PEMBUATAN MEDIA TANAM KULTUR JARINGAN
I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Keberhasilan budidaya jaringan tanaman sangat dipengaruhi oleh media tanamnya. Selain sebagai tempat tumbuh, media tanam merupakan penyedia unsur hara dan zat-zat lain yang diperlukan eksplan untuk tumbuh. Seperti halnya dengan tanaman utuh, jaringan tanaman juga memerlukan unsure hara makro (N, P, K, Ca, Mg, dan S) dan unsur hara mikro (Fe, Zn, Bo, Cu, Mo, dan Co). Karena yang ditanam adalah sepotong kecil jaringan atau sekelompok sel, media tanam haruslah dapat menyediakan bahan-bahan lain yang dapat mendukung pertumbuhan dan perkembangan jaringan tanaman sehingga tanaman dapat melakukan regenerasi. B. Tinjauan Pustaka Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan dan organ , serta menumbuhkannya dalam keadaan aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali (Sany, 2007). Suatu keuntungan yang diperoleh dalam aplikasi teknologi kultur jaringan dalam memperbanyak tanaman krisan adalah upaya untuk un tuk memodifikasi generik tanaman tersebut. Rekayasa genetik tanaman krisan dapat dilakukan dengan menggabungkan teknologi nuklir dengan teknik kultur jaringan. Selain itu, kultur jaringan in vitro terbukti sangat efisien digunakan untuk pemeliharaan sumber genetik, bemilai ekonomi tinggi karena tidak memerlukan tempat yang lu as dan dapat mengurangi resiko kerusakan oleh hama dan penyakit serta memudahkan pengawasan dan pengelolaan (Anderson, 2000). Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf (Anonim, 2008). Media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar basal/basic medium dan media tambahan. Komposisi media dasar mengandung hara essensial e ssensial baik makro maupun mikro, sumber energy dan vitamin yang jumlah dan macamnya tergantung dari penemunya. Komposisi media perlakuan merupakan komposisi media tambahan yang dapat berupa vitamin, senyawa organik komplek atau zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh khususnya auksin dan sitokinin adalah suatu zat
organik utama yang mengendalikan proses morfogenesis didalam teknik kultur jaringan. Kepekaan jaringan terhadap zat yang ditambahkan pada media perlakuan khususnya zat pengatur tumbuh ditentukan oleh konsentrasi zat pengatur tumbuh yang sudah ada didalam jaringan tersebut (Starling et. al., 1986). Sebelum membuat media, terlebih dahulu dilakukan pembuatan larutan stok. Larutan stok dibuat dengan tujuan untuk memudahkan pengambilan bahan-¬bahan kimia khususnya yang dibutuhkan dalam jumlah kecil, tak perlu sering menimbang karena hal ini kurang praktis. Larutan stok disimpan di dalam lemari pendingin agar tidak mudah rusak dan mencegah terdegradasinya bahan-bahan kimia oleh mikroba penyebab kontaminasi. Pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan cennat, sebab larutan stok yang terlalu pekat akan mengalami pengendapan di lemari es, dan larutan stok yang terkontaminasi tidak boleh digunakan lagi (Hendaryono dan Wijayani, 2002). Hormon adalah bahan organik yang disintesa pada jaringan tanaman. Hormon diperlukan dalam konsentrasi yang rendah untuk mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Banyak molekul sintetis organik yang telah dikenal memiliki aktivitas serupa hormon. Senyawa sintetis dan hormon yang secara alami ada, dikenal dengan sebutan zat pengatur tumbuh (Heddy, 1991). Zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan pada media disimpan dalam gelap pada refrigerator sebagai larutan stok. Sedikit volume (misalnya 50 mL) larutan stok mengandung 1 mg mL-1 ZPT dapat disimpan untuk beberapa lama. Kestabilan zpt bervariasi: kinetin dan IAA tidak stabil pada kondisi cahaya, seh ingga biasanya disimpan pada botol berwarna gelap. Juga, IAA kehilangan aktivitasnya pada larutan aqueous sehingga larutan stok IAA sebaiknya tidak disimpan dalam jangka waktu yang lama (Gunawan ,2001). Auxin (IAA) dalam budidaya jaringan berperan dalam mempengaruhi perkembangan dan pembesaran sel, sehingga tekanan dinding sel terhadap protoplasma berkurang, hal ini mengakibatkan protoplast dapat mengabsorbsi air di sekitar sel, sehingga sel menjadi panjang terutama sel-sel di bagian maristem. Di sisi lain NAA dapat juga mendorong terbentuknya sejumlah sel yang cukup banyak tetapi tidak membelah, kumpulan dari sel ini yang disebut kalus. Kalus terbentuk karena terjadinya penumpukan sel-sel yang mengembang akibat dari masuknya air, unsur hara dan ZPT ke dalam sel, semua bahan tersebut tidak dapat disebarkan ke seluruh tubuh tanaman seperti akar, batang, dan daun, sehingga berkumpul di satu titik (Mariska dan Purnamaningsih, 2001). Kinetine berperan dalam mendorong morfogensis sel. Proses perpanjangan sel (fase G1 dalam pertumbuhan sel) berlangsung baik karena terpenuhi kebutuhan nutrisinya. Adanya kinetine yang ditambah pada media tumbuh mengakibatkan fase transkripsi dan translasi RNA berlangsung lebih giat, yang selanjutnya akan bertambah giat memasuki fase pembesaran sel (G2) ke fase pembelahan sel (Wijayani, 2002). C. Tujuan Mengenalkan pembuatan media tanam dari stok-stok bahan kimia yang telah
dibuat pada acara sebelumnya.
II. METODOLOGI Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah stok unsur hara makro nutrien, stok unsur hara mikro, stok unsur besi, stok vitamin, stok moi inositol, stok zat pengatur tumbuh, sukrosa, aquades, agarose, dan senyawa NaOH/HCl untuk pengukuran pH. Alat-alat yang digunakan adalah gelas piala, hot plate magnetic stirrer, mikro pipet, boto-botol tempat media, pH meter, dan autoklaf untuk sterilisasi. Cara kerja dari praktikum ini adalah dengan menyiapkan gelas piala yang diisi dengan aquades secukupnya sebagai pelarut (volume akhir tidak melebihi volume yang dikehendaki), setelah itu diletakkan di atas hot plate magnetic stirrer, kemudian stirrer dihidupkan. Disiapkan stok-stok unsur hara makro, mikro, besi, vitamin, mio inositol, dan zat pengatur tumbuh. Masing-masing stok unsur hara diambil sesuai volume yang tertera pada massing-masing botol stok (disesuaikan dengan volume media yang akan dibuat), dimasukkan ke dalam gelas piala sesuai dengan urutannya. Sukrose ditambahkan sesuai dengan media yang akan dibuat. pH diukur hingga mencapai 5,7-5,8, bila terlalu asam dapat ditambahkan NaOH, dan bila terlalu basa ditambahkan HCl. Aquades ditambahkan sampai volume yang dikehendaki, kemudian ditambahkan agar dan pemanas pada hot plate magnetic stirrer dinyalakan, tunggu sampai larutan masak dan homogen. Botol-botol sebagai tempat media disiapkan. Media yang telah masak dituang ke dalam botol-botol media, kemudian tutup dengan menggunakan tutup plasstik atau alumunium foil. Media disterilkan dengan autoklaf dengan suhu 1200 C dan tekanan 1 atm selama 20-25 menit. Media tanam siap digunakan.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN Formulasi media kultur jaringan pertama kali dibuat berdasarkan komposisi larutan yang digunakan untuk hidroponik, khususnya komposisi unsur-unsur makronya. Unsur-unsur hara diberikan dalam bentuk garam-garam anorganik. Komposisi media dan perkembangan formulasinya didasarkan pada jenis jaringan, organ dan tanaman yang digunakan serta pendekatan dari masing-masing peneliti. Beberapa jenis sensitif terhadap konsentrasi senyawa makro tinggi atau membutuhkan zat pengatur tertentu untuk pertumbuhannya. Pada periode tahun 1930an, formulasi media terutama ditujukan untuk menumbuhkan akar, tuber dan kambium. Media untuk penumbuhan akar yang dikembangkan oleh White (1934 dalam Gunawan 1988), pertama White menggunakan media yang berisi garam anorganik, yeast ekstrak dan sucrose, tetapi kemudian yeast ekstrak digantikan dengan 3 macam vitamin B, yaitu pyridoxine, thiamine dan nicotinic acid (Chawla, 2002). Kultur kalus biasanya ditumbuhkan pada media dengan konsentrasi garam-garam
yang rendah seperti dalam kultur akar. Nobecourt (1937) dalam George & Sherrington, 1984), menggunakan setengah konsentrasi dari larutan Knop yang biasa digunakan untuk hidroponik, digunakan juga untuk menumbuhkan kalus wortel. Pada media Knop sumber karbon berupa glucosa dan dan vitamin berupa cysteine hydrochloride. Media White juga dikembangkan oleh Hildebrant dkk (1946 dalam Gunawan 1988), dengan memodifikasi unsur-unsur makro yang lebih tinggi dibandingkan pada media kultur tembakau, media ini media ini digunakan mengkulturkan jaringan tumor tembakau dan bunga matahari. Konsentrasi untuk NO3- K+ lebih tinggi dibandingkan pada media White, namun konsentrasi tersebut masih lebih rendah dibandingkan media yang lain yang banyak digunakan pada kultur jaringan sekarang, sedangkan kandungan unsur P, Ca, Mg dan S pada media tumor matahari, sama dengan media untuk jaringan tanaman pada umumnya seperti pada media yang dikembangkan sekarang. Perbaikkan formulasi media yang penting adalah pengembangan unsur makro yang universal, untuk mendukung pertumbuahan jaringan tumbuhan. Dalam media perlu ditambahkan ammonium dengan meningkatkan konsentrasi NO3- dan K+. Media Knop dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine, cysteine-HCl dan IAA (Dodds and Roberts, 1983). Media White dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih r endah dari pada media-media lain yang umum digunakan sekarang. Media Knudson dan media Vacin and Went, media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+ disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji anggrek. Penambahan NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm. Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang menurun. Mereka mengambil kesimpulan, bahwa NH4+ sangat menunjang pertumbuhan kalus tembakau (Miller et al, (1956 dalam Gunawan 1988). Pertumbuhan sel dari jaringan suatu organ dibandingkan dengan jaringan tumor tanaman Venca rosea (Catharanthus roseus), menunjukkan bahwa penambahan ammonium ke dalam media White yang sudah dimodifikasi, mempunyai pertumbuhan yang lebih baik. Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan H2PO4- yang diperoleh, hampir sama dengan yang dikembangkan oleh Miller (W ood & Braun (1961 dalam Gunawan 1988).
Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. K alium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM. Unsur makro lainnya konsemtrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS tersebut, antara lain media : 1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro MS, dan memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM, sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin & Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) serta Nitsch & Nitsch (1969 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther. 2. Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan 1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya. 3. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan konsentrasi NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea glabra. Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan, maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983). Pengendapan unsur -unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang tetap. Media Gamborg B5 (media B5) pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5 dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman. Pada masa ini media B5 juga digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4, media ini menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang lebih tinggi dari 2 mM menghambat
pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang diberikan setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM, sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et al, 1968). Media Schenk & Hildebrant (media SH) merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman monokotil dan dikotil (Trigiano & Gray, 2000). Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+, Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14% kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas penggunaannya, terutama untuk tanaman legume. Media WPM (Woody Plant Medium) yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon. Pada umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan. Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar pada umumnya diambil dari nama penemunya atau peneliti yang menggunakan pertama kali dalam kultur khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting artinya. Dari sekian banyak media dasar yang paling sering dan banyak digunakan adalah komposisi media dari Murashige dan Skoog. Kadang-kadang untuk kultur tertentu, kombinasi zat kimia dari murashige dan Skoog masih tetap digunakan tetapi konsentrasinya yang diubah. Sebagai contoh media ½ MS, berarti konsentrasi persenyawaan yang digunakan adalah setengah konsentrasi media MS. Dalam pembuatan media, langkah pertama adalah membuat stok dari media terpilih. Penggunaan larutan stok menghemat pekerjaan menimbang bahan yang berulang–ulang setiap kali membuat media. Selain itu, kadang-kadang timbangan yang dibutuhkan untuk menimbang jumlah kecil tidak tersedia dalam laboratorium. Setiap larutan stok dapat dipergunakan sampai 100 liter media, bahkan larutan stok mikro dapat dipergunakan sampai 100 liter media. Larutan stok dapat disimpan ditempat yang bertemperatur rendah dan gelap. Pembuatan larutan stok berdasarkan pengelompokan dalam : Stok makro, stok mikro, stok Fe, stok vitamin dan stok hormone terutama bila larutan stok tidak disimpan terlalu lama (segera digunakan habis). Stok hormon dapat disimpan antara 2-4 minggu, sedangkan stok hara dapat disimpan 4-8 minggu. Dengan adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya hanya dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja. Hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan larutan stok adalah penyimpanan (daya simpan) larutan. Larutan yang sudah mengalami pengendapan, tidak dapat digunakan lagi. Pengendapan larutan stok umumnya terjadi bila kepekatan dapat
dihindari dengan membuat larutan yang tidak terlalu pekat atau tidak menggunakan larutan campuran, yaitu dengan membuat satu larutan stok hanya untuk satu jenis bahan (terutama untuk unsur hara makro). Kondisi simpan juga diperhatikan, karena ada beberapa bahan yang tidak tahan dalam suhu tinggi atau cahaya. Larutan stok kadang-kadang ditumbuhi mikroorganisme. Larutan stok yang terkontaminasi mikroorganisme ini, juga tidak dapat digunakan lagi. Oleh karena itu kondisi simpan harus dijaga kebersihan dan tempat (wadah) larutan harus diusahakan cara-cara pembuatan larutan stok untuk media Murashige dan Skoog. Senyawa-senyawa sumber unsur hara makro diperlukan dalam jumlah yang cukup besar. Oleh karena itu sebaiknya dibuat dalam larutan stok tunggal. Selain itu jenis anion senyawa sumber unsur hara makro tidak sama, kemungkinan hal tersebut akan mempercepat pengendapan larutan bila dibuat larutan stok campuran. Langkah-Iangkah pembuatan media MS 1 liter (I) : a. Melarutkan sukrosa dalam aquadest 0.251 ml. b. Memasukkan larutan stok MS dan aquadest hingga 1 L c. Melakukan pengukuran pH (pH=5,8). Bila pH kurang dari 5,8 ditetesi larutan NaOH dan bila pH lebih dari 5,8 ditetesi lerutan HCl. d. Melakukan peneraan dengan cara memasukkan campuran ke dalam labu takar dan menambahkan aquadest hingga tepat 1 L. e. Memindahkan campuran tersebut dalam panci, kemudian dilarutkan agar didalamnya. • Untuk perlakuan I, kemudian ditambahkan NAA 0.1 ppm • Untuk perlakuan I, kemudian ditambahkan 2,4 D 0.5 ppm • Untuk perlakuan I, kemudian ditambahkan NAA 0.1 ppm + Mg 0.05 ppm • Untuk perlakuan I, kemudian ditambahkan 2,4 D 0.5 ppm + Mg 0.05 ppm. f. Memanaskan campuran tersebut sampai mendidih, menuangkannya dalam botol media. Setiap 1 liter komposisi larutan media untuk 40 botol media yang berupa botol selai g. Menutup botol media dengan Alumunium foil secara rapat. h. Melakukan sterilisasi media dalam autoklaf yaitu autoklaf dipanaskan hingga mencapai suhu 1210 C, dan tekanan uap 17 kg/cm2 selama 20 menit. i. Mendinginkan dan menyimpan media dalam ruang inkubasi.
IV. KESIMPULAN 1. Media dasar Murhasige dan Skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hampir semua jenis kultur, terutama pada tanaman herbaceous. 2. Media dasar B5 untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume lain. 3. Media dasar White (1934) yang sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat. 4. Media dasar Vacin dan Went yang biasa digunakan untuk kultur jaringan anggrek. 5. Media dasar Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan dalam kultur tepung sari
(pollen) dan kultur sel. 6. Media dasar schenk dan Hildebrandt (1972) atau media SH yang cocok untuk kultur jaringan tanaman-tanaman monokotil. 7. Medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant Medium (WPM) 8. Media N6 untuk serealia terutama padi.
DAFTAR PUSTAKA Anderson. 2000. Effect of Level and Duration Suplemantary Light on Development of Chrysanthemum. Hort. Abstract. 61(92): 148-155. Anonim. 2008. Kultur Jaringan : Alternatif Pengadaan Bibit Unggul. http://www.dephut.go.id/INFORMASI/SETJEN/PUSSTAN/info_5_1_0604/isi_11.htm. Diakses tanggal 12 Mei 2009. Gunawan, L.W. 2001. Budidaya Anggrek. Jakarta: Penebar Swadaya. Heddy, S. 1991. Hormon Tumbuhan. Jakarta: CV Rajawali. Hendaryono, D. P. S. dan A Wijayani. 2002. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius. Yogyakarta. Mariska, I. dan R. Purnamaningsih. 2001. Perbanyakan vegetatif tanaman tahunan melalui kultur in vitro. Jurnal Litbang Pertanian 20 (1) : 1-8. Sany. 2007. Tentang Kultur Jaringan. http://www.bndah-lembang.com/kuljar. Diakses tanggal 12 Mei 2009. Starling, R.J., H.J. Newburry, dan J.A . Callow, 1986. Putative Auxin Receptors in Tobacco Callus. University of Birmingham. UK. Wijayani, A. 2002. Pertumbuhan kentang pada berbagai intensitas cahaya dan konsentrasi benzil amino purin. Agrivet 5 (2): 98-104. http://manaree.blogspot.com/2009/05/pembuatan-media-tanam-kultur jaringan.html
