Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Laboratorio Métodos de Análisis
Práctica: Verifcación del uncionamiento de un espectrootómetro.
29/Agosto/2016
Objetivos
Evaluar el rendimiento instrumental de un espectrofotómetro Verificar la exactitud de la escala de la longitud de onda, la presencia de radiación dispersa, en ancho de banda, la exactitud fotométrica, la proporcionalidad de respuesta y el rendimiento global del instrumento.
Fundamento.
El espectrofotómetro es un instrumento usado en la física óptica que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones. También es utiliado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos. !onstituido de"
#uente de lu" debe cumplir con estabilidad, direccionalidad, distribución de energía espectral continua y larga vida. $onocromador" aísla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se refle%an desde el con%unto, se usa para obtener lu monocrom&tica. Est& constituido por las rendi%as de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión. !ompartimiento de $uestra" Es donde tiene lugar la interacción, '.E.$ con la materia (debe producirse donde no haya absorción ni dispersión de las longitudes de onda). Es importante destacar, que durante este proceso, se aplica la ley de *ambert+eer en su m&xima expresión. -etector" es quien detecta una radiación y a su ve lo de%a en evidencia, para posterior estudio. ay de dos tipos" a) los que responden a fotones/ o b) los que responden al calor o 'egistrador" !onvierte el fenómeno físico, en n0meros proporcionales al analito en cuestión.
1ara asegurar un funcionamiento óptimo se eval0an los siguientes criterios" 1. Exactitud de la escala de longitud de onda: *a adecuada selección de
esta exista que se producan desviaciones importantes en la exactitud fotométrica. 2e recurre a un patrón que tenga espectros de absorción o transmisión con picos y valles bien definidos, distribuidos a lo largo de la escala de revisión. 2e acostumbra el empleo de filtros o soluciones de tierras raras cuyos espectros se obtuvieron con el mismo ancho de banda que traba%a el instrumento que se est& evaluando. 2. Luz dispersa: 1ara medir esta, se emplean filtros o soluciones de est&ndares que absorben la mayor parte de la radiación en un intervalo de longitudes de onda determinados. 2i incrementa m&s del 34 se considera la presencia de esta.
3. Exactitud ,on-itud de onda est&ndares nm) transmisión (*" longitudes de (+" absorbancia o '"" También se '1" 4. Ancho de con un ancho '!" a 56 veces el '(" . ''" fotométrica: '%" de '&" una relación '" '*" permite '+" si este se ve %"" la fuente de detector o %1" %!" Datos %(" %'" 8) %%" E98!T:T7;<-8 %&" A.1) Método %" A.1) Método %*" %+"
fotométrica: 2e eval0a empleando
#$
3>.? @5.A @@.A @6.B
[email protected] [email protected] [email protected] ?3.B ?B @C.? @A.C ?6.A AB.B 35.? ?C.B C@ @C 3A.B >.A C.A #$ %.& '.! '.! %.! 1".' !! ( %".* &1.' !.& *1.* *&.& +'.' +!.* +1 ** *( *" '.' &+ &1.& %!.'
con espectros de absorción o que tienen picos o valles definidos a onda específicas y con valores de transmitancia documentados. puede usar un filtro de vidrio neutro. banda: 2e recurre a un est&ndar de banda natural que no sea mayor ancho de banda del instrumento !roporcionalidad
o
linealidad
7n intervalo de longitudes de onda o concentraciones en las que exista lineal entre a vs. λ o entre 8 vs. ! evaluar el intervalo din&mico lineal, reducido podría indicar una falla en radiación, monocromador, el presencia de lu dispersa. experimentales e Informe
-E *8 E2!8*8 -E *;<=:T7- -E del filtro de tierras raras de la solución de estndar de NISO4 6 H 2 O al !"#
'a(la 1.)atos e*perimentales del espectro de transmisión del fltro de )idimio " solución estándar.
spectros de transmisión: !iltro de didimio " solución estándar. "00 %0
&'
#0
Es&ectro solución estándar
!0
Es&ectro 'ltro de (idi)io
$0 0 370 !"0 !50 !0 530 570 #"0 350 30 !30 !70 5"0 550 50 #ongitud de onda $nm%
+ráfca 1. spectros de transmisión del fltro de didimio " solución de NISO4 6 H 2 O al 20& A.1) Método del filtro de tierras raras
"bser#ar el espectro obtenido $ se%alar a&uellas longitudes en donde se muestran picos $ #alles: /0oincidieron los mximos 2o m3nimos con las lon-itudes de onda informadas por el fabricante4 /5n 6ué lon-itudes de onda no fue as34
Mximos M3nimos
5xperimentales
7eferencia
?A6, ?>6 y @@6nm ?D6, @A6nm
?A6, ?@6, ?>6 y @@6nm. ??6, ?D6 y @A6nm
!oincidieron a las longitudes de onda, teniendo como m&ximos valores experimentales y de referencia iguales en ?A6, ?>6 y @@6nm. *a 0nica longitud de onda que no se aprecia como m&ximo en los valores que obtuvimos es ?@6nm. En valores mínimos coincidieron los valores de ?D6 y @A6nm, no coincidiendo con la informada la longitud de ??6nm.
A.1) Método de la solución de estndar de •
•
NISO4 6 H 2 O
al !"#
8erificar la lon-itud de onda en la 6ue se obtuvo el valor mximo de #$9 @66 nm, mínimos" ?66 nm. /0ómo es la exactitud de la escala de lon-itud de onda del espectrofotómetro a esta lon-itud de onda4
Es exacta, ya que el valor en m&ximo que obtuvimos fue de @66nm y el valor informado es el mismo. •
Describa ventajas desventajas de los métodos empleados en la prctica para estimar la exactitud de la escala de lon-itud de onda.
Venta%as"
*as lecturas realiadas en poco tiempo, gracias a la eficacia de los equipos.
El filtro de -idimio y la solución est&ndar
NISO4 6 H 2 O
al A64 pueden ser
usados m&s de una ve, lo que hace que se puedan realiar lecturas seguidas en diferentes equipos. 8l aprender a usar los equipos, es sencillo mane%arlos. *os resultados obtenidos son muy exactos respecto a los informados por el fabricante. -esventa%as"
El filtro es sensible, adem&s de costoso. Este puede rayarse y así afectar nuestras lecturas.
!omo cualquier solución, el NISO 6 H O al A64 se puede contaminar y 4
2
afectar las lecturas.
) 1';1;'!:;<8*:-8- #;T;$T':!8 ,on-itud de onda nm) %(" %'" %%" %&" %"
Absorbancia
'a(la 2.)atos proporcionalidad entre A " - para el 20&
6.6@@@ 6.6B6> 6.6>C> 6.5AB? 6.5C55 NISO4 6 H 2 O
E%emplo de c&lculo de 8bsorbancia"
A = 2−log ( %T )
A = 2−log
( 88 ) 0.0555 =
A ,s. 0*$ 0*"5 A(sor(ancia
0*"
+,-. / 0- "*3$ 12 / 0*
0*05 0 5$5 530 535 5!0 5!5 550 555 5#0 5#5 570 575 #ongitud de onda $nm%
al
+ráfca 2. spectro de proporcionalidad entre A " - para el NISO4 6 H 2 O
al 20&
Informe los valores de la ordenada al ori-en: la pendiente el coeficiente de correlación de la -rfica.
F +5.35B3 8F 6.66AC 'F 6.>B@C
/;ué se puede concluir respecto a la proporcionalidad fotométrica en este intervalo de lon-itudes de onda4
8l disminuir la transmitancia, la absorbancia aumenta y con esta su longitud de onda. /;ué relación existe entre la absorbancia la lon-itud de onda en este intervalo de lon-itudes de onda4
*a relación es proporcional, ya que al aumentar la longitud de onda, aumenta la absorbancia. !) *7G -:21E'28 *os resultados se encuentran en la tabla @
Hue al incrementar el 34 a nuestros resultados, estos no rebasan el límite permitido, por lo tanto el instrumentos evaluado es aceptado.
-) 8
'esultados en taba @. 0onsiderando 6ue la variación en el anc>o de banda se presenta cuando >a disminuciones o incrementos en el #$ de ms de (#$: en relación a los valores de referencia /;ué se puede concluir con respecto al anc>o de banda del instrumento4
Existe variación en el ancho de banda, ya que existe una disminución del 3.BD>4T, y al suceder esto, el ancho de banda instrumental va a aumentar.
o de banda4 /;ué ocurre si él #$ disminue4
8l ser inversamente proporcionales, si el 4T aumenta, el ancho de banda disminuye y viceversa. E) E98!T:T7- #;T;$T':!8 5.1) Método del filtro de transmisión. ¿ No serealizo debido a que el filtrono se encontraba .
5.1) Método de la solución estndar de
?armetro2,on-itud de Onda Absorbancia 5sperada $olerancia Aceptada Absorbancia Medida
NISO4 6 H 2 O
al !"#
'""nm
%""nm
5.? + 5.C 5.??D+5.@>> 5.3B6
6.6?3 J 6.6@ 6.6??+6.6?B 6.63>
'a(la . )atos e*actitud otomtrica. todo de la solución estándar
'especto a las absorbancias medidas, se encuentran un poco por deba%o de la absorbancia esperada, por lo que se puede considerar que existe exactitud fotométrica al aproximarse al valor pero no es aceptada por estar deba%o de esta.
#) :
$ubo
0oncentración de
a
aC
5 A 3 ? @ C D B > 56
5K AK 3K ?K @K CK DK BK >K 56K
A(+%
@i
6 6.66>@ 6.6AB@ 6.6CC@ 6.56?@ 6.5?A@ 6.5@A6 6.5D56 6.5B6@ 6.5>66
6 6.6C 6.5?> 6.3AB 6.?>C 6.C?B 6.CBB 6.D@C 6.DBB 6.B5@
6 6.6C3 6.5?> 6.3AA 6.?BB 6.C?B 6.CBB 6.D@C 6.DBB 6.BA6
'a(la . )atos inter,alo dinámico lineal de la concentración.
E%emplo de c&lculo de concentración" C 2=
!5V5F!AVA
( C 1 V 1 ) V 2
Cur4a de Calibración del Inter4alo (iná)ico Lineal de Concentración " 0*% 0*# A(sor(ancia
+,-. / !*$- 3 0*0$ 12 / "
0.19 M
¿
0*!
0.2 m
(¿) ¿ C 2=¿
0*$ 0 0 0*0$ 0*0! 0*0#0*0% 0*" 0*"$ 0*"!0*"# 0*"% 0*$ 1oncentración $0%
+ráfca . ur,a de cali(ración del inter,alo dinámico lineal de concentración 5l intervalo dinmico lineal de la concentración es el intervalo de concentraciones en el 6ue se observa una respuesta lineal entre la absorbancia la concentración. /0ómo es este intervalo con respecto al sealado por el profesor4
El intervalo lineal es de 6.>>DA, que se aproxima bastante al seLalado por el profesor, el cual es de 5, por lo tanto presenta una tendencia lineal casi exacta. /;ué puede indicar 6ue el intervalo sea menor al esperado4
Hue la correlación no sea lineal y el comportamiento no sea directamente proporcional, es decir que la absorbancia no aumente conforme aumenta su concentración. Esto se podría deber a un mal mane%o del aparato o a un error experimental. ?armetro 5studiado
8alores de 7eferencia
8alores Observados
0onclusion
Exactitud de la escala de longitud de onda 1. 'iltro de (idimio
$&ximo(nm)
?A6, ?@6, ?>6, @@6
?A6, ?>6, ?@6
*os valores se encuen de los valores de refere 1rueba 8probada
$ínimo(nm)
??6, ?D6, @A6
?D6, @A6
*os valores se encuen de los valores de refere 1rueba 8probada *os valores coinci exactitud a los de refer 1rueba 8probada *os valores coinci exactitud a los de refer 1rueba 8probada
al 20 2. )oluci*n de +,)" 4-/ 2"
$&ximo (nm)
@66
@66
$ínimo (nm)
?66
?66
?roporcionalidad Fotométrica
-atos de 'egresión de @36 a @D6nm
'F5
6.>B@C
El valor observado pr relación cercana al referencia dado, por aprobado.
Luz (ispersa
4T a ?66nm (2olución de <:2;?MCA; al A64)
34T(N34T)
?.?4
4T a ?@6nm
54T(N34T)
6.A4
El resultado obte encuentra dentro d permitido, por lo aprobada. 1rueba 8probada
4T a @66nm
54T((N34T)
6.?4
1rueba 8probada
Ancho de anda
4T a @A6nm
>A.B4(N34)
B>.A4
Existe un error de deba%o del esperado p es rechaada.
Exactitud 'otométrica 1. étodo de filtro de #idrio neutro
4T a @36nm
+
+
al 20 2. étodo de la soluci*n de +,)" 4-/ 2"
8bsorbancia a ?66nm
5.? J 5.C
5.3B6
8bsorbancia a @66nm
6.6?3 J 6.6@
6.63>
2e encuentra por de permitido por lo que se 2e encuentra por de permitido por lo que se
Intervalo dinmico lineal de la concentración 1rueba 8probada, y intervalo es aproxi referido, con una lineal, lo cual se espera 1ar&metro dentro de lo 0 0*" :ntervalo de la 6.6A?A por lo cual la p concentración aprobada. 'a(la 3. 4esumen de resultados de e,aluación del uncionamiento del
-atos de la regresión lineal
'F 5
'F6.>>DA
?75E@$A 5G$7A. 1.
i. Hue al usar nuestro espectrofotómetro no cerremos bien la tapa y permitamos el paso de diferentes longitudes de onda que afecten nuestra lectura. ii. *u parasita, es decir lu que no paso por la muestra pero llegó al detector.
b. 0ambio en el anc>o de banda
i. Hue en el equipo haya presencia de polvo ii. $over el aparato. c. Alteración de la respuesta relativa o rendimiento instrumental
i. El aparato no ha sido cambiado y presenta fallas en su a%uste o en la fuente de radiación ii. $over el equipo mientras se esté traba%ando, así como mover la perilla de 4T Discusión.
En esta pr&ctica se realiaron distintas pruebas para determinar si el funcionamiento del espectrofotómetro utiliado era adecuado y se encontraba en óptimas condiciones para traba%ar con él. El espectrofotómetro utiliado fue uno digital, el cual es un poco m&s difícil de mane%ar por la exactitud que se debe tener en el a%uste para no obtener falsos positivos o errores de medición, contrario al analógico el cual nos puede dar mediciones de absorbancia y transmitancia al mismo tiempo. 8l verificar la exactitud de la longitud de onda, se traba%aron dos métodos. El primer método (filtro de tierras raras) arro%ó los resultados esperados, ya que se esperaban encontrar m&ximos en ?A6, ?@6, ?>6, @@6nm, de los cuales se encontraron 3 con exactitud. 'especto a mínimos se obtuvieron también los resultados deseados. 1ara el caso de la solución est&ndar, los resultados obtenidos fueron exactos al registrar dos valores de los tres esperados, con esto se puede decir que el monocromador funciona de manera correcta, y se hace con el fin de que se seleccione la adecuada longitud de onda para evitar que se producan desviaciones importantes en la exactitud fotométrica. En proporcionalidad fotométrica al haber usado un equipo digital, se obtuvo la transmitancia, para lo cual se determinó la absorbancia a ciertas longitudes de onda mediante una formula, al realiar la gr&fica obtuvimos una línea casi recta con valor de rF 6.>B@C, cercano al valor esperado (rF5), esto quiere decir que se obtuvo una relación lineal en la que la longitud de onda aumenta conforme aumenta la absorbancia. 'especto a la prueba realiada en lu dispersa obtuvimos una variación mínima del resultado esperado, sin embargo, se encuentra dentro de los límites permitidos para aprobar esta prueba ya que el filtro seleccionado y la solución est&ndar absorben la mayor parte de la radiación en el intervalo seleccionado, por lo que no hay presencia de lu dispersa. En ancho de banda se obtuvo un error del 3.BD>4 por deba%o del valor de referencia, por lo que la prueba fue rechaada, esto se podría deber a que la ranura de salida del monocromador esta obstruida por polvo haciendo que no pasen las longitudes de onda seleccionadas.
En exactitud fotométrica se evaluó el detector y el registrador el cual nos va indicar que tan verdadero es nuestro resultado/ el método del filtro de vidrio neutro no se realió, debido a que este no se encontraba disponible para usarse. El método de la solución est&ndar, nos dio resultados por deba%o de los permitidos a las dos longitudes de onda seleccionadas, un error de este tipo podría deberse al analista. #inalmente se realió el intervalo din&mico lineal de concentración para el cual se calcularon las concentraciones y realio una curva de calibración, obteniendo así los valores de pendiente, ordenada al origen y rF 6.>>DA para la regresión lineal, siendo aceptada y de 6.A?A que se encuentra dentro del valor aceptado para el intervalo de concentración, esto nos indica que tanto el detector est& funcionando correctamente y las lecturas son certeras.
0onclusiones
$ediante diversas pruebas, se comprobó el rendimiento instrumental, así como el correcto uso y funcionamiento de las partes esenciales de un espectrofotómetro. 2e comprobó que" el equipo tiene una escala de longitud de onda exacta, no detecta la presencia de radiación dispersa, presenta un mínimo error en ancho de banda, conserva la proporcionalidad de respuesta y tiene un buen rendimiento global.
Hiblio-raf3a
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