Ngày nay, để phòng phòng tránh các căn bệnh hiể m nghèo, phát hiện các yế u t ố ố lạ trong thự c phẩ m cây tr ồng, ngườ i ta có thể sử d ụng nhiề u phươ ng ng pháp khác nhau như phươ ng ng pháp vật lý, phươ ng ng pháp giải phẫ u bệnh – sinh thiế t và phươ ng ng pháp hóa sinh, hoặc k ế ết t
ỗi phươ ng hợ p các phươ ng ng pháp này. M ỗ ng pháp có ư u và nhược điể m riêng. Tuy nhiên, ương đối chính xác, đượ c phổ biế n phương pháp đơ n giản, giá thành xét nghiệm r ẻ và t ương hiện nay là ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - xét nghiệm hấ p thụ miễ n
ết vớ i enzyme. d ịch liên k ế Hà N ội, 14/4/2012
I.
Giớ i thiệu phương pháp ELISA
1. Lịch sử phát triển Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Berson Prior mô tả phương tả phương pháp miễn dịch có gắn chất phóng x ạ (radioimmunoassay) dùng để xác định kháng nguyên, kháng th ể . Trong phương pháp này, kháng thể hay kháng nguyên có g ắn chất đánh dấu phóng x ạ và sự hiện diện của chúng được xác định thông qua tín hi ệu phóng x ạ. Tuy vậy, các chất phóng x ạ lại tiềm ẩn mối nguy hi ểm vì vậy người ta nghĩ đến một phương pháp mới trong đó tín hiệu đượ c phát ra không ph ải nhờ phóng xạ. Khi đó người ta đã biết rằng một số loại enzyme như các peroxidase phản ứng vớ i một số cơ chất nhất định như Tetramethylbenzidine hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid s ẽ phát màu. Màu sinh ra từ các phản ứng này có th ể đượ c sử dụng làm tín hi ệu nhận biết (tín hi ệu chỉ thị).
Tuy nhiên, để tín hiệu này đượ c sử dụng như chất phóng x ạ trong radioimmunoassay, tín hiệu màu phát ra ph ải đồng nghĩa vớ i sự có mặt của kháng th ể hay kháng nguyên. Chính vì vậy, giải pháp được đưa ra là enzyme sẽ đượ c gắn vớ i kháng nguyên hay kháng th ể. Kỹ thuật gắn k ết enzyme v ớ i kháng nguyên hay kháng th ể đượ c phát tri ển bở i Stratis Avrameas và G.B. Pierce . Ti ếp sau đó, vào năm 1966, Wide và Porath phát triển phương pháp gắn kháng nguyên và kháng th ể trên bề mặt rắn (bề mặt của các vi phi ếm hay các
đĩa) nhờ đó nhờ đó mà k háng háng nguyên hay kháng th ể không đượ c gắn k ết sẽ dễ dàng đượ c rửa trôi. Peter Perlmann và Eva Engvall (Th ụy Điển) cùng v ớ i nhóm Anton Schuurs và Bauke van
1
Weemen (Hà Lan) công b ố phương pháp được đặt tên ELISA (EIA) d ựa trên tất cả những
bướ c phát triển nói trên. Phương pháp chính thức ra đời vào năm 1971.
2. Khái niệm về ELISA Định nghĩa: ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là m ột k ỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng th ể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghi ệm.
*Chú thích: Kháng nguyên (antigen) là nh ững chất có khả năng huy động hệ miễn dịch và gây m ột phản ứng miễn dịch. Kháng nguyên bao g ồm protein l ạ, acid nucleic, m ột số lipide và
polysaccharide. Chưa biết gắn trên bề mặt.
Kháng thể (antibody) t ạo thành phần gramma globulin trong các protein máu. Kháng thể là những protein hòa tan do các t ế bào B hay tương bào tiết ra để đáp ứng vớ i một kháng nguyên và chúng có th ể gắn đặc hiệu với kháng nguyên đó.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước: - Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể. - Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên
tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm. Enzyme thường đượ c sử dụng là : + Peroxidase + Beta – galactoxidase + Alkaline phosphatase
3. Ưu điểm và hạn chế.
2
Kĩ thuật này khá nh ạy và đơn giản, cho phép t a xác định kháng nguyên ho ặc kháng th ể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So v ới kĩ thuật miễn dịch phóng x ạ (RIA-
Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau. ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây b ệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh.
Ưu điểm: +Dễ thực hiện + Có thể tiến hành đồng thờ i nhiều mẫu + Có thể phát hiện kháng th ể IgM, IgG, IgA và IgE
Hạn chế: + Đòi hỏi thờ i gian (có k ết quả sau 5h) + Thiết bị mắc tiền
II.
Phân loại 1. Direct ELISA (ELISA trự c tiếp)
Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đượ c gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đượ c phát hiện bằng một kháng th ể duy nhất (kháng th ể này đã đượ c gắn enzyme).
Quy trình thự c hiện:
3
Ưu nhược điểm: Ưu điểm:
+ Đơn giản nhất, Nhanh chóng b ở i vì chỉ có một kháng th ể và trải qua ít bướ c
hơn. + Phản ứng của kháng th ể thứ cấp đượ c loại bỏ.
Nhược điểm: + Độ đặc hiệu bị giớ i hạn vì thườ ng ng thì kháng nguyên có ít nh ất là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng th ể gắn vào m ột epitope. + Phản ứng mi ễn dịch của kháng thể chính có th ể ảnh hưở ng ng bất lợ i bằng cách tác dụng vớ i các enzyme. + Phải đánh dấu cho t ừng kháng th ể chuyên bi ệt vớ i từng đối tượ ng. ng. + Không có s ự linh hoạt trong l ựa chọn kháng th ể chính từ một thí nghiệm khác + Khuếch đại tín hiệu tối thiểu. 4
Áp dụng: - Phát hi ện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh đượ c sinh ra t ừ mẹ nhiễm HIV. - Phát hi ện sớm giai đoạn mớ i nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi k ết quả phát hiện KT không rõ ràng. - Theo dõi di ễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trong các m ục
đích nghiên cứu khác.
2. Indirect ELISA (ELISA gián tiếp) Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không đượ c gắn enzyme mà nó là m ục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng th ể khác (kháng th ể này mớ i là kháng th ể đượ c gắn vớ i enzyme).
Quy trình thự c hiện:
- Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng ( đượ c gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên s ẽ đượ c cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đườ ng ng chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các m ẫu chưa biết. - Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các gi ếng khác. Kháng nguyên chưa biết 5
đượ c hòa tan trong cùng m ột loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn. - Thêm dung d ịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào t ất cả các mẫu (k ể cả mẫu chuẩn). Bướ c
này đượ c gọi là "blockin" do protein huy ết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên b ề mặt của đĩa. - Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng th ể (biết trướ c) c) vào t ất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ k ết hợ p với các kháng nguyên đã đượ c cố định mà không k ết hợ p vớ i protein c ủa huyết thanh. - Thêm kháng th ể thứ cấp (secondary antibody), kháng th ể thứ cấp sẽ k ết hợ p vớ i bất k ỳ một kháng th ể còn dư (bướ c này có th ể đượ c bỏ qua nếu kháng th ể dùng để phát hiện
kháng nguyên đã gắn vớ i enzyme). - Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ đượ c loại bỏ. - Thêm cơ chất. Enzyme s ẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hi ệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa h ọc (enzyme có tác d ụng như yếu tố khuyếch đại).
Ưu nhược điểm: Ưu điểm:
+ Bướ c cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất k ỳ protein nào cũng gắn vớ i bề mặt đĩa vì vậy kháng th ể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh vớ i các protein khác trong huy ết thanh khi g ắn k ết vớ i bề mặt của đĩa. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này. + Kháng thể gắn enzyme có th ể sử dụng để đánh
dấu cho nhi ều loại kháng nguyên
nên tiện lợ i và kinh t ế hơn, dễ dàng thương mại hóa. + Linh ho ạt bở i vì các kháng th ể nhiều chính có th ể đượ c thực hiện trong một loài và cùng m ột kháng th ể thứ cấp có thể đượ c sử dụng để phát hiện. + Độ nhạy sáng được tăng lên bở i vì mỗi kháng thể chính chứa các epitope m ột số có thể đượ c ràng buộc bở i các kháng th ể thứ cấp , cho phép khu ếch đại tín hiệu.
Nhược điểm: + Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điề u này d ẫn đến k ết quả khác nhau gi ữa các thí nghi ệm và do đó cần phải thử nghiệm vớ i nhiều kháng huyết thanh khác nhau để k ết quả có thể tin tưởng đượ c. c. 6
+ Phản ứng có th ể xảy ra vớ i kháng th ể thứ cấp, dẫn đến tín hiệu không đặc hiệu. + Một bướ c ủ bệnh thêm là cần thiết trong th ủ tục.
3. Sandwich ELISA Đây là một dạng ELISA đượ c sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho ph ản ứng mạnh và nh ạy. Đượ c gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghi ệm được đánh giá thông qua sự k ết hợ p của hai loại kháng th ể là kháng th ể bắt (capture antibodies) và kháng th ể phát hiện (detection antibodies). K ỹ thuật này cũng đượ c phân làm hai d ạng là Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich).
3.1 Sandwich ELISA trự c tiếp
- Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng
thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau. - Vì phương pháp này có ưu điểm hơn hẳn những phương pháp khác mà chúng tôi chọn
phương pháp này để chẩn đoán bệnh virus đang nghiên cứu.
7
Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối quan hệ về kích thước và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm.
3.2 Sandwich ELISA gián tiếp
Chuyên bi ệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể đượ c gắn enzyme không phản ứng vớ i kháng th ể bắt kháng nguyên.
4. ELISA cạnh tranh Quy trình thự c hiện: + “Ủ” kháng thể không được đánh dấu vớ i kháng nguyên. + Đưa hỗn hợ p này vào các gi ếng của vi phiếm có chứa kháng nguyên. + Rửa đĩa, kháng thể không đượ c gắn k ết sẽ bị rửa trôi. Lượ ng ng kháng nguyên càng l ớ n, n,
lượ ng ng kháng th ể gắn thành công v ới kháng nguyên trong đĩa càng thấp do “cạnh tranh”
8
bướ c 1). Kháng th ể thứ cấp gắn + Thêm kháng th ể thứ cấp (kháng th ể của kháng th ể ở bướ vớ i enzym.
+ Thêm cơ chất. Lượng enzym dư sẽ giải phóng tín hi ệu huỳnh quang hay tín hi ệu màu. Trong phương pháp này nà y, hàm lượ ng ng kháng nguyên g ốc càng cao, tín hi ệu sản sinh càng yếu.
III.
Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp
1. Ảnh hưởng đến độ nhạy
Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng
Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên
Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên
2. Ảnh hưởng đến kết quả Nếu các đối chứng âm cho k ết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo
màu hoặc từ kháng th ể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm. Nếu màu không xu ất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối vớ i mẫu thì phải
kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản Nếu màu xuất hiện quá th ấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm tra thì ph ải
kiểm tra lại kháng thể đượ c gắn enzyme và n ồng độ của chất tạo màu. Nếu có tạo màu đối vớ i mẫu nhưng không tạo màu với đối chứng dương thì có thể
kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản. Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi
một yếu tố thí nghi ệm.
IV. -
Một số thiết bị sử dụng trong phương pháp ELISA Khay nhựa có các gi ếng.
-
Máy quang ph ổ với các bướ c sóng khác nhau.
-
Micropipette.
-
Máy rửa khay nh ựa. 9
V.
Ứ ng ng dụng
1. Trong thực phẩm -Phương pháp Elisa có thể phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời
gian vài giờ sau khi tăng sinh. -Phát hiện yếu tố gây dị ứng thực phẩm như sữa, đậu phộng, quả óc chó, hạnh nhân và
trứng -Phát hiện độc tố trong tảo. -Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus,sán lá gan… trong thực
phẩm. -Phát hiện chất chloramphenicol (chất không được phép có trong tôm, cá và các sản
phẩm thuỷ sản khác) -Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm,tàn dư thuốc diệt cỏ,thuốc trừ sâu…
2. Trong nông nghiệp -Chuẩn đoán bệnh Tristeza(tác nhân gây bệnh héo rũ) trên cây cam quýt. -Giám định sự hiện diện của BBTV(Banana Bunchy Top Virus) gây bệnh chùn đọt chuối. -Phát hiện kháng thể chống Mycoplasma hyopnewmonia(MH) ở heo. -Giám định bệnh lùn xoắn lá trên lúa bằng phương pháp DAS ELISA cải tiến
3. Trong y học -Chuẩn đóan và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và C,bệnh ung thư. -Ứng dụng để phát hiện bệnh A. cantonensis (bệnh viêm màng não) do loại giun kí sinh ở
phổi chuột gây ra. - Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền Trung-Tây Nguyên.
VI.
Ứ ng ng dụng của ELISA trong xét nghiệm HIV
1. Về HIV/AIDS 10
AIDS(Acquired Immuno-Deficiency Syndrome) là h ội chứng suy gi ảm miễn dịch mắc phải gây ra b ở i HIV (Human Immuno-Deficiency virus) AIDS xảy ra do s ự tấn công HIV vào t ế bào của hệ miễn dịch. Trướ c hết là làm suy gi ảm số lượ ng ng và rối loạn chức năng của tế bào miễn dịch dẫn dến hàng lo ạt rối loạn khác của hệ miễn dịch, gây ra suy gi ảm miễn dịch nghiêm tr ọng, tạo điều kiện cho nhiễm trùng cơ hội phát tri ển, cuối cùng là tử vong.
Cấu trúc HIV: HIV có đặc điểm chung của họ retroviridae. Hạt virus hoàn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm 3 lớp. - Lớp vỏ ngoài (vỏ peplon): lớp này là 1 màng lipid kép có kháng nguyên chéo với màng
nguyên sinh chất tế bào. Gắn lên màng này là các nhú, đó là các phân tử Glycoprotein có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (gp160). Nó gồm có 2 phần: + Glycoprotein màng ngoài :có trọng lượng phân tử là 120 kilodalton (gp120). GP120 là kháng nguyên đã biến đổi nhất, gây khó khăn cho phản ứng bảo vệ cơ thể và chế vaccin phòng bệnh. +Glycoprotein xuyên màng: có trọng lượng phân tử 41 kilodalton. trong (vỏ capsid): vỏ này gồm 2 lớp protein: - Vỏ trong (vỏ + Lớp ngoài hình cầu, cấu tạo bởi protein có trọng lượng phân töû 18 kilodalton (p18). + Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi các phân tử có trọng lượng phân tử là 24 kilodalton (p24). Đây là kháng nguyên rất quang trọng để chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS - Lõi: Là những thành phần bên trong của vỏ capsid, bao gồm:
+ Hai phân tử ARN đơn, đó là bộ gen di truyền HIV(genom).Genom của HIV chứa 3 gen cấu trúc: Gag (group specific antigen) là các gen mã hoá cho các kháng nguyên đặc hiệu của capsid cuả virus; Pol (polymerase) mã hoá cho các Enzym: reverve transcriptase (RT:Enzym sao mã ngược), protease và endonuclease (còn gọi kháng nguyên integrase); và EnV (envelop) mã hoá cho glycoprotein lớp vỏ peplon của HIV.
2. Nguyên lý của phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng HIV
11
Elisa gián tiếp Kháng thể kháng HIV có trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên virút HIV đã được cố định sẵn trên giá đỡ (các giếng phản ứng trên phiến nhựa). Phức hợp kháng nguyên -kháng thể này được nhận biết đặc hiệu bởi một cộng hợp là một kháng thể kháng immunoglobuline người (Ig) có gắn enzyme và sẽ cho phản ứng hiện màu với một cơ chất thích hợp. Giá trị mật độ quang của phản ứng màu (OD: optical density) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử. Elisa cạnh tranh Nguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự cạnh tranh giữa kháng khán g thể kháng HIV có trong mẫu thử với cộng hợp là kháng thể kháng HIV đã gắn với enzyme để được gắn lên các kháng nguyên đã cố định trên giếng. Giá trị mật độ quang (OD) tỷ lệ nghịch với lượng kháng thể trong mẫu thử.
Sanwich elisa Kháng thể kháng HIV trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên cố định trên giếng và được phát hiện bởi cộng hợp là các kháng nguyên virút gắn enzyme. Giá trị mật độ quang của phản ứng màu (OD) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử. Các thế hệ sinh phẩm Sinh phẩm thế hệ thứ nhất sử dụng kháng nguyên là vi rút toàn phần được ly giải và tinh chế từ các tế bào đã gây nhiễm với HIV. Các sinh phẩm này có độ nhạy và độ đặc hiệu hạn chế. Sinh phẩm thế hệ thứ hai dùng các kháng nguyên là protein tái tổ hợp hoặc protein tổng hợp. Sinh phẩm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn. Sinh phẩm thế hệ ba xử dụng các kháng nguyên tái tổ hợp và các proteine tổng hợp nhưng kháng thể được phát hiện theo nguyên tắc ELISA sandwich. Độ nhạy và độ đặc hiệu được cải thiện rõ rệt. Sinh phẩm thế hệ thứ tư phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể có trong mẫu thử. Sinh phẩm này cho phép phát hiện nhiễm HIV trước khi có sự chuyển đổi huyết thanh và là sinh phẩm được khuyến cáo nên lựa chọn cho kiểm tra an toàn trong truyền máu.
Các sinh phẩm ELISA ngày càng được hoàn thiện để có thể phát hiện sớm và chính xác 12
kháng thể kháng HIV, rút ngắn thời gian cửa sổ huyết thanh. Các sinh phẩm dùng các kháng nguyên có các epitop tạo ra các kháng thể sớm và có các loại kháng nguyên cho phép phát hiện kháng thể kháng virút HIV 1 & 2, các thứ type virút và các cá c virút HIV nhóm O.
3. Chế phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hiện nhiễm HIV 3.1.
Nguyên tắc
Là phản ứng ELISA “Sandwich “ một bướ c. c. - Kháng nguyên gắn trên giếng là các protein vỏ gp160 của HIV-1 và ANT70 (nhóm O);
gp36 của HIV2 - Nếu trong mẫu thử có kháng thể kháng HIV, kháng khán g thể này sẽ gắn đặc hiệu với kháng
nguyên cố định trên giếng. Đồng thời khối cầu cộng hợp là kháng nguyên HIV gắn men cũng có sẵn trong mỗi giếng sẽ tạo phức hợp kẹp chả: Kháng nguyên - Kháng thể - Cộng hợ p. p. - Phức hợp Kháng nguyên - Kháng thể - Cộng hợp sẽ được phát hiện bằng phản ứng hiện
màu với cơ chất
3.2.
13
Quy trình thự c hiện
4. Ưu điểm và hạn chế
14
Ưu điểm:
+ Cho phép th ực hiện đồng thờ i nhiều mẫu. Có thể dùng máy t ự động giảm bớ t thao tác
cho ngườ i làm xét nghi ệm, tránh sai sót và lây nhi ễm. + Đọc k ết quả bằng máy không ph ụ thuộc vào chủ quan của ngườ i làm xét nghi ệm. + Có thể lưu các bảng k ết quả và các thông s ố k ỹ thuật thuận lợ i cho vi ệc kiểm tra đánh giá chất lượ ng ng xét nghi ệm. + Giá thành xét nghi ệm tương đối rẻ.
Hạn chế:
+ Cần có sự đầu tư cho trang thiết bị ban đầu và bảo dưỡ ng ng máy móc. + Các sinh ph ẩm phải bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4-80C) + Thờ i gian thực hiện xét nghi ệm 2-3 gi ờ . + Không thích h ợ p cho những nơi số lượ ng ng mẫu ít do phải làm nhiều chứng.
5. Các kết quả bất thườ ng ng Một k ết quả dương tính không nhất thiết nghĩa là người đó bị nhiễm HIV vì có một số bệnh lý có th ể gây dương tính giả(như bệnh lý h ạch lymphô, giang mai, lupus). Khi k ết quả ELISA dương tính, thử nghiệm xác định Western blot luôn luôn ph ải đượ c thực hiện
sau đó. Western blot dương tính nhìn chung đượ c cho là ch ắc chắn có nhi ễm HIV. Kết quả âm tính không th ể loại trừ nhiễm HIV, vì cần một khoảng thờ i gian cho t ừ lúc nhiễm HIV đến khi xuất hiện đủ nồng độ kháng th ể kháng HIV để có thể đo được(do đó
đượ c gọi là giai đoạn cửa sổ). Vì vậy, nếu một ngườ i bị ngi ngờ nhiễm HIV cấp hay nguyên phát nghĩa là có giai đoạn cửa sổ, thì k ết quả ELISA và Western blot âm tính không th ể loại trừ chẩn đoán. Nên cần thực hiện thêm nh ững xét nghi ệm bổ sung như xét nghiệm tìm kháng nguyên p24 hay độ dung n ạp virus HIV. Hoặc phải xét nghi ệm lại sau 3 – 6 tháng.
15
Kết luận ELISA là một phươ ng ng pháp có nhiề u ưu điể m nổ i tr ội so vớ i các phươ ng ng pháp khác, cho
ự động giảm bớ t thao tác cho ngườ i làm phép thự c hiện đồng thờ i nhiề u mẫ u, u, dùng máy t ự độ ết quả đọc bằ ng xét nghiệm, tránh sai sót và lây nhiễ m, m, k ế ng máy không phụ thuộc vào chủ ết quả đo được có độ chính xác cao. H ơ ơn nữ a giá quan của ngườ i làm xét nghiệm nên k ế ết quả không quá lâu. V ậ y nên phươ ng thành xét nghiệm r ẻ , thời gian thu đượ c k ế ng pháp này nên đượ c sử d ụng phổ biế n r ộng ộng rãi để nâng cao k ế ết quả điề u tr ị bệnh, năng suấ t cây ồng cũng như chấ t lượ ng tr ồng ng thự c phẩ m của xã hội. Đặc biệt, ELISA giúp xét nghiệm HIV/AIDS – căn – căn bệnh thế k ỉ ỉ của con ngườ i.i. Trong quá trình làm tiể u luận này, hẳ n vẫ n còn nhiề u thiế u sót do hạn chế về kiế n thứ c
cũng như thờ i gian, vì vậ y, r ấ ấ t mong cô giáo và các bạn giúp đỡ để đỡ để tiể u luận đượ c hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn!
16
Tài liệu tham khảo Vi sinh vật học, Nguyễn Lân Dũng, NXB Giáo dục, 1997. Molecular Biotechnology, Glick BR and Jackj P, 1994. Genetic Engineering and Biotechnology, Chopra BL and Anwan N, 1990.
Hướ ng ng dẫn quốc gia về xét nghi ệm HIV, Bộ Y Tế, 2009. www.sinhhocvietnam.com www.genprice.com
17
ục Lục
M
I.
Giớ i thiệu phươ ng ng pháp ELISA ........................................................................................................
1
1.
Lịch sử phát triển ............................................................................................................................
1
2.
Khái niệm về ELISA .......................................................................................................................
2
3.
Ưu điểm và hạn chế. .......................................................................................................................
2
Phân loại ..........................................................................................................................................
3
II. 1.
Direct ELISA (ELISA trự c tiếp)....................................................................................................
3
2.
Indirect ELISA (ELISA gián tiếp) ................................................................................................
5
3.
Sandwich ELISA .............................................................................................................................
7
3.1 Sandwich ELISA tr ực tiếp...............................................................................................................
7
3.2 Sandwich ELISA gián ti ếp..............................................................................................................
8
4.
ELISA cạnh tranh ...........................................................................................................................
8
III.
Các yếu tố ảnh hưởng đến phươ ng ng pháp ......................................................................................
9
1.
Ảnh hưởng đến độ nhạy .................................................................................................................
9
2.
Ảnh hưởng đến kết quả ..................................................................................................................
9
IV.
Một số thiết bị sử dụng trong phươ ng ng pháp ELISA ....................................................................
V. Ứ ng ng dụng ...........................................................................................................................................
9 10
1.
Trong thực phẩ m ..........................................................................................................................
10
2.
Trong nông nghiệp ........................................................................................................................
10
3.
Trong y học ....................................................................................................................................
10
VI.
ng dụng của ELISA trong xét nghi ệm HIV ............................................................................. Ứ ng
10
1.
Về HIV/AIDS.................................................................................................................................
2.
Nguyên lý của phươ ng ng pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng HIV .................................... 11
3.
Chế phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hi ện nhiễm HIV ....................................................
10
13
3.1.
Nguyên tắc .............................................................................................................................
13
3.2.
Quy trình thự c hiện...............................................................................................................
13
4.
Ưu điểm và hạn chế ......................................................................................................................
14
5.
Các kết quả bất thườ ng ng ................................................................................................................
15
Kết luận .......................................................................................................................................................
16
Tài liệu tham khảo ......................................................................................................................................
17
18
