RT-PCR 1. Definición: En la RT-PCR, se retrotranscribe una hebra de ARN en ADN de ARN en ADN complementario (ADNc) (ADNc) usando una enzima una enzima llamada transcriptasa llamada transcriptasa inversa o transcriptasa reversa, reversa, y el resultado se amplifica mediante una PCR una PCR tradicional. El término PCR en transcripción reversa no debe confundirse con la PCR la PCR en tiempo real, también real, también denominada PCR cuantitativa (Q-PCR ), ), que en ocasiones, por una mala traducción del inglés, se abrevia de la misma manera ( RT). PCR , por Real Time-PCR ). Una de las características más importantes es que en el proceso de RT-PCR, el ADNc generado ya no lleva los intrones los intrones que sí tendría el ADN original. De este modo, al expresar el ADNc producto de la RT-PCR, se generará un ARNm formado exclusivamente por exones. Esto exones. Esto ha permitido darle a esta técnica uno de sus usos más importantes: insertar genes eucariota genes eucariota en organismos procariota. organismos procariota. 2. Componentes de la RT-PCR: a) ADN molde: El ARN sirve como plantilla en la transcripción inversa. b) Cebadores: Para iniciar la transcripción inversa, las transcriptasas
inversas requieren un oligonucleótido de ADN corto llamado cebador para unirse a sus secuencias complementarias en la plantilla de ARN y servir como punto de partida para la síntesis de una nueva cadena. Dependiendo de la plantilla de ARN y las aplicaciones posteriores, hay cebadores de tres tipos básicos disponibles: cebadores de oligo (dT), cebadores aleatorios y cebadores específicos de genes.
Oligo dT:
Los cebadores Oligo (dT) consisten en un tramo de 12-18 desoxitimidinas que se hibridan con colas poli (A) de ARNm eucariotas, que constituyen solo 1-5% del ARN total. Estos cebadores son la elección óptima para construir bibliotecas de ADNc a partir de ARNm eucariotas, clonación de ADNc de longitud completa y amplificación rápida 3 'de extremos de ADNc (RACE 3').
Cebadores Aleatorios:
Los cebadores aleatorios son oligonucleótidos con secuencias de bases aleatorias. A menudo tienen una longitud de seis nucleótidos y suelen denominarse hexámeros aleatorios, N6 o dN6. Debido a su unión aleatoria (es decir, sin especificidad de plantilla), los l os cebadores aleatorios pueden reasociarse potencialmente con cualquier especie de ARN en l a muestra. Por lo tanto, estos cebadores pueden considerarse para la t ranscripción inversa de ARN sin colas poli (A). Si bien los cebadores aleatorios ayudan a mejorar la síntesis de ADNc para la detección, no son adecuados para la transcripción inversa de longitud completa del ARN largo.
Los cebadores específicos de genes : Ofrecen el cebado más específico en la transcripción inversa. Estos cebadores están diseñados en base a secuencias conocidas del ARN diana. Los cebadores específicos de gen se usan comúnmente en aplicaciones de RT-PCR de un paso c) dNTPs:
Los dNTP generalmente deben estar a 0,5-1 mM cada uno, preferiblemente a concentraciones equimolares. d) Agua DEPC:
El agua utilizada en las reacciones de transcripción inversa debe estar libre de nucleasas. e) Enzima transcriptasa ( AMV o MMVL) La mayoría de las transcriptasas inversas utilizadas en biología molecular se derivan del gen pol del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) o del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV). La transcriptasa inversa de AMV posee una fuerte actividad de RNasa H que degrada el ARN en el ARN: híbridos de ADNc, dando como resultado fragmentos de ADNc más cortos (<5 kb).La transcriptasa inversa MMLV es una enzima de 75 kDa con una temperatura de reacción óptima alrededor de 37 ° C. Aunque es menos termoestable que la transcriptasa inversa AMV, la transcriptasa inversa MMLV es capaz de sintetizar un ADNc más largo (<7 kb) con una mayor eficacia, debido a su menor actividad de RNasa H.
