Universidad autónoma de Chiapas Facultad de ciencias químicas Campus IV
LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA
PRACTICA NO. 1
“antibiograma”
CATEDRATICO: Q.F.B. LUIS HUMBERTO ROSALES FURUKAWA
ALUMNO: RIOS ROQUE FABIOLA PEREZ NUÑES NANCY KARINA ESPINOSA MARTINEZ GLADIS GUADALUPE GODINES CITALAN NOE RODAS HERRERA MIGUEL ANGEL
SEMESTRE: 6° “A”
GRUPO:
TAPACHULA CHIAPAS A 05 DE MARZO DEL 2010 1
MARCO TEORICO El diagnóstico y tratamiento de un paciente son muy complejos. Desde su llegada a un establecimiento de salud hasta el alta reciben la prestación de muchos profesionales. Esto a su vez genera diferentes procesos, siendo el laboratorio uno de los más importantes. Para que los resultados de laboratorio sean útiles en el manejo del paciente, debemos asegurar la confiabilidad y validez de éstos. Es necesario entonces, asegurar el cumplimiento adecuado de todos los pasos involucrados, desde la solicitud del tipo de examen y muestra, su transporte, procesamiento, la emisión de un resultado, y la adecuada interpretación de éste. De un examen solicitado y mal orientado, se obtendrá una muestra inadecuada y por tanto una información errada. La resistencia bacteriana es un tema de importancia en la salud pública. Su extensión a nivel mundial, desarrollo de resistencia a nuevos agentes antimicrobianos, así como su presencia en patógenos relacionados con enfermedades prevalentes, como son la enfermedad diarreica aguda, las infecciones respiratorias agudas y las infecciones intrahospitalarias, le dan el carácter de problema prioritario. Por ello, el conocimiento de los perfiles de susceptibilidad Antimicrobiana debe orientar a la elaboración de esquemas de tratamiento más eficaces y además, la información proporcionada por la vigilancia debe servir de insumo para la elaboración de un programa de uso racional de antibióticos. El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones terapéuticas individuales. El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a escala de un servicio, un centro de atención médica, una región o un país, es como puede adaptarse la antibioterapia empírica, revisarse regularmente los espectros clínicos de los antibióticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevención en los hospitales. ¿Cuándo realizar un antibiograma? Siempre que una toma bacteriológica de finalidad diagnóstica haya permitido el aislamiento de una bacteria considerada responsable de la infección.
2
Establecer esta responsabilidad exige una colaboración entre el bacteriólogo y el clínico. En efecto, en ciertas circunstancias, el microbiólogo no podrá determinar con certeza que el aislamiento de una bacteria exige un antibiograma, sin los datos clínicos que le aporta el médico. Por ejemplo, una bacteria no patógena puede ser responsable de la infección de un enfermo inmunodeprimido o en un lugar determinado del organismo. La presencia de signos clínicos puede ser también determinante para la realización de un antibiograma (por ejemplo: la infección urinaria con un número reducido de gérmenes). Sensibilidad bacteriana a los antibióticos La determinación de la Concentración Inhibidora Mínima (CIM) es la base de la medida de la sensibilidad de una bacteria a un determinado antibiótico. La CIM se define como la menor concentración de una gama de diluciones de antibiótico que provoca una inhibición de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del antibiótico frente a diferentes especies bacterianas. Hay diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de manera semicuantitativa, las CIM (métodos manuales y métodos automatizados o semiautomatizados). Estos diferentes métodos de rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en función de su sensibilidad frente al antibiótico probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibiótico. Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS: Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un tratamiento a la dosis habitual. Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento. Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Cada antibiótico se caracteriza por un espectro natural de actividad antibacteriana. Este espectro comprende las especies bacterianas que, en su estado natural, sufren una inhibición de su crecimiento por concentraciones de su antibiótico susceptibles de ser alcanzadas in vivo. A estas especies bacterianas se les dice naturalmente sensibles a dicho antibiótico. Las especies bacterianas que no se encuentran incluidas dentro de dicho espectro se denominan naturalmente resistentes. Método base de dilución en caldo
3
En los métodos de dilución en caldo, de casi todos los métodos utilizados en la actualidad, se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que sostendrá el desarrollo del microorganismo. El caldo más comúnmente usado para estas pruebas es el de Mueller-Hinton suplementado con los cationes magnesio y calcio. Los agentes antimicrobianos se preparan en "soluciones madre" concentradas y luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas. Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento. Luego de la incubación adecuada (usualmente de un día para el otro) se observa la turbidez de los tubos que indicará desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los otros que no contengan suficiente agente antimicrobiano como para inhibir su desarrollo. La concentración de antibiótico que presente ausencia de crecimiento, detectada por falta de turbidez (igualando al control negativo), se designa como la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI). Para medir la capacidad de un antimicrobiano para matar a un microorganismo (CMB) se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo sistema de dilución en caldo que para medir la sensibilidad. Al mismo tiempo que la suspensión inicial del microorganismo es inoculada en los tubos de caldo, se toma una alícuota del tubo de control de crecimiento, inmediatamente después de ser sembrado, y se inocula también en una placa de agar para determinar el número real de unidades formadoras de colonias (UFC) del inóculo. Este número se obtiene al contar las colonias presentes luego de la incubación de la placa de agar hasta el día siguiente y por multiplicación por el factor de dilución. Por ejemplo, usando un asa calibrada de 0,01 ml para sembrar la placa y contando unas 250 colonias, en 1 ml del tubo original habrá 250/0,01. Una vez determinada la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de los tubos de caldo que no presentaban turbidez en placas de agar (la pequeña cantidad del agente antimicrobiano que es llevada junto con el inóculo se elimina por dilución en el agar), y el número de colonias que crece en estos subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara con el número de UFC/ml del cultivo original. Dado que incluso las drogas 4
bactericidas no siempre esterilizan totalmente una población bacteriana, la mínima concentración del agente antibacteriano que permite sobrevivir a menos de 0,1 % del inóculo original se denomina concentración bactericida mínima (CBM) o concentración letal mínima (CLM). Método de difusión en agar Una vez demostradas las grandes ventajas de las técnicas de dilución en caldo, el paso siguiente, pensando sobre todo en poder realizar fácilmente pruebas de sensibilidad de un microorganismo frente a múltiples antibióticos a la vez, consistió en buscar la manera de aplicar la idea directamente a las placas de agar. Las primeras pruebas se realizaron inoculando la superficie de una placa de agar con el microorganismo en estudio, colocando pequeñas cubetas (de metal o vidrio) sobre el agar y agregando las soluciones de los diferentes antimicrobianos dentro de dichas cubetas. Los agentes antimicrobianos difundían en el medio en forma radial alrededor de la cubeta e inhibían el desarrollo del microorganismo en la zona donde su concentración era suficientemente alta. Las áreas de inhibición grandes indicaban una actividad antimicrobiana más efectiva. Este método fue modificado en 1947 por Bondi y col. incorporando el agente antimicrobiano a discos de papel de filtro. Fue un paso adelante gigantesco ya que el uso de los discos de papel permitía preparar un gran número de pruebas idénticas y almacenarlas para uso futuro. En 1966, después de los estudios realizados por Bauer, Kirby, Sherris y Turk, ensayando diferentes cepas bacterianas, el empleo de los discos de papel de filtro para las pruebas de sensibilidad fue estandarizado y correlacionado definitivamente con las CMI correspondientes. Durante muchos años, y a pesar de ser una técnica puramente cualitativa, el método de difusión por disco (o método Kirby-Bauer), en función sobre todo de su comodidad, economía y fiabilidad, ha sido, y aun es, uno de los más utilizados en los laboratorios de todo el mundo. El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a varios antibióticos. Se incuban las placas durante 16-24 horas a 35ºC y al cabo de este tiempo se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el diámetro de la zona de inhibición que se forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias oportunas publicadas por el NCCLS. Con esta referencia podemos informar si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente (S, I, R) a cada uno de los antibióticos ensayados en las placas. 5
Método de E-test Es uno de los métodos más recientes que se han presentado en el mercado y resulta de una curiosa combinación de características de los métodos anteriores. Se trata de una técnica cuantitativa en placa que permite obtener una lectura directa de CMI en µg/ml, ya que se emplean tiras plásticas impregnadas en concentraciones crecientes de antibiótico indicadas en una escala graduada sobre la propia tira. Una de sus grandes ventajas, dadas sus características, es que resulta un método ideal para estudiar cualquier tipo de microorganismo, aerobio o anaerobio, incluyendo aquellos llamados "fastidiosos" o los que tengan requerimientos especiales para crecer. El microorganismo a investigar se inocula en una placa y sobre ella se deposita la tira del antibiótico (o antibióticos) a ensayar. Tras la incubación de 16-24 horas a 35ºC se observan las placas y se valora la zona de inhibición, de forma elíptica, alrededor de cada tira. La CMI se lee directamente observando el punto más bajo de la elipse que presente crecimiento. Antibiograma realizado por el método de E-test En la fotografía de la izquierda se muestra una vista general de una placa con crecimiento bacteriano y con dos tiras de E-test. La zona de color más claro que ocupa la mayor parte de la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Las elipses más oscuras que rodean la parte superior de las tiras E-test marcan las zonas en que los respectivos antibióticos han inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio. La foto de la derecha, un plano más cercano de la mitad inferior de la placa, permite observar con más detalle lo señalado en el párrafo anterior. Se aprecia perfectamente como el pico de la zona más estrecha de la elipse en la tira de MZ coincide, en la escala graduada, con la franja entre las marcas de 1.5 y 2, lo que nos indicaría que la CMI de este antibiótico (MZ) para este microorganismo sería de 2 µg/ml.
6
OBJETIVO
7
✔ Conocer a que microorganismo
antibiótico
es
sensible
un
determinado
PROCEDIMIENTO ✔ Muestra: Exudado faríngeo: se procede a un legrado en el área de inflamación, se recoge el exudado si existe; se debe evitar el contacto con la saliva porque puede inhibir la recuperación de los estreptococos del grupo A. Muestras del tracto respiratorio superior: La mayoría de las infecciones bacterianas de la faringe están producidas por Estreptococos del grupo A. otras bacterias que pueden producir faringitis son Corynebacterium diphteriae, B. pertusis, Neisseria gonorrhoeae. Sin embargo, estas bacterias son relativamente infrecuentes y se deben utilizar técnicas especiales para aislarlas. 8
Otras bacterias potencialmente patógenas como Staphylococus aureus, S. pneumoniae, Haemophilus influenzae, enterobacterias y Pseudomonas aeruginosa, pueden estar presente en la orofaringe, pero rara vez producen faringitis. Se debe utilizar un hisopo de Dacron o de alginato de calcio para recoge las muestras faríngeas. Deben tomarse muestras de la zona de las amígdalas, la faringe posterior y de cualquier exudado o zona ulcerada. Se debe evitar la contaminación de la muestra con saliva porque las bacterias de la saliva pueden experimentar un sobre crecimiento o inhibir el crecimiento de los estreptococos del grupo A. ✔ Medios realizados: Agar Estafilococos 110 Agar sal y manitol Agar TSA Tubos de caldo nutritivo Para la realización de estos medios de cultivo se realizaron los cálculos que venían inscritos en los frascos que lo contenían al igual que el procedimiento para su realización ✔ Frotis: Tinción de Gram: Recoger muestras Hacer el extendido Dejar secar a temperatura ambiente Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.) Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las células Gram positivas y Gram negativas se tiñen de color azul-purpura. Enjuagar con agua. Agregar lugol y esperar entre 30 segundos y 3 minutos Enjuagar con agua. Agregar acetona y/o alcohol y esperar entre 15 y 20s Enjuagar con agua. Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas. Enjuagar con agua. Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión
✔ Método base de dilución en caldo 1.- En este método se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que sostendrá el desarrollo del microorganismo. 9
2.- El caldo más comúnmente usado para estas pruebas es el de Mueller-Hinton suplementado con los cationes magnesio y calcio pero el que utilizamos nosotros fue el caldo nutritivo. 3.- Los agentes antimicrobianos se preparan en "soluciones madre" concentradas y luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas. 4.- Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento. Luego de la incubación adecuada (usualmente de un día para el otro) se observa la turbidez de los tubos que indicará desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los otros que no contengan suficiente agente antimicrobiano como para inhibir su desarrollo. 5.- La concentración de antibiótico que presente ausencia de crecimiento, detectada por falta de turbidez (igualando al control negativo), se designa como la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI). 6.- Para medir la capacidad de un antimicrobiano para matar a un microorganismo (CMB) se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo sistema de dilución en caldo que para medir la sensibilidad (la que explicamos a continuación en placas de TSA) ✔ Sensibilidad a los antibióticos o antibiograma: Método de difusión en agar 1.- el germen aislado, se distribuye en forma uniforme (inoculo abundante) sobre un medio solido adecuado (TSA) 2.- los discos (unidiscos o multidiscos) se colocan sobre la placa inoculada, con pinza estéril, dejando 2 cm., entre disco y disco, se presionan suavemente con las pinzas. Se recomienda no poner más de 9 discos por placa 3.- las placas se incuban, invertidas, en seguida o dentro de los 30 ´siguientes a 37°C 4.- los resultados se leen cuando se tenga un crecimiento satisfactorio, dentro de las 18 a 24 horas de incubación
10
OBSERVACIONES Morfología de las colonias desarrollaron en este medio: redondas pequeñas blancas y amarillas convexas
que
se
Este es el medio sal y manitol y en este no hubo mucho crecimiento solo en una placa que viro a color amarillo, lo que significa que se fermento el manitol. Los estafilococos coagulasa (+) fermentan el manitol.
Estas son las placas del medio TSA que se utilizaron para el antibiograma con los multidiscos
Estos son los 11 tubos de caldo nutritivo que se Utilizaron para suspender las bacterias de nuestra muestra (Staphylococus aureus)
Aquí estamos realizando la tinción de Gram para las muestras de frotis de exudado faríngeo 11
Estos son los frotis que se realizaron con las tinciones de Gram: Las colonias se agrupaban en forma de racimos de uva, Gram positivos ya que se tiñeron de color azul-purpura por tal motivo ya tenemos los argumentos para decir que nuestro m.o. aislado fue estafilococos aureus. Visto a 100x
Frotis realizado del medio estafilococos 110
1
2
Frotis realizado del medio sal y manitol
En el tubo 1 tenemos a las bacterias resuspendidas en solución salina. En el tubo 2 tenemos al tubo de McFarland No. 1. La turbidez de las bacterias resuspendidas en la solución salina tuvo que ser igual a la del tubo de Mc-Farland.
Aquí podemos ver cuando estábamos agregando 1 gota de la solución salina con bacterias a cada uno de los 11 tubos de caldo nutritivo
12
Aquí estamos realizando las diluciones en serie del antibiótico amoxicilina en los 11 tubos de caldo nutritivo. La 1ra concentración para llevar a cabo las diluciones en serie del medicamento fue de 64mg/L.
Colocación del multidiscos en las placas de TSA
13
CMI
32mg/L
antibiótico PER CTX CXM SXT AM E CF PE GE TE CAZ DC
16mg/L
Radio (cm) 1.3 1.4 0.7 0 0.4 1 1.4 0 0.9 0.1 0.5 O.3
Radio (cm) 1.2 1.3 0.7 0 0.3 0.9 1.3 0 0.9 0.1 0.5 0.3
Radio (cm) 1.2 1.4 0.8 0 0.3 0.9 1.3 0 0.9 0.1 0.5 0.3
Media 1.23 1.36 0.73 0 0.33 0.93 1.33 0 0.9 0.1 0.5 0.3
14
RESULTADOS ✔ CMI: fue el tubo que tenia la concentración de de 16mg/L de nuestro antibiótico
✔ CMB: no tuvimos dicha concentración, ya que al resembrar las bacterias contenidas en los tubos de caldo en concentraciones de antibiótico de 32mg/L y 16 mg/L en placas de TSA hubo crecimiento exagerado de m.o.
✔ Según los datos arrojados del antibiograma los antibióticos son: Resistente a: SXT, PE, TE Sensible intermedio: CXM, AM, GE, CAZ, DC Sensible: PER, CXT, E, CF
DISCUSIONES ✔ En el método base de dilución en caldo, el tubo de ensaye que mostro la CMI (Concentración mínima inhibitoria) fue el tubo de ensaye que tubo la concentración de 16mg/L del antibiótico (el antibiótico usado fue amoxicilina). Esta nos indica que esta concentración es la menor concentración de nuestras diluciones de antibiótico que provoca una inhibición visible 15
de la bacteria, dicho de otra manera, este tubo fue el que tuvo la menor concentración diluida de antibiótico en el que no se presentaba una turbidez presente en los tubos anteriores a él, lo que significa que no hubo crecimiento bacteriano visible. ✔ Después de haber obtenido la CMI, los tubos siguientes y el tubo de la CMI Se resembraron en placas de TSA para obtener la CMB (concentración mínima bactericida). La CMB es la capacidad que tiene un antimicrobiano para matar a un microorganismo. En este caso los tubos que se resembraron en placas de TSA fueron los tubos que tenían las concentraciones de 32mg/L y 16mg/L. Al resembrar y dejar incubar las placas de TSA en la estufa a 35°C por 24 horas, dio como resultado crecimiento en las 2 placas lo que nos da a entender este antibiótico no puede matar a nuestra bacteria, además de crecimiento de otros tipos de microorganismos. Al igual, pensamos que al dar este resultado nuestra estufa ha de estar contaminada además de que no llega hasta la temperatura adecuada que es de 37°C sino llega hasta 35°C, ya que todo el procedimiento de resembrado se llevo a cabo en condiciones de esterilidad. ✔ Corroboramos con la literatura de que el método de dilución en caldo nos da a conocer la CMI y la CMB, ya que nuestra concentración mínima inhibitoria fue de 16 mg/L y la CMB no la llegamos a conocer ya que este microorganismo es resistente a este antibiótico al grado de no poder acabar con él. ✔ BETALACTÁMICOS: La resistencia a meticilina implica también pérdida de sensibilidad a este grupo de antimicrobianos, por lo que no tienen cabida en el tratamiento del SARM, no obstante a esto, se están desarrollando nuevas cefalosporinas que, en estudios de experimentación animal, han demostrado una mejor actividad bactericida que la vancomicina, planteándose incluso su uso en terapias de combinación. Existen además nuevos carbapenémicos, con una afinidad aumentada para las PBP2, que ya han demostrado resultados positivos en las primeras fases de investigación. Por otro lado, en algunos estudios se ha observado que la asociación de vancomicina y cloxacilina o imipenem puede ser sinérgica. Nosotros corroboramos la literatura con nuestra practica ya que la penicilina al pertenecer al grupo de los betalactamicos no creo halo de inhibición, por tal motivo estos medicamento ya no surten ningún efecto contra estos microorganismos 16
CONCLUSIONES
✔ Gracias a esta práctica aprendimos a realizar todo el procedimiento para conocer la sensibilidad de un microorganismo a algún medicamento determinado, realizando los procedimientos para encontrar la CMI y la CMB mediante los métodos de dilución en caldo y de difusión en agar. También supimos que al utilizar el método de dilución en caldo encontramos tanto la CMI y la CMB y mediante la utilización de multidiscos solo sabemos a qué tipo de medicamentos es susceptible el microorganismo.
BIBLIOGRAFÍA ✔ Varios autores, 1989. Microbiología médica. Manual Moderno (1990), México Bailey Scott. Diagnóstico microbiológico. Editorial médica panamericana (1989), Argentina Regueiro García, B. Resistencia a la infección. Varios autores. Guía de terapia antimicrobiana. Dade-Grifols http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioAntibioticos.htm ✔ secretaria de comercio y fomento industrial Norma mexicana Nmx-bb-012-1974 "multidiscos para antibiogramas"
17
