PRACTICA: Determinación Determinación y caracterización del Acido ascórbico en naranja Presentado por: Arce Arbildo Lady Hachoque Cristobal Edditt Hilasaca Carlos Sauceda Plasencia Nivia
Docente: Mg Sc. Ing. Indira Betallelu
Curso: !u"#ica de Ali#entos Avanada Avanada
ESCUELA DE POST GRADO ESPECIALIDAD DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
DICIEMBRE 2!" PERU
I. INTRODUCCIÓN
El ácido ascórbico o vitamina C es un nutriente esencial en la dieta humana. La vitamina C, funciona como un cofactor redox y un catalizador en una amplia serie de procesos y reacciones bioquímicas. En humanos, la vitamina C sana y previene el escorbuto, por ello la desinación de ácido ascórbico. El t!rmino "#curvy" o "scurfy", en el inl!s antiuo, probablemente se derivó de los t!rminos escandinavos, s$%oerber y s$orb%u, queriendo decir piel áspera o costrosa. En la historia humana, además de la hambruna, el escorbuto ha causado la mayoría de los padecimientos de orien nutricional &'ohnston et al., ())*+. Esta enfermedad fue descrita por los antiuos rieos, eipcios y romanos, siendo asociado por mucho tiempo a los e%!rcitos invasores, marinas de uerra y exploradores. un al final del -ltimo silo, el escorbuto estaba ampliamente eneralizado en medio de los mineros de oro de California y las$a. En */, el Capitán 'ames Lind, m!dico de la armada británica, demostró que el escorbuto, era consecuencia de la falta de inesta de frutas y verduras frescas. Lind demostró que la me%or forma de prevenirlo se loraba areando a la dieta diaria de la tripulación un poco de %uo de limón &0raverman, *12)3 4avey et al., ()))+. El rupo que desarrolla la nomenclatura para vitaminas había propuesto que el nuevo factor antiescorb-tico sea llamado "factor o vitamina C", ya que la "" y "0" habían sido previamente desinadas como factores potenciales de salud y de crecimiento o vitaminas. En *1*5, 6ilva y sus asociados del 7nstituto Lister en Londres habían aislado la actividad antisorb-tica de una fracción cruda de limón. 8tilizando ensayos animales demostraron que la actividad se destruye por oxidación y es proteida por aentes reductores &0raverman, *12)3 'ohnston et al., ())*+. En *1(2, #zent9:yoryi y ;aobel en *1? &Eitenmiller y Landen 'r., *111+.
4ebido a su alta sensibilidad a los factores externos, la vitamina C ha sido utilizada para definir la vida -til durante el almacenamiento de veetales frescos y semisecos. II. OBJETIVOS
Cuantificar el contenido de ácido ascórbico en frutas
Cin!tica de deradación
III. FUNDAMENTO TEÓRICO
1.1.
Estructura Química
El ácido ascórbico o el ácido L9ascórbico es la desinación de la Comisión 78=C9780 para @itamina C &(9oxo9L9teo9hexono9/9lactona9(,?9enodiol+. Las estructuras químicas del ácido ascórbico y alunos derivados se muestran en la fiura *. El ácido ascórbico tiene un anillo planar de cinco miembros3 los dos centros quirálicos que están en las posiciones / y 5 determinan los cuatro estereoisómeros. El ácido dehidroascórbico, la forma oxidada del ácido ascórbico, retiene aluna actividad de la vitamina C y puede existir como un hemicetal hidratado, o como un dímero &'ohnston et al., ())*+. Aanto el ácido L9ascórbico como el ácido dehidroascórbico poseen actividad biolóica o vitamínica. =ero el ácido 49isoascórbico no posee actividad biolóica, siendo este el sustituto comercial del ácido L9ascórbico &Bon, *1153 :reory, *11+. :reory &*11+ y 4avey et al. &()))+ afirman que debido a que el ácido L9 ascórbico posee propiedades ácidas y reductoras debidas al resto (,? enodiol, es un compuesto muy polar. El carácter ácido del ácido L9ascórbico se debe a la ionización del rupo hidroxilo en el carbono C9?, donde tiene un pDa* /.)/ a (5FC. 8na seunda ionización, la disociación del hidroxilo en el carbono C9(, con pDa( **./ a (5FC, es mucho menos favorables.
Gi. *. El ácido ascórbico y varios productos de oxidación. En solución, el á cido ascórbico probablemente existe como hemicetal hidratado &'ohnston et al., ())*+.
1.2.
Estai!i"a" # F$rmas "% D%&ra"aci'(
0raverman &*12)+ sostiene que pequeHas cantidades de oxíeno, que suelen haber en los alimentos a consecuencia de las diferentes operaciones realizadas, son suficientes para iniciar la cadena de reacciones autooxidativas
que deradan el ácido ascórbico. Iientras que Aannenbaun &*1+ citado por ;uapaya &*115+ menciona que el ácido ascórbico está su%eto a una variedad de mecanismos de deradaciónJ −
4eradación aerobia catalizada, en presencia de oxíeno, metales y enzimas
−
4eradación aerobia no catalizada, sólo oxíeno
−
4eradación anaerobia, flavonoides
−
Lixiviación
El ácido ascórbico es fácilmente destruido por la oxidación, especialmente a temperaturas elevadas yKo cuando la reacción es catalizada por iones metálicos como el Ge? y Cu(, convirti!ndose en la vitamina que se pierde más fácilmente durante el procesamiento, almacenamiento y cocción de los alimentos. #u deradación está relacionada con la temperatura, luz, p;, disponibilidad de oxíeno, metales, actividad de aua, ciertas enzimas y hasta la presencia de otras vitaminas como la riboflavina. #u estabilidad es mayor a p; ácidos y en ausencia de oxíeno puede resistir temperaturas de esterilización &0adui, *11)+. 4avey et al. &()))+ afirman que las hortalizas de ho%a verde y los ranos verde son particularmente vulnerables a los periodos inmediatos a la post9cosecha, pudiendo perder un ()M de ácido ascórbico. 8n proceso de deshidratación como el que se les da a las papas, puede producir hasta un 5M de p!rdidas de ácido ascórbico. Iientras que para las hortalizas, se puede dar alo de 5)M de p!rdidas, en el enlatado. Estas p!rdidas son inevitables debido a la movilización del aua. Aal como se aprecia en la fiura (, en los enlatados y otros productos, una parte del ácido ascórbico es lixiviado hacia el líquido de procesado.
Neímenes de Cocción a diferentes proporciones auaJ muestra *. #ancochado, *J*. *) min de cocción (. #ancochado, (J*. *) min de cocción ?. #ancochado, 5J*. *) min de cocción /. #ancochado y Grito, (J*. *( minutos de cocción 5. Grito en movimiento. *) min de cocción . Cocido a =resión, (J*. min de cocción . Iicroondas, ?)ml de aua. min de cocción
Gi. (. =!rdidas de Ocido L9scórbico durante el procesamiento y cocción en casa &4avey et al., ()))+ 4avey et al. &()))+ concluyen que la oxidación del ácido ascórbico ocurre en dos pasos. El primero es reversible, mientras que el seundo no lo es. En la primera etapa, la oxidación no es severa y sólo se pierde dos hidróenos hasta llear a la forma de ácido L94ehidroascórbico. En la seunda etapa, la vitamina C eneralmente se derada hasta (, ? dicetolucónico &fiura ?+. demás sostienen que esta reacción ocurre a los minutos a ?FC. En este proceso t!rmico, las enzimas catalizadoras, como la fenolasa, citocromos oxidasa, ácido ascórbico oxidasa y peroxidasas se desnaturalizan. Gi. ?. Pxidación del ácido L9ascórbico &4avey et al., ()))+
1.).
Ci(*tica "%! Tratami%(t$ T*rmic$ "%! +ci"$ Asc'ric$
1.).1. Ci(*tica "% D%&ra"aci'( "%! +ci"$ Asc'ric$ La estabilidad del ácido ascórbico ha sido descrita por varios modelos cin!ticos. Lain et al. &*12+ citado por ;uapaya &*115+ afirma que a temperaturas y actividades de aua altas, la cin!tica de deradación del ácido ascórbico es de orden cero. Lee y Labuza &*15+ y Ahompson &*12(+ citados por ;uapaya &*115+ afirman que con variaciones de parámetros como temperatura, metales, concentración de oxíeno y actividad de aua, la cin!tica es de primer orden. =or si parte, Nobertson y #amanieo &*12+, Eison9=erchono$ y 4o
= −
k (T )C ( t )
n
(1)
4ondeJ C&t+J Concentración del nutriente, en este caso vitamina C, en el tiempo t. $&A+J Constante de velocidad de reacción correspondiente a la temperatura A. &s Q*+ nJ >-mero de orden de reacción =ara una reacción de orden cero &n )+, la ecuación quedaría de la formaJ C (t )
= C − k (T ) t ( 2) o
R si la reacción fuera de primer orden &n *+
( ) = C
C t
exp[ − k (T )t ]
o
ln[ C ( t ) ]
= ln[ C ( t ) ] − k ( T ) t ( 3)
=ero si la reacción fuera de seundo orden &n (+ 1 C ( t )
=
1 C o
+
k ( T ) t ( 4 )
4onde C) es la concentración inicial del ácido ascórbico. #in embaro, en la actualidad se están aplicando modelos cin!ticos de deradación en procesos no isot!rmicos &Corradini y =ele, ())+.
1.).2. Ecuaci'( "% Arr,%(ius # E(%r&ía "% Acti-aci'( Cada una de las reacciones anteriormente mencionadas está dada para una temperatura determinada. La ecuación de rrhenius nos ayuda a correlacionar las constantes de velocidad de reacción.
( ) = K
k T
O
ln[ k ( T ) ]
Ea *1 R * T
exp −
= ln ( ko ) −
Ea * 1 RT
( 5)
4ondeJ $) J Coeficiente cin!tico o factor de frecuencia &sQ*+ Ea J Enería de activación &D'Kmol9D, DcalKmol9D+ N J Constante 8niversal de los :ases 7deales &2.?*/ 'Kmol9D, *.12 calKmol9D+
1.).). Ti%m$ "% R%"ucci'( D%cima! $ Va!$r D El tiempo de reducción decimal se define como el tiempo necesario para reducir la concentración de nutriente hasta su d!cima parte a una temperatura A. D ( T )
=
1.)./. T%rm$rr%sist%(cia $ Va!$r 0
2.303 K (T )
(7)
La sensibilidad de los nutrientes a la temperatura se mide por medio del valor 6, que se define como el incremento de temperatura necesario para reducir el valor 4 a su d!cima parte. log[ D ( T ) ]
1./.
=
log( Do )
−
1 Z
T ( 8)
M*t$"$s "% D%t%rmi(aci'(
Existen varios m!todos de cuantificación de ácido ascórbico. Eitenmiller y Landen 'r. &*111+ mencionan que las principales son los m!todos de titulación, diclorofenolindofenol, fluorescencia automatizada a
λ
de ?5 y //),
espectrofotometría a 5))nm o ;=LC. La fiura / nos ilustra acerca de las reacciones del ácido ascórbico con alunos tipos de análisis. Gi. /. Neacciones importantes del ácido L9ascórbico durante el análisis de la @itamina C &Eitenmiller y Landen 'r., *111+.
1./.1. Titu!aci'( c$( 2 "ic!$r$3%($!i("$3%($!
En
*1?),
Aillmans
introdu%o
el
m!todo
de
titulación
con
(,
diclorofenolindofenol &4C=7+. El 4C=7, que tiene una coloración azulina, es reducido por el ácido ascórbico hasta convertirse en una solución incolora. El ácido L9ascórbico es oxidado a ácido dehidroascórbico. En exceso de 4=7 obtiene una coloración lieramente rosada. Este es el punto final de titulación. 8na alternativa de la determinación visual del punto final de titulación es medir la absorbancia a 5*2nm. Este es un m!todo sencillo y práctico de realizar. #in embaro, existen deficiencias importantes. La titulación es limitada a la cuantificación de ácido de L9scórbico. El ácido dehidroascórbico no será medido a menos que sea reducido a ácido ascórbico. La titulación no distinue entre ácido L9scórbico del ácido isoascórbico. El m!todo no sirve para análisis de vitamina C en carnes procesadas y curadas que contienen ácido isoascórbico. La titulación con 4C7= puede ser usada para %uos frescos y multivitaminas que no contienen cantidades excesivas de cobre o hierro. =ara comidas procesadas o cocinadas que contenan cobre, hierro, o estaHo, debería utilizarse otros m!todos capaces de medir el ácido dehidroascórbico, además del ácido de L9 ascórbico. Los extractos altamente coloreados de frutas y hortalizas pueden enmascarar el cambio de color en el punto de final de la titulación. demás, la reducción de 4C7= no se limitada al ácido L9ascórbico. Cualquier sustancia reductora presente en la muestra puede disminuir el color. Aales interferencias pueden ocasionar mediciones altamente erróneas, si no reconocidas de ácido L9ascórbico. Las sustancias que pueden interferir incluyen iones cuprosos, ferrosos, y estaHosos, sulfito, tiosulfato, taninos, betanina, cisteína, lutatión, y reductones enerados por pardeamiento no enzimático. 4istintas modificaciones de este m!todo han sido introducidas para eliminar o minimizar los efectos de interferencias en la titulación 4C7=. Necientemente, un m!todo de extracción de fase &#=E+ sólida fue desarrollado que expande la titulación 4C7= para multivitaminas altamente coloreadas, bebidas no alcohólicas, y frutas y hortalizas. =or otro lado, el paso de limpieza remueve cobre, hierro, sulfito, y otras sustancias, como la cisteína y lutatión, disminuyendo la interferencia. La #ílica C*2 imprenada con (,( 9 bipiridil9(,19dimetil9*,*)9
fenatrolina &neocuproína+ y >9etilmaleimida quitan compuestos de Ge &77+ y Cu &7+ y sulfidril, respectivamente. El m!todo tiene prevista la determinación de ácido L9ascórbico y ácido dehidroascórbico por reducción de ácido dehidroascórbico a ácido L9ascórbico con cisteína antes del paso #=E. Este m!todo es simple y aumenta la sensibilidad del m!todo 4C7=. La incorporación del paso #=E en los m!todos reuladores existentes podría disminuir los problemas asociados con los m!todos existentes de titulación &Eitenmiller y Landen 'r., *111+. IV. MATERIA4ES 5 M6TODOS /.1.
Mat%ria 7rima >aran%a valencia
/.2.
/.).
Mat%ria!%s −
Cubetas de espectrofotómetro
−
=apel Aissue
−
Giolas de *))), 5)), *)) y 5) ml
−
Aubos de ensayo
−
=ipetas volum!tricas de *, (, *) y () ml
−
0ea$ers de *)) y 5) ml
−
Embudo
−
@arilla de vidrio
−
0alanza analítica, electrónica de ),* m de sensibilidad
−
Centrifua
−
Aablas de picar
−
Cuchillo
R%acti-$s
cido oxalico al ),/MJ =esar / y llevar a *))) ml con aua destilada.
#olución madre de acido ascórbico ).*M en solución ácido oxálicoJ =esar *))m de acido ascórbico y llevar a volumen de *)) ml con una solución de acido oxalico al ),/M #olución de (, 4icloroindofenolJ =esar *( m de (9 4G7G, disolver y llevar a *))) ml de volumen con aua destilada. Emplear aua destilada hirviente. lmacenar en botella de color oscuro y en refrieración /./.
M%t$"$!$&ía "% "%sarr$!!$
/./.1. 7r%araci'( "% s$!uci$(%s %st8("ar%s # cur-a "% ca!iraci'( Aomar *, (, ?, / y 5 ml de solución madre de acido ascórbico, llevar a volumen de *)) ml con la solución de acido oxalico al ),/M. Estas soluciones enumeradas del * al 5 contendrán *, (, ?, / y 5 m de acido ascórbico por *)) ml respectivamente Aomar / tubos de prueba y enumerarlos del 7 al 7@ y arear lo siuienteJ 7
*)ml de aua destilada
77 * ml de acido oxalico al ),/M 777 * ml de solución estándar 1 ml de aua 7@ * ml de solución estándar %ustar a cero la absorbancia usando 7 y una lonitud de onda de 5*5 nm &Dlinmeza$, ())+ l tubo 777 aHadir 1 ml del colorante y exactamente despu!s de *5 seundos, leer la absorbancia &L*+ %ustar a cero la absorbancia con la solución del tubo 777 l tubo 7@ aHadir 1 ml del colorante y exactamente despu!s de *5 seundos, leer la absorbancia &L(+ Nepetir desde (. =ara cada estandar de traba%o y reistrar los correspondientes valores de L* y L(. Construir la curva estandar con las concentraciones de acido ascórbico &mK*))ml+ en la abcisa y en la ordenada la absorbancia &L*9 L(+ para cada estandar de traba%o.
/./.2. 7r%araci'( # "%t%rmi(aci'( "%! c$(t%(i"$ "% Vitami(a C "% !a mu%stra r$!%ma Extraer ()) ml de %uo de la muestra problema por el m!todo de exprimido y llevarlo a clarificar con la centrifua a /))) rpm por *5 minutos, lueo someter a un filtrado al vacío con papel de filtro. Aomar ? ml del filtrado y llevarlo a *)) ml con solución de acido oxálico al ),/ M en una fiola u otra dilución que permita tener medidas dentro del rano de medida de la curva estándar. =roceder como se seHaló en el item anterior desde ( hasta . En luar del estándar de traba%o traba%ar con el %uo de la muestra problema. Calcular L*9L( y la concentración de acido ascórbico mediante la curva estándar.
/./.). Tratami%(t$ t*rmic$ "% !a mu%stra r$!%ma #e toma muestras del %uo filtrado de naran%a de *) ml y se coloca en tubos de prueba cerrados , para minimizar la variación de masa debido a la perdida de aua de la muestra por efecto de la temperatura &cebedo, ())5+ Las muestras serán sometidas a dos temperaturasJ A* 2)FC y A( 1)FC. =ara cada temperatura se tomara tiempos de *5, (5, /5 y ) minutos de calentamiento en el baHo termostático. Enfriar en baHo con hielo Nealizar una dilución adecuada con la muestra tratada &la lectura debe caer en el rano de la curva de calibración+ en *)) ml de acido oxalico al ),/M. Iedir la absorbancia en el espectrofotómetro a una S 5*5 nm. Nealizar tres repeticiones
/././. Ot%(ci'( "% !a %9ui-a!%(cia &ast$ "% 2 "ic!$r$i("$3%($! c$( ca(ti"a" "% 8ci"$ asc'ric$ Aransferir ( ml de la solución estándar de ácido ascórbico en un erlenmeyer de 5)ml conteniendo 5 ml solución de extracción. Aitular rápidamente con la solución estándar de (, dicloroindofenol hasta la aparición de un color rosado
persistente por un tiempo mayor de 5 seundos. Nealizar una titulación similar de ? blancos compuestos de ml de la solución de extracción más un volumen de aua equivalente al volumen de la solución estándar de dicloroindofenol astado en la titulación directa. 4espu!s de sustraer el blanco del asto en la solución estándar de ácido ascórbico, cálcular y expresar la concentración de la solución estándar de (, dicloroindofenol
como m de ácido ascórbico
equivalente a * ml de asto. V. RESU4TADO 5 DISCUSIONES Giura * 9 Curva estándar de cido ascórbico a 5*5 nm &m K*)) ml solución de acido oxálico al )./M+
Ta!a 1 : C$(c%(traci'( m&;1<
Aiempo &min+ ) *5 ?) /5 )
L* N* ).(* ).(( ).( ).(( ).(5
N( ).(( ).(? ).(* ).( ).(?
L( N* ).)1? ).*) ).*)( ).*5 ).*15
N( ).)1( ).**( ).*55 ).*5 ).()?
L* Q L( bsorbancia Concentración N* N( mK*))ml ).*2 ).*2 ).*1 5?.*(( ).*5 ).** ).*? /2.(1() ).*2 ).** ).*/( /*.1/5 ).**5 ).*)5 ).** ?(.(5( ).)2 ).)) ).)5 (*.12*
Fi&ura 2 > D%&ra"aci'( "% aci"$ asc'ric$ %( (ara(=a a ?<@C a "i3%r%(t%s ti%m$s
La concentración inicial de ácido ascórbico es de 5?.*(( mK*))ml de %uo de naran%a. Collazos reporta entre /? y 1( mK*)) de naran%a. Iientras que 0raverman &*12)+ afirma que el contenido de ácido ascórbico varía en función a la parte de la naran%a. La cáscara amarilla tiene entre *5 y (1(mK*)). En el albedo o cáscara blanca, 2 9 *1/ mK*)) y en la pulpa, //.19?.( mK*)). La fiura ( muestra la disminución del ácido ascórbico al aplicarse los tratamientos t!rmicos al %uo de naran%a en diferentes tiempos. Como se di%o anteriormente, a condiciones totalmente aerobias o anaerobias, la cin!tica de reacción es de orden cero &Nobertson y #amanieo, *123 Eison9 =erchono$ y 4o
El %uo de naran%a de variedad valencia tiene 5?.*(( mK*))ml de ácido ascórbico. R es deradado elevadas temperaturas respecto al tiempo de tratamiento.
REFERENCIAS BIB4IORAFICAS
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