ANTIBIOGRAMA: DETERMINACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS INTRODUCCIÓN El uso y abuso de los antibióticos en las terapias contra infecciones de origen bacteriano, conlleva a la selección de cepas bacterianas resistente. La diseminación de estas resistencias a otras cepas de la misma o diferente especie se ve facilitada cuando los marcadores de resistencia (genes) se encuentran en elementos genéticos móviles como son plásmidos y/o transposones La susceptibilidad de los microorganismos a los antibióticos se determina mediante técnicas basadas en la dilución o difusión del antibiótico en un medio de cultivo donde desarrolla el microorganismo en estudio. Las técnicas de dilución en caldo y agar son utilizadas para medir la actividad de un agente antimicrobiano frente a una cepa bacteriana y permiten determinar la concentración inhibitoria mínima (CIM) que es la menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento bacteriano. La CIM indica la concentración de antimicrobiano que se necesita para matar o inhibir el crecimiento del microorganismo analizado y permite valorar comparativamente la potencia de los antimicrobianos. La reproducibilidad de estas pruebas es de ± 1 dilución y para evitar una gran variabilidad éstas deben ser estandarizadas y controladas muy cuidadosamente. Los métodos estandarizados se detallan ampliamente en el NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) Para el caso de las técnicas que se basan en la difusión del antibiótico, el método universalmente utilizado es el de Bauer y Kirby comúnmente llamado antibiograma. Este método consiste básicamente en un disco de papel embebido en el antibiótico que es colocado sobre un medio de cultivo sólido inoculado con el microorganismo a ensayar; luego de 18 a 24 horas de incubación se mide el halo de inhibición del crecimiento bacteriano que produce el antibiótico al difundir desde el disco de papel que lo contiene, radialmente hacia el medio de cultivo donde esta creciendo el microorganismo. El diámetro del halo de inhibición del crecimiento en un antibiograma y el valor de la CIM para un determinado antibiótico son un criterio de referencia experimental para determinar si un microorganismo es resistente o sensible a ese antibiótico. Otro novedoso método es el EtestTM , que permite la determinación de la (CIM) . El EtestTM es una tira plástica que contiene un gradiente continuo de un antibiótico, la técnica combina el fenómeno de difusión con el de dilución del antibiótico para determinar la CIM para un dado microorganismo. Este método, como veremos en el trabajo práctico, es mucho más certero que el antibiograma y más rápido y preciso que la técnica de dilución para obtener la CIM, que usualmente se realiza en varios pasos de dilución y cultivo lo cual requiere disponer de mucho material estéril para una sola determinación. Materiales Cultivo exponencial de la cepa bacteriana a analizar. Agar Müller Hinton Cajas de Petri estériles Ansa Pipetas de 1 ml y 10 ml estériles Solución de hipoclorito al 5% para descarte de material contaminado. Tubos de ensayo estériles
Hisópos estériles Escala de McFarland Tubo 1 y # 5 (0.5 de Bacl2 (1.75%) y 99.5 de H2SO4 (1%). Discos de antibiograma Estufa a 37 °C Desarrollo del trabajo práctico Determinación de la CIM por dilución en caldo 1. Se realizan diluciones decrecientes del o los antibióticos en tubos conteniendo 1 ml de caldo Mueller-Hinton 2. Se siembra 1ml de una suspención bacteriana de aproximadamente 10 5 bacterias por ml que equivale a una dilución 1/500 del tubo 1 de la escala de Mc Farland. 3. Se realiza un control de crecimiento inoculando un caldo sin antibiótico y un control negativo con caldo sin inocular. 4. Se incuban todos los tubos a 37 °C durante 24 horas. Luego se observa turbidez indicativa del desarrollo bacteriano. 5. Se determina la CIM como aquella concentración del antibiótico contenida en el tubo que posee la mayor dilución del mismo en la que se detecta falta de turbidez. La mínima concentración que inhibe el crecimiento bacteriano. Antibiograma 1. Preparar placas de Petri con agar Müller Hinton de aproximadamente 4 mm de alto. (30ml) Dejar solidificar y secar bien. 2. Preparar con el cultivo de la cepa a analizar, una suspensión bacteriana con solución fisiológica estéril, ajustarla al tubo # 5 de la escala de McFarland. 3. Sumergir un hisopo estéril en la suspensión recién preparada, escurrir el excedente de líquido en las paredes del tubo y sembrar la placa de Petri con medio de cultivo anteriormente preparada. Distribuir uniformemente el inóculo en toda la superficie del agar. 4. Cuando la superficie del agar este completamente seca, apoyar los discos de antibiograma utilizando el aplicador o una pinza estéril. Asegurarse que toda la superficie de los discos esté en contacto con el agar, una vez colocados no deberá ser movidos, dado que el antibiótico es liberado instantáneamente cuando entra en contacto con el agar. 5. Incubar en estufa a 37 °C durante 24 horas. 6. Observar y medir para cada disco el halo de inhibición del crecimiento. 7. Analizar si las cepas bacterianas utilizadas son resistentes o sensibles a los antibióticos probados, según los datos que figuran en tablas de sensibilidad a antibióticos. Bibliografía Bauer, A., Kirby, W., Sherris, J., Turk, M. American Journal of Clinical Pathology, 45: 493-496, 1986. Davis, D. B., Dulbecco, R., Eisen, H., Ginsberg, H., Tratado de Microbiología. capítulo 7 Salvat Editores, Tercera edición, 1984.
