PRACTICA N° 1
Técnica del d el número más probable: probable : NMP El número de microorganismos presentes en alimentos está s!eto a normas preestablecidas por lo cal es necesario "e se cmplan con este re"isito para determinar s tili#aci$n o consmo% &as bacterias coli'ormes( los esta)lococos * otras de impo import rtan anci cia a en alim alimen ento tos( s( p ped eden en ser ser can canti ti)c )cad ados os mediante la técnica del NMP%
I% +b!eti,os In,estigar la presencia de bacterias del grpo Coli'orme en aga de consmo -mano mediante la técnica del Número Más Probable .NMP/% E,al E,ala arr la cali calida dad d sani sanita tari ria a de m mes estr tras as de aga aga o alime alimento ntos s media mediante nte la bús"e bús"eda da de microo microorga rganis nismo mos s coli'ormes totales( coli'ormes 'ecales * Esc-eric-ia coli% 0i'e 0i'ere renc ncia iarr los los orga organi nism smos os coli' coli'or orme mes s tota totale les s de los los microorganismos microorganismos coli'ormes 'ecales% Aprender el procedimiento de la técnica del NMP%
II% Introdcci$n El aga es n recrso natral necesario para el desarrollo de n gran número de acti,idades -manas debido a "e las agas son de composici$n ,ariada( contiene di'erentes tipos de microorganismos contaminantes% &a ,ariada poblaci$n de microorganismos en el aga( pro,iene del selo * de origen intes intestin tinal( al( incl* incl*end endo o aer$b aer$bico icos s * anaer$ anaer$bic bicos os estric estrictos tos * 'aclt 'acltati ati,as ,as as como como n nmer meroso oso ,irs ,irs%% &os anális análisis is "e se peden reali#ar al aga para controlar ss calidades como 'sicas( "micas * microbiol$gicas% microbiol$gicas%
III% Marco te$rico &a denominaci$n genérica coli'ormes designa a n grpo de especies bacterianas "e tienen ciertas caractersticas bio"micas en común .aerobias o anaerobias 'acltati,as( gram negati,as( no espor$genas( 'ermentan lactosa a23°c en 45 -oras/ * tienen importancia rele,ante como indicadores de contaminaci$n del aga * los alimentos6% El grpo coli'orme está 'ormado por los sigientes géneros: 1% Esc-eric-ia% 7% 8lebsiella% 2% Enterobacter% 4% Citrobacter% 9C-romoclt Agar para Coli'ormes: Es n agar selecti,o para la identi)caci$n simltánea de coli'ormes totales * E% coli en mestras de aga * alimentos% racias a la acci$n con!nta de peptonas selectas( pir,ato * tampon de 'os'atos se garanti#a n rápido crecimiento tambien de coli'ormes con da;os sbletales% El contenido en laril sl'ato in-ibe ampliamente el crecimiento de bacterias gram
almon<A& es Escondido por la en#ima beta<0
I@% Técnica de prebas bio"micas IM@IC: engloba 4 prebas
1% IN0+&: El indol es no de los prodctos de degradaci$n metab$lica del aminoácido tript$'ano% &as bacterias "e poseen la tript$'anos son capaces de -idroli#ar * desaminar el tript$'ano con prodcci$n de indol( ácido pirú,ico * amonaco% &a prodcci$n de indol es na caracterstica importante para la identi)caci$n de mc-as especies de microorganismos% &a preba de indol está basada en la 'ormaci$n de n comple!o ro!o cando el indol reacciona con el grpo alde-do del p
7% PREBA T>I .TRIP&E >AR IR+N TRIP&E ADCAR FIERR+/ El T>I es n medio ntriente * di'erencial "e permite estdiar la capacidad de prodcci$n de ácido * gas a partir de glcosa( sacarosa * lactosa en n único medio% También permite la identi)caci$n de la prodcci$n de >F7% Esta es na preba espec)ca para la identi)caci$n a ni,el de género en la 'amilia Enterobacteriaceae( con ob!eti,o de di'erenciar entre: Bacterias 'ermentadoras de la glcosa Bacterias 'ermentadoras de la lactosa Bacterias 'ermentadoras de sacarosa
Bacterias aerogénicas Bacterias prodctoras de >F7 a partir de sstancias orgánicas "e contengan a#'re% Procedimiento: Inoclar los tbos de T>I con pnta .alambre recto/% Para eso introdcir la pnta -asta 2 a 3 mm% 0el 'ondo del tbo% Tras retirar el alambre del 'ondo( estriar el pico con n mo,imiento -acia no * otro lado% Incbar a 23° drante 74 -oras% Posteriormente se debe medir el pF de los clti,os%
2% PREBA 0E& CITRAT+ Este ensa*o pone en e,idencia la capacidad del microorganismo de tili#ar citrato como única 'ente de carbono% Estriar citrato de >immons .contiene A#l de bromotimol como indicador de pF/% Incbaci$n 45- a 2G°C Reacci$n .
Reacci$n .H/: Crecimiento * ,ira!e al a#l .la eliminaci$n de citrato alcalini#a el medio/ Salmonella enterobacter klebsiella
4% R++ METI&+
na de las caractersticas taJon$micas "e se tili#an para identi)car los di'erentes géneros de enterobacterias lo constit*en el tipo * la proporci$n de prodctos de 'ermentaci$n "e se originan por la 'ermentaci$n de la glcosa% >e conocen 7 tipos generales: &a 'ermentaci$n ácido
entre K(L .amarillo/ * 4(4 .ro!o/( "e se tili#a para ,isali#ar la prodcci$n de ácidos por la ,a de 'ermentaci$n ácido miJto% Procedimiento: Inoclar el caldo Ro!o Metilo con n clti,o pro de no más de 74 -oras del microorganismo en estdio% Incbar a 23°C drante 45 -oras% &ego de )nali#ado el tiempo de incbaci$n agregar nas gotas del reacti,o de ro!o de metilo% &a preba es positi,a si se desarrolla de n color ro!o estable% Esto indica "e la prodcci$n de ácido es s)ciente para prodcir el ,ira!e del indicador * el microorganismo 'erment$ la glcosa por la ,a de ácido miJta% n color anaran!ado( intermedio entre el ro!o * el amarillo no es considerado como positi,o%
3% @+E> PR+>8AER En la preba de @oges
@% Materiales * métodos 4%1
Materiales:
Mestra de aga Pipetas 1L m& estériles Pipetas de 1m& estériles% rascos para la dilci$n Marcadores de ,idrio 2 tbos con 1L m& de caldo lactosado con Campana de 0r-am% Mec-ero Pectona Ba;o mara% Matra# Tabla de lectra de NMP% @%7
Medidas de segridad El laboratorio es responsable de mantener en ambiente de traba!o segro * nas normas de biosegridad respecto a la eJposici$n * mane!o segro de las sstancias especi)cadas en este método% &as mesas de traba!o del laboratorio deben limpiarse antes * al )nal de cada so con n desin'ectante apropiado% &os medios de clti,os deben colocarse en las cámaras de clti,o con s identi)caci$n respecti,o% E"ipos de protecci$n .mandil( gantes( naso bcal( etc%/
@%2
Procedimiento
@%2%1 +btenci$n de la mestra >e desin'ecto el gri'o antes de abrir( ne,amente se desin'ecta el gri'o * pasamos el mec-ero por la boca del gri'o de!amos caer el aga por 3 segndos lego cerramos * abrimos el gri'o de!ando caer aga por 1L segndos * scesi,amente con otros 13 segndos% &a obtenci$n de la mestra tiene "e ser rápida( pasamos el mec-ero antes * despés de obtener la mestra al 'rasco%
@%2%7 Identi)caci$n * control de mestra Para la identi)caci$n de la mestra debe de eti"etarse el 'rasco con la sigiente in'ormaci$n: Número de registro para la identi)caci$n( 'ec-a * -ora% @%2%2 Preser,aci$n de la mestra El análisis bacteriol$gico de la mestra debe practicarse inmediatamente despés de s toma% >e inicia dentro de las dos -oras pr$Jimas a la recolecci$n de la mestra * n ningún caso( este lapso debe eJceder las 74 -oras para el aga potable * K -oras para otros tipos de aga para "e sea ,álido el resltado del análisis% 0rante el periodo "e trascrre del análisis% @%2%4 Tama;o de la alcota: Para la determinaci$n del número más probable .NMP/( se re"iere n ,olmen de 1LL m&%
@I% Resltados 1L<1: 1 Tbos:
1L<7: L
L( G C CT m&
1L<2: 1
Técnica presnti,a: MP: Coli'ormes Totales tili#amos: Caldo &aril >l'ato Mestra 1L<1: sembramos en el tbo "e contiene Caldo &aril >l'ato
1L<1
1L<1
Mestra 1L<7: sembramos
1L<2
1L<2
En los tbos sembrados los cales contienen caldo &aril sl'ato son incbados para con)rmar * este proceso drante 74- a na temperatra de 44°C Q ba;o mara% Presencia de gas
Técnica con)rmati,a: >embrar en medio espec)co% 0etectar E% Coli al 1LLO * para esto tili#amos el agar Mac Cone* *a "e es el principal para detecci$n% Agar Mac Cone*: &actosa( cristal ,ioleta( sales biliares% Agar EMB: Color ,erde oscro brillo metálico Prebas bio"micas: IN0+&: 0egrada el aminoácido tript$'ano al agregar 2<3 gotas de obacs ormaci$n de na 'ase ro!a orgánica% 2G°C74-
Análisis de los resltados:
o
0espés de la práctica los resltados anali#ados * comprobados obtenidos en el aga se establece el número más probable en los coli'ormes totales es L(G esto "iere decir "e las 2 series de 2 tbos
cada 7 'eros positi,os( debido a "e el aga anali#ada microbiol$gicamente era aga potable "e contena esc-eric-ia coli% o
o
&os resltados de coli'ormes 'ecales dieron G(1 en la mestra de aga de a'era por"e -a* presencia de anillo ro!o ,ioláceo esto signi)ca positi,o en la mestra anali#ada% &a mestra de aga de la ni,ersidad de Ca!amarca nos dio resltado cero por"e -bo presencia de anillo crema esto signi)ca negati,o en la mestra%
@II% Conclsi$n El aga anali#ada de la ni,ersidad nacional de Ca!amarca es apta para el consmo -mano( pero el aga anali#ada de a'era no es apta por"e mestra e% Coli% En la preba presnti,a todos a"ellos tbos "e den positi,os se procederá a reali#ar la preba con)rmatoria para Coli'ormes totales * 'ecales pes en esta preba solo nos indica la presencia de coli en el aga pero no el tipo% >i se obser,a trbide# * prodcci$n de gas la preba se considera positi,a( debiendo anotar el número de tbos positi,os para posteriormente -acer el cálclo del NMP la cal nos indica la presencia de coli total * 'ecal% En la mestra reali#ada obt,imos 7 mestras% En la lectra de la tabla del número más probable el aga de la mestra nos arro!$ n resltado de G% En las mestras de colonias se identi)c$ la presencia de colonias con centro negro( planas con brillo metálico lo cal indica presencia de coli 'ecal% Al aplicar la preba del indol para las mestras se identi)c$ positi,o la cal indica presencia de coli 'ecal en el aga mestreada% S al igal se mestreo el aga de la NC la cal arro!o n resltado negati,o * L de coli 'ecales * totales%
@III% 0I>C>I+N En la técnica de números más probables N%M%P es la más identi)cada para determinar Coli'ormes 'ecales mediante la técnica presnti,a * con)rmati,a% En la técnica presnti,a solo se identi)ca en n 3LO * para con)rmar si eJiste Coli'ormes 'ecales entonces empleamos la técnica con)rmati,a en la cal para sembrar se tili#a el Agar Mac Cone* * la preba bio"mica el Indol "e es la más e)ciente para con)rmar en n 1LLO% Pdimos obser,ar "e la mestra en este caso de aga no potable presento coli'ormes .'ecales * totales/ lo cal nos indica na bena limpie#a * desin'ecci$n del área de traba!o( la bena -igiene e del maniplador * el almacenamiento "e t,o el prodcto para e,itar precisamente este tipo de contaminaci$n con estos microorganismos%
I?% Bibliogra'a Microbiologa alimentaria: metodologa analtica para alimentos% Norma o)cial meJicana nom<117
CCASAC
J%
AneJo
