Penentuan Kadar Tablet Asetosal dengan Menggunakan Metode Perf ormance ormance Li quid Chr omato omatograp graphy) hy) HPLC (H igh Perf Maura Syafa Islami 260110150163
Jurusan Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, Jatinangor, Sumedang
Abstrak
Telah dilakukan optimasi sistem dan penetapan kadar sampel tablet asetosal dengan metode HPLC. HPLC (High (H igh Performance Liquid Chromatography) Chromatography ) merupakan teknik pemisahan yang paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu, salah satunya adalah zat aktif dalam obat. Dari hasil optimasi, diketahui sistem yang baik untuk sampel adalah fasa gerak metanol:air (62:38), laju alir 1mL/menit dan menggunakan fasa diam silika C 18, sedangkan dari pengujian, didapatka sampel asetosal sebesar 107% per tablet. Hal ini sesuai dengan syarat yang ditetapkan oleh Farmakope Indonesia. Kata kunci: HPLC, asetosal, fasa gerak, optimasi
Qualitative and Quantitative Analysis of Raw Materials Amoxicillin Abstract
System optimization has been done and the assay samples acetosal tablets by HPLC method. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) is a se paration technique that is most commonly used to define the levels of certain compounds, one of which is the active ingredient in the drug. From the results of the optimization, it is known that a good system for the sample is the mobile phase of methanol: water (62:38), flow rate 1mL / min and using a silica C18 stationary phase, while of testing, the sample didapatka asetosal by 107% per tablet. This is in accordance with the conditions set by the Indonesian Pharmacopoeia.
Keyword: HPLC, acetosal, mobile phase, optimization
HPLC (High Performance Liquid
PENDAHULUAN
Banyak
obat-obat
familiar
yang mengandung struktur aromatik yang umumnya merupakan gugus kromofor, termasuk analgesik OTC (Over The Counter) seperti aspirin (Snape, 2013). Kromofor merupakan kelompok atom yang bertanggung jawab terhadap absorbsi sinar UV/Vis yang secara prinsip akan memberikan warna terhadap molekul (Bayne dan
Chromatography) merupakan teknik pemisahan
atau
asam
2-
merupakan
siklooksigenase
yang
digunakan sebagai agen antipiretik, analgesik,
sering
senyawa-senyawa
tertentu
seperti
asam-amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein fisiologis;
dalam
cairan
menentukan
kadar
senyawa-senyawa aktif obat; dan lain-lain
(Gandjar
dan
Rohman,
2012). Fasa terbalik adalah bentuk
(asetiloksi)-benzoat inhibitor
paling
digunakan untuk menetapkan kadar
Carlin, 2010). Aspirin
yang
antiinflamasi,
dan
yang paling umum digunakan pada metode HPLC. Pada umumnya fasa terbalik ini memiliki ukuran kolom yang sama, namun silika dibuat menjadi
nonpolar
menambahkan
antitrombotik (Gujarathi, 2010).
rantai
dengan hidrokarbon
panjang (biasanya 8-18 atom a tom karbon) Beberapa metode yang dapat diterapkan
untuk
pada
permukaannya.
Kemudian
pengestimasian
pelarut polar akan digunakan sebagai seba gai
aspirin baik tunggal maupun dalam
fasa gerak, misalnya air dan alkohol
kombinasi
seperti metanol (Clark, 2016).
dengan
obat
lainnya
seperti UV, HPLC fasa terbalik, HPTLC,
spektrofluorometrik,
Zat dengan kepolaran berbeda
dan
spektrometri (Jain , et.al , 2012).
dapat
dipisahkan
dengan
HPLC
berdasarkan partisi cair-cair. Prinsip Kromatografi
cair
kinerja
tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut
HPLC
menggunakan
prinsip
kromatografi adsorbsi dan banyak
digunakan dalam industi farmasi dan
glasial terlebih dahulu. Kemudian
pestisida (Khopkar, 1990).
baku
Photodiode Array Detector (PDA, atau yang dikenal dengan deodearray
detector
menyediakan
spektrum
(DAD), UV
dari
asetosal
dilarutkan
dengan
metanol (larutan pengencer) hingga mencapai konsentrasi 500ppm. Penyesuaian sistem dilakukan, meliputi variasi laju
perbandingan serta
puncak elusi juga sebagai detektor
variasi
alir.
Perbandinga
absorbansi UV/Vis multiwavelength
metanol:air yang dilakukan adalah
(Dong, 2006).
(100:0; 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50: 40:60; 30:70; 20:80; 10:90;
METODE
dan 0:100), dan variasi laju alir adalah a. Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum
antara
lain
perangkat
HPLC, pH meter, beaker gelas, gelas
9,75mL/min;
0,80mL/min;
0,85mL/min;
0,90mL/min;
0,95mL/min; dan 1,00mL/min. Langkah
selanjutnys
adalah
ukur, vial, kertas saring dan pipet
dilakukan
volume.
dengan cara menginjeksian baku asetosal
b. Bahan
uji
kesesuaian
sebanyak
6
sistem
kali
dan
menghitung hasil AUC serta standar Bahan-bahan yang digunakan adalah
metanol,
tablet
deviasinya.
asetosal,
asetosal baku, asam asetat glasial, dan
Setelah diketahui sistem yang sesuai dengan asetosal, dibuat kurva
aquadest.
baku dengan mengencerkan larutan c. Prosedur
stok asetosal menjadi 80ppm, 60ppm, 40ppm, dan 20ppm.
Setelah alat dan bahan disiapkan,
Preparasi
sampel
asetosal
dibuat fasa gerak yang terdiri dari
dilakukan dengan menimbang 20
metanol:air (30:70)
tablet asetoal lalu digerus dan diambil
dengan pH air
dibuat 2,98 menggunakan asam asetat
100mg
lalu
diencerkan
dengan
metanol hingga 20mL dan disonikasi.
metanol:air
Setelah semuanya selesai dilakukan,
1mL/min, dan detektor UV 278nm.
pengujian kadar
Dari
asetosal
dengan
menggunakan HPLC dilakukan. Fasa gerak
yang
digunakan
hasil
(62:38),
AUC
laju
yang
alir
didapat,
dihitung kadar asetosal dalam tablet.
adalah
HASIL a. Pembuatan Fase Gerak
No. 1.
Perlakuan
Hasil
Gambar
Dicampurkan 30 bagian
Didapatkan campuran
metanol
air dan metanol (70:30)
dengan
70
bagian air. 2.
Asam
asetat
ditambahkan
pH air 2,98
ke
sebagian besar volume air hingga pH 2,98 3.
Ditambahkan air hingga
Didapatkan fase gerak
volume menjadi 70 bagian
air dan metanol (70:30) (Waliszewski, et.al , 2007)
b. Pembuatan Larutan Pengencer
No. 1.
Perlakuan
Hasil
Digunakan larutan
Didapatkan larutan
pengencer berupa metanol
pengencer metanol
Gambar
(Dhaneshwar, 2012) c. Preparasi Baku Asetosal
No.
Perlakuan
Hasil
Gambar
1.
Asetosal dilarutkan dengan larutan pengencer hingga
Didapatkan larutan
konsentrasinya 500ppm
baku asetosal 500ppm (Depkes RI, 1995)
d. Optimasi Sistem (Variasi Perbandingan Metanol Air)
No. 1.
Perlakuan
Hasil
Gambar
Larutan asetosal 20ppm
Didapatkan optimasi
diinjeksikan ke dalam
sistem fase gerak
sistem dengan
metanol-air dengan
menggunakan fase gerak
berbagai variasi
metanol:air dalam
perbandingan
beberapa perbandingan (100:0; 90:10; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50: 40:60; 30:70; 20:80; 10:90; dan 0:100) (Bhusari & Dhaneswar, 2012) e. Optimasi Sistem (Variasi Laju Alir)
No. 1.
Perlakuan
Hasil
Pengujian laju HPLC
Didapatkan optimasi
dilakukan berulang dengan
sistem fase gerak
membuat variasi laju alir
metanol-air dengan
yakni, 9,75mL/min;
berbagai variasi laju
0,80mL/min; 0,85mL/min;
alir
Gambar
0,90mL/min; 0,95mL/min; dan 1,00mL/min (Siyakumar , et.al , 2007)
f.
Uji Kesesuaian Sistem
No. 1.
Perlakuan Sistem
yang
Hasil
Gambar
telah
dioptimasi
diuji
kesesuaiannya melakukan
dengan 6
kali
penginjeksian 2.
Hasil
AUC
tiap
Didapatkan AUC tiap
penginjeksian
dicatat
penginjeksian dan
lalu
standar
standar deviasinya
dihitung
deviasinya (Depkes RI, 1995) g. Pembuatan Kurva Baku
No. 1.
Perlakuan Dipipet
larutan
asetosal
Hasil stok
200ppm
sebanyak
4mL,
diencerkan
Didapatkan
Gambar larutan
asetosal 80ppm
lalu
dengan
metanol hingga 10mL 2.
Dipipet
larutan
asetosal
stok
200ppm
sebanyak
3mL,
diencerkan
Didapatkan
larutan
asetosal 60ppm
lalu
dengan
metanol hingga 10mL 3.
Dipipet
larutan
stok
asetosal sebanyak 2mL,
Didapatkan
larutan
asetosal 40ppm
lalu diencerkan dengan metanol hingga 10mL 4.
Dipipet asetosal
larutan
stok
100ppm
Didapatkan larutan asetosal 20ppm
sebanyak
1mL,
diencerkan
lalu
dengan
metanol hingga 10mL
h. Preparasi Sampel Asetosal
No. 1.
Perlakuan
Hasil
Gambar
20 tablet asetosal digerus
Didapatkan berat total
lalu ditimbang
20
asetosal
5,3735g,
sehingga berat rata-rata per tablet adalah 0,27g. 2.
Ditimbang
100mg
asetosal
yang
menjadi
serbuk
sudah dan
Didapatkan
100mg
sebuk asetosal dalam labu ukur 20mL
dimasukkan ke dalam labu ukur 3.
Ditambahkan sebagian
Didapatkan
larutan pengencer
asetosal
dalam
larutan labu
ukur 20 mL 4.
Larutan
disonikasi,
Didapatkan
larutan
kemudian ditambahkan
asetosal 20mL dengan
larutan
pengencer
konsentrasi 5000ppm
hingga
volumenya
20mL 5.
Selanjutnya dilakukan
Didapatkan
pengenceran
larutan asetosal
pada
variasi
konsentrasi 500, 100, dan 60 ppm (Depkes RI, 1995)
i.
Penetapan Kadar Asetosal
No. 1.
Perlakuan
Hasil
Sistem
HPLC HPLC
dibuat dibuat
Didapatkan
dengan
fase
gerak
HPLC
metanol:
air
dengan
laju
(62:38) alir
1mL/min dan detektor
sistem
dengan
gerak
Gambar
fasa
metanol:air
(62:38) dengan laju alir 1mL/min.
UV 278nm 2.
Lalu, larutan baku dan
Didapatkan
larutan
sampel
baku dan larutan sampel
diinjeksikan
secara
diinjeksikan ke dalam
terpisah
dalam
kromatografi.
ke
larutan
kromatografi sebanyak 1 μL.
3.
Kemudian
diukur
Didapatkan
kadar
respon puncak utama,
asetosal
dan dihitung jumlah
sebesar 107%.
mg
asetosal
per
tablet
dalam
bagian tablet (Depkes RI, 1995)
j.
Data Optimasi HPLC
k. Perhitungan A. Optimasi Kondisi HPLC Terhadap Zat Aktif Asetosal
Fase gerak metanol : air (30 : 70), laju alir 1 mL/menit pada panjang gelombang 227 nm
1)
Jumlah Lempeng Teoritis
GRAF GRAF I K 1
= 1 6 × () 87,3 = 1 6 × ( 1,2 ) =84.681
2)
GRAF GRAF I K 2
= 1 6 × () 88,8 =16×( 1 ) =126.176,04
Faktor Kapasitas
GRAF GRAF I K 1
GRAF GRAF I K 2
− ,−, K’ = ,
− K’ = ,−, K’ = .
K’ =
K’ = 0,24
K’ = 0,40
3)
Resolusi
GRAF GRAF I K 1
− Rs = + ,9−, Rs = +
AUCasetosal = x W x T AUCasetosal = 1379,21 GRAFIK 2
− + , − , Rs = + Rs =
Rs = 1,33
Rs = 0,661 4) % RSD GRAFIK 1
GRAFI GRAFI K 2
X=
9,+ = 761,7 2 2
(X1-X2) = (1379,21-761 ( 1379,21-761,7) ,7) = 381318,6 (X1-X2)2 = (144,258-761 ( 144,258-761,7) ,7) 2 = 381234,62
[,]/ , −
AUCasetosal = x W x T
SR(%) =
AUCasetosal = 144,258
SR(%) = 0,13 x 873,24 SR(%) = 113,5%
/ Σ − SR(%) = [ − ] %RSD = −
%RSD =
, x 100% ,
%RSD =15%
Grafik I II
Rs 0,66 1,33
K’
0,40 0,24
N
84.681 126.176,04
%RSD
15%
Fase gerak metanol : air (30 : 70), laju alir 1 mL/menit pada panjang gelombang 278 nm
1)
Jumlah Lempeng Teoritis GRAF GRAF I K 1
GRAF GRAF I K 2
=16×( )
= 1 6 × () 1,480 = 1 6 × (26,17) 88,8 = 1 6 × (26,17) =184,22
1,455 = 1 6 × (26,36) 87,3 = 1 6 × (26,36) =175,5 2)
Resolusi
GRAF GRAF I K 1
GRAF GRAF I K 2
− + , – ,99 Rs = ,+ , , – , Rs = ,+ , 3)
− + , − , Rs = ,+, , − , Rs = ,+,
Rs =
Rs =
Rs = 1,397
Rs = 0,73
AUC
GRAF GRAF I K 1
GRAF GRAF I K 2
AUC asetosal = 224206 =
××
××17010
W = 26,36 AUC noise=
AUC asetosal = 226496 =
××
××17311
W = 26,17
××
AUC noise=
××
1398 =
××136
3213 =
W = 20,55 4)
××301
W = 21,35
% RSD
/ − SD = − SD = + 9− / − − / -4 + SD = 4,437 x 10
2622050 √ 2622050
SD = 4,437 x 10 -4 ( SD = 0,71845
Grafik I II
Kromatogram Kromatogram Kurva Baku
Rs 0,0232 0,0123
N 0,0488 0,0512
C
AUC 1
20 40 60 80
64368 126332 186838 225350
AUC Rata" 69666 67017 121729 124030.5 160643 173740.5 241560 233455 AUC 2
278 nm 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
y = 0,0004x 0,0004x - 4,421 4,4217 7 R² = 0,9989
0
50000
100000
150000
200000
250000
B. Proses Penentuan Penentuan Kadar Tablet Asetosal Dengan Metode HPLC
Perhitungan pengenceran kurva baku
1) 80 ppm, 10 mL
x = x 10 x 80 = x 200 = 4 mL
2) 60 ppm, 10 mL
x = x 10 x 60 = x 200 = 3 mL
3) 40 ppm, 10 mL
x = x 10 x 40 = x 200 = 2 mL
x = x 10 x 20 = x 200 = 1 mL
Perhitungan pengenceran pengenceran larutan sampel
1) 5000 ppm 100 mg serbuk asetosal dalam 20 mL larutan pengencer.
= 5000 ppm 2) 500 ppm, 10 mL
x = x x 5000 = 10 x 500
4) 20 ppm, 10 mL
= 1 mL 3) 100 ppm, 10 mL
x = x x 500 = 10 x 100 = 2 mL 4) 60 ppm, 10 mL
x = x x 100 = 10 x 60 = 6 mL
+ =
Perhitungan penentuan
AUCrata-rata =
kadar tablet asetosal
9+9 = 78105
y = 2754,1x + 12305
78105 = 2745,1x + 12305
= 107 mg
= 23,97 , ,9 = = 0,3994
% dalam tablet =
x=
x
100% = 107%
% Kadar per tablet =
,99 , = 0,107 gram PEMBAHASAN
Telah dilakukan penetapan
polar
ketika
terionisasi.
kadar asetosal dengan menggunakan
kepolaran
HPLC ( High Performance Liquid
asetosal dapat dipisahkan dengan
Chromatography). Chromatography).
HPLC karena prinsip kerja dari HPLC
Sebelum
inilah
yang
Sifat
dilakukan penetapan kadar sampel,
adalah
perlu dilakukan optimasi
dengan
berdasarkan polaritas. HPLC yang
menggunakan baku asetosal terlebih
digunakan adalah fasa terbalik yang
dahulu.
agar
dimana fasa diam merupakan silika
diperoleh sistem yang sesuai dengan
yang dilapisi oleh senyawa yang
sampel sehingga dapat diperoleh hasil
terdiri dari 18 atom karbon (Silika
pemisahan yang baik.
C18), sehingga senyawa yang bersifat
Tujuannya
Asetosal
adalah
atau
aspirin
merupakan asam yang sangat lemah, yang berarti iti zat ini tidak banyak terdisosiasi. Aspirin memiliki tiga gugus yaitu gugus asam karboksilat, ester, dan aromatik (cincin benzen). Menurut DeLorenzo (1981), aspirin
pemisahan
membuat
senyawa
lebih nonpolar dari asetosal akan teradsorbsi di permukaan fasa diam. Adsorpsi Underwood
menurut (2002)
Day
dan
merupakan
kecenderungan suatu senyawa untuk berkumpul di permukaan zat padat. Asetosal
atau
asam
asetil
bersifat sedikit polar (karena terdapat te rdapat
salisilat memiliki gugus autokrom (-
gugus yang dapat berikatan hidrogen)
OH) dan gugus kromofor (- CO)
ketika tidak terionisasi dan relatif non
sehingga bisa menyerap sinar UV
yang
merupakan
detektor
yang
umumnya digunakan dalam HPLC.
yang dipakai semakin tidak efektif. Ukuran
efisiensi
adalah
kolom
jumlah lempeng yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis pada distilasi.
Faktor
kapasitas
merupakan ciri khas suatu analit pada kondisi tertentu, yaitu pada komposisi Parameter optimasi tersebut
fase gerak, suhu dan jenis kolom
antara lain resolusi (daya pisah) yang
(panjang kolom, diameter kolom dan
didefinisikan
ketebalan lapisan film) tertentu.
sebagai
perbedaan
antara waktu retensi 2 puncak yang Dari
saling berdekatan. Nilai Rs yang baik adalah yang mendekati atau lebih dari 1,5
karena
akan
memberikan
pemisahan puncak yang baik ( base line resolution). resolution). Selain itu ada pula simpang
baku
relatif ( Relative Relative
Standar Deviation, Deviation, RSD) yang di mana menurut USP selain dinyatakan lain, untuk injeksi sebannyak 5 kali nilai RSD harus lebih kecil atau sama dengan 2%, dan untuk injeksi di atas. Faktor
pengekoran atau
tailing
factor yaitu terjadinya pengekoran pada kromatogram menjadi tidak simetris.
Kromatogram
yang
pengujian
kromatogram
tersebut
asetosal
kesesuaian
sistem,
metanol : air (62: 38) dan laju alir 1mL/menit
adalah
yang
terbaik
dilihat dari parameter yang telah disebutkan. Sedangkan perbandingan fasa
gerak
metanol:air
(70:30)
memiliki %RSD yang terlalu besar yaitu 15% di mana nilai ini sangat jauh dari syarat yang ditentukan untuk penginjeksian 6 kali, dan nilai Rs di bawah 1,5 menjadikan perbandingan fasa gerak ini kurang baik untuk digunakan. Setelah didapatkan kondisi optimum, barulah sampel dapat diuji
simetrsis, namun jika TF>1 artinya
dengan menggunakan HPLC.
kromatogram
hasil
tersebut
asimetris.
Semakin besar nilai TF maka kolom
dan
didapatkan hasil bahwa perbandingan
memberikan nilai TF=1 menunjukkan bahwa
baku
Dari
kromatogram yang dihasilkan
oleh detektor, dapat diketahui AUC
sampel.
Kemudian
dengan
memasukkan nilai AUC sebagai “y” ke dalam persamaan
linier, dapat
diketahui konsentrasi dari sampel asetosal tersebut. Dari perhitungan, didapatkan kadar asetosal sebesar 107,36% pada setiap
tablet,
kadar
asetosal
ini
memenuhi syarat karena menurut Farmakope
Indonesia
IV,
kadar
asetosal dalam tablet adalah antara 90% hingga 110%. Sehingga dapat dikatakan tablet sampel memiliki kualitas yang baik.
KESIMPULAN
Dengan menggunakan metode HPLC, didapatkan kadar asetosal sebesar 107,36% yang di mana hal ini sesuai dengan
pernyaratan
Indonesia
IV
Optimasi
sistem
digunakan
Farmakope
yaitu
adalah
90-110%.
HPLC
yang
fasa
gerak
metanol:air (62:38) dengan laju alir 1mL/menit
dan
detektor UV 278nm.
diukur
dengan
Departemen Kesehatan RI. 1995.
DAFTAR PUSTAKA
Bayne, S., dan M. Carlin. 2010. Forensic Applications of High Performance
Liquid
Chromatography. Chromatography.
US:
CRC
Press
Farmakope Indonesia. Edisi IV . Jakarta: Departemen Kesehatan RI Dong, M. W. 2006. Modern HPLC for
Bhusari, V., dan S. Dhaneshwar. 2012. Validated HPLC Method
Practicing
Scientists.
Canada: John WIley Gandjar, I. G., dan A. Rohman. 2012.
for Simultaneous Quantitation
Kimia
of
Yogyakarta: Pustaka Pelajar
Amlodipine
Besylate,
Atenolol and Aspirin in Bulk Drug and Formulation. J. of Pharmaceutical
and
Biomedical Sciences, Sciences, 17(1), 16.
Analisis. Analisis.
Gujarathi, S. C., A. R. Shah, S. C. Jagdale, P. A. Datar, V. P. Choudhari, B. S. Kuchekar. 2010.
Spectrophotometric
Simultaneous Determination of
Clark, Jim. 2016. High Performance Liquid
Farmasi
Chromatography
–
Aspirin
and
Ticlopidine
in
Combined Tablet Dosage Form
HPLC.
by
http://www.chemguide.co.uk/an
Spectroscopy,
alysis/chromatography/hplc.ht
Curve
ml [diakses [diakses pada 19 Maret 2017
Derivaive Spectrophotometric
pukul 12.44]
Methods.
Day, R. A., dan A. L. Underwood. 2002.
Analisis
Kimia
Kuantitatif . Jakarta: Erlangga DeLorenzo. R. A. 1981. Problem Solving in General Chemistry. Dubuque: Publishers
W.C.
Brown
First
Order
Area
(AUC)
Int.
Pharmaceutical
Derivative Under
and
Ratio
J.
Of
Sciences
Review and Research, Research, 3(1), 115-119 Jain, D. K., N. Jain, dan J. Verma. 2012. RP-HPLC Method for Simultaneous
Estimation
of
Aspirin and Prasugrel in Binary
Combination.
International
Waliszewski, K., V. Pardio, dan S.
Pharmaceutical
Ovando. 2007. A Simple and
Sciences and Drug Research,
Rapid HPLC Technique for
4(3), 218-221
Vanillin
Journal
of
Khopkar, S.M. (1990). (1990). Konsep Konsep Dasar Kimia Analitik . Jakarta : UI Press Snape, Tim. 2013. Pharmaceutical Chemistry. Chemistry.
UK:
University Press
Oxford
Alcohol
Determination Extract.
in
Food
Chemistry, Chemistry, 101(3), 1059-1062
