Penelitian Mengenai Perbandingan GeneXpert dengan Pewarnaan ZN dan Kultur pada Sampel Suspek TB paru
Abstrak Pendahuluan : Tuberkulosis tetap menjadi salah satu penyakit menular yang paling mematikan. Ada sejumlah pemeriksaan yang tersedia dalam mendiagnosis tuberkulosis tapi pemeriksaan mikroskopi konvensional memiliki sensitivitas yang rendah dan kultur walaupn digunakan sebagai standar emas membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mendapatkan hasil positif. Di sisi lain, teknik amplifikasi asam nukleat karena kecepatan dan sensitivitasnya tidak hanya membantu dalam diagnosis dini dan penanganan tuberkulosis terutama pada pasien d engan kecurigaan klinis tinggi seperti pasien immunocompromised, riwayat kontak dengan penderita tuberkulosis aktif dll, tetapi juga mengurangi transmisi penyakit. Tujuan : Mengevaluasi sensitivitas, spesifisitas, nilai prediktif positif dan nilai prediktif negatif dari amplifikasi amplifikasi asam nukleat assay (GeneXpert) (GeneXpert) menggunakan sampel pasien dengan suspect tuberkulosis paru dan bandingkan dengan pemeriksaan AFB mikroskopi smear (Ziehl Neelsen stain) dan Asam Fast Bacilli (AFB). Bahan dan metode : Kami meninjau secara retrospektif sampel pasien suspek tuberkulosis paru (termasuk bronchoalveolar lavage dan sputum) dari 170 pasien dari Jan 2015 sampai November 2015 untuk ZN noda, no da, budaya dan GeneXpert (Xpert® MTB / Rif assay). Sensitivitas, spesifisitas, PPV dan NPV dari mikroskop GeneXpert dan ZN dibandingkan dengan menggunakan kultur Liquid Mycobacterium tuberculosis sebagai standar emas. Hasil: Sebanyak 170 sampel pasien dievaluasi hingga analisis akhir Dari jumlah tersebut, 14 sampel positif menurut ketiga metode yang digunakan dalam penelitian kami. Sensitivitas keseluruhan, spesifisitas, PPV dan NPV GeneXpert adalah 86,8%, 93,1%, 78 ,5% dan 96% masingmasing dan untuk sampel BAL, 81,4%, 93,4%, 73,3% dan 9 5,7% masing-masing. Sensitivitas dan spesifisitas keseluruhan mikroskopi BTA masing - masing 22,2%, dan 78,5% dan untuk sampel BAL 22,2% dan 100% masing-masing. Untuk sampel AFB yang negative memiliki sensitivitas dan spesifitas adalah 79,1% dan 93,1%. Kesimpulan : GeneXpert memiliki sensitivitas yang lebih tinggi dari pada AFB smear pada sampel. GeneXpert bisa menjadi alat yang berguna untuk dia gnosis dini pasien dengan kecurigaan klinis tinggi tuberkulosis paru-paru. Positif GeneXpert, tapi pada h asil kultur negative harus dibaca dengan hati-hati dan berkorelasi baik dengan klinis dan riwayat pengobatan pasien. Keuntungan utama lainnya adalah bahwa Gen Xpert secara bersamaan mendeteksi resistansi Rifampisin dan sangat bermanfaat pada pasien dengan MDR dan HIV dengan tuberkulosis dan harus dipelajari lebih lanjut.
Pendahuluan
Menurut laporan Global Tuberculosis 2014 oleh Organisasi Kesehatan Dunia (WHO), Tuberkulosis (TB) tetap menjadi salah satu penyakit menular paling mematikan di dunia yang disebabkan oleh Bakteri Mycobacterium tuberculosis (MTB) [1]. Pen yakit ini biasanya menyerang paru-paru (pulmonary TB) dan disebarkan melalui transmisi udara dari orang dengan TB paru [2]. Pada tahun 2013, keluar dari perkiraan kejadian tahunan global dari 9 juta kasus TB, di India saja ada 2,1 juta (24%) kasus/tahun (seperempat kejadian global) [3]. Diagnosis dini sangat penting untuk penanganan pasien dini dan hasil klinis pasien. Hasil negatif palsu dan salah dalam diagnosa suspek TB umum terjadi di negara-negara berkembang, karena kebanyakan program pengendalian TB menggunakan pemeriksaan Ziehl-Neelsen (ZN) smear, yang memiliki sensitivitas rendah. Kultur, meski dianggap sebagai standar emas tapi lambat dan biasanya membutuhkan 2-6 minggu untuk menghasilkan hasil akhir dan membutuhkan keahlian teknis yang tepat[1,4,5]. Ada sejumlah metode Nucleic Acid Amplification (NAA) yang telah dikembangkan untuk deteksi dan identifikasi cepat Mycobacterium tuberculosis (MTB) pada spesimen klinis kasus tuberkulosis paru dan ekstra paru [6-8]. Teknik ini tidak hanya memberikan keuntungan dari kecepatan diagnosis tetapi juga mendeteksi genomik specimen MTB genrenik yang rendah. Baru-baru ini, WHO mendukung pemeriksaan GeneXpert (Xpert®MTB / Rifassay) untuk diagnosis TB [6]. GeneXpert menggunakan teknik DNA PCR untuk deteksi simultan Mycobacterium TBC dan mutasi Rifampisin. yang pertama sepenuhnya menggunakan amplifikasi kartrid berbasis asam nukleat (CB-NAAT) untuk deteksi TB yang mencakup semua langkah yang diperlukan DNA PCR. Dan hasilnya dapat diketahui dalam waktu 2 jam. Akurasi diagnostik GeneXpert untuk TB paru telah dilaporkan tinggi [9,10]. Pasien dengan risiko tinggi tuberkulosis seperti suspek pasien TB terkait HIV dan suspek anak termasuk kasus paru ekstra yang pemeriksaan AFB smearnya biasanya negatif, adalah yang paling mungkin diuntungkan den gan adanya GeneXpert [3,10]. Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi sensitivitas, spesifisitas, PPV dan NPV uji GeneXpert pada pasien dengan sampel positif dan negatif (sebaiknya sampel BAL) dari kasus suspek tuberkulosis paru dan dibandingkan dengan AFB smear microscopy (ZN stain) dan kultur Liquid AFB. Bahan dan metode Kriteria inklusi
Pasien dengan dugaan klinis tuberkulosis paru termasuk gejala batuk dengan atau tanpa dahak> 2 minggu,penurunan berat badan, kelelahan, hemoptisis dan hilangnya nafsu makan. Kriteria eksklusi
1) Sampel yang diterima tidak memiliki riwayat catatan klinis 2) Sampel diterima tanpa permintaan ketiga tes tersebut 3) Pasien dengan riwayat keganasan paru atau infeksi jamur
Spesimen paru dari 170 pasien dengan suspek pulmonary tuberkulosis, menerima secara retrospektif permintaan pemeriksaan ZN, kultur AFB cair dan GeneXpert dari pusat ke laboratorium Oncquest Ltd., ditinjau dari periode Januari 2015 sampai November 2015. Spesimen paru berupa 21 sputum dan 149 sampel BAL. Informasi yang berhubungan dengan pasien tersebut dikumpulkan dari Formulir Permintaan Uji (TRF), diterima dengan samp el. Metode laboratorium
Setiap sampel dahak dan BAL diterima di laboratorium dari pusat sesuai dengan kebijakan pengumpulan dan pengiriman laboratorium, dibagi menjadi tiga bagian; satu bagian pun segera diuji menggunakan GeneXpert, bagian kedua yang digunakan untuk mikroskop ZN smear dan bagian ketiga untuk MGET BACTEC 320 kultur cair dan dilakukan pada hari yang sama. Hanya satu sampel saja BAL atau sputum dari satu pasien terbagi dan diproses. Untuk kultur cair sampel diambil setelah dilakukan pemeriksaan GeneXpert dan ZN tapi sebaiknya diperiksa untuk sisa volume yang seharusnya tidak kurang dari 2 ml. Uji GeneXpert dilakukan sesuai struktur [11]. Reagen sampel ditambahkan pada sputum dan BAL dengan perbandingan 2: 1, secara manual diaduk dan disimpan selama 10 menit pada suhu kamar, lalu diputar lagi dan didiamkan selama 5 menit; 2 ml dari bahan yang tidak aktif dipindahkan ke kartrid uji dan dimasukkan ke dalam platform uji. Hanya hasil elektronik saja yang digunakan untuk perbandingan. Mikroskop Smear langsung dilakukan untuk mengtahui basi asam cepat dengan bagian kedua spesimen menggunakan metode pewarnaan ZN konvensional. Slide dengan basil asam berwarna merah cepat dianggap positif dan negative jika tidak memiliki basil asam cepat [12]. Bagian ketiga diproses menggunakan N-acetyl-L sistein-natrium hidroksida (NALC-NaOH) sesuai dengan intsrtuksi pabrikan, dikultur dimedia MGIT dan diinkub asi di MGIT BACTEC 320 sistem kultur cair [13]. Sodium hidroksida (NaOH) adalah agen dekontaminasi dan juga bertindak sebagai pengemulsi dan NALC bertindak sebagai agen mukolitik dan juga mengurangi konsentrasi NaOH yang dibutuhkan [12]. Saat tabung diberi tanda positif oleh sistem, pewarnaan ZN dan kultur pada 5% agar darah domba agar dilakukan dari tabung secara langsung untuk melihat adanya kontaminasi. Semua tabung diperiksa positif sampai 42 hari Uji coba MOTT dan Mycobacterium tuberculosis dari tabung kultur positif dilakukan dengan imunokromatografi yang cepat menggunakan MPT 64 antigen sesuai dengan pabrikan. Analisis
Data ditabulasikan dalam spreadsheet excel Microsoft untuk korelasi. Analisis data secara drastic dilakukan dengan paket stastical untuk sistem sains social versi SPSS17.0 Sensitivitas, spesifisitas, PPV dan NPV dihitung. Sensitivitas, spesifisitas, PPV dan NPV untuk diagnosis Tuberkulosis paru dihitung untuk mikroskopi BTA AFB dan GeneXpert, dengan menggunakan kultur Mycobacterium tuberculosis dari sputum atau spesimen BAL sebagai standar emas.
Dengan mengambil metode kultur sebagai acuan, sampel yang positif dan negatif dalam kultur dianggap true positif dan true negatif. Sampel positif dan sampel positif GeneXpert diambil sebagai sampel positif palsu. GeneXpert negatif dan kutur positif dianggap negatif palsu. Hasil
Sebanyak 170 spesimen pernafasan (149 BAL dan 21 Sputum sampel) diuji. Dari 170 spesimen, ada 14 sampel positif dan 123 spesimen negatif oleh ketiga metode tersebut. Di antara 170 sampel, 42 sampel (24,7%) adalah GeneXpert TB positif. Di antara 149 sampel BAL, 22 sampel kultur dan GeneXpert positif, 8 sampel GeneXpert positif dan 5 sampel hanya kultur positif. Di antara 21 sampel Sputum, 11 sampel adalah kultur dan GeneXpert positif, 1 sampel positif GeneXpert [Tabel / Gbr. 1]. Secara keseluruhan, 38 (22%) spesimen adalah kultur positif untuk AFB; 35 (20%) isolat ditemukan milik MTB (11 berasal dari spesimen sputum, 24 berasal dari spesimen BAL), sedangkan sisanya 3 (1,7%) strain dari sampel BAL d iidentifikasi sebagai Spesies Mycobacterium selain tuberkulosis (MOTT). Pemeriksaan lebih lanjut spesiasi isolat ini tidak dilakukan. Dari 170 sampel, hanya 14 sampel (6 BAL dan 8 sampel dahak) yang ditemukan AFB positif. Semua sampel positif BTA juga psotif kultur dan positif GeneXpert [Tabel / Gbr. 2]. Di antara 156 sampel AFB smear negative, 123 sampel negatif untuk ketiga metode tersebut. Sisa 33 sampel AFB smear negatif, 19 sampel kultur dan GeneXpert positif, 9 sampel positif dan negatif GeneXpert dan 5 sampel adalah kultur positif dan negatif GeneXpert. Secara keseluruhan sensitivitas, spesifisitas, PPV dan NPV GeneXpert saat kultur diambil sebagai metode referensi diilustrasikan pada [Tabel / Gambar-3]. Secara keseluruhan sensitivitas, spesifisitas, PPV dan NPV mikroskopi BTA AFB dan BAL ketika kultur diambil sebagai metode referensi ditunjukkan pada [Tabel / Gambar-4]. Sensitivitas, spesifisitas, PPV dan NPV GeneXpert pada sampel BAL dan untuk sputum digambarkan pada [Tabel / Gbr. 5]. Untuk sensitivitas sampel negatif AFB, spesifisitas, PPV dan NPV masing masing 79,1%, 93,1%, 67,8% dan 96%. Untuk sampel BTA positif, sensitivitas dan PPV adalah 100% [Tabel / Gbr.3]. Diskusi
Dalam penelitian retrospektif ini, kami telah mengevaluasi hasil diagnostikGene Xpert untuk mendeteksi MTB pada sampel pernafasan (BAL dan Sputum) dan membandingkannya dengan kultur AFB yang dianggap sebagai standar emas. Kultur mikobakteri untuk mendeteksi Mycobacterium tuberculosis bisa dilakukan dengan menggunakan media padat (Lowenstein Jensen) atau sistem kaldu cair (MGIT 320). Hasil kultur MGIT cair hasilnya dapat lebih cepat dibandingkan dengan medium LJ [14,15]. Pada penelitia kami hasil kultur MGIT 320 disertakan. GeneXpert adalah pemeriksaan sederhana yang dapat dilakukan dengan sedikit latihan. Hasilnya dapat diketahui dalam 2 jam, jauh lebih awal dari kultur yang biasanya memakan waktu berhari-hari [10,16].
Sejumlah penelitian telah menunjukkan kegunaan GeneXpert untuk diagnosis tuberkulosis paru [17-20]. Dalam penelitian kami, secara keseluruhan sensitivitas, spesifisitas, PPV dan NPV GeneXpert adalah 86,8%, 93,1%, 78,5% dan 96% masing-masing sebanding dengan penelitian lain [21-24]. Dalam penelitian lain, sensitivitas GeneXpert dan spesifisitas untuk sampel BAL adalah dari 81% -92% dan 71% - 100%, ini sama d engan penelitian kami seperti yang ditunjukkan pada [Tabel / Gambar-6] [21,22,24-26]. Meskipun spesifisitas dalam penelitian kami adalah 93,4%, karena hanya 3 sampel kultur positif untuk MOTT dan GeneXpert hanya mendeteksi MTB. Di dua sampel lainnya, meski ada pertumbuhan MTB dalam kultur tetapi ada kemungkinan bahwa jumlah bakteri mungkin terlalu rendah untuk GeneXpert untuk mendeteksi DNA dari kompleks MTB. Ini menunjukkan bahwa pasien dengan GeneXpert negatif masih dapat memiliki kemunginan TB dengan MTB atau MOTT [21,25,27]. Nilai NPV dari GeneXpert tinggi dalam penelitian kami dibandingkan dengan penelitian yang dilakukan oleh Kan wal et dengan media LJ digunakan dalam penelitian mereka sedangkan penelitian kami dan lainnya menggunakan metode kultur cair digunakan [26] [Tabel / Sintang-6,7]. 9 sampel dengan kultur negatif dan positif GeneXpert (spesifisitas-93,1% keseluruhan), hasil GeneXpert sangat rendah atau positif rendah. Karena kasus dievaluasi secara retrospektif, riwayat pengobatan dengan OAT tidak dapat dikesampingkan dengan jumlah bakteri rendah. Tes PCR menguatkan temuan DNA apapun, dari bacil hidup atau mati. Dalam mendiagnosis seseorang dengan tuberkulosis yang aktif perlu dilakukan sangat berhati-hati dalam menggunakannya sebagai satu-satunya metode. Memastikan riwayat pengobatan dengan OAT diharuskan untuk menghindari hasil positif palsu [16,25]. Dibandingkan dengan kultur yang digunakan sebagai standar emas, sensitivitas, spesifisitas, PPV dan NPV untuk mikroskop Smear untuk sampel BAL masing masing 22,2%, 100%, 100% dan 85,3% yang sesuai dengan penelitian lain seperti yang digambarkan pada [Tabel / Gambar-7] [21,25,26]. Uji GeneXpert memiliki sensitivitas keseluruhan 86,8% dan untuk sampel BAL 81,4% untuk PTB, yang lebih tinggi dari pada mikroskop smear (keseluruhan 36,8% dan untuk BAL 22,2%). Secara keseluruhan spesifisitas mikroskop GeneXpert dan smear adalah 93,1% dan 100% masing-masing yang juga berkorelasi baik dengan penelitian lainnya [21,25,26]. Untuk sampel BTA negatif sensitivitas dan spesifisitas GeneXpert adalah 79,1% dan 93,1% yang berkorelasi baik dengan penelitian lain dari 57% -75% dan 97% -100% masing-masing [27-30] Untuk BTA positif sensitivitas kasus adalah 100% sesuai dengan penelitian lain dari 68,6% - 100% [27-30]. Sensitivitas dan spesifisitas GeneXpert dalam uji sputum pada penelitian adalah 100% dan 90% sejalan dengan penelitian Sharma dkk., (96,9% dan 99,8%) [24]. Studi kami selanjutnya memperkuat penggunaan GeneXpert dalam bentuk smear sampel pu lmonal positif yang didukung oleh WHO [10]. Pada pasien dengan hasil mikroskop smear dan GeneXpert tidak sesuai tapi bukti klinis tinggi adanya TBC paru seperti HIV positif atau kritis, dokter mungkin memikirkan keputusan klinis mereka untuk memulai pengobatan anti tuberkulosis setelah dikirim sampel untuk kultur [6]. Namun, GeneXpert tidak menghilangkan kebutuhan mikroskopi konvensional, kultur dan sensitivitas obat anti tuberculosis diperlukan untuk memantau perkembangan pengobatan dan untuk mendeteksi resistensi terhadap obat-obatan selain Rifampisin [6].
Keterbatasan
Ada beberapa keterbatasan dalam penelitian ini: Pertama, penelitian ini dilakukan secara retrospektif dan hasilnya tidak dapat berkorelasi dengan temuan radiologi dan laporan histo patologis. Kedua, salah satu kekuatan penting dari tes Xpert adalah kemampuannya mendeteksi adanya resistansi Rifampisin. Sensitivitas dan spesifisitas uji MTB / RIF untuk mendeteksi resistensi Rifampisin tidak dievaluasi dan tidak termasuk dalam tujuan penelitian kami karena tidak mendapatkan permintaan untuk sensitivitas Rifampisin secara fenotipik metode di semua sampel positif. Ketiga, jumlah sputum dalam sampel kami sedikit, penelitian lebih lanjut dengan jumlah sampel yang lebih banyak perlu dilakukan. Kesimpulan
Pemeriksaan mikroskopi AFB memiliki spesifisitas yang hampir sama namun sensitivitas GeneXpert jauh lebih tinggi daripada mikroskopi AFB. Meskipun kultur dianggap sebagai metode standar emas namun karena butuh beberapa hari untuk mendapatkan deteksi Rifampisin yang positif. Di sisi lain GeneXpert dapat menjadi metode diagnostik yang berguna pada pasien dugaan tuberkulosis paru, baik AFB BTA negatif atau positif karena kecepatan dan deteksi antibodi Rifampisin secara simultan terutama bermanfaat pada pasien dengan TB yang terkait dengan MDR dan HIV. Efektivitas biaya GeneXpert di negara-negara berpenghasilan rendah seperti India dengan prevalensi tuberkulosis yang tinggi perlu dilakukan. GeneXpert positif, namun hasil negatif kultur perlu dibaca dengan hati-hati dan harus berkorelasi dengan baik dengan riwayat klinis dan pengobatan pasien.
