DETERMINACIÓN DE COLIFORMES EN JUGO DE FRESA. NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP). a Diana
Marcela Galindo, b Richard Andrés Martínez, c Tatiana Zapata Gualtero.
a
[email protected], b
[email protected], c
[email protected] a, b y c
Universidad Santiago de Cali, Facultad de Ciencias Básicas, Programa de Microbiología, Laboratorio de Microbiología de Alimentos, Santiago de Cali, Colombia. Octubre 19 de 2017.
RESUMEN. Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral y que utilizan como vehículo los alimentos y el agua. En los últimos años, se ha aumentado la necesidad de encontrar indicadores de calidad en alimentos, el método más utilizado para encontrar coliformes totales y fecales es denominado “número más probable” o NMP. En
esta práctica de laboratorio se analizaron dos muestras de jugo de fresa proveniente de la tienda la Frutería de la Universidad Santiago de Cali, encontrándose que para coliformes totales había 2,4x102 UFC/mL, y que en coliformes fecales había <3 UFC/mL, estos resultados fueron comparados con la normatividad INVIMA. Encontrándose que solo el análisis en coliformes fecales cumplen con los parámetros de esta norma. P alabr labr as C lave lave: N M P , fr f r esa, sa, presunti presunti va, va, confir confi r mativa, tiva, coli colifor form mes.
1. INTRODUCCÓN El método de número más probable (NMP) se aplica para coliformes totales, coliformes E.coli y bacterias fecales y bacterias patógenas, este método no sirve para identificar E.coli patógenas asociadas con enfermados enferm ados humanas como lo es el serotipo s erotipo de E.coli de E.coli 0157:H7. 0157:H7. El grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción
de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h de incubación a 44.5 ± 0.1°C en diferentes diluciones se inoculan con tres repeticiones en caldo BGLB (Brillan Green Lactose Bilie). Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo, la más prominente es Escherichia coli. La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales cuyos colorantes marcan a los fermentadores (Camacho, Giles, Ortegón, Palao, & Velázquez, 2009) (Pachón, 2009). Enterobacterias, coliformes, coliformes fecales y E. coli son usados como “bio-indicadores” de calidad tanto de agua como de alimentos; su presencia puede deberse a diferentes causas, mala manipulación de los productos, contaminación cruzada, mal almacenamiento, etc. La presencia de E. coli y coliformes fecales indica una posible contaminación fecal, aunque pueden venir de un ambiente contaminado. Se deben determinar la cantidad de estos organismos que presentan las muestras y concluir de acuerdo con los límites establecidos por las normas vigentes (Técnica, 2009). El objetivo de la practica fue conocer la técnica del número más probable (NMP) en una muestra de alimento, a partir de la técnica de tubos múltiples, en el cual diluciones seriadas se inoculan las muestras en el caldo de cultivo adecuado.
2. METODOLOGÍA. 2.1.Procesamiento de la muestra y preparación de diluciones. Inicialmente se desinfectó con alcohol al 70% el sitio por donde se extrajo la muestra y se abrió aséptica y adecuadamente la muestra. Después, se mezcló para asegurar su homogenización antes de preparar las diluciones, en este punto se tomaron 10 mL de una muestra de Jugo de Fresa obtenido de una Frutería de la Universidad Santiago de Cali,
estos se agregaron a 90 mL de agua peptonada estéril (0,1%) para obtener una dilución 10-1, se agitó vigorosamente y se dejó en reposo por 10 minutos. Seguidamente, se prepararon diluciones consecutivas de esta (10-2, 10 -3). Para preparar la dilución 10-2, se transfirió 1 mL de la dilución 10-1, con pipeta de 1 mL a un tubo de dilución que contenía 9 mL de agua peptonada 0.1% y se agitó cuidadosamente, después para la dilución 10-3, se pasó 1 mL de la dilución 10-2 con pipeta de 1 mL a un tubo de dilución que contenía 9 ml de agua peptonada 0.1% y se agitó cuidadosamente.
2.2. Determinación de coliformes totales. 2.2.1. Fase presuntiva: Para esta fase de cada dilución se pasó 1 mL a tubos que contenían 10 mL de verde brillante, seguidamente, se dejaron incubando a 35°C +/- 0,2 °C por 24 horas. Pasado el tiempo de incubación, se evaluó la presencia de gas y turbidez en los tubos y se determinó el número más probable (NMP). 2.2.2. Fase confirmativa: Después de la incubación y evaluación de los tubos, se tomaron al azar 2 tubos con verde brillante de cada dilución y se sembraron por agotamiento en Agar EMB. 2.3. Determinación de coliformes fecales. 2.3.1. Fase presuntiva: Para esta fase de cada dilución se pasó 1 mL a tubos que contenían 10 mL de verde brillante, seguidamente, se dejaron incubando a 44,5°C +/- 0,2 °C por 24 horas. Pasado el tiempo de incubación, se evaluó la presencia de gas y turbidez en los tubos y se determinó el número más probable (NMP). 2.3.2. Fase confirmativa: Después de la incubación y evaluación de los tubos, se tomaron al azar 2 tubos con verde brillante de cada dilución y se sembraron por agotamiento en Agar EMB.
Figura 1. Metodología utilizada para esta práctica de laboratorio (Fuente: Zapata, T).
3. RESULTADOS. 3.1. Determinación de coliformes totales. En la Figura 1 se muestra la dilución 10-1, la cual se obtuvo a partir de 10 mL de muestra de jugo de Jugo de Fresa obtenido de una Frutería de la Universidad Santiago de Cali; además se agregaron a 90 mL de agua peptonada estéril (0,1%). Por otro lado, en la Figura 2, se observa la fase presuntiva de los tubos que contenían 10 mL de verde brillante, que se habían dejaron incubando a 35°C +/- 0,2 °C por 24 horas. Pasado el tiempo de incubación, se evaluó la presencia de gas y turbidez en los tubos.
Figura 1. Dilución de 10-1 de muestra de jugo de fresa (10 mL) y agua peptonada 90 mL.
Figura 2. Tubos con verde brillante, incubados a 35°C +/- 0,2 °C por 24 horas (evaluación de la presencia de gas y turbidez).
En la Tabla 1, se muestra los tubos con verde brillante, incubados a 35°C +/- 0,2 °C por 24 horas (evaluación de la presencia de gas y turbidez) para la prueba de coliformes totales de un jugo de fresa.
Tabla 1. Tubos con verde brillante, incubados a 35°C +/- 0,2 °C por 24 horas (evaluación de la presencia de gas y turbidez). DILUCIÓN PRESENCIA DE GAS PRESENCIA DE TURBIDEZ -1 10 Si Si -1 10 Si Si -1 10 Si Si -2 10 Si Si -2 10 Si Si -2 10 Si Si -3 10 No No -3 10 No No -3 10 No No En las siguientes Figura 3, 4 y 5 se muestra la fase confirmativa de coliformes totales, las cuales se sembraron en cajas petri en agar EMB de los tubos de verde brillante de las diluciones 10-1(A), 10-1(B), 10-2(A), 10-2 (B), 10-3(A) y 10-3 (B), respectivamente.
Figura 3. Agar EMB de la siembra de los tubos de verde brillante de la dilución 10-1(A) y 10-1(B).
Figura 4. Agar EMB de la siembra de los tubos de verde brillante de la dilución 10-2(A) y 10-2(B).
Figura 5. Agar EMB de la siembra de los tubos de verde brillante de la dilución 10-3(A) y 10-3(B). 3.2. Determinación de coliformes fecales. En la Figura 6, se observa la prueba de coliformes fecales de la fase presuntiva de los tubos que contenían 10 mL de verde brillante, que se habían dejaron incubando a 44.5°C +/- 0,2°C por 24 horas. Pasado el tiempo de incubación, se evaluó la presencia de gas y turbidez en los tubos.
En la Tabla 2, se muestra los tubos con verde brillante, incubados a 44.5°C +/- 0,2 °C por 24 horas (evaluación de la presencia de gas y turbidez) de la prueba para la determinación de coliformes fecales de un jugo de fresa.
Tabla 2. Tubos con verde brillante, incubados a 35°C +/- 0,2 °C por 24 horas (evaluación de la presencia de gas y turbidez). DILUCIÓN PRESENCIA DE GAS PRESENCIA DE TURBIDEZ -1 10 No No -1 10 No No -1 10 No No -2 10 No No -2 10 No No -2 10 No No -3 10 No No -3 10 No No -3 10 No No En las siguiente Figura 6 se muestra la fase confirmativa de coliformes fecales, las cuales se sembraron en cajas petri en agar EMB de los tubos de verde brillante de las diluciones 101
(A), 10-1(B), 10-2(A), 10-2 (B), 10-3(A) y 10-3 (B), respectivamente.
Figura 6. Agar EMB de la siembra de los tubos de verde brillante de la dilución 10-1(A) y 10-1(B), 10-2(A) y 10-2(B) y 10-3(A) y 10-3(B). 4. ANÁLISIS DE RESULTADOS. Para esta práctica de laboratorio, se realizó la determinación de coliformes en un jugo de fresa obtenido de la frutería perteneciente a la Universidad Santiago de Cali, por medio del método de número más probable. En primer lugar, se realizó la determinación de coliformes totales, observando que en los tubos con verde brillante incubados a 35°C +/- 0,2 °C por 24 horas, arrojaron que las diluciones 10-1 y 10-2 hubo presencia de gas y de turbidez, confirmando que este alimento contenía coliformes; por el contrario, la dilución 10-3 no se observó presencia de gas ni de turbidez (ver Tabla 1). Con estos resultados se obtuvo el número más probable de la muestra que fue 2,4x102 UFC/mL, lo cual no está dentro del parámetro establecido en la norma INVIMA, que dice que el índice máximo permisible para identificar nivel de buena calidad para concentrados de jugos de pulpa de frutas para coliformes totales debe ser menor a 3 UFC/mL (INVIMA, 2013). Por otro lado, al mirar las muestras en las placas Petri con agar EMB (ver Figuras 3, 4 y 5), estas presentaban unas colonias de color negro en el centro, por lo que se puede decir que son bacterias fermentadoras de lactosa y/o sacarosa, que asimilan en parte el colorante diferenciador (Becton Dickinson BD, 2013), infiriendo que posiblemente son E.coli ATTC 25922 o E.coli 8539. En segundo lugar, para la prueba de coliformes fecales, en los tubos con verde brillante incubados a 44.5°C +/- 0,2 °C por 24 horas, dio como resultado que para todas las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 no se observó presencia de gas ni de turbidez (ver Tabla 2). Con estos resultados se obtuvo el número más probable de la muestra que fue < 30 UFC/mL lo cual es
acorde a la norma INVIMA, que dice que el índice máximo permisible para identificar nivel de buena calidad para concentrados de jugos de pulpa de frutas para coliformes fecales debe ser menor a 3 UFC/mL (INVIMA, 2013). Para corroborar estos resultados, se realizó una prueba confirmativa mediante la siembra de agar EMB, el cual arrojó que posiblemente hay ausencia de coliformes fecales (ver Figura 6). En las fresas los mesófilos no son flora propia de estas, llegan a ellas desde el mismo sitio de siembra porque sobreviven en organismos parásitos hospederos de las plantas o son saprofitos del suelo, la inadecuada manipulación y la interrupción de la cadena de frío que permite el desarrollo de estos, por eso es tan importante mantenerla; además, el crecimiento de estos microorganismos se ve afectado por la sobrepoblación de hongos, que si es propio de las fresas y de las condiciones intrínsecas de las mismas que permite su crecimiento mientras que el de las bacterias no es tan factible. También hay que tener en cuenta que la presencia de estos microorganismos refleja la calidad higiénica del producto y de su manejo (Medina, 2006), en este caso, se podría decir que las fresas no provienen de un buen manejo, ya que en estas se pudo determinar la presencia de coliformes totales. Actualmente existen varias interrogantes sobre la transmisión de microorganismos contaminantes de las frutas y de los vectores que pueden estar involucrados. Cada tipo de fruta presenta una composición y característica única. Por ejemplo, las fresas son frutillas muy delicadas y perecederas y no se lavan después de la cosecha. Todas estas características se deben tomar en cuenta en el estudio y control de posibles riesgos de contaminación con patógenos de humanos. Las frutas que crecen cerca del suelo, como la fresa, se contaminan fundamentalmente a partir de los microorganismos de la tierra, mientras que aquellas frutas que no están en contacto directo con el suelo, pueden contaminarse con microorganismos por la acción de arrastre que realiza el viento; así, bacterias coliformes como Enterobacter, Citrobacter, E.coli y Klebsiella, y otras bacterias como Serratia y Lactobacillus, entre otras, se encuentran frecuentemente en la superficie de estas frutas (Gil, Morón de Salim, & Gaesrte, 2010).
5. CONCLUSIÓN. Mediante esta práctica de laboratorio se logró el objetivo de conocer y aplicar la técnica del número más probable aplicada en alimentos. A partir del resultado obtenido entre los dos
análisis a diferentes temperaturas se puede decir que en el jugo de fresa analizado tiene una mayor proporción de bacterias mesofilas o coliformes totales, debido a que se presentó crecimiento a 35°C y no a 45°C, por tanto, la concentración de coliformes totales fue menor a 3 UFC/mL, la causa de estos resultados se pudo deber al tiempo de exposición del alimento después de su preparación, ya que inicialmente para el conteo de coliformes totales, el jugo estuvo más tiempo expuesto al ambiente que en el segundo experimento para coliformes fecales, lo que explicaría la posible presencia de E. coli en la muestra número 1 y no en la número dos para confirmar coliformes fecales y E.coli. El alimento es no apto para consumo humano respecto a contenido de mesofilos aerobios, aun así, cumple con la normatividad INVIMA en jugos y pulpa de frutas para coliformes fecales el cual es menor a 3 UFC/mL. Cabe mencionar que los mesofilos no son flora propia de las fresas, estos microorganismos pueden llegar a ellas desde el mismo sitio de siembra, por la inadecuada manipulación y la interrupción de la cadena de frío que permite el desarrollo de estos, por eso es recomendable hacer un seguimiento a la empresa y dar instrucciones de sanidad a modo preventivo.
6. REFERENCIAS. Becton Dickinson BD. (2013). EMB Agar ( Eosin Methylene Blue Agar ), Modified. Instituciones de uso-Medio en placas listo para su uso, (April), 2 – 4. Recuperado a partir de https://www.bd.com/resource.aspx%3FIDX%3D8765 Camacho, A., Giles, M., Ortegón, A., Palao, M., & Velázquez, O. (2009). Método para la determinación de bacterias coliformes , coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple (Número más Probable o NMP). Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos, 2, 1 – 17. Gil, A., Morón de Salim, A., & Gaesrte, Y. (2010). Calidad microbiológica en frutas de conchas comestibles expendidas en mercados populares de los municipios Valencia y San Diego, estado Carabobo, Venezuela. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología, 30, 24 – 28. Medina, A. (2006). INFLUENCIA DEL MANTENIMIENTO DE LA CADENA DE FRÍO CONTROLADA EN LA VIDA ÚTIL, CALIDAD MICROBIOLÓGICA, FÍSICO QUÍMICA Y ORGANOLÉPTICA EN FRESAS TIPO EXPORTACIÓN . Pontificia Universidad Javeriana.
Pachón, D. (2009). AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIA. Universidad Nacional De Colombia En Villavicencio – Meta, (198), 115. Técnica, N. (2009). NTC, (571). INVIMA. (2 de Octubre de 2013). Resolución número 003929. Colombia. Obtenido de https://www.invima.gov.co/images/pdf/intranet/Dir%20operaciones/RESOLUCI% C3%93N%203929%20DE%202013.pdf
