Partes del microscopio compuesto moderno El microscopio compuesto de uso común también se conoce con el nombre microscopio óptico en base a que sus propiedades derivan del empleo de lentes ópticas. Está constituido por cuatro grupos de dispositivos o sistemas articulados de tal manera que garantizan un funcionamiento óptimo y ergonómico (19) (ver fig. 4-3): • Sistema mecánico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y demás elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina, revolver, tubo). • Sistema óptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolución (objetivos y ocular) • Sistema de Iluminación: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o no) y transmite n, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos que van a incidir sobre el espécimen (lámpara o fuente de iluminación, espejo, condensador y diafragma). • Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del instrumento (cámaras fotográficas, de video, computadoras, accesorios para dibujar, entre otros).
4.3.-Sistema mecánico del microscopio La parte mecánica del microscopio también se denomina montura y es de forma y dimensiones muy variables, dependiendo del fabricante y el precio del instrumento. De manera general se describen modelos grandes, medianos y pequeños o portátiles. Los modelos grandes poseen todos los aditamentos que garantizan un trabajo profesional y permiten el intercambio de piezas y accesorios para realizar los trabajos más variados y s u costo es el más elevado. ele vado. Los modelos medianos no convienen a todo tipo de investigación i nvestigación pero son más prácticos puesto que su precio es menor gracias a su construcción más simple. si mple. Los microscopios portátiles responden a necesidades más restringidas y producen aumentos menores, conviniendo para observaciones someras. Toda montura, por complicada que sea posee los siguientes elementos: pie o base, mecanismo de enfoque, la platina, el revólver y el tubo del ocular.
4.3.1- Pie o base Generalmente en herradura o en Y, aunque también puede ser rectangular, con un peso considerable que garantiza la estabilidad del instrumento. La base aloja la fuente de iluminación y puede contener un mecanismo para regular la intensidad luminosa. Sirve de soporte a una columna o brazo sobre el cual reposa el resto del aparato. La columna c olumna puede ser inclinada; en su parte más inferior se dispone el condensador y la parte superior posee una cremallera que permite desplazar en sentido vertical el condensador, la platina o el revólver y el tubo. Las ventajas que procura el microscopio inclinado son múltiples y la posición es más confortable para el observador (actividad que es muy incómoda cuando el tubo del microscopio es vertical).
4.3.2.-Mecanismo de enfoque Se logra desplazando en sentido vertical ya sea la platina donde se coloca el espécimen o ya sea el revólver donde están colocados los objetivos, de modo que se pueda centrar el punto focal del objetivo que se está utilizando es ese momento. Se logra mediante dos mecanism os, primero uno rápido del tornillo macrométrico y segundo, otro lento del tornillo micrométrico. La cremallera que permite el movimiento rápido del tornillo macrométrico posee dientes que se engranan y producen un movimiento tosco para lograr un enfoque aproximado. Se utiliza para enfocar con los objetivos de poco aumento y para subirlos rápidamente con la fin alidad de colocar o retirar de la platina el preparado histológico. El tornillo micrométrico por el contrario posee una graduación tal que cada división de la rosca permite un movimiento vertical imperceptible en el orden de 0,001 mm. Esta disposición permite evaluar de manera aproximada el espesor de los objetos, considerando el número de vueltas que realiza el tornillo al enfocar su parte más superficial y luego la más profunda. El movimiento del tornillo micrométrico tiene una extensión de 5mm aproximadamente y está limitado. Permite un enfoque fino y se utiliza utili za con los objetivos de mayor aumento (11).
4.3.3.-La platina Es el soporte horizontal donde se colocan las pre paraciones histológicas. Presenta en el centro un orificio circular por donde pasa el rayo de luz producido por la fuente luminosa y proveniente del condensador.
Generalmente es de forma cuadrada y posee un sistema de fijación e inmovilización de la lámina portaobjeto compuesto por pinzas o una pieza articulada que esta fij a a otro dispositivo, el carro. Este dispositivo permite el examen metódico y completo de la preparación al proporcionar un desplazamiento hacia adelante o hacia atrás y de derecha a izquierda y viceversa. Otra pieza, el vernier (denominado así gracias al nombre de su inventor en 1631), también llamado nonius, consiste en dos pequeñas reglas graduadas en milímetros cuya finalidad es la de obtener coordenadas aproximadas que sirven de referencia para localizar una estructura determinada en la preparación. En la práctica, el uso del vernier no es frecuente, se hace un poco complicado anotar las cifras y más difícil aún colocarlas en las reglas y localizar la estructura en cuestión. Además, estas cifras solo son válidas para el microscopio en el cual se obtuvieron. Hay otros procedimientos más simples para tal fin (11, 64).
4.3.4.-El revólver Considerado como un accesorio del tubo. Es un implemento muy importante que permite el intercambio rápido de objetivos mediante un movimiento de rotación. El revólver está constituido por una semi-esfera que posee una serie de anillos en los cuales van atornillados los objetivos. Esta pieza gira alrededor de un eje que está colocado en la parte inferior del tubo. Puede ser de diversas forma s y de igual manera, alojar un número variable de objetivos (dos, tres, c uatro o más).
4.3.5.-El tubo Soporta la porción óptica del microscopio. Es un cilindro hueco de longitud variable, cuyo interi or está pintado de negro mate y posee un diafragma para impedir la formación de reflejos y facilitar la observación. El tubo puede ser doble y alojar dos l entes oculares (microscopio binocular). En los modelos de microscopios grandes destinados a la microfotografía, hay un tercer t ubo accesorio, generalmente más largo y vertical que sirve para conectar una cámara fotográfica sin necesidad de lente ocular.
4.4.-Sistema óptico del microscopio • Sistema óptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolución (objetivos y ocular) Los microscopios modernos están diseñados para proporcionar imágenes aumentadas y níti das de los especímenes que se observan. Los componentes ópticos están colocados en una base estable que permite un intercambio rápido y un alineamiento preciso. El sistema óptico está constituido por dos juegos de lentes: El objetivo y el ocular.
4.4.1.-Los objetivos Representan el componente óptico más importante del microscopio. Su principal función consiste en colectar la luz proveniente del espécimen y proyectar una imagen nítida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio. Constituyen un sistema óptico formado por una o varias lentes, las cuales deben estar centradas y los ejes ópticos de cada una deben coincidir exactamente para formar el ej e óptico del sistema. Sus lentes están hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros) con un alto grado de calidad y funcionamiento; su precio depende del poder de aumento, resolución y de la corrección de las aberraciones. Muchos fabricantes elaboran objetivos que pueden ser intercambiados y empleados en microscopios de otras marcas comerciales.
Clasificación: Tomando en cuenta el grado de corrección de l as aberraciones hay dos categorías de objetivos para el microscopio, los objetivos acromáticos y los objetivos apocromáticos. En cada categoría se distinguen aún dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de inmersión (64, 65, 66): • Objetivos acromáticos: Presentan corrección cromática para la luz azul y roja. Corrección de e sfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color verde y son ideales para microfotografía blanco y negro. Se asume que un objetivo es acromático cuando no posee ninguna denominación. • Objetivos semi-apocromáticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La corrección de e sfericidad es para dos colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y están mejor di señados para la microfotografía en colores. • Objetivos apocromáticos: Poseen el más alto nivel de corrección de aberraciones y por ello, son más costosos. Presentan corrección cromática para cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo y verde); corrección de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para microfotografía y video a color. Debido a su alto grado de corrección, estos objetivos poseen mayores aperturas numéricas que los acromáticos y las fluoritas. Esto puede ser un inconveni ente puesto que el campo de observación se presenta un poco curvo. Los tres tipos de objetivos proyectan imágenes con cierta distorsión que se manifiesta como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromáticos, plan-fluoritas o plan-apocromáticos.
Objetivos secos y objetivos de inmersión: Estos objetivos difieren entre sí por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-objeto de la lámina histológica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el medio interpuesto es el aire cuyo índice de refracción (n=1) es muy diferente del índice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de inmersión el medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un líquido cuyo índice de refracción es
lo más próximo al del vidrio. Este líquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor aún aceite de cedro, que posee un índice de refracción (n=1,515) casi idéntico al del vidrio. La ventaja de los objetivos de inmersión consiste en la disminución o eliminación de la refracción de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad de la imagen está aumentada, mientras que en los objetivos secos, está disminuida. El empleo de la inmersión aumenta el ángulo de apertura del objetivo y permite mayor resolución gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados (11, 64) (ver fig. 3-5) y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento. Óptica finita y óptica infinita: Figura 4-4.-Esquema que muestra el principio de los objetivos con corrección al infinito. Modificado de Microscope objetives. Olympus Microscopy Resource Center (66).
La microscopia de luz o fotónica ha experimentado cambios radicales en sus sistemas ópticos en los últimos años. El tubo que soporta tanto el revólver por un extremo, como el ocular por el otro, se confeccionaba con una determinada longitud y los fabricantes elaboraban objetivos que funcionaban para esa longitud (longitud finita) que fue estandarizada a 160mm y en algunos casos (Leitz) a 170mm. En muchos modelos de microscopios modernos el tubo no es rectilíneo y los rayos de luz transmitidos desde el objetivo hacia el ocular son desviados por prismas, especialmente en los microscopios trinoculares para fotografía. Emplear objetivos diseñados para una determinada longitud de tubo en otro microscopio que no corresponda produce incremento en las aberraciones de esfericidad, ocasionado por una longitud de tubo diferente. Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes, espejos y prismas que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y actualmente casi todos los fabricantes están elaborando microscopios que puedan aceptar objetivos diseñados para realizar una corrección infinita. Tales objetivos proyectan una imagen al infinito la cual es captada por otra lente que se introduce en el tubo y que a su vez la proyecta al punto focal del ocular. Los objetivos con esta corrección poseen el símbolo infinito grabado en la parte externa. Los sistemas corregidos al infinito son significativos porque corrigen la aparición de imágenes fantasma que con frecuencia se observa en microscopios anteriores, no obstante estos nuevos modelos son de mayor tamaño (66) (fig. 4-4).
Estructura de los objetivos: Generalmente es un tubo cilíndrico que contiene en su interior un revestimiento anti-reflejos y las diversas lentes colocadas en serie y alineadas (fig. 4-5). En la parte externa posee grabadas las especificaciones y características. Figura 4-5 .-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromático que contiene una lente frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromático o fluorita, con cuatro pares de lentes y (c) objetivo apocromático que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente esférica frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15).
Nomenclatura de los objetivos:
Figura 4-6.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades ópticas especiales en este objetivo denotan que puede emplearse en Interferencia de contraste diferencial (DIC differential interference contrast) y la H significa que puede emplearse en microscopios con platina caliente (heating stage). Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).
La identificación de las propiedades individuales de los objetivos es posible gracias a la nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las especificaciones necesarias para su uso apropiado (11, 15). La minuciosa información, generalmente en el idioma inglés, puede contener (fig. 4-6): • Nombre del fabricante: Casa comercial • Aumento linear: Con un rango que puede ir de sde 0,5x hasta 200x • Correcciones ópticas: Achro, Achromat (acromáticos); Fluar, Neofluar (semi - apocromáticos); Apo (apocromáticos); Plan, Plano (corrige curvatura de campo); ICS (infinity corrected system), UIS (universal infinity system); N, NPL (normal field o view plan); CF, CFI (chrome-free, chrome free infinity) y muchas otras especificaciones cuya nomenclatura depende del fabricante. • Apertura numérica: Es un valor que i ndica el ángulo de apertura del cono luminoso. • Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en milímetros (160, 170, 220) o con el símbolo (8) para objetivos con corrección infinita.
• Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero hay diversos espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos poseen un collar de corrección en las lentes internas para realizar la corrección y se denominan CR, Corr, w/corr, o pueden ten er una escala graduada móvil para el ajuste. • Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo, expresada en milímetros. • Propiedades ópticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas condiciones tienen resultados óptimos (para luz polarizada, contraste de fase, entre Código de color de inmersión Medio de inmersión otros). Negro Aceite • Rosca del objetivo: La mayoría de objetivos están Naranja Glicerol estandarizados de acuerdo a la Royal Microscopy Society Blanco Agua para garantizar una compatibilidad universal y se Rojo Especial o multiuso designan con las siglas RMS, sin embargo, algunos Código de color de aumento Aumento fabricantes tiene sus propias dimensiones. El diámetro Negro 1x, 2.5x general es de 20mm, pero los objetivos Leica y Nikon son Marrón 2x, 2.5x de rosca más amplia y sólo funcionan en sus Rojo 4x, 5x microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y 32 mm Amarillo 10x respectivamente. Verde 16x, 20x Azul turquesa 25x, 32x • Medio de inmersión: Algunos objetivos ameritan el uso de Azul celeste Azul cobalto Blanco, crema
40x, 50x 60x, 63x 100x, 250x, 200x
medios de inmersión y para ello se emplea un código de colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite); HI (homogeneous immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly (glicerol).
• Código de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de colores para facilitar la identificación del aumento Tabla 4-1.-Códigos de color en los objetivos microscópicos. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15)
4.4.2.-El ocular El ocular (del latín oculus = el ojo) está formado por lentes que generalmente son separadas por un diafragma, montadas en las extremidades de un cilindro que va introducido en la parte superior del tubo. El ocular sirve para observar la imagen real e invertida que produce el objetivo, ejerciendo dos funciones: • Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto a la imagen del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto. Posteriormente el ojo endereza la imagen. • Aplana y aclara el campo óptico o plano circular en el que aparece el objeto. La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la imagen real del objetivo; la lente inferior también se denomina colec tora y es la que aplana y aclara el campo (fig. 4-7).
Clasificación: Figura 4-7.-Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y (c) ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el diafragma entre las dos lentes (colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma por debajo de las lentes (c). Modificado de Digit Life (67).
• Oculares de Huygens : Empleados con los objetivos acromáticos y formados por dos lentes plano-convexas cuya convexidad está dirigida hacia el objetivo y el diafragma se ubica entre ambas. También denominado ocular negativo porque la imagen se forma entre las dos lentes. Muy común en modelos de microscopios antiguos (11). • Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por varias lentes unidas entre sí y colocadas por encima del diafragma. Generalmente corrigen aberraciones y funcionan de manera óptima con los objetivos corregidos al infinito (15). • Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de aumento para los diversos colores (diferencia cromática de aumento) que se aprecia en los objetivos apocromáticos. No tiene buen rendimiento con objetivos acromáticos secos. • Oculares de proyección: Posee una lente que permite la proyección de la imagen en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar o para exhibición (11). • Oculares aplanéticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente plano y el poder de resolución es igual tanto en el centro como en la periferia del campo ópti co (11). • Oculares peri-planáticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens pero con una doble lente ocular (11). Uno de los diseños de oculares más avanzados es el ocular Periplan (38) (fig. 4-8) que contiene siete lentes que corrigen las aberraciones cromáticas, la curvatura de campo y su em pleo óptimo es en combinación con objetivos de gran poder de aumento .
Los modelos de microscopios más simples poseen un solo ocular (mono-oculares), sin embargo hay microscopios binoculares y algunos modelos más modernos son trinoculares, especiales para la microfotografía. Los binoculares tienen los objetivos dispuestos con una inclinación de 45º para realizar la observación cómodamente. Campo del microscopio:
Se denomina campo del microscopio al círculo visible que se observa en el ocular. También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través de las lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo c ual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. La forma del campo está determinada por el diafragma fijo del ocular, que generalmente es de forma circular, no obstante el campo puede ser cuadrado y esta forma es muy útil al realizar estudios de coprología o hematología, en donde se requiere reconstruir la totalidad del campo de observación de la preparación, lo cual se dificulta con un campo circular clásico al quedar zonas superpuestas (11). El ocular produce un aumento adicional a la i magen proporcionada por el objetivo. El valor de este aumento está inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de 10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x. Otro valor es el número de campo que consiste en el diámetro en milímetros de la apertura fija del diafragma, la cual puede variar desde 18mm hasta 26.5mm. Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus características: • UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio. • H: Para un alto punto focal del observador que usa lente s durante la observación microscópica. • K, C, comp: Para oculares compensadores. • Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos planos. Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificación o medición de estructuras del espécimen en estudio. En ciertos casos es relevante conocer el número, tamaño o dimensiones de las células y demás elementos del tejido. Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza circular de vidrio con una escala o gradilla (fig. 4-9), la cual aparece enfocada y superpuesta a la imagen del espécimen al encontrarse en el plano de formación de la misma. Los oculares para la medición poseen un mecanismo de enfoque mediante rotación. Se debe calibrar la escala de medición del ocular con cada objetivo que se use (15). En la actualidad se puede emplear algún software de computación para realizar mediciones sobre las imágenes digitales y obtener datos muy precisos, no obstante, el método más económico y de uso más generalizado es la medición con los oculares. En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa (alambre, pestaña, cerda) denominada señalador, con la finalidad de i ndicar de manera específica alguna estructura en particular en el campo de observación. El señalador se aprecia como una línea oscura que parte del borde del campo hacia el centro del mismo. Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una parte colocar los ojos a la distancia correcta de observación y por otra, impedir la formación de reflejos luminosos que dificulten la visualización. Algunos microscopios binoculares poseen un mecanismo de enfoque del ocular que ajusta las dioptrías en caso que el observador posea una disminución de su agudeza visual. El ajuste se realiza por separado tanto para el ojo derecho como para el izquierdo; de igual manera se ajustan a la distancia interpupilar del observador (usualmente entre 55 y 75 mm). Figura 4-9.-Microfotografía de un frotis de sangre periférica en la que se observa un
campo rectangular con una escala de divisiones precisas, que en este caso son en el orden de 1/10 mm. Para determinar el tamaño de una célula se cuenta el número de divisiones que ocupa y la cifra se divide entre el aumento del objetivo empleado, dando como resultado un valor que corresponde al tamaño de la misma. Si la célula mide 7 divisiones, corresponde a 7/10mm; si el aumento del objetivo es 10 0x, se divide 0.7mm:100 = 0.007mm = 7µm. Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining. 2ª ed. (13).
4.5.-Sistema de iluminación
El sistema de iluminación está constituido por las partes del microscopio que producen o captan, reflejan y regulan la i ntensidad de la luz que se utiliza para la observación microscópica. Uno de los aspectos críticos a considerar en la microscopía óptica es la fuente de luz que se emplea para iluminar el espécimen. Si la muestra es iluminada de manera inadecuada, la calidad de la imagen que se obtiene se verá afectada, aun cuando se disponga de un e xcelente sistema óptico. La iluminación óptima debe ser
brillante, sin resplandores y en lo posible debe dispersarse de manera uniforme en el campo de observación. Si se emplea luz visible (fotones) es usual que al microscopio se le den omine fotónico. En sus inicios, la microscopía se practicaba con iluminación por reflexión; se util izaba un espejo que se orientaba para recoger la luz solar o en su defecto, luz artificial (la luz de una vela, mechero a gas, lámparas de aceit e o petróleo) y la desviaba hacia la preparación. Este método se mantuvo durante mucho tiempo, en parte debido al lento perfeccionamiento de las bombillas incandescentes, que consisten en un globo de cristal en el que se ha hecho el vacío y dentro del cual va colocado un hilo de metal (platino, carbón, tungsteno, entre otros) que al paso de una corriente eléctrica se pone incandescente y sirve para alumbrar (50). Con el uso de la bombilla eléctrica se suprime este espejo y los microscopios pueden utilizarse en cualquier lugar. Sin embargo, algunos modelos de microscopios actuales, desde los más sencillos y económicos hasta los más sofisticados, aún poseen un espejo que sirve para desviar la luz producida por la bombilla, en el caso que ésta no se encuentre alineada con la platina. El sistema de iluminación está constituido por la fuente de luz, el condensador y un di afragma o iris. Como regla general, el sistema de iluminación está colocado debajo de la platina y la finalidad es de iluminar mediante luz transmitida. En la mayoría de los casos el estudio de las preparaciones histológicas se hace por transiluminación. En otros casos muy específicos se emplea el método de luz reflejada, en el cual se ilumina la superficie del espécimen mediante epi-iluminación (ver capítulo 3). La fuente de luz emite una radiación que es recogida por un dispositivo denominado condensador, que a su vez forma un cono luminoso necesario para la visualización con objetivos de mayor aumento. 4.5.1.-Fuentes de luz
Aparte de la luz solar, empleada en microscopios sencillos con espejo, existen numerosas fuentes de iluminación artificial, tanto para la observación rutinaria como para la microfotografía. La luz artificial presenta numerosas ventajas tales como la const ancia, la uniformidad y la intensidad; además es muy favorable para los mayores aumentos. Existen varios tipos de fuentes de luz artificial: • Bombillas de tungsteno y halógenas: La mayoría de microscopios de luz están dotados de lámparas de este tipo cuyo poder oscila entre 10W y 100W. Se emplean como fuentes principales o accesorias. Estas lámparas son radiadores térmicos que emiten una l uz continua en un espectro comprendido entre 300 – 1200 nm. Están constituidas por un bulbo de cri stal relleno de un gas inerte y un filamento de tungsteno que es activado por una corriente eléctrica produciendo una importante cantidad de luz y calor. Varían mucho en tamaño, diseño y forma (68). Producen una luz blanca pero incrementan la intensidad del azul al rojo. La luz puede ser muy brillante para la observación y se reduce con filtros que dis minuyen la intensidad, denominados filtros de densidad neutra, disminuyendo la intensidad sin alterar los colores. También se emplean filtros de colores que compensen el color rojo, de manera que se pueda observar la imagen del espécimen sobre un fondo iluminado neutro, blanco y claro. El vidrio azul corrige el ti nte amarillo que tiene la luz incandescente y se obtiene una luz suave y agradable que aumenta la definición. • Lámparas de arco eléctrico: Son lámparas que pueden contener gases (vapor de mercurio, xenón o circonio) y son empleadas para proveer una luz monocromática con filt ros apropiados, ideal para microfotografía en blanco y negro o a colores. También se utilizan en microscopios especiales (fluorescencia). • Láser: En los últimos años se ha incrementado el uso de láser (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, Amplificación de Luz por Emisión Estimulada de Radiación) (42), que consiste en un dispositivo que genera un haz de luz con características de tamaño, coherencia, forma y pureza controladas. El láser de argón es uno de los más utilizados, cuya emisión está en el orden de 488-514 nm. Su costo es muy elevado y se emplea principalmente en microscopía confocal. • LED: De las siglas en inglés Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz) es un dispositivo emisor de luz con características muy próximas a la luz monocromática (espectro reducido). La luz se produce cuando una corriente eléctrica pasa a través del material semiconductor (arseniuro de galio-aluminio) del que están hechos (69). Se utilizan en una amplia gama de artefactos y lámparas. En comparación con las bombillas incandescentes, son más interesantes porque permiten ahorro de energía con un ma yor rendimiento lumínico. Para microscopía se emplean LED de l arga duración que proveen una luz muy brillante y fría; esto último es una gran ventaja, puesto que no gener a calor y la observación es más cómoda para el usuario. En la actualidad se producen combinaciones de diodos que emiten una luz blanca. 4.5.2.-Condensador
Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes, con aperturas mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor aumento. El término condensador puede considerarse inadecuado, ya que no produce una condensación de los rayos luminos os, por el contrario, produce un aumento de la sección del cono luminoso (11) que a su vez forma una imagen más clara. El condensador está conformado por una o varias lentes situadas debajo de la platina del microscopio, colocadas entre la fuente de luz y el espécimen. El primer condensador que se fabricó en 1838 (por Dujardin) poseía tres lentes acromáticas. Al igual que en los objetivos, las lentes del condensador poseen poder de aumento y también producen aberraciones, sin embargo, éstas también pueden corregirse.
Tipos de condensadores de acuerdo al grado de corrección de aberraciones ópticas (15): • Condensador de Abbe: Es el más simple, sin corrección de aberraciones y el más económico. Compuesto de dos o más lentes. Puede llegar a tener una apertura numérica de 1.4 en modelos de tres lentes. Se emplea para observación de rutina y con objetivos de modesta apertura numérica y amplificaci ón. Una de las ventajas es el amplio cono de iluminación que puede producir. • Aplanático: Corrige aberraciones de esfericidad. •Acromático: Corrige aberraciones cromáticas. Contiene tres o cuatro lentes corregidas para el azul y el rojo. Este condensador es útil para observaciones de rutina con objetivos secos y para microfotografía (blanco y negro o color). •Aplanático-Acromático: Poseen el más alto nivel de corrección y es el condensador de elección para microfotografía a color con luz blanca. Puede contener ocho lentes y su uso es óptimo con inmersión y objetivos de mayor aumento. Figura 4-10.-Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. Se observa un condensador con dos lentes y el trazado del haz de luz en
un microscopio fotónico. El medio de inmersión, en este caso aceite, se puede colocar tanto entre la lente frontal del condensador y el preparado histológico como entre el preparado y la lente frontal del objetivo. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).
El cono de luz que produce el condensador debe ajustarse de manera apropiada para optimizar la intensidad y el ángulo de apertura. Cada vez que se cambia un objetivo se debe realizar un ajuste para obtener el cono de luz conveniente a la apertura numérica del nuevo objetivo. A menudo no es práctico utilizar el mismo condensador para un amplio rango de objetivos (2x hasta 100x). Para objetivos de bajo poder de aumento (menor a 10x) algunos condensadores poseen una lente frontal adicional que es abatible. La altura del condensador es regulada mediante un mecanismo activado con un tornillo que lo baja o lo sube, acercándolo o no a la platina donde está colocado el espécimen (fig. 4-10). Además de los condensadores empleados en l os microscopios de campo claro, existe una variedad de modelos de condensadores especializados que se utilizan en diferentes aplicaciones, cuya finalidad principal es el incremento del contraste entre los detalles de la estructura del espécimen. Se han desarrollado condensadores especiales para microscopía de campo oscuro, contraste de fase, luz polarizada, contraste de interferencia diferencial. 4.5.3.-Diafragma o iris
Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe permitir cambios en la apertura y con diámetros variables cuya finalidad es la de obtener conos luminosos cada vez más estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes. Los primeros diafragmas consistían en un dis co de metal con agujeros de diferente diámetro, el cual se rotaba según la necesidad. Estos discos fueron substituidos por el iris, otro dispositivo más elaborado y con un di seño que le permite cambiar de diámetro. La apertura del diafragma se regula en relación con el tipo de objetivo que se esté utilizando. El diafragma o iris está pintado de negro con la finalidad de eliminar los rayos de luz reflejada que pueden interferir con la iluminación del objeto. (11, 70, 71). (fig. 4-11). Figura 4-12.-Iluminación Köhler. Se debe iluminar el espécimen siguiendo el esquema. La lámpara posee un filamento (S)
incandescente cuya luz es captada por la lente colectora L1 y regulada por el diafragma de campo D1. La i magen S’ del filamento de la lámpara es proyectada al plano del segundo diafragma D2. Este primer paso se realiza con D1 completamente abierto. La altura del condensador L2 se regula de manera que su punto focal esté en el plano D2. La imagen del diafragma de campo D1 es proyectada en el plano de la preparación por el condensador. Tomado de Estudio de diafragmas de campo y apertura. Microscopio (72).
4.5.4.-Iluminación Köhler
La iluminación es una variable crítica que hay que considerar al poner en funcionamiento el microscopio. Con frecuencia el uso incorrecto de la iluminación, aún en equipos sofisticados, conduce a la obtención de imágenes defectuosas. El espécimen debe ser iluminado mediante una fuente de luz artificial, la cual puede producir artificios en la imagen que se observa. En el año 1893, el profesor August Köhler propuso un método de iluminación para
optimizar la observación microscópica y la microfotografía (15), que permite aprovechar al máximo las capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la muestra en estudio con un campo de luz uniforme cuyo diámetro sea igual al del área de captura del objetivo. Los microscopios modernos están diseñados para aplicar la iluminación Köhler y los requerimientos son (figs. 4-12 y 4-13): • Condensador que sube y baja para enfocar el cono de l uz. • Bombilla con lente colectora. • Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lámpara y un diafragma de apertura, colocado debajo del condensador. El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen nítida del diafragma de campo. La iluminación ideal se consigue cuándo el condensador se encuentra lo más cerca de la preparación. El diafragma de campo regula el diámetro de la apertura de la iluminación y al cerrarlo se incrementan los contrastes (15). Una vez ajustada la iluminación Köhler no se debe regular la intensidad de la luz o el brillo bajando el condensador o cerrando la apertura de diafragma-iris, por el contrario, se regula la intensidad de la lámpara mediante un ajuste de voltaje. 4.6.-Formación de la imagen en el microscopio compuesto Figura 4-14 . Las líneas dibujadas desde el
ojo a A y R forman un ángulo, el cual es dos veces más grande que el ángulo de las líneas O-W. De igual manera, la distancia del ojo a la flecha OW es dos veces la distancia del ojo a la flecha AR. La flecha en AR aparece dos veces más grande que la flecha en OW. Las proporciones se mantienen al alejar o acercar la flecha. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and
Con la finalidad de facilitar la comprensión de la propiedad de aumento que tienen las lentes y en consecuencia el microscopio para observar objetos minúsc ulos, es necesario conocer algunos aspectos del fenómeno de la visión. El ojo humano está constituido de tal manera que sólo puede tener una visión clara cuando los rayos luminosos incidentes son paralelos o ligeramente divergentes, debido a que la retina requiere la participación del cristalino para enfocar los rayos en su superficie. El límite para visión cercana es la mínima distancia a la cual se puede observar claramente un objeto; varia de un individuo a otro y se estima entre 15 y 25 cm (6 y 10 pulgadas respectivamente), depende de la edad y otros factores. El valor considerado normal es de 25 cm. El tamaño aparente de un objeto depende del ángulo formado por dos líneas proyectadas desde el centro del ojo a las extremidades de dicho objeto (fig. 4-14) Este ángulo así formado se conoce como ángulo de vi sión o ángulo visual (73). La utilidad de una lente convexa interpuesta entre el ojo y un objeto cercano consiste en la reducción de la divergencia de los rayos luminosos emanados del objeto, de manera que puedan entrar al ojo en un es tado de moderada divergencia, como si emanaran de un objeto situado más allá del límite de visión cercana y en consecuencia se forma la imagen en la retina (fig. 4-15). Figura 4-15. Diagrama que representa una lente bi- convexa cercana al ojo y a una flecha pequeña (objeto en estudio) cuyos conos dibujados representan parte de los rayos de luz divergentes emanados de varios puntos. Los rayos emanados del objeto muy cercano, al i ncidir en la pupila, son aún tan divergentes que no permiten formar una imagen enfocada en la retina; pero al pasar primero por la lente son desviados para formar líneas casi paralelas que si pueden ser captadas por el ojo si éste está a su vez muy cercano a la lente. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications (73). Esos rayos luminosos emanados del objeto cercano y desviados por la lente son recibidos por el ojo como si fuesen emanados directamente por una flecha (objeto) más grande, aparentemente situada en el límite de visión cercana del observador (aprox. 25 cm del ojo). La diferencia de tamaño entre la flecha real y la flecha imaginaria estará determinada por el poder de aumento de la lente. La imagen formada no es real, no puede ser proyectada en una pantalla o recogida en una placa fotográfica; es una imagen mental. Por esta razón la imagen se denomina virtual y la distancia desde la lente hasta la imagen formada se denomina distancia focal virtual (74,75). Al interponer una lente bi-convexa entre un objeto y el ojo se incrementa el ángulo de visión y en consecuencia el objeto se verá más grande (fig. 4-16) Figura 4-16. Sin la lente colocada en f’g’ el ojo verá la flecha con el ángulo formado por las
líneas punteadas b y c, formando la imagen b’c’. Los rayos b’f’ y c’g’ emanados de las extremidades de la flecha son refractados por la lente hacia el ojo en dirección f y g, los cuales crean un ángulo visual mayor que hace que la fecha se vea más grande (d-e). Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications (73).
Lo que se conoce sobre las propiedades de las lentes permitirá comprender
el principio del microscopio compuesto, denominado así, en oposición a la lupa (microscopio simple) en base a que está conformado por dos sistemas de lentes, los cuales deben estar centrados, es decir, tener el mismo eje óptico. El primer sistema, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo, posee una distancia focal muy corta y es posible colocar el objeto un poco más allá de su punto focal para obtener una imagen real, invertida y aumentada. El sistema de lentes a través del cual el observador examina se denomina ocular y funciona como una lupa que aumenta la imagen real producida por el objetivo. La distancia entre el ocular y el objetivo debe ser calculada de manera que la imagen real obtenida por el objetivo se forme entre el ocular y su punto focal (11). El aumento del microscopio dependerá en principio de la longitud focal del objetivo. Mientras más pequeña sea esta longitud y el objeto se acerque al objetivo, más grande será la imagen real. El aumento también depende de la distancia focal del ocular y mientras más corta sea esta, mayor será el aumento (fig. 4-17). Figura 4-17. Esquema simplificado que muestra el trayecto que siguen los rayos emanados del espécimen en estudio y su paso a través de las lentes objetivo y ocular para la formación de las imágenes. La flecha ab corresponde al espécimen, que está colocado un poco por delante del foco (f) del objetivo, el cual forma una imagen real, aumentada e invertida en a’b’. Esta imagen se forma por dentro del foco (f ’) de la lente ocular. El ojo del observador percibirá a través del ocular la imagen virtual, aumentada y derecha a’’b’’ de la imagen real a’b’. Modificado de Langueron M. P récis de Microscopie (
4.7.-Accesorios del microscopio
Habiéndose familiarizado con la estructura y funcionamiento del microscopio compuesto, hay que considerar aquellos accesorios que conducen a una excelente práctica microscópica y que facilitan el trabajo, haciéndolo más rápido y efectivo o ampliando las capacidades del instrumento. Dentro de las actividades o posibilidades se pueden citar: • Medir y cuantificar: Consiste en la micrometría (morfometría) aproximada de los especímenes observados al microscopio. Para cuantificar longitudes, cantidades (conteo de células, núcleos, partículas), án gulos. Se emplean oculares de medición con retículos o gradillas en combinación con micrómetros especializados, láminas calibradas, cámaras de conteo y el vernier. En la actualidad se han desarrollado instrumentos para morfometría que emplean tecnología digital y los datos obtenidos pueden ser transmitidos a un computador, permitiendo así la automatización, el almacenamiento de los datos y la obtención de variables estadísticas a partir de ellos. • Dibujar: Dibujar las preparaciones microscópicas es una actividad de las más completas y precisas que permite obtener una representación fiel del espécimen en estudio tal y como el observador la percibe y representa la suma de detalles que se observan al cambiar el plano de enfoque, obteniéndose la sensación de relieve y profundidad. Se emplean las cámaras claras y otros dispositivos para dibujar que están concebidos con una serie de espejos y prismas que hacen coincidir en la retina o en una pantalla tanto el campo observado como el plano en el cual se debe dibujar. Se sigue sobre una hoja de papel el contorno de la imagen observada al mismo tiempo que se dibuja con un lápiz. • Fotografiar: Una manera de preservar lo observado al microscopio es mediante la microfotografía. Las imágenes obtenidas se archivan y se emplean en publicaciones científicas y presentaciones con fines docentes y banco de datos. Se necesitan ad aptadores para conectar la cámara a un tubo semejante al tubo del ocular en microscopios trinoculares. Se emplean desde las cámaras fotográficas clásicas hasta las cámaras digitales especializadas para acoplar al microscopio y las cámaras fotográficas digitales de uso común. Actualmente la fotografía clásica resulta complicada, costosa, de resultados menos atractivos y ha sido desplazada por la fotografía digital que es de más fácil y práctica ejecución. Con las cámaras digitales de alta resolución se obtienen resultados muy satisfactorios e inmediatos que pueden ser archivados en el computador para su posterior análisis y procesamiento. • Filmar: La captura de imágenes en movimiento se realiza mediante cámaras de video (digitales o no) que registran la actividad de especímenes vivos, células en cultivo, cámaras de perfusión, dispositivos con motor y automatizados, entre otros, para la demostración y análisis de procesos fisiológicos en videomicroscopía. • Incrementar el contraste: Para facilitar la observación de especímenes con una estructura particular y células vivas se emplean filtros, condensadores y otros dispositivos que transforman al microscopio de campo claro en un instrumento para tal fin, lográndose la microscopia fotónica especial (campo oscuro, contraste de fases, polarización, entre otras).
• Procesamiento de imágenes: Con el empleo del computador y de software especializados para captura,
administración y procesamiento de las microfotografías, en la actualidad se ha llegado a nuevos niveles en facilidad de uso y sofisticación que simplifican la investigación científica (76, 77) http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo4_8.htm http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MO NOWEB/capitulo3_4.htm
