PRACTICA No. 12: Antibiograma
I. Antecedentes El antibiograma es un método de estudio in vitro del comportamiento de los antimicrobianos frente a los agentes infecciosos. Tiene como finalidad proporcionar información útil para la iniciación y marcha de la terapéutica anti infecciosa (2). La información que proporciona el antibiograma es valiosísima, aunque no basta para el establecimiento de una terapia adecuada si se considera aisladamente y se aplica sin tener en cuenta las peculiaridades del antimicrobiano, las características clínicas del proceso infeccioso y las del propio paciente. El estudio estadístico del antibiograma permite conocer la tendencia de sensibilidad de cada especie bacteriana, su coeficiencia de benignidad frente a los antimicrobianos utilizados y su índice de especificidad, que traduce la eficacia de cada antimicrobiano desde el punto de vista terapéutico y epidemiológico (2). A. Método de difusión en agar Aunque está sujeto a numerosos errores, es el de elección en el de elección en el laboratorio por su sencillez de ejecución, su exacta reproducción, la facilidad de lectura y la fiabilidad de sus resultados. Esta reconocido internacionalmente (FDA, ICS, NCCLS, CDC). Consiste en inocular una placa de agar con el microorganismo problema y colocar sobre la superficie del medio, discos que contienen determinadas concentraciones de los antimicrobianos a ensayar. El antibiótico difunde por el medio y después de un tiempo de incubación determinado, el microorganismo se desarrolla en toda la placa excepto alrededor de los dicscos cuya concentración de antimicrobiano es inhibitoria. El diámetro del halo de inhibición del crecimiento expresa la sensibilidad, moderadamente sensibles o resistencia del microorganismo; su tamaño está influenciado por el grosos del medio de cultivo, la concentración del inóculo, la carga del disco y otros factores, por lo que habrá que tener ciertas precauciones en la realización de la técnica (1). 1. Medio de cultivo Se recomienda el medio de Mueller-Hinton, con determinados índices de calcio y magnesio (mínimo de 60mcg/ml de calcio y 20 mg/ml de magnesio), pues toda variación de importancia implica errores de lectura significativos; el pH debe mantenerse entre 7.2 y 7.4. Para bacterias exigentes se adiciona un 5% de sangre: Mueller-Hinton sangre y Mueller-Hinton chocolate. El medio no debe contener sustancias antagonistas (3). Estos medios se reparten en placas de Petri, a razón de 25ml para placas de 90mm y 60ml para placas de 140mm. En todo caso, el espesor de la capa de agar debe ser de 4mm (1). 2. Inóculo La preparación del inóculo puede hacerse a partir de un cultivo puro en medio líquido o bien de colonias aisladas en medio sólido. Conviene asegurarse de la pureza del cultivo y por ese se utilizan colonias aisladas. La densidad del inóculo es uno de los factores que más influye en el tamaño de los halos de inhibición. Cuando se prepara, debe estandarizarse para que ofrezca un crecimiento denso pero no totalmente
confluente. Un inóculo muy denso permitiría que las colonias crecieran ocupando toda la superficie del medio; un inóculo pobre tampoco sería adecuado pues las colonias dejarían claros entre sí. Lo ideal es un crecimiento semiconfluente (2). En general la densidad microbiana del inóculo es de aproximadamente 107-108 UFC/ml o de turbidez equivalente al punto 0.5 de la escala de McFarland (0.5ml de cloruro de bario 0.048M añadidos a 99.5ml de ácido sulfúrico 0.36M). Este inóculo se consigue efectuando diluciones a partir de un cultivo en caldo en fase estacionaria de crecimiento y ajustando la turbidez (2). 3. Método de Kirby-Bauer Consiste en introducir un hisopo en el inóculo ajustado, eliminando el exceso presionando suavemente sobre las paredes del tubo e inocular las placas por estriación masiva. Antes de colocar los discos se deja secar la superficie, introduciendo la placa en a incubadora hasta 15 minutos como máximo (3). 4. Discos Se utilizan discos de papel absorbente grueso de 6mm de diámetro, que contienen los distintos antibióticos desecados y a la concentración conveniente. Estos discos ya listos para su empleo, son preparados por distintas casas comerciales con la concentración expresada en mcg/ml o en unidades internacionales (UI), ateniéndose a las normas establecidas. Es conveniente efectuar con cierta periodicidad un control de calidad de los discos para verificar la actividad de los antibióticos. Este control se realiza con cepas patrón: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 (2) 5. Lectura Como cada antimicrobiano difunde a una velocidad distinta y la difusión está influenciada por muchos factores y eventualidades, no es de capital importancia dar una precisión matemática de las zonas de inició sino que es correcto valorar éstas sencillamente por el diámetro del halo, que suele ser distinto para cada antibiótico y cada microorganismo. Si se quiere expresar el valor de la CMI (concentración mínima inhibitoria) es preciso medir exactamente la longitud del halo de inhibición con un compás o regla. Para ello, los resultados de un mínimo de 100 cepas susceptibles al antibiótico se colocan sobre un sistema de coordenadas, se valoran matemáticamente y se obtiene así la línea de regresión, con la que se puede deducir la CMI aproximada, sabiendo la amplitud del halo de inhibición (2).
II. Materiales 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
Cultivo bacteriano de Staphylococcus aureus y Escherichia coli Agar tripticasa soya (TS) o infusión cerebro corazón (BHI) Placas de agar Müeller Hinton (MH) Solución salina estéril (SS) Estándar 0.5 de McFarland* Discos comerciales de antibióticos Hisopos estériles Pinzas de laboratorio Asa de platino Incubadora a 37°C
11. Regla o calibrador (3) *Preparación del Estándar de McFarland: añadir 0.05 mL de BaCl, 0.048 M (1.75% p/v de BaCl 2H2O2) a 9.95 mL de H2SO4 0.36N (1% v/v) III. Procedimiento 1. Suspender una colonia del agar TS en solución salina hasta lograr la turbidez equivalente al estándar 0.5 de McFarland 2. Utilizando un hisopo de algodón estéril, sumergirlo en el inóculo y eliminar el exceso presionándolo sobre la pared interna del tubo que lo contiene y por encima del nivel del caldo de cultivo. 3. Inocular la superficie de una placa de agar de Müeller-Hinton con el hispo pasándolo uniformemente por toda la superficie en tres direcciones. Por último, pasar el hisopo por el reborde de la placa de agar. 4. Dejar secar por 5 minutos 5. Colocar los discos de antibióticos sobre la superficie del agar utilizando unas pinzas estériles y apretándolos suavemente sobre la superficie del agar. Los discos no deben estar a menos de 15mm de los bordes de la placa y lo bastante separados entre ellos para que no se superpongan las zonas de inhibición (aproximadamente 20mm). 6. Dejar las placas 15min. A temperatura ambiente para que comiencen a difundir los antibióticos 7. Incubar la placa en posición invertida a 37°C durante 18.24horas 8. Medir los diámetros de las zonas de inhibición con una regla o un calibrador utilizando luz refleja sobre fondo negro Interpretación: Los diámetros de los halos de inhibición se traducen a las categorías de resitente ® intermedio (I), moderadamente sensible (MS) o sensible (S), de acuerdo a los criterios interpretativos de la CLSI (3).
IV. Cuestionario 1. ¿Cuál es el medio de cultivo recomendado por la FDA y el NCCLS para la realización del antibiograma por el método de difusión en agar? Si este medio de cultivo no permitiera el desarrollo de un determinado microorganismo, ¿Qué medio podría utilizar? 2. Mencione otros métodos para determinar la resistencia o susceptibilidad antimicrobiana cualitativa y cuantitativamente. 3. ¿Qué es la CLSI? y ¿por qué se relaciona con los antibiogramas?
V. Bibliografía 1. Gamazo, C., Sánchez, S., Camacho, A.I (2013). Microbiología basada en la experimentación. Elsevier Health Sciences. Barcelona, España. 2. García, P., Paredes, F., & Fernández, M. (1994). Microbiología Clínica Práctica. Publicaciones UCA. España.
3. Leiva, J. (1999). Determinación de la sensibilidad de una bacteria a agentes antimicrobianos: antibiograma. Manual práctico de Microbiología (2a. Ed.) Barcelona, España.
Anotaciones
