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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA CARRERA DE QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO LABORATORIO DE GENÉTICA CLÍNICA
REPORTE DE LA PRÁCTICA 5: “IDENTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS”
INTEGRANTES DEL EQUIPO 6:
Baez Ramírez Oliveria Araceli Osorio García Alexander Pérez Saucedo Salvador
Marzo del 2013
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PRÁCTICA 5: “IDENTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS” OBJETIVO
Que el alumno extraiga por métodos fisicoquímicos, identifique y cuantifique los ácidos nucleicos de una muestra de sangre venosa humana por espectrofotometría y densitometría de las bandas en un gel de agarosa. INTRODUCCIÓN
Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de pureza. Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultra centrifugación en gradientes de CsCl o una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas (laboriosas y/o caras) en los protocolos de purificación. PRECIPITACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales), y deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible (mediante la disolución en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los mismos. En la mayoría de los casos cuando se trabaja con ADN es importante realizar una cuantificación de la cantidad con la que se dispone. La cuantificación del ADN se puede llevar a cabo por estimación de la intensidad de una banda en geles de agarosa en el que el ADN es teñido por algún colorante como Bromuro de Etidio, Syber Green o Gel Red, obien mediante técnicas de espectrofotometría de luz ultravioleta. Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos nucleicos absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico de ADN presenta un máximo a λ ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción de un ácido nucleico en particular depende de la secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten estimar la concentración a partir del valor de A260 nm. Así, una unidad de absorbancia a 260 nm corresponde aproximadamente a una concentración de 50 μg/mL de ADN doble hebra,40 μg/mL de ARN o 33 μg/mL de fragmentos cortos de ADN monohebra. En las preparaciones de ácidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteíca. Dado que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración de ácidos nucleicos. Una vez que se ha realizado la extracción de ADN es necesario revisar la integridad y la cantidad del mismo, esto se efectúa mediante la separación por electroforesis en geles de agarosa o de poliacrilamida. La agarosa es más comúnmente utilizada puesto que no es tóxica. A los valores de pH en los cuales usualmente se trabaja con ácidos nucleicos, los grupos fosfato confieren carga neta negativa a estas moléculas. En la electroforesis en geles de agarosa, las moléculas de ADN lineales migran según su tamaño y se pueden visualizar mediante tinción. La velocidad de migración está determinada por varios parámetros, algunos de los cuales son detallados a continuación.
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Tamaño del ADN. Las moléculas de ADN lineal de doble hebra migran a través del gel a velocidades que son inversamente proporcionales al log del número de pares de bases. Dado que la carga del ADN está dada por los grupos fosfato y que por cada par de bases hay dos grupos fosfato, la relación carga/masa es la misma para moléculas de ADN de diferente tamaño. Pero, debido a la fricción que impone la malla del gel de agarosa, las moléculas de mayor tamaño serán retardadas respecto a las de menor tamaño. Concentración de la agarosa. Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes concentraciones de agarosa. Conformación del ADN. El ADN circular cerrado de doble hebra superenrollado (forma I), el circular relajado con un corte en una de las hebras (forma II) y la forma lineal (forma III) que tengan idéntico peso molecular y misma secuencia van a migrar a distinta velocidad en los geles de agarosa. Las movilidades relativas de las tres formas dependen primariamente de la concentración de agarosa, pero también están influidas por otros factores como la corriente eléctrica aplicada, la fuerza iónica del buffer y de la cantidad del colorante presente Corriente aplicada. A bajo voltaje, la velocidad de migración de los fragmentos lineales es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo a medida que la fuerza del campo eléctrico aumenta, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto peso molecular se incrementa menos. Por lo tanto el intervalo efectivo de separación en los geles de agarosa disminuye a medida que el voltaje es incrementado. Otros factores. La dirección del campo eléctrico, la composición de bases de los fragmentos a analizar, la temperatura y la composición del buffer de electroforesis.
4 MÉTODOS
A) EXTRACCIÓN DEL ADN 1) Extraer 3mL de sangre venosa en tubos heparina.
2) Adicionar 5mL de agua doble destilada esteril.
3) Mezclar suavemente hasta la lisis completa de los eritrocitos.
6) Incubar durante 1hr.
5) Eliminar sobrenadante y resuspender el boton en 80 L en amortiguador de lisis con pronasa.
4) Centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos.
8) Incubar nuevamente a 37°C por 1h.
9)Adicionar 480µL de la mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1) y agitar vigorosamente en vortex durante 5 min.
12) Centrifugar a 13 000 rpm durante 15 min. a 4°C.
11) Separar la fase acuosa y adicionar el mismo volumen de isopropanol previamente enfriado a -20 °C.
10) Centrifugar a 13000 rpm dureante 5 min. a T ambiente.
13) Eliminar sobrenadante.
14) Adicionar un volumen de 980µL de alcohol etilico al 80% en agua bidestilada.
15) Almacenar en congelación y cuando se ocupe poner a temperatura ambiente.
17) Secar los tubos en un termociclador a 37 °C.
16) Eliminar sobrenadante
a
37°C
7) Adicionar 320µL de
acetato de sodio 375mM.
el
el
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Para la muestra de ARN se realizaron también los pasos 15-17.
B) HIDRATACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL ADN Y ARN POR ESPECTROFOTOMETRÍA 1) Hidratar las muestras con 30 µL de agua bidestilada esteril y mezclar.
2) Colocar en 2 tubos eppendorf 2 µL de ADN y ARN puro y adicionar 200 µL de agua bidestilada estéril (dilución 202/2).
3) Leer la absorbancia de las muestras a 260 y 280 nm.
4) Calcular la concentracion de ADN y ARN.
CÁLCULOS Absorbancia260nm x 50 µg x factor de dilución Concentración ADN (µg/µL) = ----------------------------------------------------------1000 µL Absorbancia260nm x 40 µg x factor de dilución Concentración ARN (µg/µL) = ----------------------------------------------------------1000 µL
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C) ELECTROFORÉSIS DEL DNA Y DEL RNA
De cada dilución de DNA y RNA 202/2 mezclar 10 µL con amortiguador de carga de azul de metileno.
Colocar en 2 pozos en un gel de agarosa.
Visualizar el gel en el transiluminador.
Correr la electroforésis horizontal a 120 V por 2 horas con amortiguador de corrimiento TBE.
RESULTADOS
1) CUANTIFICACIÓN DEL ADN TABLA 1. Resultados por equipo de las absorbancias a 260 y 280 nm, concentración y coeficiente Abs260/Abs280 para el ADN y ARN, así como promedios de las concentraciones, en muestras de sangre venosa. DNA RNA Abs 260 Conc. Abs 280 Abs 260 Conc. Abs 280 EQUIPO nm (µg/µL) nm Abs260/Abs280 nm (µg/µL) nm Abs260/Abs280 1 0,737 3,722 0,437 1,686 0,808 3,264 0,434 1,862 2 0,926 4,676 0,624 1,484 1,132 4,573 0,597 1,896 3 0,572 2,889 0,388 1,474 0,681 2,751 0,446 1,527 4 0,706 3,565 0,481 1,468 0,579 2,339 0,383 1,512 5 0,245 1,237 0,207 1,184 0,330 1,333 0,220 1,500 6 0,419 2,116 0,319 1,313 1,631 6,589 1,061 1,537 7 0,534 2,697 0,392 1,362 0,602 2,432 0,422 1,427 8 0,474 2,394 0,355 1,335 1,33 5,373 0,863 1,541 9 0,589 2,974 0,419 1,406 0,62 2,505 0,454 1,366 10 0,359 1,813 0,276 1,301 0,525 2,121 0,393 1,336 11 0,503 2,540 0,357 1,409 0,683 2,759 0,473 1,444 Promedio 2,784 3,276
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2) ELECTROFORÉSIS EN GEL DE AGAROSA Los pozos del RNA fueron del 1 al 11, y los pozos para el DNA fueron del 13 al 19. El equipo 6 ocupó el pozo 6 para el RNA y el 18 para el DNA. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 13 14 15 16 17 18 19
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
1)
CUANTIFICACIÓN DEL ADN Y ARN A 260 NM
El valor promedio de la concentración fue de 2,784 y 3,276 µg/µL para el ADN y el ARN, respectivamente, lo que indicó que se obtuvieron mayores concentraciones de ARN que de ADN. De acuerdo a la tabla 2, la mayor concentración de ADN fue de 4,676 µg/µL con un coeficiente Abs260/Abs280 = 1,484; y el mayor coeficiente para el ADN fue de 1,686 con una concentración de 3,722 µg/µL; además la muestra del equipo 6 presentó menor concentración y coeficiente que éstas muestras. La mayor concentración de ARN fue de 6,589 µg/µL con un coeficiente Abs260/Abs280 = 1,537; y el mayor coeficiente para el ARN fue de 1,896 con una concentración de 4,573 µg/µL. Por lo que tanto para el ADN
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como para el ARN, en el primer caso se obtuvo una mayor concentración pero una menor pureza, y en el segundo caso se obtuvo una menor concentración pero mayor pureza. TABLA 2. Comparación de las mayores concentraciones y coeficiente Abs260/Abs280 para el ADN y ARN, en muestras de sangre venosa. EQUIPO 1 2 6
ADN Conc. (µg/µL) 3,722 4,676 2,116
Abs260/Abs280
EQUIPO
1,686 1,484 1,313
2 6
ARN Conc. (µg/µL) 4,573 6,589
Abs260/Abs280 1,896 1,537
Asimismo se observó que los coeficientes fueron mayores para el ARN que para el ADN, para todas las muestras, lo que indicó que su extracción fue más eficiente porque se obtuvo más puro. Dado que los aminoácidos aromáticos absorben luz UV, la presencia de proteínas lleva a sobrestimaciones de la concentración de ácidos nucleicos. Debido a que el máximo de absorbancia de las proteínas se encuentra en λ ~ 280 nm, es posible estimar el grado de impurezas de origen proteico a partir del coeficiente A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260 nm/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucleicos puros. Para el ADN de doble hebra en soluciones de alta pureza se espera Abs260/Abs280 ≥ 1,8, y para el ARN A260/A280 ≥ 2,0. De acuerdo a la tabla 2, el coeficiente Abs260/Abs280 máximo para el ADN fue de 1,686, y para el ARN fue de 1,896; por lo que ninguna de las 11 muestras presentó alta pureza porque en todas hubo impurezas proteicas. 2)
ELECTROFORÉSIS
La separación por electroforesis en gel de agarosa se hace para revisar la integridad y la cantidad del ADN y ARN, y estas moléculas migran hacia el ánodo debido a su carga negativa. Su velocidad de migración está determinada por el tamaño del ADN, la concentración de agarosa, la conformación del ADN, corriente aplicada, la dirección del campo eléctrico, la composición de bases de los fragmentos a analizar, la temperatura y la composición del buffer de electroforesis. Para el caso del DNA se observó que estaba desnaturalizado porque las muestras presentaron una franja sin bandas, y el ARN estaba íntegro porque todas las muestras corrieron normalmente, excepto la 13, 15 y 19.
CONCLUSIONES
Se obtuvieron mayores concentraciones de ARN que de ADN. Tanto para el ADN como para el ARN se obtuvo una muestra con la mayor concentración ácido nucleico pero con menor pureza, y otra muestra con una menor concentración pero con la mayor pureza, y la muestra del equipo 6 presentó menor concentración y coeficiente que éstas. Asimismo en todas las muestras el coeficiente Abs260/Abs280 fue mayor para el ARN que para el ADN, lo que indicó que la extracción del ARN fue más eficiente porque se obtuvo más puro, pero en ambos casos hubo impurezas proteicas por ser los coeficientes Abs260/Abs280 < 1,8 para el ADN y < 2 para el ARN.
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Respecto a la electroforesis, el DNA estaba desnaturalizado porque las muestras presentaron una franja sin bandas, y el ARN estaba íntegro porque las muestras corrieron normalmente. Finalmente se cumplió el objetivo de extraer los ácidos nucleicos por métodos fisicoquímicos, identificarlos y cuantificarlo a partir de una muestra de sangre venosa humana por espectrofotometría y densitometría en un gel de agarosa.
BIBLIOGRAFÍA
Sambrook, J. y Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3ª ed. Ed. Cold Spring Harbor Laboratories. Nueva York. USA 2001.
