose et l. Primera edicion. 2001.
11.AUTOEVALUACION. NUMERO DE LA PRACTICA
LOGRO (Objetivos cumplidos) SI NO
FORTALEZAS
DEBILIDADES
SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD
